2024年3月26日发(作者：景平安)
JOURNAL
微生物学杂志
2005
年
3
月第
25
卷第
2
期
OFMICROBIOLOGYMar.2005Vol.25No.2
69
纳豆激酶的研究进展
程守强
,
梁凤来
,
王仁静
,
刘如林
(
南开大学生命科学学院
,
天津
300071
)
摘 要 纳豆激酶是一种由纳豆菌产生的具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶
,
与传统的一些溶栓剂相比
,
其
具有安全性好、成本低、口服有效等优点。就纳豆激酶的理化性质、制备过程、生物学功能、酶活测定方法及分
子生物学研究等进行了综述。
关键词 纳豆激酶
;
纳豆菌
;
溶栓作用
;
丝氨酸蛋白酶
中图分类号
Q556
文献标识码
A
文章编号
1005-7021
(
2005
)
02-0069-06
AdvanceinNattokinaseResearch
CHENGShou
2
qiang,LIANGFeng
2
lai,WANGRen
2
jing,LIURu
2
lin
(
ng
300071
)
Abstract
Nattokinaseisakindserineproteinasethathasstrongfibrinolyticactionproducedby
Bacillussubtilis
(
natto
)
.Ascomparedwithsometraditionalthrombolytics,nattokinasepossessestheadvantagesofsafety,lowcost,
vancesinnattokinaseresearchwerereviewedinthispaper,mainly
itsphysiologicalproperties,preparationprocess,biologicalfunctionsofdissolvingfibrin,assayforenzymaticactivity,
andmolecularbiologicalstudy.
Keywords
nattokinase;
Bacillussubtilis
(
natto
)
;fibrinolytic
function;serineproteinase
纳豆激酶
(
Nattokinase,NK;
也称
Subtilisin
NAT,SubtilisinBSP
)
是由纳豆菌
(
Bacillussubtilis
var.
natto
)
产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白
酶
,
是一种枯草杆菌蛋白酶
(
Subtilisin
)
。它是由
日本学者须见洋行等
[1]
于
1987
年首次在日本传
统食品纳豆中发现提取出来并定名。
10
余年来
,
研究者们对纳豆激酶的理化特性、作用机理及生
产工艺等方面进行了较为详尽的研究。实验研究
证实该酶不仅易于提取纯化
,
成本低廉
,
溶栓效果
好
,
作用迅速
,
药效时间长
,
而且安全性好
,
无任何
毒副作用
[2,3]
,
较目前已开发研制的一些溶栓药
物如尿激酶
(
Urokinase,UK
)
、链激酶
(
Streptoki
2
nase,SK
)
、组织型纤溶酶原激活剂
(
Tissue
2
type
plasminogenactivator,t
2
PA
)
等具有独特的优越
性
,
有望成为一种新型溶栓药物。
1.1
分子量和等电点
由于测定分子量采用的技术方法不同
,
所测
得的分子量也明显不同。须见洋行用
SephadexG
2
100
柱凝胶过滤法得到的结果为
20000u,
后来
他在另外的文章中发表用
SDS
2
PAGE
凝胶电泳
法测得的分子量为
35000u
[4]
,
而有人用圆二色
法测定为
27300u
。现由分离纯化的纳豆激酶基
因
DNA
序列推出其氨基酸序列
,
根据该顺序计算
出该酶的准确分子量为
27728u
[5]
,
远小于尿激
酶的分子量
54000u
。
用
Svunsson
柱型电泳法等电聚焦测得纳豆
激酶具有对称的单一的纤溶酶峰
,
其
pI
值为
8.6
±
0.3
[6]
。
1.2
分子结构
纯化的纳豆激酶无论还原剂巯基乙醇存在与
否
,
其在
SDS
2
PAGE
凝胶上均显示
1
条带
,
表明
该酶为一单链多肽。其由
275
个氨基酸残基组
1
理化性质
收稿日期
:2003-07-17
作者简介
:
程守强 男
,
硕士研究生。研究方向为资源细菌及工程。
70
微 生 物 学 杂 志
25
卷
成
,
与其它枯草杆菌蛋白酶同源性极高
[7,8]
:
它与
枯草杆菌蛋白酶
E
只差
2
个氨基酸残基
,
与枯草
杆菌蛋白酶
J
相差
4
个氨基酸残基
,
与枯草杆菌
蛋白酶
BPN
′的同源性为
86%,
而与枯草杆菌蛋
白酶
DY
和枯草杆菌蛋白酶
Carlsberg
也分别有
70%
和
72%
的同源性。纳豆激酶的活性中心在
Asp
32
,His
64
和
Ser
221
,
与底物的结合部位在
Ser
125
,
Leu
126
和
Gly
127
处
[7]
。
1.3
稳定性
S
2
2484
(
Pyro
2
Glu
2
Pro
2
Val
2
pNA
)
则明显无活性。
另有报道
[7]
,
纳豆激酶对枯草杆菌蛋白酶和胰凝
乳蛋白酶
(
Chymotrypsin
)
的底物
Suc
2
Ala
2
Ala
2
Pro
2
Phe
2
pNA
也有高度水解活性。以氧化型胰岛素
B
链为作用底物
,
研究纳豆激酶的酶切特性
,
发现纳
豆激酶有严格的识别位点及限制性酶切位点
,
首
选酶切位点在
Leu
15
2
Tyr
16
,
其次在
Ser
9
2
His
10
,
在
Gln
4
2
His
5
及
His
5
2
Leu
6
也有微弱的水解活性。与
其它一些枯草杆菌蛋白酶不同的是
,
纳豆激酶对
氧化型胰岛素
B
链
C
端
Tyr
16
2
Ala
30
之间的肽段却
无任何酶切特性
[7,12]
。
纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶
,
在
1mmol/L
二异丙基氟代磷酸酯
(
DFP
)
和
5mmol/L
敌百虫
(
Neguron
)
及
5mmol/L
苯甲基磺酰氟
(
PMSF
)
作
用下完全失活
;
由于不含半胱氨酸
(
Cys
)
和二硫
键
,
其活性不受
5mmol/LCys
影响
[1,7]
。此外
,
纳豆激酶可与血浆
α
1
结
2
巨球蛋白按摩尔比
2
∶
合而失去活性
[9]
。
Cu
2+
、
Zn
2+
和
Al
3+
等金属离
子对纳豆激酶有明显的抑制作用
,Hg
2+
可使其完
全失活
,
而
Mg
2+
和
Co
2+
对该酶则有显著的激活
作用
[10,11]
。纳豆激酶在
pH6.0
～
12.0
范围内
稳定
,pH
低于
5.0
则极不稳定。它在温度低于
45
℃时
,
活性相对稳定
,
在
40
℃保温
30min
活
力也无变化
,
但温度超过
50
℃
,
活力逐渐丧失
,
超过
60
℃时则因蛋白变性而迅速失活。若添加
明胶
,
可使其热稳定性提高
5
倍以上
[10]
。研究表
明
,
冻融对纳豆激酶活性影响不大
,
反复冻融
5
个循环
,
酶活性仍保持
95%
以上。当与胃黏液蛋
白、血清蛋白以及煮沸过的小麦或大米提取液和
肉汤混合后
,
纳豆激酶的稳定性显著增加
,
甚至在
酸性条件下
,
酶活性也不会完全丧失
[1]
。这说明
纳豆激酶能在胃环境中保持一定的活性
,
可通过
口服达到溶栓目的。
1.4
底物特异性
Sumi
等
[1]
利用几种人工合成的小分子短肽
作反应底物
,
研究纳豆激酶的酰胺水解活性
,
发现
纳豆激酶具有特异的水解蛋白的氨基酸作用
:
对
纳豆激酶最敏感的底物是血浆纤维蛋白溶酶
(
Plasimin,
纤溶酶
)
的作用底物
S
2
2251
(
H
2
D
2
Val
2
Leu
2
Lys
2
pNA
)
,
对凝血酶
(
Thrombin
)
底物
S
2
2238
(
H
2
D
2
Phe
2
Pip
2
Arg
2
pNA
)
和激肽释放酶
(
Kallikrein
)
底物
S
2
2302
(
H
2
D
2
Pro
2
Phe
2
Arg
2
pNA
)
也有一定活性
,
而对尿激酶底物
S
2
2444
(
Pyro
2
Glu
2
Gly
2
Arg
2
pNA
)
和弹性蛋白酶
(
Elastase
)
底物
2
分离纯化
纳豆激酶是胞外酶
[13]
,
故可利用纳豆菌的发
酵液提取。方法如下
:
将纳豆菌的发酵液离心
,
取
上清
,
用硫酸铵或乙醇沉淀
,
再经离心以除去发酵
上清液中的粘性物质
,
主要是果糖
(
Fructose
)
和多
聚谷氨酸
(
Polyglutamine
)
。离心后取沉淀
,
溶于
缓冲液中便为粗酶液。粗酶液经超滤脱盐
,
离子
交换
,
柱层析
,
透析
,
最后冷冻干燥即得酶干粉。
若以纳豆为材料提取纳豆激酶
,
只需在上述
步骤前增加一步
,
先用生理盐水浸提
,
其它相同
,
即可。
3
作用药理
大多数溶栓药物
,
如链激酶、尿激酶、
t
2
PA
等
都是纤溶酶原激活剂型
,
均需通过激活靶酶
,
即纤
维蛋白溶酶原
(
Plasminogen
)
转变为纤维蛋白溶
酶
,
再与纤维蛋白
(
Fibrin
)
结合
,
发挥溶栓作用
,
而
其自身不能直接作用于纤维蛋白
[14,15]
。
纳豆激酶则不然
[16
～
18]
,
它对纤维蛋白尤其
是交联形式的纤维蛋白本身更加敏感
,
可直接将
其水解成小肽和氨基酸
[19]
(
图
1
作用
A
)
。当把
酶提取液滴加到纤维蛋白平板上
,
短时间内即可
出现透明的溶解圈
,
体外溶栓效果显著。此外
,
将
纳豆激酶应用于狗的血栓模型实验及健康人群的
体内研究
[20,21]
,
表明其不仅可以抑制血栓的形
成
,
还可迅速降解纤维蛋白
,
增加纤维蛋白降解产
物
(
FDP
)
的量
,
明显缩短血浆中的优球蛋白的溶
解时间
(
ELT
)
,
提高优球蛋白的纤溶活性
(
EFA
)
,
并能降低
PAI
等纤溶酶原激活因子抑制子的活
性
[8]
,
从而激活静脉内皮细胞
,
引起
t
2
PA
的继发
2
期 程守强等
:
纳豆激酶的研究进展
71
性增加
(
图
1
作用
B
)
,
同时激活尿激酶原
(
pro
2
UK
)
转变为尿激酶
[21,23]
(
图
1
作用
C
)
,
使内源性
纤溶酶量和活性间接增强
,
具有双重功能。研究
表明
,
纳豆激酶的溶栓效果远大于纤溶酶和弹性
蛋白酶
,
活性是纤溶酶的
4
倍
[2,20]
。
图
1
纳豆激酶的作用机理
A.
直接溶解纤维蛋白
;B.
增加
t
2
PA;C.
激活尿激酶原为尿激酶
4
活性测定
纳豆激酶活性测定方法作为研究该酶的基
础
,
得到不断地建立和改进。现已有的活性测定
方法包括以下几种。
4.1
纤维蛋白平板法
纤维蛋白平板法是最早用于纳豆激酶活性测
定的方法之一
[1]
,
它是参照尿激酶或
t
2
PA
的测活
方法
[24]
而建立的。是将琼脂糖、血纤维蛋白原
(
Fibrinogen
)
溶液和凝血酶溶液按一定比例混合
,
制成人工血栓平板。取纳豆激酶样品点样于平板
上
,37
℃恒温孵育
,
测溶解圈直径
,
计算面积。并
以标准纳豆激酶或尿激酶或纤溶酶等作标准品对
照绘制标准曲线
,
从标准曲线上读取样品酶活性。
其原理是以凝血酶和纤维蛋白原作用生成的交联
纤维蛋白为底物
,
酶活与溶解圈面积成线性关系
,
故可用溶解面积来表示纳豆激酶的溶纤维活
性
[25]
。
该法简便直观
,
但测定值易随恒温孵育时间
变化而变化
,
并受样品中杂质影响较大。
4.2
纤维蛋白块溶解时间
(CLT)
法
[25]
该法也是参照
t
2
PA
、尿激酶等溶栓物质活性
测定方法加以改进而建立的。具体方法
:0
℃下
,
在小试管中依次加入凝血酶、巴比妥钠缓冲溶液、
纳豆激酶样品溶液和纤维蛋白原
,
强烈搅拌
,
置于
37
℃恒温水浴中。从纤维蛋白形成起开始计时
,
随着反应液混浊
,
有气泡上升到液面
,
至气泡不再
冒出时所用时间作为纤维蛋白溶解时间。同样以
标准纳豆激酶或尿激酶或纤溶酶等作为标准品绘
制标准曲线。原理为以
CLT
对纳豆激酶浓度的
对数作图
,
在
10
～
70
μ
g
范围内有很好的线性
关系。
此法迅速快捷
,
有较大的分辨率
,
不易受样品
中杂质影响
,
但精度不够
,
随着灵敏度的提高
,
溶
解时间的判定也更加困难。
4.3
酶联免疫吸附法
(ELISA)
[26]
该法是以对纳豆激酶有特异性的单克隆抗体
与纳豆激酶发生特异性结合
,
然后再同连有标志
酶的多克隆抗体结合
,
形成一种类似三明治的结
构
,
通过标志酶—过氧化物酶的反应测定纳豆激
酶样品的活性。具体方法为先将抗纳豆激酶的单
克隆抗体同纳豆激酶样品孵育
,
再同连有过氧化
氢酶的多克隆抗体结合。加入新配制的底物溶
液
,
孵育
10min,
再加入
1mol/LH
2
SO
4
,
测定
490nm
处的吸光值。
该法特异性强
,
抗干扰
,
灵敏度极高
,
可达到
0.1
μ
g/L,
既可测纳豆激酶的酶量
,
又可测其纤
溶活性。但操作复杂
,
成本高。
4.4
四肽底物法
[27]
由于纳豆激酶与枯草杆菌蛋白酶
E
同源性
极高
,
达
99.3%,
只有
2
个氨基酸的差异
,
且催化
中心和结合中心相同
,
故有人用测定枯草杆菌蛋
72
微 生 物 学 杂 志
25
卷
白酶
E
的方法来测定纳豆激酶的活性
[28]
。即在
四肽底物
Suc
2
Ala
2
Ala
2
Pro
2
Phe
2
pNA
溶液中加入
纳豆激酶样品
,37
℃孵育
1min,
测定单位时间
内
410nm
处吸光值的变化。
该方法简便易行
,
可迅速测定酶的活性
,
但该
方法所测得的蛋白酶活性与其溶纤维活性的相关
性还有待确定。
4.5
血清板法
[27]
血清板法也称微量稀释法
,
是纤维蛋白平板
法的改进
:
在血清板的小孔内按照纤维蛋白平板
的制作方法
,
制成微型纤维蛋白平板
,
再于各孔内
分别加入纳豆激酶样品和标准品。反应开始后
4h
内
,
每
30min
测定
1
次
OD
655
值
,
计算出每个
时间的
OD
655
值同初始
OD
655
值的差
-
Δ
OD
655
,
以斜率
-
Δ
OD
655
/h
同纳豆激酶样品的浓度的对
数作图
,
即得。因为纤维蛋白形成初始时在
655nm
处的吸光值最大
,
随着纳豆激酶催化
,
纤
维蛋白溶解
,
使吸光度下降
,
而吸光度的减少同纳
豆激酶的活性成线性关系。
该方法操作简便、快捷
,
样品消耗小
,
成本低
,
在短时间内可同时测多个样品
,
而且同经典的纤
溶分析法—纤维蛋白平板法相关系数为
0.967,
可信度高。
以上几种纳豆激酶的活性测定方法
,
各有优
缺点。目前普遍使用的仍是经典的纤维蛋白平板
法和纤维蛋白块溶解时间法。
端下游
7bp
处有一段序列可形成茎环结构
,
即
ρ
因子非依赖性终止序列。该工作为利用基因工程
技术提高纳豆激酶的产量及活性奠定了基础。
近年来
,
纳豆激酶的分子生物学研究取得了
很大进展
,
很多研究者都克隆出了纳豆激酶基因
并成功表达。张淑梅
[29]
、黄志立
[30]
、尹俊
[31]
、罗
立新
[32]
等利用
PCR
技术从分泌纳豆酶的枯草杆
菌基因组
DNA
中扩增得到了纳豆激酶基因
,
利
用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载
体
,
在
中实现了表达
;
刘北域等则在
E.
coli
中表达纳豆激酶原基因
[33]
,
并使纳豆激酶基
因在
Bacillus
中进行了表达
[34]
。而潘秋辉等
[35]
在不改变蛋白质序列的前提下
,
对纳豆激酶
N
2端
序列进行改造
,
实现了纳豆激酶成熟肽的高效表
达。罗立新等还成功构建了纳豆激酶基因重组酵
母菌
[36]
。
此外
,
有人通过改造与纳豆激酶极其相似的
枯草杆菌蛋白酶
E
的基因
,
从而改变该酶的分子
结构
,
以进一步提高其性能。
TakagiH
等
[37]
人采
用定点突变的方法
,
改变了酶活性中心
Asp
32
附近
的
Ile
31
,
使其酶活显著提高
,
催化效率是野生型的
2
～
6
倍。作为对照
,
他们在
Ile
31
位点引入了
8
种
不同的氨基酸残基
(
Cys
、
Ser
、
Thr
、
Gly
、
Ala
、
Val
、
Leu
、
Phe
)
,
结果发现只有
Val
31
和
Leu
31
突变株表
现出酶活力增加
,
其中
Leu
31
突变株的酶活力显著
增加
,
其他
6
种突变株的酶活力均明显下降。这
表明
,
在
31
位点的侧链氨基酸对枯草杆菌蛋白
酶
E
活力的表现是非常重要的
,
并且酶活力表现
的水平依赖于侧链基团的结构。后来
[38]
也是通
过定点突变的方法
,
改变了枯草杆菌蛋白酶
E
的
氨基酸组成
,
使
Gly
61
/Ser
98
变为
Cys
61
/Cys
98
,
引入
二硫键
,
使枯草杆菌蛋白酶
E
的半衰期提高了
2
～
3
倍
,
热稳定性提高了
4.5
℃。该方法可望应
用于纳豆激酶。
5
分子生物学研究
Nakamura
等
[5]
于
1992
年用鸟枪法首先在大
肠杆菌
(
)
宿主2载体系统中克隆得到了包
括调控序列在内的纳豆激酶基因
(
又称枯草杆菌
蛋白酶
NAT
基因
,aprN
)
的全长序列。该基因长
1473bp,
以
GTG
为起始密码子
,
其上游
-17bp
至
-11bp
位点为核糖体结合位点
S
2
D
序列
:
AAAGGAG
。
S
2
D
序列上游是
A/T
含量高达
72%
的转录调控区。起始密码子后是
1143bp
组成的开放阅读框架
(
ORF
)
,
编码共
381
个氨基
酸残基组成的多肽
,
其中包括
:29
个氨基酸残基
组成的信号肽
,77
个氨基酸残基组成的前肽和
275
个氨基酸残基组成的成熟肽—纳豆激酶。结
构基因的
3
′末端为连续的
3
个终止密码子
TAA,
TAG,TAA,
终止密码子之后位于成熟蛋白区域
C
6
开发现状及应用前景
纳豆激酶在日本已得到广泛深入的研究
,
其
制剂
NKCP
等已面市。在我国
,
纳豆激酶制剂—
恩开胶囊也已进入中试阶段
[39]
。由于使用不同
的纳豆菌发酵产生的纳豆激酶的量和活性有很大
差别
,
因而如何获得合适的菌株
,
并控制一定的条
件
,
使纳豆激酶占纤溶成分中的大部分甚至全部
,
2
期 程守强等
:
纳豆激酶的研究进展
73
对大规模生产是至关重要的
:
首先是菌种选育
,
有
意识地分离筛选纳豆激酶活力高的菌株
,
并进一
步诱变
,
或利用基因工程技术对其进行改造
;
其次
是改变进而优化培养条件
,
使菌株在最佳生长环
境中生长。很多学者已就此两方面进行了大量的
研究。
血栓栓塞性疾病是引起死亡的主要原因之
一
,
是现今仅次于癌症的第二大病症。目前常用
的及一些还在研制开发的溶栓药物如链激酶、尿
激酶、水蛭素
(
Hirudin
)
、
t
2
PA
等均在不同程度上
存在不足
[40]
[7]
Fujita,M.,,&,
etal
.Purificationand
characterizationofastrongfibrinolyticenzyme
(
nattokinase
)
inthevegetablecheesenatto,apopularsoybeanfermentedfood
inJapan[J].,1993,197:
1340-1347.
[8]
Urano,T.,,&a,
etal
.TheProfibrinolyt
2
icEnzymeSubtilisinNATPurifiedfrom
Bacillussubtilis
CleavesandInactivatesPlasminogenActivatorInhibitorType
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江晓
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[J].
食品与
:
或是毒性比较强
,
易引起出血
,
副作
用大
;
或是在体内半衰期短
,
且不易被吸收
,
只能
静脉给药
,
药效难以发挥
;
或是来源紧缺
,
成本高
,
价格昂贵
,
很难成为
1
种大众药品
[41]
。而目前的
研究表明
,
纳豆激酶却可以很好地弥补这些缺陷
,
它分子量小
,
无免疫原性
,
安全无毒
,
药效高
,
作用
时间长
,
不仅能抑制血栓形成
,
而且溶栓作用强
,
并抗胰酶水解
,
在肠道内稳定性好
,
易被人体消化
吸收
[2,21]
,
因而既可以静脉给药
,
也可以口服。
同时纳豆激酶除可以直接作用于交联纤维蛋白
外
,
还可使机体自身纤溶酶系统活化
,
从而温和、
持续地提高血液的纤溶活性。此外
,
纳豆激酶可
以采用细菌发酵进行规模生产
,
周期短
,
产量高
,
且易于提取纯化
,
成本低廉。这些独特的优点无
疑将使其成为新一代理想的预防和治疗栓塞的生
化药物。
参考文献
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natto
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[4]
须见洋行
.
纳豆
2024年3月26日发(作者：景平安)
JOURNAL
微生物学杂志
2005
年
3
月第
25
卷第
2
期
OFMICROBIOLOGYMar.2005Vol.25No.2
69
纳豆激酶的研究进展
程守强
,
梁凤来
,
王仁静
,
刘如林
(
南开大学生命科学学院
,
天津
300071
)
摘 要 纳豆激酶是一种由纳豆菌产生的具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶
,
与传统的一些溶栓剂相比
,
其
具有安全性好、成本低、口服有效等优点。就纳豆激酶的理化性质、制备过程、生物学功能、酶活测定方法及分
子生物学研究等进行了综述。
关键词 纳豆激酶
;
纳豆菌
;
溶栓作用
;
丝氨酸蛋白酶
中图分类号
Q556
文献标识码
A
文章编号
1005-7021
(
2005
)
02-0069-06
AdvanceinNattokinaseResearch
CHENGShou
2
qiang,LIANGFeng
2
lai,WANGRen
2
jing,LIURu
2
lin
(
ng
300071
)
Abstract
Nattokinaseisakindserineproteinasethathasstrongfibrinolyticactionproducedby
Bacillussubtilis
(
natto
)
.Ascomparedwithsometraditionalthrombolytics,nattokinasepossessestheadvantagesofsafety,lowcost,
vancesinnattokinaseresearchwerereviewedinthispaper,mainly
itsphysiologicalproperties,preparationprocess,biologicalfunctionsofdissolvingfibrin,assayforenzymaticactivity,
andmolecularbiologicalstudy.
Keywords
nattokinase;
Bacillussubtilis
(
natto
)
;fibrinolytic
function;serineproteinase
纳豆激酶
(
Nattokinase,NK;
也称
Subtilisin
NAT,SubtilisinBSP
)
是由纳豆菌
(
Bacillussubtilis
var.
natto
)
产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白
酶
,
是一种枯草杆菌蛋白酶
(
Subtilisin
)
。它是由
日本学者须见洋行等
[1]
于
1987
年首次在日本传
统食品纳豆中发现提取出来并定名。
10
余年来
,
研究者们对纳豆激酶的理化特性、作用机理及生
产工艺等方面进行了较为详尽的研究。实验研究
证实该酶不仅易于提取纯化
,
成本低廉
,
溶栓效果
好
,
作用迅速
,
药效时间长
,
而且安全性好
,
无任何
毒副作用
[2,3]
,
较目前已开发研制的一些溶栓药
物如尿激酶
(
Urokinase,UK
)
、链激酶
(
Streptoki
2
nase,SK
)
、组织型纤溶酶原激活剂
(
Tissue
2
type
plasminogenactivator,t
2
PA
)
等具有独特的优越
性
,
有望成为一种新型溶栓药物。
1.1
分子量和等电点
由于测定分子量采用的技术方法不同
,
所测
得的分子量也明显不同。须见洋行用
SephadexG
2
100
柱凝胶过滤法得到的结果为
20000u,
后来
他在另外的文章中发表用
SDS
2
PAGE
凝胶电泳
法测得的分子量为
35000u
[4]
,
而有人用圆二色
法测定为
27300u
。现由分离纯化的纳豆激酶基
因
DNA
序列推出其氨基酸序列
,
根据该顺序计算
出该酶的准确分子量为
27728u
[5]
,
远小于尿激
酶的分子量
54000u
。
用
Svunsson
柱型电泳法等电聚焦测得纳豆
激酶具有对称的单一的纤溶酶峰
,
其
pI
值为
8.6
±
0.3
[6]
。
1.2
分子结构
纯化的纳豆激酶无论还原剂巯基乙醇存在与
否
,
其在
SDS
2
PAGE
凝胶上均显示
1
条带
,
表明
该酶为一单链多肽。其由
275
个氨基酸残基组
1
理化性质
收稿日期
:2003-07-17
作者简介
:
程守强 男
,
硕士研究生。研究方向为资源细菌及工程。
70
微 生 物 学 杂 志
25
卷
成
,
与其它枯草杆菌蛋白酶同源性极高
[7,8]
:
它与
枯草杆菌蛋白酶
E
只差
2
个氨基酸残基
,
与枯草
杆菌蛋白酶
J
相差
4
个氨基酸残基
,
与枯草杆菌
蛋白酶
BPN
′的同源性为
86%,
而与枯草杆菌蛋
白酶
DY
和枯草杆菌蛋白酶
Carlsberg
也分别有
70%
和
72%
的同源性。纳豆激酶的活性中心在
Asp
32
,His
64
和
Ser
221
,
与底物的结合部位在
Ser
125
,
Leu
126
和
Gly
127
处
[7]
。
1.3
稳定性
S
2
2484
(
Pyro
2
Glu
2
Pro
2
Val
2
pNA
)
则明显无活性。
另有报道
[7]
,
纳豆激酶对枯草杆菌蛋白酶和胰凝
乳蛋白酶
(
Chymotrypsin
)
的底物
Suc
2
Ala
2
Ala
2
Pro
2
Phe
2
pNA
也有高度水解活性。以氧化型胰岛素
B
链为作用底物
,
研究纳豆激酶的酶切特性
,
发现纳
豆激酶有严格的识别位点及限制性酶切位点
,
首
选酶切位点在
Leu
15
2
Tyr
16
,
其次在
Ser
9
2
His
10
,
在
Gln
4
2
His
5
及
His
5
2
Leu
6
也有微弱的水解活性。与
其它一些枯草杆菌蛋白酶不同的是
,
纳豆激酶对
氧化型胰岛素
B
链
C
端
Tyr
16
2
Ala
30
之间的肽段却
无任何酶切特性
[7,12]
。
纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶
,
在
1mmol/L
二异丙基氟代磷酸酯
(
DFP
)
和
5mmol/L
敌百虫
(
Neguron
)
及
5mmol/L
苯甲基磺酰氟
(
PMSF
)
作
用下完全失活
;
由于不含半胱氨酸
(
Cys
)
和二硫
键
,
其活性不受
5mmol/LCys
影响
[1,7]
。此外
,
纳豆激酶可与血浆
α
1
结
2
巨球蛋白按摩尔比
2
∶
合而失去活性
[9]
。
Cu
2+
、
Zn
2+
和
Al
3+
等金属离
子对纳豆激酶有明显的抑制作用
,Hg
2+
可使其完
全失活
,
而
Mg
2+
和
Co
2+
对该酶则有显著的激活
作用
[10,11]
。纳豆激酶在
pH6.0
～
12.0
范围内
稳定
,pH
低于
5.0
则极不稳定。它在温度低于
45
℃时
,
活性相对稳定
,
在
40
℃保温
30min
活
力也无变化
,
但温度超过
50
℃
,
活力逐渐丧失
,
超过
60
℃时则因蛋白变性而迅速失活。若添加
明胶
,
可使其热稳定性提高
5
倍以上
[10]
。研究表
明
,
冻融对纳豆激酶活性影响不大
,
反复冻融
5
个循环
,
酶活性仍保持
95%
以上。当与胃黏液蛋
白、血清蛋白以及煮沸过的小麦或大米提取液和
肉汤混合后
,
纳豆激酶的稳定性显著增加
,
甚至在
酸性条件下
,
酶活性也不会完全丧失
[1]
。这说明
纳豆激酶能在胃环境中保持一定的活性
,
可通过
口服达到溶栓目的。
1.4
底物特异性
Sumi
等
[1]
利用几种人工合成的小分子短肽
作反应底物
,
研究纳豆激酶的酰胺水解活性
,
发现
纳豆激酶具有特异的水解蛋白的氨基酸作用
:
对
纳豆激酶最敏感的底物是血浆纤维蛋白溶酶
(
Plasimin,
纤溶酶
)
的作用底物
S
2
2251
(
H
2
D
2
Val
2
Leu
2
Lys
2
pNA
)
,
对凝血酶
(
Thrombin
)
底物
S
2
2238
(
H
2
D
2
Phe
2
Pip
2
Arg
2
pNA
)
和激肽释放酶
(
Kallikrein
)
底物
S
2
2302
(
H
2
D
2
Pro
2
Phe
2
Arg
2
pNA
)
也有一定活性
,
而对尿激酶底物
S
2
2444
(
Pyro
2
Glu
2
Gly
2
Arg
2
pNA
)
和弹性蛋白酶
(
Elastase
)
底物
2
分离纯化
纳豆激酶是胞外酶
[13]
,
故可利用纳豆菌的发
酵液提取。方法如下
:
将纳豆菌的发酵液离心
,
取
上清
,
用硫酸铵或乙醇沉淀
,
再经离心以除去发酵
上清液中的粘性物质
,
主要是果糖
(
Fructose
)
和多
聚谷氨酸
(
Polyglutamine
)
。离心后取沉淀
,
溶于
缓冲液中便为粗酶液。粗酶液经超滤脱盐
,
离子
交换
,
柱层析
,
透析
,
最后冷冻干燥即得酶干粉。
若以纳豆为材料提取纳豆激酶
,
只需在上述
步骤前增加一步
,
先用生理盐水浸提
,
其它相同
,
即可。
3
作用药理
大多数溶栓药物
,
如链激酶、尿激酶、
t
2
PA
等
都是纤溶酶原激活剂型
,
均需通过激活靶酶
,
即纤
维蛋白溶酶原
(
Plasminogen
)
转变为纤维蛋白溶
酶
,
再与纤维蛋白
(
Fibrin
)
结合
,
发挥溶栓作用
,
而
其自身不能直接作用于纤维蛋白
[14,15]
。
纳豆激酶则不然
[16
～
18]
,
它对纤维蛋白尤其
是交联形式的纤维蛋白本身更加敏感
,
可直接将
其水解成小肽和氨基酸
[19]
(
图
1
作用
A
)
。当把
酶提取液滴加到纤维蛋白平板上
,
短时间内即可
出现透明的溶解圈
,
体外溶栓效果显著。此外
,
将
纳豆激酶应用于狗的血栓模型实验及健康人群的
体内研究
[20,21]
,
表明其不仅可以抑制血栓的形
成
,
还可迅速降解纤维蛋白
,
增加纤维蛋白降解产
物
(
FDP
)
的量
,
明显缩短血浆中的优球蛋白的溶
解时间
(
ELT
)
,
提高优球蛋白的纤溶活性
(
EFA
)
,
并能降低
PAI
等纤溶酶原激活因子抑制子的活
性
[8]
,
从而激活静脉内皮细胞
,
引起
t
2
PA
的继发
2
期 程守强等
:
纳豆激酶的研究进展
71
性增加
(
图
1
作用
B
)
,
同时激活尿激酶原
(
pro
2
UK
)
转变为尿激酶
[21,23]
(
图
1
作用
C
)
,
使内源性
纤溶酶量和活性间接增强
,
具有双重功能。研究
表明
,
纳豆激酶的溶栓效果远大于纤溶酶和弹性
蛋白酶
,
活性是纤溶酶的
4
倍
[2,20]
。
图
1
纳豆激酶的作用机理
A.
直接溶解纤维蛋白
;B.
增加
t
2
PA;C.
激活尿激酶原为尿激酶
4
活性测定
纳豆激酶活性测定方法作为研究该酶的基
础
,
得到不断地建立和改进。现已有的活性测定
方法包括以下几种。
4.1
纤维蛋白平板法
纤维蛋白平板法是最早用于纳豆激酶活性测
定的方法之一
[1]
,
它是参照尿激酶或
t
2
PA
的测活
方法
[24]
而建立的。是将琼脂糖、血纤维蛋白原
(
Fibrinogen
)
溶液和凝血酶溶液按一定比例混合
,
制成人工血栓平板。取纳豆激酶样品点样于平板
上
,37
℃恒温孵育
,
测溶解圈直径
,
计算面积。并
以标准纳豆激酶或尿激酶或纤溶酶等作标准品对
照绘制标准曲线
,
从标准曲线上读取样品酶活性。
其原理是以凝血酶和纤维蛋白原作用生成的交联
纤维蛋白为底物
,
酶活与溶解圈面积成线性关系
,
故可用溶解面积来表示纳豆激酶的溶纤维活
性
[25]
。
该法简便直观
,
但测定值易随恒温孵育时间
变化而变化
,
并受样品中杂质影响较大。
4.2
纤维蛋白块溶解时间
(CLT)
法
[25]
该法也是参照
t
2
PA
、尿激酶等溶栓物质活性
测定方法加以改进而建立的。具体方法
:0
℃下
,
在小试管中依次加入凝血酶、巴比妥钠缓冲溶液、
纳豆激酶样品溶液和纤维蛋白原
,
强烈搅拌
,
置于
37
℃恒温水浴中。从纤维蛋白形成起开始计时
,
随着反应液混浊
,
有气泡上升到液面
,
至气泡不再
冒出时所用时间作为纤维蛋白溶解时间。同样以
标准纳豆激酶或尿激酶或纤溶酶等作为标准品绘
制标准曲线。原理为以
CLT
对纳豆激酶浓度的
对数作图
,
在
10
～
70
μ
g
范围内有很好的线性
关系。
此法迅速快捷
,
有较大的分辨率
,
不易受样品
中杂质影响
,
但精度不够
,
随着灵敏度的提高
,
溶
解时间的判定也更加困难。
4.3
酶联免疫吸附法
(ELISA)
[26]
该法是以对纳豆激酶有特异性的单克隆抗体
与纳豆激酶发生特异性结合
,
然后再同连有标志
酶的多克隆抗体结合
,
形成一种类似三明治的结
构
,
通过标志酶—过氧化物酶的反应测定纳豆激
酶样品的活性。具体方法为先将抗纳豆激酶的单
克隆抗体同纳豆激酶样品孵育
,
再同连有过氧化
氢酶的多克隆抗体结合。加入新配制的底物溶
液
,
孵育
10min,
再加入
1mol/LH
2
SO
4
,
测定
490nm
处的吸光值。
该法特异性强
,
抗干扰
,
灵敏度极高
,
可达到
0.1
μ
g/L,
既可测纳豆激酶的酶量
,
又可测其纤
溶活性。但操作复杂
,
成本高。
4.4
四肽底物法
[27]
由于纳豆激酶与枯草杆菌蛋白酶
E
同源性
极高
,
达
99.3%,
只有
2
个氨基酸的差异
,
且催化
中心和结合中心相同
,
故有人用测定枯草杆菌蛋
72
微 生 物 学 杂 志
25
卷
白酶
E
的方法来测定纳豆激酶的活性
[28]
。即在
四肽底物
Suc
2
Ala
2
Ala
2
Pro
2
Phe
2
pNA
溶液中加入
纳豆激酶样品
,37
℃孵育
1min,
测定单位时间
内
410nm
处吸光值的变化。
该方法简便易行
,
可迅速测定酶的活性
,
但该
方法所测得的蛋白酶活性与其溶纤维活性的相关
性还有待确定。
4.5
血清板法
[27]
血清板法也称微量稀释法
,
是纤维蛋白平板
法的改进
:
在血清板的小孔内按照纤维蛋白平板
的制作方法
,
制成微型纤维蛋白平板
,
再于各孔内
分别加入纳豆激酶样品和标准品。反应开始后
4h
内
,
每
30min
测定
1
次
OD
655
值
,
计算出每个
时间的
OD
655
值同初始
OD
655
值的差
-
Δ
OD
655
,
以斜率
-
Δ
OD
655
/h
同纳豆激酶样品的浓度的对
数作图
,
即得。因为纤维蛋白形成初始时在
655nm
处的吸光值最大
,
随着纳豆激酶催化
,
纤
维蛋白溶解
,
使吸光度下降
,
而吸光度的减少同纳
豆激酶的活性成线性关系。
该方法操作简便、快捷
,
样品消耗小
,
成本低
,
在短时间内可同时测多个样品
,
而且同经典的纤
溶分析法—纤维蛋白平板法相关系数为
0.967,
可信度高。
以上几种纳豆激酶的活性测定方法
,
各有优
缺点。目前普遍使用的仍是经典的纤维蛋白平板
法和纤维蛋白块溶解时间法。
端下游
7bp
处有一段序列可形成茎环结构
,
即
ρ
因子非依赖性终止序列。该工作为利用基因工程
技术提高纳豆激酶的产量及活性奠定了基础。
近年来
,
纳豆激酶的分子生物学研究取得了
很大进展
,
很多研究者都克隆出了纳豆激酶基因
并成功表达。张淑梅
[29]
、黄志立
[30]
、尹俊
[31]
、罗
立新
[32]
等利用
PCR
技术从分泌纳豆酶的枯草杆
菌基因组
DNA
中扩增得到了纳豆激酶基因
,
利
用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载
体
,
在
中实现了表达
;
刘北域等则在
E.
coli
中表达纳豆激酶原基因
[33]
,
并使纳豆激酶基
因在
Bacillus
中进行了表达
[34]
。而潘秋辉等
[35]
在不改变蛋白质序列的前提下
,
对纳豆激酶
N
2端
序列进行改造
,
实现了纳豆激酶成熟肽的高效表
达。罗立新等还成功构建了纳豆激酶基因重组酵
母菌
[36]
。
此外
,
有人通过改造与纳豆激酶极其相似的
枯草杆菌蛋白酶
E
的基因
,
从而改变该酶的分子
结构
,
以进一步提高其性能。
TakagiH
等
[37]
人采
用定点突变的方法
,
改变了酶活性中心
Asp
32
附近
的
Ile
31
,
使其酶活显著提高
,
催化效率是野生型的
2
～
6
倍。作为对照
,
他们在
Ile
31
位点引入了
8
种
不同的氨基酸残基
(
Cys
、
Ser
、
Thr
、
Gly
、
Ala
、
Val
、
Leu
、
Phe
)
,
结果发现只有
Val
31
和
Leu
31
突变株表
现出酶活力增加
,
其中
Leu
31
突变株的酶活力显著
增加
,
其他
6
种突变株的酶活力均明显下降。这
表明
,
在
31
位点的侧链氨基酸对枯草杆菌蛋白
酶
E
活力的表现是非常重要的
,
并且酶活力表现
的水平依赖于侧链基团的结构。后来
[38]
也是通
过定点突变的方法
,
改变了枯草杆菌蛋白酶
E
的
氨基酸组成
,
使
Gly
61
/Ser
98
变为
Cys
61
/Cys
98
,
引入
二硫键
,
使枯草杆菌蛋白酶
E
的半衰期提高了
2
～
3
倍
,
热稳定性提高了
4.5
℃。该方法可望应
用于纳豆激酶。
5
分子生物学研究
Nakamura
等
[5]
于
1992
年用鸟枪法首先在大
肠杆菌
(
)
宿主2载体系统中克隆得到了包
括调控序列在内的纳豆激酶基因
(
又称枯草杆菌
蛋白酶
NAT
基因
,aprN
)
的全长序列。该基因长
1473bp,
以
GTG
为起始密码子
,
其上游
-17bp
至
-11bp
位点为核糖体结合位点
S
2
D
序列
:
AAAGGAG
。
S
2
D
序列上游是
A/T
含量高达
72%
的转录调控区。起始密码子后是
1143bp
组成的开放阅读框架
(
ORF
)
,
编码共
381
个氨基
酸残基组成的多肽
,
其中包括
:29
个氨基酸残基
组成的信号肽
,77
个氨基酸残基组成的前肽和
275
个氨基酸残基组成的成熟肽—纳豆激酶。结
构基因的
3
′末端为连续的
3
个终止密码子
TAA,
TAG,TAA,
终止密码子之后位于成熟蛋白区域
C
6
开发现状及应用前景
纳豆激酶在日本已得到广泛深入的研究
,
其
制剂
NKCP
等已面市。在我国
,
纳豆激酶制剂—
恩开胶囊也已进入中试阶段
[39]
。由于使用不同
的纳豆菌发酵产生的纳豆激酶的量和活性有很大
差别
,
因而如何获得合适的菌株
,
并控制一定的条
件
,
使纳豆激酶占纤溶成分中的大部分甚至全部
,
2
期 程守强等
:
纳豆激酶的研究进展
73
对大规模生产是至关重要的
:
首先是菌种选育
,
有
意识地分离筛选纳豆激酶活力高的菌株
,
并进一
步诱变
,
或利用基因工程技术对其进行改造
;
其次
是改变进而优化培养条件
,
使菌株在最佳生长环
境中生长。很多学者已就此两方面进行了大量的
研究。
血栓栓塞性疾病是引起死亡的主要原因之
一
,
是现今仅次于癌症的第二大病症。目前常用
的及一些还在研制开发的溶栓药物如链激酶、尿
激酶、水蛭素
(
Hirudin
)
、
t
2
PA
等均在不同程度上
存在不足
[40]
[7]
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[J].
食品与
:
或是毒性比较强
,
易引起出血
,
副作
用大
;
或是在体内半衰期短
,
且不易被吸收
,
只能
静脉给药
,
药效难以发挥
;
或是来源紧缺
,
成本高
,
价格昂贵
,
很难成为
1
种大众药品
[41]
。而目前的
研究表明
,
纳豆激酶却可以很好地弥补这些缺陷
,
它分子量小
,
无免疫原性
,
安全无毒
,
药效高
,
作用
时间长
,
不仅能抑制血栓形成
,
而且溶栓作用强
,
并抗胰酶水解
,
在肠道内稳定性好
,
易被人体消化
吸收
[2,21]
,
因而既可以静脉给药
,
也可以口服。
同时纳豆激酶除可以直接作用于交联纤维蛋白
外
,
还可使机体自身纤溶酶系统活化
,
从而温和、
持续地提高血液的纤溶活性。此外
,
纳豆激酶可
以采用细菌发酵进行规模生产
,
周期短
,
产量高
,
且易于提取纯化
,
成本低廉。这些独特的优点无
疑将使其成为新一代理想的预防和治疗栓塞的生
化药物。
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