2024年3月28日发(作者：邸曼吟)
AGRIC,UNIV.（NaturalScienceEdition）
学报（自然科学版）
2022，42（2）
:
056
路媛媛，孙承龙，谭玉琴，等.玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析［J］.山西农业大学学报（自然科学版），2022，
42（2）：56-64.
LuYY，SunCL，TanYQ，utandbioinformaticsanalysisofVelBgeneinCercosporazeae-maydis［J］.Journalof
ShanxiAgriculturalUniversity（NaturalScienceEdition），2022，42（2）：56-64.
doi：10.13842/1671-8151.202111016
04097
玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
路媛媛
1
，孙承龙
2
，谭玉琴
1
，魏文杰
1
，史咸春
1
，宋艳波
1
，李丽
1
，刘振宇
3*
（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；
3.山西农业大学信息科学与工程学院，山西太谷030801）
摘要：［目的］通过对玉蜀黍尾孢菌VelB基因进行生物信息学分析并构建敲除载体，为研究CzVelB调控玉蜀黍尾孢
菌致病性的分子机制奠定基础。［方法］从JGI数据库中获得CzVelB基因序列，对其进行生物信息学分析，包括蛋白质
的性质、保守区域、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构域和聚类分析，分析其基因功能。并采用同源互补原理构建
CzVelB基因敲除载体，最终采用农杆菌介导遗传转化技术进行基因敲除。［结果］CzVelB基因编码385AA，预测pI和
MW分别为9.05和42.13645kDa，是亲水性蛋白，无跨膜结构域。在亚细胞水平上，CzVelB定位在细胞核中。在氨
基酸序列方面，具有多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位点；在功能上具有2个Velevt的保守结构域，并与As⁃
pergillusflavus、亲缘关系较近，具有较高同源性。根据CzVelB基因序列设计特异性引物，扩增侧翼片段和标
记基因，分别连入骨架载体pPZP100中，成功构建CzVelB基因的敲除载体，最终利用ATMT技术获得其敲除转化
子。［结论］本文系统研究玉蜀黍尾孢菌VelB基因功能，并成功构建其敲除载体，获得敲除转化子，为后续研究CzVelB
基因功能提供基础材料。
关键词：玉蜀黍尾孢菌；VelB；生物信息学；敲除载体；敲除突变体
中图分类号：S432.1文献标识码：A文章编号：1671-8151（2022）02-0056-09
玉米灰斑病是世界玉米种植区重要真菌性病
害之一，其病原菌为玉蜀黍尾孢菌（Cecrosporaze⁃
ae⁃maydisTehon&Daniels），属子囊菌门球腔菌
属真菌
［1］
。自1991年首次在我国辽宁丹东地区发
现该病害以来，玉米灰斑病菌在我国多次爆发流
行，近些年在东北地区大面积发生，危害程度达
3~5级，严重地块达7级，给玉米生产造成了惨重
损失
［2］
。随后在山东、吉林、云南等地区相继发生，
成为我国东北和西南玉米产区一种重要病害
［3］
。
病原菌致病性分化与变异是引起病害流行的
主导因素之一。对病原菌进行致病性研究发现，
病原菌侵染后显症速度不同，且出现的病斑类型
也存在明显差异。通过血清学和蛋白质组学研究
证明了病原菌存在分化现象
［4］
。对玉蜀黍尾孢菌
致病性的研究主要集中在尾孢毒素方面。长期以
来，致病学家和化学家研究内容主要集中在尾孢
毒素的分离、纯化
［5］
和化学结构鉴定
［6］
等方面。目
前对尾孢毒素的提取仍采用浓缩浸提法
［7］
，研究发
现该毒素对寄主保护酶及玉米胚根的生长有抑制
作用，对玉米胚根细胞膜具有伤害，且能够引起叶
片的电渗值发生变化
［8-10］
。但目前对该毒素的主
要成分仍有争议
［11-12］
。由上可知，对玉蜀黍尾孢菌
致病分子机理的研究较少。因此，尽快寻找发掘
相关致病基因对于摸清玉米灰斑病菌致病性分子
机理，以及玉米灰斑病的防治具有重要意义。
Velvet蛋白家族最早发现在模式真菌Asper⁃
gillusnidulans中
［13］
，是一类真菌特异的具有Vel⁃
vet结构域的蛋白。该家族含有VeA（Velvet），
VelB（VelvetlikeB），VosA（ViabilityofsporesA）
和VelC（VelvetlikeC），具有调控真菌次生代谢及
收稿日期：
2021⁃11⁃11
修回日期：
2022⁃01⁃12
基金项目：山西省高等学校科技创新项目（2020L0130）；山西农业大学科技创新基金项目（2018YJ30）
作者简介：路媛媛（1987-），女，副教授，博士，研究方向：病原真菌遗传学
刘振宇，教授，博士生导师，E-mail：**************
*
通信作者：
42（2）
路媛媛等：玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
57
生长和发育的作用。其中VelB是Velvet家族中
唯一包含2个Velvet结构域的成员
［14］
。近些年研
究结果表明，VelB可通过调控Cochliobolussati⁃
vus、Fusariumoxysporum、Curvularialunata等子
囊菌的次生代谢产物、孢子产生及子实体的形成，
最终调控致病性
［15-17］
。本课题组前期研究利用农
杆菌介导遗传转化技术，获得玉米灰斑病菌
PH6WC（强致病类型）突变体库，通过形态学和致
病性分析，从突变体库中获得一个产孢量下降，致
病力明显减弱的菌株，通过Tail-PCR分析，获得
T-DNA插入位点为VelB基因的启动子区域
［18］
。
因此，本文克隆玉蜀黍尾孢菌的CzVelB基因
序列，并进行生物信息学分析，研究CzVelB基因
与玉蜀黍尾孢菌致病性之间的关系。构建ATMT
敲除载体，获得敲除转化子，为研究CzVelB对玉
蜀黍尾孢菌致病性的分子机制奠定基础，同时也
为加快该重大植物病害的防控理论研究提供新的
思路和策略。
学生命科学学院保存，载体构建所需的pPZP100
和pCT74购买于武汉淼灵生物科技有限公司。
本文中所使用2×EsTaqMasterMix，所用试
剂盒及抗生素等试剂购于沈阳森宇生物科技有限
公司。
限制性内切酶、T4连接酶、PMD19-TVector
购于Takara生物技术有限公司。
1.2
1.2.1
试验方法
生物信息学分析
根据NCBI基因组数据库中Colletotrichum
graminicola中的VelB保守区序列，从JGI数据库
中Cecrosporazeae-maydis基因组中查询到相似度
较高的基因，采用DNAMAN软件对-may⁃
dis基因组中的VelB蛋白序列进行同源性比对分
析，最终确定其基因序列和拷贝数。根据所得到
的基因序列，利用多种生物信息学软件对CzVelB
基因的性质、结构及功能进行预测。
生物信息学分析软件如表1所示，分别对Cz⁃
VelB蛋白的氨基酸组成、理化性质、疏水性、跨膜
结构、磷酸化位点、亚细胞定位、保守结构域以及
信号肽进行分析。在NCBI数据库中Blast搜索其
他病原真菌VelB基因序列，使用MEGA5.0软
件，利用NJ法构建系统发育树，Bootstrap分析重
复数为1000。
1
1.1
材料和方法
试验菌株、载体及试剂
本试验所用的玉米灰斑病菌菌株Cz-1，大肠
杆菌菌株DH5α、农杆菌为EHA105由山西农业大
表1
Table1
软件/工具
Software/Tools
ProtScale（https：///protscale/）
Protparam（https：///cgi-bin/protparam/）
Genescan（http：///）
TMPRED（https：///resources/tmpred）
SignalP⁃4.1（http：///services/SignalP⁃4.1/）
NetPhos3.1（http：///services/NetPhos/）
WoLFPSORTPrediction（https：///）
NCBI（https：///Structure/cdd/）
生物信息学分析工具及网址
Bioinformaticsanalysistoolsandwebsites
分析
Analysis
疏水性分析
基础蛋白质理化性质
氨基酸组成分析
蛋白质跨膜区域
蛋白质信号肽
蛋白质磷酸位点
蛋白质亚细胞定位
蛋白保守结构域预测
1.2.2CzVelB侧翼序列的获得
合PCT74载体上标记基因序列和pPZP100骨架载
体序列，在特异性引物的5'端加入酶切位点，最后
利用高保真PCR技术获得侧翼序列。
引物如下，其中gcc为保护碱基，小写字母并
首先采用CTAB法
［19］
对玉米灰斑病菌进行基
因组DNA的提取。其次根据CzVelB序列，利用
DNAMAN和BioXM软件设计特异性引物，并结
58
山西农业大学学报（自然科学版）2022
带有下划线为酶切位点碱基。
CzVelB-5F-F1：gccgtcgacTGTGTACCC⁃
GACCTCAGTG
CzVelB-5F-F2：gcctctagaTTCCATAAATC⁃
GACCGTGAG
HphGFP-F：gcctctagaCAATTAACCCT⁃
CACTAAAGG
HphGFP-R：gccggtaccTAATACGACT⁃
CACTATAGGG
CzVelB-3R-R1：gccggtaccTCAACCTC⁃
GTCCGTCATTCG
CzVelB-3R-R2：gccgagctcAGGT⁃
GACAAATTAGGCGCTT
高保真PCR反应体系：DNA1.0μL，5×Phu⁃
sionHF10.0μL，dNTPmixture（10mM）1.0
μL，primer（10µM）2.5μL，最终ddH
2
O定容至
50.0μL。
PCR反应程序：98℃，30s；98℃，10s；Tm，30
s；72℃，30s共30个循环；72℃，10min；4℃，
保存。
1.2.3CzVelB敲除载体构建及验证
以野生菌Cz-1为模板，分别采用CzVelB-5F-
F1/CzVelB-5F-F2、CzVelB-3R-R1/CzVelB-3R-
R2和HphGFP-F/HphGFP-R扩增上游、下游和
标记基因片段，扩增产物连入pMD19-T载体，大
肠杆菌转化后，用质粒试剂盒提取质粒，酶切验
证。上游片段和pPZP100经SalⅠ和XbaⅠ酶切
后连入，构成重组质粒pPZP100CzVelB-5F。随后
用KpnⅠ和SacⅠ酶切下游片段和重组质粒
pPZP100CzVelB-5F，构成重组质粒pPZP100Cz⁃
VelB-5F3R，最后分别采用HindIIⅠ和KpnⅠ酶切
重组质粒pPZP100CzVelB-5F3R和标记基因片
段，形成敲除载体质粒pPZP100HphGFP-Cz⁃
VelB（图1）。
1.2.4CzVelB敲除突变体获得及验证
将上述构建好的敲除载体质粒pPZP100Hph⁃
GFP-CzVelB，利用冻融法转化到农杆菌感受态
EHA105细胞中
［18］
。将疑似含有敲除载体质粒
pPZP100HphGFP-CzVelB的农杆菌，置于28℃培
养至菌液浑浊，随后进行PCR验证。
通过农杆菌介导的方法，将含有敲除载体的
农杆菌转化到玉蜀黍尾孢菌基因组中，获得敲除
突变体
［19］
。将转化所得拟敲除突变株进行单胞分
离，继代培养后，取长势较好的疑似转化子接种在
250µg·mL
-1
头孢霉素、200µg·mL
-1
潮霉素的PDA
培养基中进行验证。随后提取疑似转化子DNA，
最终利用PCR的方法进行验证。
图1敲除载体pPZP100HphGFP-CzVelB
Fig.1DelectionvectorpPZP100HphGFP-CzVelB
2结果与分析
2.1CzVelB基因序列的获得
根据NCBI中Colletotrichumgraminicola中的
VelB保守区序列（XM_008095148.1），利用JGI数
据库中Cecrosporazeae-maydis基因组序列，分析
获得1个相似度高达95%的VelB基因，将该基因
定为CzVelB。该基因全长为1184bp。
2.2CzVelB生物信息学分析
2.2.1CzVelB的蛋白质组成及理化性质
利用DNAMAN对CzVelB编码的氨基酸组
成进行分析，结果表明该基因编码氨基酸为385
个，含有一个开放阅读框。蛋白序列如图2所示。
利用ProtParam对CzVelB编码的氨基酸进行
理化性质分析，结果表明该蛋白42.13645kDa，等
电点（PI）为9.05，正（Asp+Glu）/负（Arg+Lys）的
电荷残基数分别为31和26，分子式为C
1884
H
2887
N
519
O
561
S
11
，总原子数为5862，不稳定性指数值为58.27
（<40稳定；>40不稳定
［20］
），因此该蛋白属于不稳
定蛋白，脂肪指数为67.90，总平均亲水性是−
0.434，为亲水性蛋白。
2.2.2CzVelB蛋白的亲水性/疏水性分析
利用ProtScale对CzVelB蛋白亲/疏水性进行
42（2）
路媛媛等：玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
59
图2
Fig.2
CzVelB基因碱基序列及氨基酸序列
GeneandaminoacidsequenceofCzVelBgene
预测分析，结果如图3所示。CzVelB蛋白在第268
位氨基酸上得分为1.15，有最强疏水性；而在第12
位上亲水性最强，最低值为−2.10。玉米灰斑病
CzVelB蛋白的亲水性总平均值为−0.434，表明该
蛋白为亲水性蛋白。
2.2.3CzVelB蛋白跨膜结构域分析
利用TMPRED对CzVelB蛋白的跨膜结构域
进行预测分析（图4）。得分越高，则说明该蛋白质
位于某一部位的概率就越大。根据预测结果可知
该蛋白处于膜外，没有跨膜结构区。
2.2.4CzVelB蛋白磷酸化位点分析
磷酸化多数情况下是发生在丝氨酸（Serine，
Ser）、苏氨酸（Threoine，Thr）、酪氨酸（Tyrosine.
Tyr）等氨基酸的残基上。利用NetPhos3.1在线
软件在线分析CzVelB蛋白的磷酸化位点，结果如
图5所示。发现在该蛋白上存在有17个丝氨酸激
酶磷酸化位点（第21、44、146、149、157、158、169、
200、274、285、298、307、323、346、356、365、372位
60
山西农业大学学报（自然科学版）2022
122、137、280位氨基酸）以及7个酪氨酸激酶磷酸
化位点（第82、172、202、206、221、283和360位氨
基酸）。该结果说明，CzVelB能够被激酶磷酸化，
从而实现其功能的调控。
图3
Fig.3
CzVelB蛋白的疏水性和亲水性分析
Fig.5
HydrophobicandhydrophilicanalysisofCzVelB
图5CzVelB蛋白磷酸化位点分析
PhosphorylationsitesanalysisofCzVelB
2.2.5CzVelB蛋白的亚细胞定位
采用PSORT对玉米灰斑病CzVelB的亚细胞
定位进行预测，结果显示：CzVelB在细胞核（nucle⁃
ar）、细胞质（cytoplasmic）、线粒体（mitochondrial）、
过氧化物酶（peroxisome）、高尔基体（Golgiappara⁃
tus）的分布比例分别为15.5%、7.5%、2%、1%、
1%，说明CzVelB蛋白定位在细胞核中。
图4
Fig.4
CzVelB蛋白质跨膜结构域分析
TransmembraneanalysisofCzVelB
2.2.6CzVelB蛋白功能结构域
利用NCBI对CzVelB蛋白进行蛋白质结构域
分析（图6）。其氨基酸序列含有2个Velvet结构
域，具有Velvet蛋白的典型特征。
氨基酸）、5个苏氨酸激酶磷酸化位点（第97、111、
图6
Fig.6
CzVelB蛋白结构域分析
ConserveddomainanalysisofCzVelB
2.2.7CzVelB蛋白信号肽分析
nata等多种植物病原菌的VelB保守区序列，利用
MEGA5对CzVelB进行系统进化分析（图8）。A.
flavus、、Cecrosporazeae-maydis、Emeri⁃
cellanidulans聚为一类，Curvularialunata
、
Collet⁃
otrichumgraminicola和Cochliobolusheterostro⁃
phus聚为一类，其中Cecrosporazeae-maydis与A.
flavus、亲缘关系较近。CzVelB的同源性
分析进一步验证了该基因具有保守性。即推测出
的CzVelB功能与、的VelB基因
功能相似，参与调控玉蜀黍尾孢菌致病性。
利用软件SignalP-4.1预测玉米灰斑病Cz⁃
VelB编码蛋白信号肽。C-score、S-score、Y-score
分别代表着剪切位点的得分、信号肽的得分和综
合酶切位点的得分。信号肽预测结果计算方式为
以上3个值均为最大值的位点才是可信度最高的
信号肽剪切位点，由图7可知得出该蛋白不存在信
号肽位点，目前可以推测该蛋白为非分泌蛋白。
2.2.8CzVelB系统进化分析
结合GenBank和JGI数据库中Curvularialu⁃
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路媛媛等：玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
61
农杆菌菌株中。
2.5CzVelB敲除突变体获得及验证
经含有250µg·mL
-1
头孢霉素、200µg·mL
-1
潮
霉素的PDA抗性培养基筛选获得敲除突变体（图
12）。并根据玉蜀黍尾孢菌VelB基因载体构建过
程中设计的特异性引物，对ΔCzVelB进行PCR验
证。利用CzVelB-5F-F1/CzVelB-3R-R2引物，
以野生型菌株Cz-1基因组为模板，扩增出的全长
片段大小为616bp，突变体扩增出片段大小为
3196bp；利用CzVelB-5F-F1/HphGFP-R引物，
以野生型菌株Cz-1基因组为模板为扩增出条带，
图7
Fig.7
CzVelB蛋白的信号肽分析
ThesignalPeptidegraphanalysisofCzVelB
但突变体扩增出2915bp大小的片段，与预期大小
一致（图13），证明获得了CzVelB的敲除突变体。
2.3CzVelB敲除载体构建及验证
根据CzVelB基因序列设计特异性引物，分别
3讨论与结论
本文采用生物信息学手段分析CzVelB蛋白
扩增上游片段315bp和下游片段281bp（图9-A，
B）。利用HphGFP-F/HphGFP-R扩增出带有
HPH和GFP的标记基因片段2600bp（图9-C）。
利用HindIIⅠ和KpnⅠ验证标，2条片段大小
分别为2915bp和6917bp，说明载体构建成功
（图10）。
2.4农杆菌转化验证
将疑似含有敲除载体质粒pPZP100HphGFP-
CzVelB的农杆菌进行PCR验证，分别利用Cz⁃
VelB-5F-F1/CzVelB-5F-F2、CzVelB-3R-R1/
CzVelB-3R-R2和HphGFP-F/HphGFP-R对农
杆菌进行菌落PCR，最终分别获得315、281和
2600bp大小的目标片段（图11）。以上结果表明
pPZP100HphGFP-CzVelB敲除载体已成功转入
保守结构域表明，其氨基酸序列含有2个VelB蛋
白的保守结构域-Velvet结构域，具有Velvet蛋白
的典型特征。已有研究表明，Aspergillusnidu⁃
lans、Fusariumoxysporum、Aspergillusflavus等真
菌的VelB蛋白均存在Velvet结构域，且结构域保
21］
守
［16，
。通过结合系统发育树进一步分析，⁃
ae-maydis与、亲缘关系较近。
因此，玉蜀黍尾孢菌具有典型的VelB蛋白功能。
另外，针对CzVelB蛋白理化性质、亲水性、疏
水性等分析，结果表明该蛋白为亲水性蛋白，无跨
膜结构区，这与Ustilagomaydis和Cochliobolus
heterostrophus的分析结果相一致
［22-23］
。
亚细胞定位结果表明，在分析玉米大斑病菌
GU815258.1|Aspergillus_flavus|CA14
XM001389016.2|Aspergillus_niger|CBS_513.88
Cercospora_zeae-maydis|Cz-1
EF540815.1|Emericella_nidulans
KY435512.1|Curvularia_lunata|CX-3
XM008095148.1|Colletotrichum_graminicola|M1.001
XM035481109.1|Colletotrichum_scovillei
JF826791.1|Cochliobolus_heterostrophus
图8
Fig.8
CzVelB与其他病原菌的系统进化分析
EvolutionaryanalysisofCzVelBaminoacidsystem
62
山西农业大学学报（自然科学版）2022
图A中M泳道为2kbDNAMarker，1泳道为上游片段，2泳道为
ddH
2
O；图B中M泳道为2kbDNAMarker，1泳道为下游片段，2泳道为
ddH
2
O；图C中M泳道为5kbDNAMarker，1泳道为ddH
2
O，2泳道为标记
基因片段
A：M，2kbDNAMarker，1，CzVelB⁃5F，2，ddH
2
O；B：M，2kb
DNAMarker，1，CzVelB⁃3R，2，ddH
2
O；C：A：M，5kbDNAMarker，1，
ddH
2
O，2，HphGFP
图9CzVelB侧翼序列和标记基因获得
Fig.9FlankingsequenceofCzVelBandHphGFPsequence
M泳道为10kbDNAMarker，1，2泳道为HindIIⅠ和KpnⅠ酶切
pPZP100HphGFP⁃CzVelB
M，10kbDNAMarker，1，2pPZP100HphGFP⁃CzVelBdigestedby
HindIIⅠ和KpnⅠ
图10pPZP100HphGFP-CzVelB载体验证
Fig.10ConfirmationpPZP100HphGFP-CzVelBbydigested
VelB蛋白时发现，该蛋白位于细胞质中，因此可能
需要从细胞质中转运至细胞核中，进而发挥作
用
［24］
。但本文分析CzVelB蛋白位于细胞核中，且
不存在信号肽，这与杨峥的研究结果不一致。针
对蛋白磷酸化结果分析，均发现CzVelB蛋白存在
大量的磷酸化位点，能被激酶磷酸化，从而实现其
功能的调控。因此推测CzVelB蛋白参与调控玉
蜀黍尾孢菌刺激代谢途径。
国内外研究表明，ATMT技术是目前丝状真
菌遗传转化最常用的手段，因此获得目标基因的
敲除突变体为后续研究该基因的功能奠定基础。
M泳道为10kbDNAMarker，1，3，5泳道为ddH
2
O，2泳道为上游片段，
4泳道为下游片段，6泳道为标记基因片段
M，10kbDNAMarker，1，3，5，ddH
2
O，2，CzVelB⁃5F，4，CzVelB⁃
3R，6，HphGFP
图11PCR验证敲除载体pPZP100HphGFP-CzVelB转入农杆菌
Fig.11PCRverificationoftransformationofpPZP100HphGFP-
CzVelBintoAgrobacterium
A：野生型，B：突变体
A：Cz⁃1，B：ΔCzVelB
图12菌落形态
Fig.12Stainmorphology
M泳道为10kbDNAMarker，1，4泳道为ddH
2
O，2，5泳道为野生型，3，
6泳道为突变体
M，10kbDNAMarker，1，4，ddH
2
O，2，5，Cz⁃1，3.6，ΔCzVelB
图13PCR验证敲除突变体
Fig.13PCRidentificationofΔCzVelB
本文根据玉蜀黍尾孢菌的VelB基因序列，设计特
异性引物，扩增出侧翼片段和标记基因片段，并成
功连入骨架载体中，构建CzVelB基因的敲除载体
42（2）
路媛媛等：玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
63
pPZP100HphGFP-CzVelB，最终利用ATMT技术
获得ΔCzVelB
，
为进一步研究该基因的功能分析
提供基础材料。
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LuYuanyuan
1
，SunChenglong
2
，TanYuqin
1
，WeiWenjie
1
，ShiXianchun
1
，SongYanbo
1
，LiLi
1
，Liu
Zhenyu
3*
（eofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；eofHorticulture，ShanxiAgri⁃
culturalUniversity，Taigu030801，China；eofInformationScienceandEngineer，ShanxiAgriculturalUniversity，
Taigu030801，China）
Abstract：［Objective］ThestudywasaimedtoanalyzethebioinformationofVelBofCercosporazeae-maydisandconstructthe
deletionvector，toenrichthestudyonthemolecularmechanismofCzVelBregulatingpathogenesis.［Methods］CzVelBgene
wasfoundinJGIdatabaseandbioinformaticsanalysiswasperformed，includingproteinproperties，conservedregions，phos⁃
phorylationsites，subcellularlocalization，，Cz⁃
y，ATMTmethodwasusedforgene
knockout.［Results］BioinformaticsanalysisshowedthatCzVelBencodes385AA，thetheoreticalisoelectricpointpIvalue
andmolecularweightwere9.05and42.13645kDa，wasahydrophilicmemberproteinwithnotrans⁃
ubcellularlevel，anoneoftheserine，threonineandtym⁃
sinekinunctionalstructure，CzVelBprotein
containedtwotypicalconservedVelvetfunctionaldomain，⁃
cificprimersweredesignedaccordingtotheCzVelBgenesequence；Theflankingfragmentsandmarkergenes
ckoutvectorofCzVelBgenewassuccessfully
constructed，andtheknockouttransformantwasobtainedbyATMTtechnology.［Conclusion］Inthisstudy，thefunctionof
CzVelBgenewassystematicallyinvestigated；itsdeletionvectorwassuccessfullyconstructedandthemutantstrainwereob⁃
ebasisforthesubsequentstudyofCzVelBgenefunction.
Keywords：Cercosporazeae-maydis，VelB，Bioinformatic，Deletionvector，ΔCzVelB
2024年3月28日发(作者：邸曼吟)
AGRIC,UNIV.（NaturalScienceEdition）
学报（自然科学版）
2022，42（2）
:
056
路媛媛，孙承龙，谭玉琴，等.玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析［J］.山西农业大学学报（自然科学版），2022，
42（2）：56-64.
LuYY，SunCL，TanYQ，utandbioinformaticsanalysisofVelBgeneinCercosporazeae-maydis［J］.Journalof
ShanxiAgriculturalUniversity（NaturalScienceEdition），2022，42（2）：56-64.
doi：10.13842/1671-8151.202111016
04097
玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
路媛媛
1
，孙承龙
2
，谭玉琴
1
，魏文杰
1
，史咸春
1
，宋艳波
1
，李丽
1
，刘振宇
3*
（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；
3.山西农业大学信息科学与工程学院，山西太谷030801）
摘要：［目的］通过对玉蜀黍尾孢菌VelB基因进行生物信息学分析并构建敲除载体，为研究CzVelB调控玉蜀黍尾孢
菌致病性的分子机制奠定基础。［方法］从JGI数据库中获得CzVelB基因序列，对其进行生物信息学分析，包括蛋白质
的性质、保守区域、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构域和聚类分析，分析其基因功能。并采用同源互补原理构建
CzVelB基因敲除载体，最终采用农杆菌介导遗传转化技术进行基因敲除。［结果］CzVelB基因编码385AA，预测pI和
MW分别为9.05和42.13645kDa，是亲水性蛋白，无跨膜结构域。在亚细胞水平上，CzVelB定位在细胞核中。在氨
基酸序列方面，具有多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位点；在功能上具有2个Velevt的保守结构域，并与As⁃
pergillusflavus、亲缘关系较近，具有较高同源性。根据CzVelB基因序列设计特异性引物，扩增侧翼片段和标
记基因，分别连入骨架载体pPZP100中，成功构建CzVelB基因的敲除载体，最终利用ATMT技术获得其敲除转化
子。［结论］本文系统研究玉蜀黍尾孢菌VelB基因功能，并成功构建其敲除载体，获得敲除转化子，为后续研究CzVelB
基因功能提供基础材料。
关键词：玉蜀黍尾孢菌；VelB；生物信息学；敲除载体；敲除突变体
中图分类号：S432.1文献标识码：A文章编号：1671-8151（2022）02-0056-09
玉米灰斑病是世界玉米种植区重要真菌性病
害之一，其病原菌为玉蜀黍尾孢菌（Cecrosporaze⁃
ae⁃maydisTehon&Daniels），属子囊菌门球腔菌
属真菌
［1］
。自1991年首次在我国辽宁丹东地区发
现该病害以来，玉米灰斑病菌在我国多次爆发流
行，近些年在东北地区大面积发生，危害程度达
3~5级，严重地块达7级，给玉米生产造成了惨重
损失
［2］
。随后在山东、吉林、云南等地区相继发生，
成为我国东北和西南玉米产区一种重要病害
［3］
。
病原菌致病性分化与变异是引起病害流行的
主导因素之一。对病原菌进行致病性研究发现，
病原菌侵染后显症速度不同，且出现的病斑类型
也存在明显差异。通过血清学和蛋白质组学研究
证明了病原菌存在分化现象
［4］
。对玉蜀黍尾孢菌
致病性的研究主要集中在尾孢毒素方面。长期以
来，致病学家和化学家研究内容主要集中在尾孢
毒素的分离、纯化
［5］
和化学结构鉴定
［6］
等方面。目
前对尾孢毒素的提取仍采用浓缩浸提法
［7］
，研究发
现该毒素对寄主保护酶及玉米胚根的生长有抑制
作用，对玉米胚根细胞膜具有伤害，且能够引起叶
片的电渗值发生变化
［8-10］
。但目前对该毒素的主
要成分仍有争议
［11-12］
。由上可知，对玉蜀黍尾孢菌
致病分子机理的研究较少。因此，尽快寻找发掘
相关致病基因对于摸清玉米灰斑病菌致病性分子
机理，以及玉米灰斑病的防治具有重要意义。
Velvet蛋白家族最早发现在模式真菌Asper⁃
gillusnidulans中
［13］
，是一类真菌特异的具有Vel⁃
vet结构域的蛋白。该家族含有VeA（Velvet），
VelB（VelvetlikeB），VosA（ViabilityofsporesA）
和VelC（VelvetlikeC），具有调控真菌次生代谢及
收稿日期：
2021⁃11⁃11
修回日期：
2022⁃01⁃12
基金项目：山西省高等学校科技创新项目（2020L0130）；山西农业大学科技创新基金项目（2018YJ30）
作者简介：路媛媛（1987-），女，副教授，博士，研究方向：病原真菌遗传学
刘振宇，教授，博士生导师，E-mail：**************
*
通信作者：
42（2）
路媛媛等：玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
57
生长和发育的作用。其中VelB是Velvet家族中
唯一包含2个Velvet结构域的成员
［14］
。近些年研
究结果表明，VelB可通过调控Cochliobolussati⁃
vus、Fusariumoxysporum、Curvularialunata等子
囊菌的次生代谢产物、孢子产生及子实体的形成，
最终调控致病性
［15-17］
。本课题组前期研究利用农
杆菌介导遗传转化技术，获得玉米灰斑病菌
PH6WC（强致病类型）突变体库，通过形态学和致
病性分析，从突变体库中获得一个产孢量下降，致
病力明显减弱的菌株，通过Tail-PCR分析，获得
T-DNA插入位点为VelB基因的启动子区域
［18］
。
因此，本文克隆玉蜀黍尾孢菌的CzVelB基因
序列，并进行生物信息学分析，研究CzVelB基因
与玉蜀黍尾孢菌致病性之间的关系。构建ATMT
敲除载体，获得敲除转化子，为研究CzVelB对玉
蜀黍尾孢菌致病性的分子机制奠定基础，同时也
为加快该重大植物病害的防控理论研究提供新的
思路和策略。
学生命科学学院保存，载体构建所需的pPZP100
和pCT74购买于武汉淼灵生物科技有限公司。
本文中所使用2×EsTaqMasterMix，所用试
剂盒及抗生素等试剂购于沈阳森宇生物科技有限
公司。
限制性内切酶、T4连接酶、PMD19-TVector
购于Takara生物技术有限公司。
1.2
1.2.1
试验方法
生物信息学分析
根据NCBI基因组数据库中Colletotrichum
graminicola中的VelB保守区序列，从JGI数据库
中Cecrosporazeae-maydis基因组中查询到相似度
较高的基因，采用DNAMAN软件对-may⁃
dis基因组中的VelB蛋白序列进行同源性比对分
析，最终确定其基因序列和拷贝数。根据所得到
的基因序列，利用多种生物信息学软件对CzVelB
基因的性质、结构及功能进行预测。
生物信息学分析软件如表1所示，分别对Cz⁃
VelB蛋白的氨基酸组成、理化性质、疏水性、跨膜
结构、磷酸化位点、亚细胞定位、保守结构域以及
信号肽进行分析。在NCBI数据库中Blast搜索其
他病原真菌VelB基因序列，使用MEGA5.0软
件，利用NJ法构建系统发育树，Bootstrap分析重
复数为1000。
1
1.1
材料和方法
试验菌株、载体及试剂
本试验所用的玉米灰斑病菌菌株Cz-1，大肠
杆菌菌株DH5α、农杆菌为EHA105由山西农业大
表1
Table1
软件/工具
Software/Tools
ProtScale（https：///protscale/）
Protparam（https：///cgi-bin/protparam/）
Genescan（http：///）
TMPRED（https：///resources/tmpred）
SignalP⁃4.1（http：///services/SignalP⁃4.1/）
NetPhos3.1（http：///services/NetPhos/）
WoLFPSORTPrediction（https：///）
NCBI（https：///Structure/cdd/）
生物信息学分析工具及网址
Bioinformaticsanalysistoolsandwebsites
分析
Analysis
疏水性分析
基础蛋白质理化性质
氨基酸组成分析
蛋白质跨膜区域
蛋白质信号肽
蛋白质磷酸位点
蛋白质亚细胞定位
蛋白保守结构域预测
1.2.2CzVelB侧翼序列的获得
合PCT74载体上标记基因序列和pPZP100骨架载
体序列，在特异性引物的5'端加入酶切位点，最后
利用高保真PCR技术获得侧翼序列。
引物如下，其中gcc为保护碱基，小写字母并
首先采用CTAB法
［19］
对玉米灰斑病菌进行基
因组DNA的提取。其次根据CzVelB序列，利用
DNAMAN和BioXM软件设计特异性引物，并结
58
山西农业大学学报（自然科学版）2022
带有下划线为酶切位点碱基。
CzVelB-5F-F1：gccgtcgacTGTGTACCC⁃
GACCTCAGTG
CzVelB-5F-F2：gcctctagaTTCCATAAATC⁃
GACCGTGAG
HphGFP-F：gcctctagaCAATTAACCCT⁃
CACTAAAGG
HphGFP-R：gccggtaccTAATACGACT⁃
CACTATAGGG
CzVelB-3R-R1：gccggtaccTCAACCTC⁃
GTCCGTCATTCG
CzVelB-3R-R2：gccgagctcAGGT⁃
GACAAATTAGGCGCTT
高保真PCR反应体系：DNA1.0μL，5×Phu⁃
sionHF10.0μL，dNTPmixture（10mM）1.0
μL，primer（10µM）2.5μL，最终ddH
2
O定容至
50.0μL。
PCR反应程序：98℃，30s；98℃，10s；Tm，30
s；72℃，30s共30个循环；72℃，10min；4℃，
保存。
1.2.3CzVelB敲除载体构建及验证
以野生菌Cz-1为模板，分别采用CzVelB-5F-
F1/CzVelB-5F-F2、CzVelB-3R-R1/CzVelB-3R-
R2和HphGFP-F/HphGFP-R扩增上游、下游和
标记基因片段，扩增产物连入pMD19-T载体，大
肠杆菌转化后，用质粒试剂盒提取质粒，酶切验
证。上游片段和pPZP100经SalⅠ和XbaⅠ酶切
后连入，构成重组质粒pPZP100CzVelB-5F。随后
用KpnⅠ和SacⅠ酶切下游片段和重组质粒
pPZP100CzVelB-5F，构成重组质粒pPZP100Cz⁃
VelB-5F3R，最后分别采用HindIIⅠ和KpnⅠ酶切
重组质粒pPZP100CzVelB-5F3R和标记基因片
段，形成敲除载体质粒pPZP100HphGFP-Cz⁃
VelB（图1）。
1.2.4CzVelB敲除突变体获得及验证
将上述构建好的敲除载体质粒pPZP100Hph⁃
GFP-CzVelB，利用冻融法转化到农杆菌感受态
EHA105细胞中
［18］
。将疑似含有敲除载体质粒
pPZP100HphGFP-CzVelB的农杆菌，置于28℃培
养至菌液浑浊，随后进行PCR验证。
通过农杆菌介导的方法，将含有敲除载体的
农杆菌转化到玉蜀黍尾孢菌基因组中，获得敲除
突变体
［19］
。将转化所得拟敲除突变株进行单胞分
离，继代培养后，取长势较好的疑似转化子接种在
250µg·mL
-1
头孢霉素、200µg·mL
-1
潮霉素的PDA
培养基中进行验证。随后提取疑似转化子DNA，
最终利用PCR的方法进行验证。
图1敲除载体pPZP100HphGFP-CzVelB
Fig.1DelectionvectorpPZP100HphGFP-CzVelB
2结果与分析
2.1CzVelB基因序列的获得
根据NCBI中Colletotrichumgraminicola中的
VelB保守区序列（XM_008095148.1），利用JGI数
据库中Cecrosporazeae-maydis基因组序列，分析
获得1个相似度高达95%的VelB基因，将该基因
定为CzVelB。该基因全长为1184bp。
2.2CzVelB生物信息学分析
2.2.1CzVelB的蛋白质组成及理化性质
利用DNAMAN对CzVelB编码的氨基酸组
成进行分析，结果表明该基因编码氨基酸为385
个，含有一个开放阅读框。蛋白序列如图2所示。
利用ProtParam对CzVelB编码的氨基酸进行
理化性质分析，结果表明该蛋白42.13645kDa，等
电点（PI）为9.05，正（Asp+Glu）/负（Arg+Lys）的
电荷残基数分别为31和26，分子式为C
1884
H
2887
N
519
O
561
S
11
，总原子数为5862，不稳定性指数值为58.27
（<40稳定；>40不稳定
［20］
），因此该蛋白属于不稳
定蛋白，脂肪指数为67.90，总平均亲水性是−
0.434，为亲水性蛋白。
2.2.2CzVelB蛋白的亲水性/疏水性分析
利用ProtScale对CzVelB蛋白亲/疏水性进行
42（2）
路媛媛等：玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
59
图2
Fig.2
CzVelB基因碱基序列及氨基酸序列
GeneandaminoacidsequenceofCzVelBgene
预测分析，结果如图3所示。CzVelB蛋白在第268
位氨基酸上得分为1.15，有最强疏水性；而在第12
位上亲水性最强，最低值为−2.10。玉米灰斑病
CzVelB蛋白的亲水性总平均值为−0.434，表明该
蛋白为亲水性蛋白。
2.2.3CzVelB蛋白跨膜结构域分析
利用TMPRED对CzVelB蛋白的跨膜结构域
进行预测分析（图4）。得分越高，则说明该蛋白质
位于某一部位的概率就越大。根据预测结果可知
该蛋白处于膜外，没有跨膜结构区。
2.2.4CzVelB蛋白磷酸化位点分析
磷酸化多数情况下是发生在丝氨酸（Serine，
Ser）、苏氨酸（Threoine，Thr）、酪氨酸（Tyrosine.
Tyr）等氨基酸的残基上。利用NetPhos3.1在线
软件在线分析CzVelB蛋白的磷酸化位点，结果如
图5所示。发现在该蛋白上存在有17个丝氨酸激
酶磷酸化位点（第21、44、146、149、157、158、169、
200、274、285、298、307、323、346、356、365、372位
60
山西农业大学学报（自然科学版）2022
122、137、280位氨基酸）以及7个酪氨酸激酶磷酸
化位点（第82、172、202、206、221、283和360位氨
基酸）。该结果说明，CzVelB能够被激酶磷酸化，
从而实现其功能的调控。
图3
Fig.3
CzVelB蛋白的疏水性和亲水性分析
Fig.5
HydrophobicandhydrophilicanalysisofCzVelB
图5CzVelB蛋白磷酸化位点分析
PhosphorylationsitesanalysisofCzVelB
2.2.5CzVelB蛋白的亚细胞定位
采用PSORT对玉米灰斑病CzVelB的亚细胞
定位进行预测，结果显示：CzVelB在细胞核（nucle⁃
ar）、细胞质（cytoplasmic）、线粒体（mitochondrial）、
过氧化物酶（peroxisome）、高尔基体（Golgiappara⁃
tus）的分布比例分别为15.5%、7.5%、2%、1%、
1%，说明CzVelB蛋白定位在细胞核中。
图4
Fig.4
CzVelB蛋白质跨膜结构域分析
TransmembraneanalysisofCzVelB
2.2.6CzVelB蛋白功能结构域
利用NCBI对CzVelB蛋白进行蛋白质结构域
分析（图6）。其氨基酸序列含有2个Velvet结构
域，具有Velvet蛋白的典型特征。
氨基酸）、5个苏氨酸激酶磷酸化位点（第97、111、
图6
Fig.6
CzVelB蛋白结构域分析
ConserveddomainanalysisofCzVelB
2.2.7CzVelB蛋白信号肽分析
nata等多种植物病原菌的VelB保守区序列，利用
MEGA5对CzVelB进行系统进化分析（图8）。A.
flavus、、Cecrosporazeae-maydis、Emeri⁃
cellanidulans聚为一类，Curvularialunata
、
Collet⁃
otrichumgraminicola和Cochliobolusheterostro⁃
phus聚为一类，其中Cecrosporazeae-maydis与A.
flavus、亲缘关系较近。CzVelB的同源性
分析进一步验证了该基因具有保守性。即推测出
的CzVelB功能与、的VelB基因
功能相似，参与调控玉蜀黍尾孢菌致病性。
利用软件SignalP-4.1预测玉米灰斑病Cz⁃
VelB编码蛋白信号肽。C-score、S-score、Y-score
分别代表着剪切位点的得分、信号肽的得分和综
合酶切位点的得分。信号肽预测结果计算方式为
以上3个值均为最大值的位点才是可信度最高的
信号肽剪切位点，由图7可知得出该蛋白不存在信
号肽位点，目前可以推测该蛋白为非分泌蛋白。
2.2.8CzVelB系统进化分析
结合GenBank和JGI数据库中Curvularialu⁃
42（2）
路媛媛等：玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
61
农杆菌菌株中。
2.5CzVelB敲除突变体获得及验证
经含有250µg·mL
-1
头孢霉素、200µg·mL
-1
潮
霉素的PDA抗性培养基筛选获得敲除突变体（图
12）。并根据玉蜀黍尾孢菌VelB基因载体构建过
程中设计的特异性引物，对ΔCzVelB进行PCR验
证。利用CzVelB-5F-F1/CzVelB-3R-R2引物，
以野生型菌株Cz-1基因组为模板，扩增出的全长
片段大小为616bp，突变体扩增出片段大小为
3196bp；利用CzVelB-5F-F1/HphGFP-R引物，
以野生型菌株Cz-1基因组为模板为扩增出条带，
图7
Fig.7
CzVelB蛋白的信号肽分析
ThesignalPeptidegraphanalysisofCzVelB
但突变体扩增出2915bp大小的片段，与预期大小
一致（图13），证明获得了CzVelB的敲除突变体。
2.3CzVelB敲除载体构建及验证
根据CzVelB基因序列设计特异性引物，分别
3讨论与结论
本文采用生物信息学手段分析CzVelB蛋白
扩增上游片段315bp和下游片段281bp（图9-A，
B）。利用HphGFP-F/HphGFP-R扩增出带有
HPH和GFP的标记基因片段2600bp（图9-C）。
利用HindIIⅠ和KpnⅠ验证标，2条片段大小
分别为2915bp和6917bp，说明载体构建成功
（图10）。
2.4农杆菌转化验证
将疑似含有敲除载体质粒pPZP100HphGFP-
CzVelB的农杆菌进行PCR验证，分别利用Cz⁃
VelB-5F-F1/CzVelB-5F-F2、CzVelB-3R-R1/
CzVelB-3R-R2和HphGFP-F/HphGFP-R对农
杆菌进行菌落PCR，最终分别获得315、281和
2600bp大小的目标片段（图11）。以上结果表明
pPZP100HphGFP-CzVelB敲除载体已成功转入
保守结构域表明，其氨基酸序列含有2个VelB蛋
白的保守结构域-Velvet结构域，具有Velvet蛋白
的典型特征。已有研究表明，Aspergillusnidu⁃
lans、Fusariumoxysporum、Aspergillusflavus等真
菌的VelB蛋白均存在Velvet结构域，且结构域保
21］
守
［16，
。通过结合系统发育树进一步分析，⁃
ae-maydis与、亲缘关系较近。
因此，玉蜀黍尾孢菌具有典型的VelB蛋白功能。
另外，针对CzVelB蛋白理化性质、亲水性、疏
水性等分析，结果表明该蛋白为亲水性蛋白，无跨
膜结构区，这与Ustilagomaydis和Cochliobolus
heterostrophus的分析结果相一致
［22-23］
。
亚细胞定位结果表明，在分析玉米大斑病菌
GU815258.1|Aspergillus_flavus|CA14
XM001389016.2|Aspergillus_niger|CBS_513.88
Cercospora_zeae-maydis|Cz-1
EF540815.1|Emericella_nidulans
KY435512.1|Curvularia_lunata|CX-3
XM008095148.1|Colletotrichum_graminicola|M1.001
XM035481109.1|Colletotrichum_scovillei
JF826791.1|Cochliobolus_heterostrophus
图8
Fig.8
CzVelB与其他病原菌的系统进化分析
EvolutionaryanalysisofCzVelBaminoacidsystem
62
山西农业大学学报（自然科学版）2022
图A中M泳道为2kbDNAMarker，1泳道为上游片段，2泳道为
ddH
2
O；图B中M泳道为2kbDNAMarker，1泳道为下游片段，2泳道为
ddH
2
O；图C中M泳道为5kbDNAMarker，1泳道为ddH
2
O，2泳道为标记
基因片段
A：M，2kbDNAMarker，1，CzVelB⁃5F，2，ddH
2
O；B：M，2kb
DNAMarker，1，CzVelB⁃3R，2，ddH
2
O；C：A：M，5kbDNAMarker，1，
ddH
2
O，2，HphGFP
图9CzVelB侧翼序列和标记基因获得
Fig.9FlankingsequenceofCzVelBandHphGFPsequence
M泳道为10kbDNAMarker，1，2泳道为HindIIⅠ和KpnⅠ酶切
pPZP100HphGFP⁃CzVelB
M，10kbDNAMarker，1，2pPZP100HphGFP⁃CzVelBdigestedby
HindIIⅠ和KpnⅠ
图10pPZP100HphGFP-CzVelB载体验证
Fig.10ConfirmationpPZP100HphGFP-CzVelBbydigested
VelB蛋白时发现，该蛋白位于细胞质中，因此可能
需要从细胞质中转运至细胞核中，进而发挥作
用
［24］
。但本文分析CzVelB蛋白位于细胞核中，且
不存在信号肽，这与杨峥的研究结果不一致。针
对蛋白磷酸化结果分析，均发现CzVelB蛋白存在
大量的磷酸化位点，能被激酶磷酸化，从而实现其
功能的调控。因此推测CzVelB蛋白参与调控玉
蜀黍尾孢菌刺激代谢途径。
国内外研究表明，ATMT技术是目前丝状真
菌遗传转化最常用的手段，因此获得目标基因的
敲除突变体为后续研究该基因的功能奠定基础。
M泳道为10kbDNAMarker，1，3，5泳道为ddH
2
O，2泳道为上游片段，
4泳道为下游片段，6泳道为标记基因片段
M，10kbDNAMarker，1，3，5，ddH
2
O，2，CzVelB⁃5F，4，CzVelB⁃
3R，6，HphGFP
图11PCR验证敲除载体pPZP100HphGFP-CzVelB转入农杆菌
Fig.11PCRverificationoftransformationofpPZP100HphGFP-
CzVelBintoAgrobacterium
A：野生型，B：突变体
A：Cz⁃1，B：ΔCzVelB
图12菌落形态
Fig.12Stainmorphology
M泳道为10kbDNAMarker，1，4泳道为ddH
2
O，2，5泳道为野生型，3，
6泳道为突变体
M，10kbDNAMarker，1，4，ddH
2
O，2，5，Cz⁃1，3.6，ΔCzVelB
图13PCR验证敲除突变体
Fig.13PCRidentificationofΔCzVelB
本文根据玉蜀黍尾孢菌的VelB基因序列，设计特
异性引物，扩增出侧翼片段和标记基因片段，并成
功连入骨架载体中，构建CzVelB基因的敲除载体
42（2）
路媛媛等：玉蜀黍尾孢菌VelB基因敲除及生物信息学分析
63
pPZP100HphGFP-CzVelB，最终利用ATMT技术
获得ΔCzVelB
，
为进一步研究该基因的功能分析
提供基础材料。
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LuYuanyuan
1
，SunChenglong
2
，TanYuqin
1
，WeiWenjie
1
，ShiXianchun
1
，SongYanbo
1
，LiLi
1
，Liu
Zhenyu
3*
（eofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；eofHorticulture，ShanxiAgri⁃
culturalUniversity，Taigu030801，China；eofInformationScienceandEngineer，ShanxiAgriculturalUniversity，
Taigu030801，China）
Abstract：［Objective］ThestudywasaimedtoanalyzethebioinformationofVelBofCercosporazeae-maydisandconstructthe
deletionvector，toenrichthestudyonthemolecularmechanismofCzVelBregulatingpathogenesis.［Methods］CzVelBgene
wasfoundinJGIdatabaseandbioinformaticsanalysiswasperformed，includingproteinproperties，conservedregions，phos⁃
phorylationsites，subcellularlocalization，，Cz⁃
y，ATMTmethodwasusedforgene
knockout.［Results］BioinformaticsanalysisshowedthatCzVelBencodes385AA，thetheoreticalisoelectricpointpIvalue
andmolecularweightwere9.05and42.13645kDa，wasahydrophilicmemberproteinwithnotrans⁃
ubcellularlevel，anoneoftheserine，threonineandtym⁃
sinekinunctionalstructure，CzVelBprotein
containedtwotypicalconservedVelvetfunctionaldomain，⁃
cificprimersweredesignedaccordingtotheCzVelBgenesequence；Theflankingfragmentsandmarkergenes
ckoutvectorofCzVelBgenewassuccessfully
constructed，andtheknockouttransformantwasobtainedbyATMTtechnology.［Conclusion］Inthisstudy，thefunctionof
CzVelBgenewassystematicallyinvestigated；itsdeletionvectorwassuccessfullyconstructedandthemutantstrainwereob⁃
ebasisforthesubsequentstudyofCzVelBgenefunction.
Keywords：Cercosporazeae-maydis，VelB，Bioinformatic，Deletionvector，ΔCzVelB