2024年10月20日发(作者：窦任真)
摘要
启动子是基因表达调控重要的元件，启动子的活性间接反映了它所控制的基
因表达。组织特异性启动子作为启动子的一种，可以启动外源基因在受体植物的
特定组织器官中高效表达，减少不必要的浪费。
WRKY
基因家族是在植物中起特
异作用的一类转录调控因子，它被证明了参与植物的抗病反应，还影响植物的衰
老、抗胁迫以及生长和发育。
本实验克隆了一个玉米
WRKY
基因的启动子，采用GUS报告基因对
WRKY
基因的启动子功能进行了分析，通过启动子的删减实验，水稻的遗传转化及组织
的GUS染色，取得如下结果：
1、根据网上预测的
WRKY
基因设计引物，从玉米(玉米品种B73)中扩增了该基
因的启动子部分，命名为P2880，在启动子顺式作用元件预测网站上分析该启动
子序列，预测到存在TATA盒、CAAT盒和GATA盒等多个作用元件。
2、克隆出
WRKY
基因上游的启动子并且克隆了4个5’端缺失启动子，5个启
动子的长度依次为2880bp、1812bp、1254bp、680bp和355bp。将5个启动子与
含有GUS报告基因的质粒pCAMBIA1301连接并构建了pCAM2880GUS和4
个5’端缺失启动子载体，将缺失载体分别命名为pCAM1812GUS、
pCAM1254GUS、pCAM680GUS和pCAM355GUS。
3、用农杆菌介导法将所有植物表达载体转化水稻，获得了37棵转基因植株。由
实验结果可知，pCAM2880GUS载体对应的转基因植株愈伤组织染色结果为蓝
色，而pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、pCAM680GUS、pCAM355GUS载体
对应的转基因植株的愈伤组织均未染上蓝色，由此可知P2880启动子的核心区域
位于转录起始位点前2880bp至1812bp之间。
综上所述，本研究克隆了一个玉米
WRKY
基因启动子，并发现该启动子是
一个愈伤特异性启动子，而目前
WRKY
基因未有愈伤组织表达特异性的报道，
该启动子的克隆对玉米相关基因功能研究具有重要的意义。
关键词：玉米，启动子，水稻遗传转化，GUS染色，愈伤组织特异性
-I-
Abstract
ivityof
indof
promoter,tissue-specificpromoterscoulddrivestableandeffectiveexpressionof
ult,wastesarereduced.
WRKY
gene
familyisatypeoftranscriptionalregulatoryfactorswhichhasspecificfunctionsin
WRKY
gene-encodedtranscriptionalregulatorsappeartobeinvolvedin
variousphysiologicalprograms,includingdisease-resistance,senescence,stress
responsesofbioticandabiotic,growthanddevelopmentprocesses.
Weclonesa
WRKY
genepromoterinZeaMaize,andanalysethefunctionswith
hthepromoterreductionexperiment,ricegenetic
transformationandGUSstaining,wegettheacheievementsasbelow:
1.A2880bppromoterfragmentof
WRKY
geneisamplifiedbypolymerase
chainreaction(PCR)techniquefrommaizeB73,cast
somecis-elementsinP2880fromPLACEwebsite.
supstreampromoterof
WRKY
gene,four5’missingpromotersare
cloned,whoselengthare2880bp,1812bp,1254bp,680bpand355bprespectively.
ThesefivepromotersandplasmidpCAMBIA1301whichcontainsGUSreportergene
areattachedtoconstructpCAM2880GUSandfour5’missingpromotercarriers
whosenamearepCAM1812GUS,
allplant
pCAM1254GUS,
expressional
pCAM680GUS
torice
and
by
pCAM355GUSrespectively.
erringvectors
Agrobacterium-mediatedtransformation,ing
toexperimentalresults,theGUSstainingresultofcallustissuerelatedto
pCAM2880GUSvectorisblue,whereas,othervectorssuchaspCAM1812GUS,
pCAM1254GUS,lusion,the
coreareaofP2880promoterisbetween2880bpand1812bpbeforetranscriptionstart
site.
Tosumup,weclonea
WRKY
genepromoterinmaize,andfoundthatthe
snoreportof
WRKY
genewhichis
ningofthispromoterhasthevitalsignificance.
-II-
Keywords:Maize,Promoters,Ricegenetictransformation,GUSstaining,
callus-specific
-III-
1文献综述
1.1植物启动子概述
1.1.1启动子的概念
启动子（promoter）位与基因的上游，是一段提供RNA聚合酶识别和结合
的DNA序列。一旦RNA聚合酶定位并且结合到启动子序列上，即可启动转录
基因的表达首先是该基因5’端启动子序列能否被植物的RNA聚合酶所识别，
从而启动基因的转录
[1]
。RNA聚合酶转录过程的开始必须定位并且和启动子结
合，所以使基因表达的启动子是一个重要的顺式作用元件，启动子调控的实质是
它与RNA聚合酶或者其他的蛋白辅助因子等反式作用元件相互作用的结果。
启动子作为基因的表达调控重要的顺式作用元件，具有下面四个特征：1)
序列特异性。在启动子的基因序列中，一般含有若干个保守序列框，在序列框中，
若碱基序列发生改变，会使得转录启动滞后并且使得转录速度减慢。2)方向性。
启动子具有方向性，在其正反两个方向中，只有一个方向具有启动的功能。3)
位置特性。启动子在所要启动的转录基因上游或者基因内部的前端。4)种属特异
性。通常亲缘关系越相近的两种生物，启动子通用的可能性越大。
1.1.2启动子的结构
真核生物中，有三种RNA聚合酶，并因此将这三种RNA聚合酶作用的启
动子分为三类:类别I启动子、类别Ⅱ启动子、类别Ⅲ启动子。真核生物的启动
子Ⅱ由两大部分组成：核心启动子元件（corepromoterelement）和上游启动子元
件
(1)
（upstreampromoterelement）。
核心启动子元件（corepromoterelement）
核心启动子区域包括了启动子必须的转录起始位点和TATA盒。TATA盒是
位于转录起始位点上游的一段保守的基因序列，它富含AT碱基对。TATA盒有
7对保守的碱基序列：5’-TATA（A/T）A(A/T)-3’，提供RNA聚合酶Ⅱ的结
合位置，在很多情况下也会影响到基因的转录水平。TATAbox是第一个被确定
的RNA聚合酶Ⅱ的启动子元件，也是一些反式作用因子与DNA相互作用的位
点之一。植物的启动子的TATA框是在转录起点的上游约50bp处的一段序列，
富含AT碱基对，它的保守的序列为TCACTATATATAG。
(2)上游启动子元件（upstreampromoterelement）
在许多真核基因启动子中，位于转录起始位点上游大约80bp-220bp的序列
都有上游启动子元件，它们可以很大程度上提高基础启动子的转录活性。较为重
要的上游元件有两种：一种是一般上游元件，比如CCAAT盒和GC盒，普遍存
在于真核基因启动子中；另一种上游元件是启动子特有的上游元件。
-1-
(3)其他影响基因表达的调控序列
除启动子外还有一些特定序列能提高基因的转录速率或加工效率，比如增强
子、5’UTR(5’-非翻译序列)、3’UTR(3’-非翻译序列)、Kozak序列、沉寂子
等。
1.1.3植物启动子的分类
可以依据不同的标准对启动子进行分类。按启动子来源可分为：原核启动子
和真核启动子；从转录模式上，启动子又可以分为组成型启动子和诱导型启动子。
植物基因工程常其作用方式及功能可分为三类:组成型启动子、诱导型启动
子和组织特异性启动子。
(1)组成型启动子
组成型启动子能在所有细胞中都能启动基因表达，基因表达的产物具有稳定
性和持续性，基因的表达量随着植物的生长发育不发生明显的变化。研究发现，
在组成型启动子的转录起点的上游的几百个核昔酸处，有共有序列TGACTG
[2]
。
现在被广泛应用的组成型启动子有如下几种：水稻actin基因启动子(Act1)、花椰
菜花叶病毒CaMv35S启动子、水稻Ubiquntin基因启动子、章鱼碱合成酶基因(oes)
启动子以及土壤根癌杆菌Ti质粒的胭脂碱合成酶基因(Nos)启动子。花椰菜花叶
病毒355启动子现在被广泛的应用，它的启动活性强，而且表达量高，所以在双
子叶植物中的应用己经得到人们的认可，但在单子叶植物中，它的调控表达能力
较弱
[3,4,5]
。水稻Actl启动子也是表达量高、启动性强的组成型启动子，actin基
因表达的产物是植物细胞骨架的基本组成成分，所以在所有的组织中，它的启动
子都有活性
[6]
。水稻ubiquntin基因启动子近年来越来越受到人们的重视，由于它
的转录活性较高，所以现在已经在植物转基因中得到应用
(2)诱导型启动子
植物在生长发育的过程中如果受外界环境的影响，就会使得基因表达发生改
变。在物理或者化学信号的诱导下调节基因转录水平的启动子是诱导型启动子。
根据不同的诱导因素，诱导型启动子可被分为如下几种：环境响应启动子、激素
响应启动子、创伤诱导型启动子、真菌诱导型启动子等
[8]
。
1
[7]
。
环境响应启动子
在长期进化的过程中，植物已经对一定范围内的光、温、水等环境因素做出
反应，环境响应启动子对基因转录表达起了关键的作用。这一类启动子主要包括
光效应启动子、温度效应启动子和水效应启动子
[9]
。
A.光效应启动子
LampPa等(1985)克隆出小麦Cab基因，并经研究发现，在转基因的烟草中，
Cab基因具有光调控效应和器官特异性
[10]
。王念捷等(1996)克隆出水稻R4CL-1
-2-
基因，并与Gus基因融合构建表达载体，转化烟草，在紫外光诱导下，R4CL-1
启动子能在植物发育过程中特异性的表达
[11]
。Awinderks等(1999)发现在光诱导
下，LTP启动子可以启动GUS基因在转基因的拟南芥侧根、花药、柱头和维管
组织中的表达，它的启动子中存在有GT-1位点、I-盒、G-盒和AT-rich等顺式作
用元件
[12]
。水稻中的三个八番茄红素合成酶基因OsPSYI，OsPSYⅡ和OsPSYⅢ
的启动子都受到脱落酸的诱导；前两者受光诱导，后者则不表现出光诱导性。
[13,14]
。
Mariaac等(1996)从向日葵中克隆出编码小热激蛋白(sHSPS)HaHsp18.6G2和
B.温度效应启动子
HaHspl7.7G4的基因，发现前者只具有热诱导活性，而后者对高温(42℃)、ABA
和水分诱导都有应答
异序列
2
[16]
[15]
。通过比较番茄中的两个热胁迫转录因子(Hsfs)LPHsfA1
和LPHsfA2的序列得出：Hsf启动子的选择度依赖于高温诱导响应元件的一段特
。
真菌诱导表达启动子
在进化的过程中，高等植物在应对病原菌的侵染时，形成了非常严密的抗病
防御系统，病原菌的侵染能够诱导许多启动子的表达。几丁质酶基因在植物受到
病原菌侵染后进行的抗病防御中起着重要的作用，在烟草的悬浮培养细胞中，真
菌的强烈诱导类型Ⅰ的几丁质酶的表达，转录起始位点上游-788bp至-345bp是
转录的核心区域，是诱导表达所必需的
[17]
。Jorda等(2000)把马铃薯P68B和P69C
基因的启动子分别与GUS和LUC报告基因融合转化拟南芥，实验结果发现在受
到水杨酸诱导和假单胞菌的诱导下，P68B和P69C启动子启动抗性作用
[18]
。
Gulderdoni等(2002)发现水稻中的脂质转移蛋白基因LtpI的启动子是真菌诱导表
达启动子
[19]
。SaskiK等(2004，2007)克隆出水稻的两个过氧化物酶基因R2329
和R2184，结果得出这两个启动子受到稻瘟病菌感染的诱导表达，进一步研究发
现，R2329基因启动子的-1798bp至-748bp，R2184启动子的-1975bp到-548bp的
序列中含有许多诱导响应元件，包括脱落酸响应元件，茉莉酮酸响应元件和乙烯
响应元件等
[20,21]
。
3
创伤诱导表达启动子
在植物遭受自然创伤或者害虫造成的机械损伤时，许多植物能够受到创伤的
诱导，使得基因特异性的表达。李红等(1997)发现水稻受到创伤诱导后，RCH8
启动子启动GUS基因的表达。而后进行缺失分析发现该启动子缺失至-676bp的
后，GUS酶活性显著下降，当缺失到-68bp处时，启动子的活性极低
[22]
。此外，
泛素-核糖体蛋白融合基因ubi3基因启动子同样也是创伤诱导型启动子
[23]
。在水
稻的叶片中，水稻蛋白酶抑制蛋白基因(OsPI8-I)启动子也受到创伤诱导
[24]
。
-3-
Alexandre等(2007)在研究puroindoline-a基因(PinA)启动子时发现：在水稻中，
PinA启动子同样也是创伤诱导型启动子
[25]
。
4
植物激素诱导表达启动子
生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯等都是植物生长发育中不可缺
少的激素。
A.生长素诱导表达启动子
Nagao等克隆出GH3启动子并且发现：该启动子序列中含有两个相互独立
的生长素效应元件，且二者都含有一个生长素诱导表达必需的TGTCTC基元
(motif)
[26]
。
B.赤霉素诱导表达启动子
wolf等(1992)研究发现：在一些禾本科植物α淀粉酶启动子中，可能是元件
之间组合或者赤霉素效应复合体得作用导致了赤霉素响应的产生
[27]
。Gubler等
(l992)研究发现：在低等电点的大麦α淀粉酶启动子Amy32b中，若嘧啶序列发
生突变，则会导致赤霉素诱导的表达丧失；而相反的，在某些高等电点的α淀粉
酶启动子中，如果嘧啶序列发生缺失，赤霉素诱导的效应活性并没有太大影响。
在这高低等电点的α淀粉酶启动子中，若TATCCAC序列突变，则赤霉素的诱
导表达均基本丧失
[28]
。
C.脱落酸效应启动子
脱落酸效应元件一般含有G-box结构，其特异表达元件的序列为5’-(C/G/T)
[28]
。ACGTGG(C/G)-3’ABA诱导水稻Osem基因，该基因的启动子含有类似ABA
效应元件的结构5’-ACGTG-3’和5’-CATGCATG-3’（SPh-盒）
D.乙烯效应启动子
[29]
。
在某些植物中，乙烯大量的合成和释放对果实的成熟起非常重要的作用。在
番茄果实成熟过程中，乙烯激活E8基因，并且使其高效的表达
[30]
。在抗病的启
动子中，GCC-盒以及其它的一些元件，比如G-box，对产生乙烯效应有着重要
的作用
(3)
[31]
。因此，乙烯效应元件可能有多种类型。
组织特异性启动子
组织特异性启动子即器官特异性启动子（organ-specificpromoter）。在这些
启动子调控下，外源基因在某些特定的器官或者组织中表达。这种类型的启动子
最大的优点是：它启动外源基因在受体植物中特异的表达，在需要该基因大量表
达的特定组织部位则高效的表达，得到预期的效果
[32]
。因此，组织特异性启动子
一直以来都是植物基因工程中研究的重点和难点。
1
维管组织特异性启动子
木质部和韧皮部是植物维管组织的组成部分，维管组织可以形成和维持植物
-4-
器官的形态，可以运输水分、养分，但是也是许多植物病虫害直接侵害的部位。
因此，利用维管组织特异性启动子驱动目标基因在植物的维管组织中特异表达，
可以有效的发挥目的基因的作用。维管束特异性启动子可以使抗病、抗虫基因在
维管束中高效特异表达，能够运用于防治病虫害
[33]
。现在己经克隆出了拟南芥
Prof基因、菜豆富甘氨酸细胞壁蛋白GRPl.8基因以及黄豆蔗糖结合蛋白基因
SBP2的启动子
[34]
，并对它们进行了功能分析。国外有人将菜豆富甘氨酸细胞壁
蛋白GRPl.8基因的启动子与报告基因相连，转化烟草，实验结果发现在烟草的
根、茎、叶的木质部内有特异性的表达，其中根的表达最强，茎的表达低于根，
叶的表达最弱
[35,36]
。
2
根特异型启动子
Tittareth等克隆了AtAGP18基因启动子，发现它能够使得GUS基因在根，
花和茎中高效的表达，在根中的表达最强，而在莲座叶和幼苗中表达相对较弱
[37]
。
3
茎特异性启动子
在茎特异性启动子中橡胶树乳管特异表达REF启动子，长度为306bp片段，
是一个强启动子，能够实现该启动子的全部功能，可以通过光、热、损伤等诱导
启动子活性
[38]
。此外，有人认为长度800bp的GBSS启动子能够驱动GUS基因
在块茎和葡匐茎中高表达，长度400bp的启动子也可以表现块茎专一性
是块茎表达专一性最强烈的启动子
[40]
。
4
[39]
；也
有研究者认为1600bp的启动子才能表现块茎的专一性，而长度2900bp的启动子
叶特异性启动子
拟南芥绿色组织特异表达AtSTP3启动子，可通过受伤诱导，驱动GUS基
因在转基因水稻叶片中特异表达
米及马铃薯等植物中都有发现
达，且受光诱导
[43]
[41]
。水稻rbcS启动子含两个顺式作用元件，一
是光效应启动子调控元件；二是rbcS保守序列，这两个元件在烟草、拟南芥玉
[42]
。rbcS启动子（1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧
酶的小亚基）可驱动GUS基因在转基因玉米和水稻叶片及叶鞘内的叶肉细胞表
。王利军等克隆了拟南芥atslA基因启动子，并且构建了植
[44]
物的瞬时表达载体，为植物叶绿体中的特异高效表达提供新途径
性高于355启动子9倍
[45]
。
5
。杨予涛克
隆了PNZIP基因启动子，并且证明了在叶片组织中，全长的PNZIP启动子的活
花器官组织特异性启动子
植物花特异表达启动子的分离克隆为花卉的品质改良提供了重要作用，在植
物开花时期可以启动基因表达，而在其它时期、植物的其它部位或者组织中不表
达或者表达量低。近年来人们分离和鉴定了许多花的特异表达基因启动子，其中
对查尔酮合成酶基因家族的CHS启动子的研究最为深入。Yu
[46]
等分离得到了兰
-5-
花同源异型基因DOMADS1，并证实了几个推断的DNA结合位点；当AP3启动
子转录因子TF激活后，AP3启动子可以驱动GUS基因在转基因植物的花瓣中
表达活性剧增
[47]
。此外，花特异表达的启动子还有矮牵牛PchsA和菊花UEPl花
特异表达启动子
[48,49]
。
6
果实特异性启动子
果实对植物的繁衍有着重要作用，研究果实特异性启动子对我们了解启动子
的调控机制和果实的发育过程有着非常重要的理论意义。植物果实相关基因启动
子一般与乙烯形成有关，研究比较深入的有E4、E8、PG、2All等基因的启动子
[50]
。目前对双子叶植物启动子研究最多的是番茄，Chen等从番茄中克隆了ACO
基因家族的Ell启动子，将1200bp和2000bp的序列区域与报道基因gusA融合
并且转化番茄
[51]
。结果发现2000bp的序列区域都能引起果实特异的高表达，而
1200bp的序列区域可以在缺水和创伤诱导时在果实中表达。
7
种子特异性启动子
时间和空间可以调节种子特异性启动子的表达。石东乔
[52]
等从甘蓝型油菜
(Brassicanapus)品种H165中克隆了种子贮藏蛋白基因BcNA1的启动子，将此启
动子与gus基因融合转化烟草，结果发现BcNA1基因启动子是种子特异性启动
子。
1.2启动子分析的方法
目前，生物信息数据库服务己实现高度的计算机化和网络化，现在可通过数
据库的生物信息学方法分析调控元件
[53]
。植物启动子顺式作用元件数据库如下：
1.2.1TRANSAFC数据库(TRANSAFC)
TARNSFAC数据库(TranseriptionalFaetorDatabase)是由德国生物工程研究所
开发，它是真核生物基因调控转录因子的数据库，它是一个较为全面的二次数据
库，包括六个子库，依次为顺式调控位点、基因、转录因子、细胞来源、分类和
调控位点核甘酸分布。TARNSFAC数据库于1988年建立，运用关系数据库模式。
近几年，该数据库进行进一步的开发，特别在植物方面快速发展
[54,55]
。
1.2.2PLACE数据库(/sigsean/)
随着水稻、玉米等植物基因组计划的完成，大量的植物基因序列出现，但是
TRANSFAC中所包含较少的植物基因的顺式作用元件，所以从包含植物转录因
子的数据库PALCE(Plnatcis-actingregulatoryNDAelmenets)产生。由日本的农、林、
渔部门主管开发的PLACE数据库，主要收集己发表的维管植物基因的顺式作用
元件。用户可以在该数据库中查询自己序列中存在的顺式作用元件，数据库可以
快速的报告相关顺式作用元件的介绍
[56,57]
。
-6-
1.2.3PlantCARE数据库(:8080/PlantCARE/)
PlantCARE数据库是包含了植物顺式作用元件、增强子和抑制子，大概介绍
了高等植物的160个启动子，共收集了417个顺式作用元件，其中单子叶植物
150个，双子叶植物263个，松柏科植物4个。Plant数据库是一个可以自动更新
的数据库，但是必须经过一段时间监控这些调控元件才能够补充到该数据库中去
[58]
。
1.3启动子克隆的方法
目前，克隆启动子的方法主要有两种:一是利用探针筛选启动子；二是利用
PCR技术获得启动子，其中主要包括己普通的PCR技术、反向环化PCR技术、
染色体步移等
[59]
。
1.3.1探针载体筛选启动子
启动子探针载体筛选启动子的方法非常常用，它是利用缺失启动子产物易检
测的报告基因系统，构建出启动子探针质粒载体，克隆出具有启动子功能的DNA
片段。启动子探针载体包括了两个部分：转化单元和检测单元。构建启动子探针
型载体时，常见的检测标记基因有β-半乳糖甘酶基因(LacZ)，氯霉素乙酰转移
酶基因(cat)，四环素抗性基因(Tetr)和卡那霉素抗性基因(Kanr)。近些年来人们开
始较多的使用潮霉素β-磷酸转移酶基因(hyg)作为检测标记的基因。有研究者以
氯霉素作为报告基因
[60]
。Fodor
[61]
等以大肠杆菌LacZ为报告基因，以其作为探
针获得一些启动子片段。李维等
[62]
设计了含有潮霉素抗性基因的启动子探针，从
大肠杆菌中克隆出黄抱原毛平革菌基因的启动子。该方法具有时间短，效率高的
特点。
1.3.2普通PCR克隆启动子
根据己知的序列设计引物然后进行PCR扩增，从基因中克隆出启动子的方
法十分简单，所以常用此方法克隆启动子。设计引物时，在序列两端加入酶切位
点，得到的产物经酶切回收后可以直接连接到载体上相应的酶切位点上便可得到
重组质粒。所得序列进行测序后与原先序列比对，确定是否克隆正确。使用这种
方法是必须已知基因的全序列，而且只能扩增己知序列之间的DNA序列，因此，
这种方法有很大的局限性。曹军利用PCR技术成功的从番茄中分离出2A11基
因启动子序列
[63]
。苏宁等
[64]
以水稻叶绿体DNA为模板克隆出水稻叶绿体
16SrRNA基因启动子。彭仁旺等
[65]
根据烟草TA29基因序列设计特异性引物，
以烟草基因组为模板，PCR扩增到花药特异表达基因TA29启动子的片段。
1.3.3以PCR技术为基础的技术克隆启动子
利用PCR的方法扩增DNA片段非常简便快捷而且经济，随着PCR技术的
发展，人们越来越多的开始使用PCR的方法来克隆基因的启动子。目前已经开
-7-
发出多种克隆启动子的方法，包括：①环状PCR；②利用载体或接头的染色体
步行技术；③热不对称交错PCR等。
(1)环状PCR
环状PCR是基于已知的序列设计出嵌套式的引物，PCR克隆出启动子，包
括I-PCR和P-PCR两种类型。韩志勇等利用I-PCR技术克隆出转基因水稻外源
基因的旁侧序列
[66]
。利用改进的I-PCR方法，李竹红等克隆出Tcl转座子左侧
反向重复序列的旁侧序列
[67]
。利用改进的P-PCR技术，在形成panhandle结构之
前Jones等在3’端的末端连上ddCTP碱基，大大减少了引物的错配机率，使得
特异性增加。P-PCR有很高的特异性，因为它是现今可以扩增出距离我们已知的
序列最远未知DNA序列的方法
(2)
[68,69]
。
利用载体或接头的染色体步移技术
染色体步移技术是将基因组DNA经过限制性酶切，将其酶切产物与特定的
载体或者接头连接，根据已知的基因组DNA序列设计特异性引物和载体二者的
通用引物或接头序列，再进行PCR扩增。利用加接头的方法，王新国等PCR克
隆出胡萝卜Ⅱ型转化酶基因的启动子部分序列，增加了反应的特异性
[70]
。利用此
项技术，Chen等克隆出拟南芥AtGPR9基因启动子区域约3000bp的序列
[71]
。
(3)TAIL-PCR
利用改良的TAIL-PCR技术，刘耀光等从突变体中克隆出了外源插入基因的
旁侧序列，成功的为启动子的克隆提供了新的有效的方法
[72]
。
TAIL-PCR方法具有特异性高、灵敏性强的优点，在分子生物学技术研究中
已经被越来越广泛的应用。在现今国内外的研究中，TAIL-PCR主要应用确定
T-DNA的旁侧序列的插入位点并且扩增己知序列的旁侧序列，根据实验结果可
以绘制出遗传图谱或者为基因进行定位
[73-80]
。利用TAILPCR技术，Wang等在
一种小球藻属椭球体中扩增出硝酸盐还原酶基因(NR基因)的5’端，与GUS基
因连接，在藻类(alga)中检测表达，证明扩增出的序列是有驱动表达的启动子作
用元件
[81]
。利用TAIL-PCR技术，杨国栋等克隆出棉花GhNHX1基因的启动子
片段，长度为1610bp
[82]
。运用此项技术，刘召华等克隆出ACA基因5’端起始
密码子上游约700bp的序列
[83]
。
1.4植物遗传转化法
植物的遗传转化方法有农杆菌介导法。农杆菌是革兰氏阴性土壤杆菌，它有
两种类型：一种为根癌农杆菌，其中含有Ti质粒，能够诱导被侵染的植物细胞
诱发冠瘦瘤；另一种为发根农杆菌，含有Ri质粒，能诱导被侵染的植物细胞产
生毛发状根。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti质粒基因转化系统是现今
研究最多的，机理最清楚的，技术最成熟的基因转化途径。
-8-
1.5本课题研究的目的和意义
目前，商业化生产的转基因植物中广泛应用的是组成型启动子，它们驱动植
物各种组织和所有发育阶段表达
[84]
，增加了植物的代谢负担，并且造成物质和能
量的巨大浪费，往往还会引起植物形态发生改变，甚至影响植物的生长发育。所
以，采用特异性启动子可以使外源基因能够定时、定点、定量地在植物中表达，
是植物基因工程研究的重要内容。因而就需要从农作物中分离诱导特异性启动子
和组织特异性启动子。通过鉴定，确定它们的特异性元件，将这些特异元件组装
起来，形成一种能定时、定量和定点驱动目的基因表达的复合启动子为我们所用。
在水稻转化体系中转化周期是非常长的，抗性愈伤的筛选决定了水稻转化
率。利用愈伤特异性启动子可以在很短的时间内确定是否为抗性愈伤组织，进而
可以确定是否为抗性苗，可以大大减少不必要的浪费，节约成本，减少人力物力
的浪费。
-9-
2材料与方法
2.1技术路线
2.2实验材料
2.2.1植物材料
本实验所用的植物材料粳稻（ca）中花11号为国
家植物基因研究中心（北京）惠赠。
2.2.2菌株与质粒
(1)大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α菌株为安徽农业大学生物物理重点实验室
所保存。
(2)农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105菌株为安徽农业大学生物物理
重点实验室所保存。
(3)质粒pCAMBIA1301，全长11837bp。由本实验室保存。
-10-
图2-1植物表达载体pCAMBIA1301质粒图谱
Fig2-1SchematicdiagramofplasmidpCAMBIA1301
2.2.3转化受体材料与外植体培养
本实验用于转化的受体材料为粳稻（ca）中花11
号。将成熟的水稻种子去掉颖壳，用70%的酒精灭菌1-2min，0.1%的升汞浸泡
10-15min，无菌水冲洗两次，再用10-15%的次氯酸钠浸泡30-45min，用无菌水
冲洗3-4次，接种在诱导培养基上。暗培养7-10d后，剥离种子胚，接到继代培
养基上培养至长出愈伤组织。
2.2.4培养基
(1)细菌培养基
1
大肠杆菌培养基
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L；若为固体培养加琼
脂15g/L，pH=7。
2
农杆菌培养基
YEB培养基：牛肉膏5g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L；若为固体培养
加琼脂15g/L，pH=7。
(2)粳稻转化培养基
1
水稻N
6
基本培养基：N
6
大量+MS-Fe盐+B
5
有机+500mg/L脯氨酸+300mg/L
水解酪蛋白+1.0g/L肌醇30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉。
诱导继代培养基：N
6
基本培养基+2,4-D2.5mg/L。
共培养培养基：诱导培养基+100μMAS。
筛选培养基：诱导培养基+500mg/L羧苄青霉素+50mg/L潮霉素。
2
3
4
-11-
5
分化培养基：N
6
基本培养基+0.25mg/LNAA+2mg/L6-BA+0.5mg/LKT+
500mg/L羧苄青霉素+50mg/L潮霉素。
生根培养基：1/2MS基本培养基+NAA1mg/L。
所有培养基pH均为5.8，热不稳定性化合物如抗生素、AS、6-BA及KT细
6
菌滤器除菌后于培养基温度降至50℃左右时加入。
(3)抗生素储液配制（见表）
表2-1抗生素储液配制
Table2-1Confectofantibiotics
抗生素种类
Nameofantibiotic
氨卞青霉素(Amp)
卡那霉素(Kan)
利福霉素(Rif)
羧卞青霉素(Carb)
溶剂
Solvent
H
2
O
H
2
O
甲醇
H
2
O
储存液浓度
Concentrationofstock
100mg/mL
100mmol/L
10mg/mL
100mg/mL
使用浓度
Usageoncentration
100mg/L
50mg/L
50mg/L
500mg/L
(4)主要试剂和仪器
PCR引物、DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物有限公司；
LA-Taq-MixDNA聚合酶、碱性磷酸酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购
自大连宝生物工程有限公司；
卡那霉素（Kan）、氨苄青霉素（Amp）、羧苄青霉素（Cb）、利福平（Rif）、
潮霉素B（HygromycinB）均购自Sigma公司；
其它常用化学试剂均为国产分析纯。
光照培养箱、高速冷冻离心机(LCJ-64-0,SCR20B)、小型高速离心机
(HemaTGL-16H)、5810R型大型冷冻离心机（eppendorf）、制冰机（Sanyo）、
PCR扩增仪（WhatmanBiometra-96PCR仪）、紫外分光光度计(HitechU2001)、
VORTEX-2型涡旋振荡器（Genie）、酸度计、电子天平（Sarhorius，BS210S
型）、电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)、Kodak凝胶成像系统、恒温水浴
(Grant)、常温冰箱、-20℃低温冰箱（Sanyo）、-70℃超低温冰箱（Sanyo）、琼
脂糖凝胶电泳仪（DYY-6C型）、电泳槽（北京六一厂）、高压灭菌锅（Hirayama
HVE50）、恒温摇床（武汉中科院科学仪器厂）、手提式紫外检测仪、超净工
作台（苏净）及其它分子生物学实验常用设备。
2.3实验方法
2.3.1CTAB法提取玉米基因组总DNA
(1)
1
试剂的配制
CTAB提取液：2%（w/v）CTAB、100mmol/LTris-HCl（pH8.0）、20mmol/L
-12-
EDTA（pH8.0）、1.4mol/LNaCl，临用前65℃提前水浴，然后再根据所用
体系加2%的β-疏基乙醇。
2
3
CTAB/NaCl溶液：10%（w/v）CTAB、0.7mol/LNaCl。
CTAB沉淀液：1%（w/v）CTAB、50mmol/LTris-HCl（pH8.0）、10mmol/L
EDTA（pH8.0）。
高盐TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），0.1mmol/LEDTA（pH8.0），
1mol/LNaCl。
4
(2)基因组DNA的提取方法
1
2
提取前将材料在暗处处置24h，以降低材料的淀粉含量（视材料而定）
剪取大约1g叶片，置于研钵中，倒入液氮研成粉末，分装入50mL的离心管
中，每管加入6mL预热的CTAB提取缓冲液，温和彻底的混匀，静置，使裂解
彻底；
3
4
65℃水浴中保温1-1.5h；
冷至室温后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分温和混匀直
至叶片粉末由绿转白（水相，酚相混匀成乳状液）；
室温下13000rpm离心10min，吸取上层水相，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：
1）在抽提一次，13000rpm离心10min；
取上层水相，加入十分之一体积的3M醋酸钠，加入2倍体积的无水乙醇沉淀
DNA，-20℃放置30min，13000rpm离心10min；
小心倒出每管中的液体，用70%乙醇洗涤沉淀1-2次，每次将沉淀适当浸泡以
充分洗涤，最后一次稍加离心，将洗涤液尽量去除干净，通风橱中晾干，约
10min左右（不要过分干燥）；
5
6
7
8
加200μLTE溶解沉淀，加入适量的RNaseA至终浓度为50μg/mL，37℃保温1h
溶解沉淀，充分混匀，并消化RNA；
取3μL样品在0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分
光光度计法检测DNA纯度（将DNA稀释50倍后分别测OD
260
和OD
280
，并计算
OD
260
/OD
280
的比值）。
9
2.3.2PCR克隆启动子序列
(1)引物
根据目的基因片段序列和植物表达载体设计引物，一般引物序列中GC含量
在40%-60%之间。四种碱基最好随机分布，尽量避免聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
一般引物长度为在15至30个碱基之间，Tm值最好不要相差太大，并且尽量少
少含发夹结构和引物二聚体。根据这些原则设计的引物如下：
引物1（上游引物）：5’-CCGAAGCTTATGACAAGAGAAGTTGGACAAG-3’
-13-
引物2（上游引物）：5’-CCGAAGCTTGGCTGCTTGTTATTATGC-3’
引物3（上游引物）：5’-CCGAAGCTTCCCCTTCACTCATTACAC-3’
引物4（上游引物）：5’-CCGAAGCTTCACTCTTATTGTCGGCTTG-3’
引物5（上游引物）：5’-CCGAAGCTTCTAAAATGTCACCTTTGCCCCT-3’
引物6（下游引物）：5’-GCGAGATCTTCAGATCGACCTCCTAGCTCTA-3’
(2)反应体系
表2-2
Table2-2
PCR扩增的反应体系
PCRamplificationreactionsystem
ddH2O
5’primer(10μmol/L)
3’primer(10μmol/L)
Template(50ng/μL
）
LA-TaqDNApolymerase(5U/μL)
Total
(3)反应程序
21.5μL
1μL
1μL
1.5μL
25μL
50μL
94℃预变性5min，94℃30s，55℃40s，72℃2min，共35个循环，然后72
℃延伸10min。4℃保温。扩增后的产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果拍
照记录。
2.3.3PLACE分析
PLACE是一款专业的植物DNA顺式调控元件分析在线数据库。
(/PLACE/)，使用该软件在线进行分析，
操作步骤如下：
(1)进入PLACE数据库网站界面；
(2)将pi-hit-1基因转录起始位点前DNA序列输入序列对话框中；
(3)点击submit键，开始进行预测；
(4)对预测结果进行分析。
2.3.4质粒的重组与转化
(1)大肠杆菌感受态细胞的制备
1
2
挑取单菌落接种于3-5mLLB液体培养基（LB）中，37℃过夜活化；
按1:50-100的比例接种于100mLLB液体培养基上扩大培养2-3h，37℃220
rpm培养至OD
600
=0.3左右；
取10mL培养菌液移入10mL离心管中，冰上放置10min后，4℃下5000rpm
离心10min；
弃上清收集菌液，用预冷的100mmol/LCaCl
2
溶液5mL轻轻悬浮细胞，冰浴
-14-
3
4
15min，4℃下5000rpm离心10min；
5
弃去上清，加入0.5ml预冷100mmol/LCaCl
2
溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置几
min，即为感受态细胞；
取200μL感受态细胞分装到1.5mLeppendorf管中，用占总体积15%的甘油
（灭菌的）混匀保存，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
6
(2)DNA片段的回收和纯化
使用DNA快速纯化/回收试剂盒（生工生物工程公司生产的UNIQ-10柱式
DNA胶回收试剂盒）进行纯化。
1
2
割下含目的DNA的琼脂糖块，使它尽可能小，放入1.5mL离心管中；
估计液体总量，加入3倍体积的结合液BindingBuffer，充分混匀，置于55-65℃
水浴中10min，至胶完全融化；
将溶液转移到离心柱中，静置2min，12000rpm室温离心1min；
取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的溶液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管
中，室温离心12000rpm离心1min；
将离心柱重新装在收集管中，置于室温或37℃烘干箱中数min，充分晾干以
除掉洗涤液中的乙醇；
将晾干后的离心柱装在一个高压灭菌处理过的1.5mL离心管中，向离心柱
膜中间位置悬空加入20‐50μL洗脱液EB或去离子水，室温静置2min，
12,000rpm离心1min，洗脱DNA；
3
4
5
6
7
洗脱得到的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测，或分光光度计定量后，冻存于‐
20℃备用。
(3)PCR扩增片段与Easyvector的连接
表2-3
Table2-3
克隆载体的构建
Thepathwayofcloningvectorconstruction
PCRfragment
PMD18-TVector
Ligase
10×LigaseBuffer
ddH2O
Total
(4)连接产物转化大肠杆菌DH5α
1
2
3
5.5μL
1μL
1μL
1μL
1.5μL
10μL
将5μL的连接液移入含有20μL感受态细胞的1.5mL离心管中；
冰浴30min，每隔5min轻弹管壁；
42℃水浴热激90s，立即冰浴5min；
-15-
4
5
加入100μL不含Amp的LB液体培养基，37℃下180rpm/h；
在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基表面，加40μL20mg/mLX-gal、
4μL200mg/mLIPTG涂布于平板表面；
分别吸取80μL培养液涂布含Amp（100μg/mL）的LB固体培养基上，涂布
均匀，待液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养16-24h；
6
(5)质粒DNA的小量提取
1
挑取含有Amp（100μg/mL）平板上的单菌落，接种到7mLLB液体培养基，
37℃下220rpm培养过夜；
将菌液倒入1.5mL的eppendorf管中，12000rpm离心1min收集菌体；
弃上清，将管倒置于吸水纸上，使液体流尽；
加入预冷的溶液Ⅰ100μL，让悬浮菌体沉淀，室温下放置5-10min；
加入新配制的200μL溶液Ⅱ，轻轻混合均匀，至冰上5min；
加入150μL预冷的溶液Ⅲ，轻轻颠倒混合均匀，冰浴5-10min；
在室温下12000rpm离心15min；
将上清倒入干净的1.5mLeppendorf管中，加入等体积（约450μL）酚/氯仿
（1：1），剧烈震荡混匀，12000rpm离心5min；
注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。
将上层水相移入干净的1.5mLeppendorf管中，加入2.5倍体积的异戊醇充分
震荡混匀后置于-20℃冰箱中2-3min，12000rpm离心10min；
彻底弃上清，沿管壁加1mL70%乙醇漂洗沉淀（颠倒两次），立即倒去上清
后，自然干燥；
将沉淀溶于30μLTE缓冲液（PH8.0，含20μg/mL的RNaseA）中，37℃保
温30min，储于-20℃冰箱中；
取5μL样品于在1.1%琼脂糖凝胶上电泳检查质粒提取情况。提取的质粒于
-20℃保存备用。
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
2.3.5转基因水稻的获得
(1)重组质粒转化根癌农杆菌
1
2
3
4
5
将3-5μL载体质粒DNA加入到200μL感受态细胞中混匀；
冰浴5min，液氮冷冻1min后置于37℃水浴5min；
加入300μLYEP液体培养基，28℃，150-200rpm/min预表达4-5h；
吸取上述菌液80μL左右涂布于含相应抗生素的YEP固体平板上，涂布均匀；
28℃培养1-2d。
从-70℃超低温冰箱里取出冻存的农杆菌EHA105在冰上融化后，划线接种
(2)根癌农杆菌感受态的制备
1
-16-
于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP固体平板上，于28℃暗培
养2d左右；
2
从将单菌落接种于5mL含50mg/L利福霉素的YEP液体培养基中，
28℃160-250rpm，培养过夜，取2mL菌液转入50mlYEB培养基中扩大培养，
5h暗培养；
3
4
4℃5000rpm离心5min；
弃去上清液，加入10mL100mmol/LCaC1
2
溶液，重新轻轻悬浮菌体，冰浴
20min；
制备好的农杆菌感受态细胞，分装于无菌eppendorf管中，每管约200μL，
经过液氮速冻1min后，贮存于-70℃长期保存。
5
(3)农杆菌转化水稻
通过农杆菌感受态的方法将含目的基因的质粒导入农杆菌菌株EHA105中，
经菌落PCR筛选出阳性克隆，然后用共培养法将含有目的基因的农杆菌导入植
物受体材料转化水稻。
1
水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养与继代培养
将水稻去壳用灭菌水冲洗二次，再用70%的乙醇浸泡1-2min，然后用50%次
氯酸钠浸泡10min，进行表面消毒。消毒后用无菌水冲洗3-4次，再将胚放在无菌
滤纸上吸干表面水分，接种到含2,4-D2.5mg/L的N
6
培养基上诱导愈伤组织，28
℃强光培养。
约10-15d后，水稻幼胚盾片长出的愈伤组织，将这些愈伤组织切下转入继
代培养基上，在相同条件下继续培养，5-7d后，挑选继代培养色泽淡黄、愈伤块
紧密的的愈伤组织作为受体材料。
2
用于转化水稻的农杆菌菌液的准备
将含有植物表达载体的农杆菌接种于YEB液体培养基（含有50μg/MLrif和
100μg/mLKan）中，28℃振荡培养至OD
600
为0.5-0.6，将菌液在室温下5000rpm，
离心5min去除含抗生素的液体培养基，将收集到的菌体悬浮于含AS的液体共培
养基中，调整菌体浓度至OD
600
为0.3-0.5，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮
液。
3
愈伤组织与农杆菌的共培养
挑选金黄色致密的愈伤组织放入100mL无菌三角瓶中，加入50mL农杆菌
悬浮液，放入摇床上28℃150rpm振荡培养20min。倒掉菌液，将愈伤组织放在
无菌滤纸上吸去表面多余菌液，最后接种到固体共培养培养基上，22℃暗培养
3d。
4
洗菌及抗性愈伤的筛选
-17-
用无菌水清洗愈伤3-4次至清洗液透明，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面水分，
转入附加有50mg/L羧苄青霉素的溶液中振荡30min，用无菌滤纸吸干，将愈伤
转移至加有50mg/L羧苄青霉素的选择培养基中。
5
抗性愈伤组织的分化
经过一个月的潮霉素筛选后愈伤组织周围长出乳黄色的抗性愈伤，挑选乳黄
色致密的潮霉素抗性愈伤转至附加有50mg/L潮霉素的分化培养基上，28℃强光
照条件下培养，15-25d左右出现绿点，30-40d后分化出小苗。
6
生根、壮苗和移栽
当分化出的抗性小苗长到高度大于2cm时，移到附加有50mg/L潮霉素的生
根培养基上培养2周。选择高15cm以上、根系发达的抗性小苗，洗去根表面的
培养基，最后移栽到温室。
2.3.6转基因植株的PCR分析
(1)潮霉素引物
引物7（上游引物）：5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’
引物8（下游引物）：5’-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3’
(2)反应体系
表2-4PCR扩增的反应体系
Table2-4PCRamplificationreactionsystem
ddH2O
5’primer(10μmol/L)
3’primer(10μmol/L)
Template(50ng/μL）
LA-TaqDNApolymerase(5U/μL)
Total
(3)反应程序
21.5μL
1μL
1μL
1.5μL
25μL
50μL
94℃预变性5min，94℃30s，55℃40s，72℃2min，共35个循环，然后72℃
延伸10min，4℃保温。扩增后的产物在含有0.5μg/mL溴化乙锭（Ethidium
Bromide）的2%琼脂糖凝胶上电泳，电压为5v/cm，电泳结果由Kodark凝胶成
像系统拍照记录分析。实得片段大小约1Kb。
2.3.7GUS活性检测
(1)GUS染液配制
1
200mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0），制备方法：
A液：称取NaHPO·2HO3.12g溶于蒸馏水，定容至100mL；
B液：称取NaHPO·12HO7.17g溶于蒸馏水，定容至100mL；
-18-
取100mLB液与40mLA液混合（混合后pH值约7.03），用NaHPO·2HO调
至7.0。
2
GUS缓冲液（4℃保存）配方：
磷酸钠缓冲液（PH7.0）50mmol/L
Na
2
EDTA10mmol/L
K
3
[Fe(CN)
6
]2mmol/L
K
4
[Fe(CN)
6
]2mmol/L
TritonX-1001%(v/v)
甲醇20%(v/v)
3
GUS染色液：N，N-二甲基甲酰胺溶解x-Gluc粉剂，配制成20mM的溶液，
-20℃下保存备用。
(2)染色方法
1
取待检测的植物组织于小离心管中，加入GUS染液浸没组织块，混匀后37℃
下保存16-24h；
叶片等绿色材料转入70%乙醇溶液中脱色2-3次，直至阴性对照材料呈白色；
肉眼或显微镜下观察，白色背景下的蓝色小点即为GUS表达载体。
2
3
-19-
3结果与分析
3.1启动子的克隆与序列分析
3.1.1启动子的克隆和生物信息学分析
(1)启动子目标片段的克隆
根据预测的基因设计引物（引物1），从玉米B73基因组中扩增出编码区5’
端上游大小为2880bp的调控序列，命名为P2880(图3-1)。将扩增产物处理后连
接到pMD18-T-vector载体上得到ZMW2880，仍需测序验证。
图3-1PCR扩增P2880的DNA序列
M：DL2000plus；1：PCR产物
icationofP2880DNAsequence
M：DL2000plus；1：PCRproduct
(2)特异性启动子片段的生物信息学分析
将鉴定正确的阳性克隆菌测序，结果表明，该基因长度为2880bp，并且与
已发表的基因相似性为99%，所以将其确定为目的基因。将所测片段的序列放
在启动子顺式作用元件预测网站PLACE数据库（
/sigsean
）
上进行分析，结果表明，它含有多种在其它植物启动子中存在的通用启动子元件
（图3-2），如TATA盒和CAAT盒，GATA-box等顺式作用元件和ACGT
核心序列，及诱导物(应答元件W-box（（T）TGAC（C））AACA（AAACAA））。
因此，可以推测克隆的片段为具有完整功能的启动子。
-20-
图3-2：
WRKY
的DNA序列
uenceof
WRKY
(3)
缺失启动子目标片段的克隆
根据28740的基因组序列，设计引物，以玉米B73为模板，利用PCR技术
扩增基因上游2880bp、1812bp、1254bp、680bp、355bp的5个不同长度的DNA
片段，依次命名为
P2880
、
P1812
、
P1254
、
P680
、
P355
。用浓度为
0.8%
的琼脂
糖胶(含EB)检测（图3-3）。将片段克隆进pMD18-T-vector，然后将五个片段克
隆进T载体，依次命名为ZmW2880、ZmW1812、ZmW1254、ZmW680、ZmW355
启动子。
-21-
图3-3不同长度Zmwrky5’端缺失图
M：DL2000plus；1-5：PCR产物
ticdiagramof5’terminaldeletionofZmwrky
M：DL2000plus；1-5：PCRproducts
3.2载体构建
将克隆进T载体的ZmW2880、ZmW1812、ZmW1254、ZmW680、ZmW355
启动子分别用
Hind
Ⅲ和
Bgl
Ⅱ切下，连接到
pCAMBIA1301
上相应的酶切位点中，
获得载体pCAM2880GUS。
图3-4植物表达载体pCma一owsglp构建的策略图
uctionofAgrobacteriumbinaryvectorpCAM2880GUS.
用同样的方法依次获得缺失载体pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、
pCAM680GUS、pCAM355GUS（图3-5）。这4个缺失载体上的GUS基因分别
由各载体5’端缺失后剩下的启动子部分驱动。
-22-
图3-5：不同长度5’端缺失载体图
Fig.3-5Schematicdiagramof5’terminaldeletionsvectorof
Zmwrky
阳性对照载体采用pCAMBIA1301(含有35S启动子)。启动子载体
pCAM2880GUS、pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、pCAM680GUS、
pCAM355GUS经HindⅢ和BglⅡ酶切鉴定正确（图3-6）。
图3-6：缺失载体的酶切图谱
M：DL2000plus；1-5：缺失载体酶切
ctionpatternofdeletionvector
M：DL2000plus；1-5：Restrictionofdeletionvector
3.3水稻的遗传转化及转基因植株的检测
3.3.1水稻的遗传转化
将重组表达载体pCAM2880GUS及阳性对照载体pCAMBIA1301分别转化
根癌农杆菌EHA105，在确定阳性克隆后，通过农杆菌介导法转化水稻的愈伤组
织。将水稻成熟胚诱导培养出愈伤组织（图3-7A），在继代培养基中培养一个
星期后与农杆菌共培养；然后将共培养后的愈伤组织放在的筛选培养基上，经过
10d左右，部分愈伤组织出现褐化，其中的一部分褐化了的组织之后在周围又重
新生长出金黄色的抗性愈伤组织（图3-7B）；经过大约一个月的两轮筛选，从
-23-
抗性愈伤组织中挑选出紧密的乳黄色的抗性愈伤组织，将其转至分化培养基上诱
导分化，再经过2-3星期左右，出现绿色的芽点；经过一个月左右分化出了小苗
（图3-7C）；当苗的高度大于3cm时，将小苗移入生根培养基中，将具有潮霉
素抗性的苗在生根培养基上培养2-3星期（图3-7D）；选择生长状况良好的小
苗，用灭菌水洗去附着的培养基，移入大田，精细管理（图3-7E）。
图3-7农杆菌介导的水稻转化
A：诱导愈伤；B：转化后的筛选及抗性愈伤增殖；C：抗性愈伤分化出绿色组织；
D：生根培养基中的转化苗；E：定植于培养土中的转化苗
enicriceby
Agrobacterium
-mediated
A:Inductioncalli;B:Transformedcallionselectionmedium;C:Regenerationofresistantcalli;
D:Youngseedlingsinrootingmedium;E:Transformedplantsinplasticbarrel
3.3.2转基因植株的PCR检测
经潮霉素抗性平板筛选得到的抗性转基因植株分别为
37
棵（转
P2880
）和
15棵（转1301）。用潮霉素基因设计的引物，分别以37棵和15棵转基因水稻
叶片总DNA为模板，进行PCR扩增，结果显示pCAMBIA1301的转基因植株含
有大小约为
1Kb
的目的条带，而作为阴性对照的野生型植株则没有该条带。
37
棵转基因（P2880）植株中有28棵经潮霉素PCR检测为阳性。下图给出部分转
基因植株的电泳图，8棵中有6颗验证为阳性，两颗则为阴性。
-24-
图3-8转基因水稻PCR检测结果
M：DL2000plus;1:阳性质粒;2:中花11;3-8:转基因植株
lysisfordetectingthe
WRKY
geneintransgenicrice
M：DL2000plus;Lane1:Positivecontrol;Lane2:ZH11;Lane3-Lane8:Transgenicplant
3.4GUS染色结果与分析
对获得的转基因水稻植株的不同组织进行GUS染色，检测其GUS活性。作
为阳性对照的15棵含有35S启动子的转基因植株所有组织GUS染色结果均为阳
性。37棵P2880启动子转基因植株中有22棵植株的愈伤组织的GUS染色均呈
阳性（图3-9B），而相对应的阳性植株的根、茎、叶、种子等组织中未观察到
GUS表达（图3-10A’-D’）。P1812、P1254、P680、P355启动子对应的愈伤
组织染色均未出现蓝色（图3-9C-F）。作为阴性对照的野生型植株各组织中未
检测到GUS基因的表达（图3-10A”-D”）。GUS活性的组织化学分析结果显
示Zm2880启动子能够启动GUS基因在水稻愈伤组织中特异性表达，而不能在
其它组织中表达。
-25-
图3-9转基因水稻愈伤组织的GUS组织化学染色
A:转pCAMBIA1301载体水稻愈伤的GUS染色结果;
B-F:依次为转P2880、P1812、P1254、P680、P355水稻愈伤的GUS染色结果;
G:中花水稻愈伤的GUS染色结果;
iningofthecallustissueinricegenetictransformation
A:GUSstainingofpCAMBIA1301vector
B-F:GUSstainingofP2880、P1812、P1254、P680andP355vectors
G:GUSstainingofZH11
-26-
图3-10转基因水稻根，茎，叶，种子的GUS组织化学染色
A-D:转pCAMBIA1301载体水稻的根，茎，叶，种子的GUS染色结果;
A’-D’:转pCAMBIA2880GUS水稻的根，茎，叶，种子的GUS染色结果;
A’’-D’’:对照水稻的根，茎，叶，种子的GUS染色结果;
Fig..iningoftheroots、stems、leavesandseedsinricegenetictransformation
A-D:GUSstainingoftheroots、stems、leavesandseedsofpCAMBIA1301vector
A’-D’:GUSstainingoftheroots、stems、leavesandseedsofpCAMBIA2880GUSvector
A’’-D’’:GUSstainingoftheroots、stems、leavesandseedsofZH11
以上结果表明，转基因水稻的GUS基因是在愈伤特异性启动子Zm2880的
调控下在愈伤中特异性表达。
-27-
4讨论
4.1计算机数据分析与生物实验结合的方法具有可行性
启动子是控制基因表达的转录调控区，具有高度的保守性，因此利用已有的
植物启动子分析预测数据库，对新的植物基因的启动子进行分析与预测，能够高
效经济的分析研究新基因的启动子。现在对于动物新基因启动子的研究，主要就
是采用序列分析和实验验证相结合的方式进行研究的，相对于动物基因的启动
子，高等植物基因的启动子区结构具有高度保守性和同源性，这也就为通过已知
基因启动子预测分析未知基因的启动子奠定了理论依据。但是，由于已经研究清
楚的植物基因启动子远没有动物的多，所以真对植物的启动子分析的数据库还存
在数据量小，软件自我学习能力较慢的缺点。但通过本实验证明，软件预测与实
验数据存在一致性，证明这种基于计算机数据分析与生物实验结合的方法，对于
研究玉米基因的启动子具有可行性。
4.2Zm2880启动子是一个愈伤特异性启动子
转基因植物的研究，在许多情况下，外源基因的表达需要经过严格的调控，
选择正确的启动子显得尤为重要。组成型启动子在转基因研究已被广泛使用，但
组成型启动子在空间和时间上不能得到有效的表达，而且可能造成植物能源的浪
费，甚至危害植物。组织特异型启动子摒弃了组成型启动子的缺点，在植物遗传
工程中成为转基因研究中的理想选择之一，得到越来越广泛的应用。
从玉米中克隆的
WRKY
基因启动子Zm2880与GUS报告基因融合，并构建
了融合表达载体，然后进行水稻的遗传转化，通过检测转基因水稻各个组织的
GUS活性，得到这个启动子驱动GUS基因的表达特性。结果表明克隆的玉米启
动子Zm2880为愈伤特异性表达的启动子。据Coca等报道，在水稻中和玉米中
ZmPR4启动子通过病原、真菌激动子、机械创伤激活诱导，能驱动GUS报告
基因表达，并且该启动子仅在病原侵袭部位有活性；与之相比，本实验研究的启
动子不用任何条件诱导便可在愈伤组织中特异性表达，并且表达量相较报导的未
经诱导的启动子高，与其诱导后的在肉眼观察上表达量相近。
WRKY
基因启动子
已报道的均是抗旱、抗寒、抗盐胁迫、抗病虫害等抗逆境胁迫类型的启动子，而
作为愈伤特异性启动子是首次发现。
在植物基因工程中，转化的外源基因能否在植物体中正确、高效并且按照人
们的意愿特异的表达，这是人们非常关注的问题。目前植物基因工程中常用的启
动子是组成型表达启动子。外源基因在组成型启动子的控制下，在转基因植物的
所有部位和所有发育阶段都会表达，这样不但造成植物能量和养分的浪费，而且
-28-
还会造成转基因植物的一些性状发生改变，影响植物正常的生长发育。而愈伤特
异性启动子可以控制外源基因在植物愈伤组织中高效表达，避免外源基因在植物
的其它部位表达，减少对植物的不利影响。
4.3Zm2880启动子的核心区域
由实验结果可知，pCAM2880GUS载体对应的愈伤组织染色结果为染上了蓝
色，而pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、pCAM680GUS、pCAM355GUS载体
对应的愈伤组织均未染上蓝色，由此可知Zm2880启动子的核心区域位于转录起
始位点前2880bp至1812bp之间。
-29-
5结论
(1)根据
Zmwrky
基因设计特异性引物，以玉米基因组DNA为模板，扩增出该基
因的启动子部分，命名为P2880。
(2)将P2880启动子的序列放在启动子顺式作用元件预测网站上进行分析，预测
到存在TATA盒、CAAT盒和GATA盒等多个顺式作用元件，所以该启动子
是一个具有完整功能的启动子。
(3)利用农杆菌介导法将构建的pCAM2880GUS植物表达载体转化水稻，获得了
37棵转基因植株，对获得的转基因植株进行潮霉素检测，其中22棵检测为阳性，
转化率约为67%。
(4)将检测为阳性的转基因各个组织进行GUS染色，根据染色结果得出，GUS
基因只在愈伤组织中表达，在其余组织中未发现有表达。所以Zm2880启动子是
一个愈伤特异性启动子。
(5)只有pCAM2880GUS载体对应的转基因植株的愈伤组织染色结果为染上了
蓝色，其余缺失载体对应的转基因植株的愈伤组织均未染上颜色，所以Zm2880
启动子的核心区域位于转录起始位点前2880bp-1812bp之间。
-30-
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-37-
2024年10月20日发(作者：窦任真)
摘要
启动子是基因表达调控重要的元件，启动子的活性间接反映了它所控制的基
因表达。组织特异性启动子作为启动子的一种，可以启动外源基因在受体植物的
特定组织器官中高效表达，减少不必要的浪费。
WRKY
基因家族是在植物中起特
异作用的一类转录调控因子，它被证明了参与植物的抗病反应，还影响植物的衰
老、抗胁迫以及生长和发育。
本实验克隆了一个玉米
WRKY
基因的启动子，采用GUS报告基因对
WRKY
基因的启动子功能进行了分析，通过启动子的删减实验，水稻的遗传转化及组织
的GUS染色，取得如下结果：
1、根据网上预测的
WRKY
基因设计引物，从玉米(玉米品种B73)中扩增了该基
因的启动子部分，命名为P2880，在启动子顺式作用元件预测网站上分析该启动
子序列，预测到存在TATA盒、CAAT盒和GATA盒等多个作用元件。
2、克隆出
WRKY
基因上游的启动子并且克隆了4个5’端缺失启动子，5个启
动子的长度依次为2880bp、1812bp、1254bp、680bp和355bp。将5个启动子与
含有GUS报告基因的质粒pCAMBIA1301连接并构建了pCAM2880GUS和4
个5’端缺失启动子载体，将缺失载体分别命名为pCAM1812GUS、
pCAM1254GUS、pCAM680GUS和pCAM355GUS。
3、用农杆菌介导法将所有植物表达载体转化水稻，获得了37棵转基因植株。由
实验结果可知，pCAM2880GUS载体对应的转基因植株愈伤组织染色结果为蓝
色，而pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、pCAM680GUS、pCAM355GUS载体
对应的转基因植株的愈伤组织均未染上蓝色，由此可知P2880启动子的核心区域
位于转录起始位点前2880bp至1812bp之间。
综上所述，本研究克隆了一个玉米
WRKY
基因启动子，并发现该启动子是
一个愈伤特异性启动子，而目前
WRKY
基因未有愈伤组织表达特异性的报道，
该启动子的克隆对玉米相关基因功能研究具有重要的意义。
关键词：玉米，启动子，水稻遗传转化，GUS染色，愈伤组织特异性
-I-
Abstract
ivityof
indof
promoter,tissue-specificpromoterscoulddrivestableandeffectiveexpressionof
ult,wastesarereduced.
WRKY
gene
familyisatypeoftranscriptionalregulatoryfactorswhichhasspecificfunctionsin
WRKY
gene-encodedtranscriptionalregulatorsappeartobeinvolvedin
variousphysiologicalprograms,includingdisease-resistance,senescence,stress
responsesofbioticandabiotic,growthanddevelopmentprocesses.
Weclonesa
WRKY
genepromoterinZeaMaize,andanalysethefunctionswith
hthepromoterreductionexperiment,ricegenetic
transformationandGUSstaining,wegettheacheievementsasbelow:
1.A2880bppromoterfragmentof
WRKY
geneisamplifiedbypolymerase
chainreaction(PCR)techniquefrommaizeB73,cast
somecis-elementsinP2880fromPLACEwebsite.
supstreampromoterof
WRKY
gene,four5’missingpromotersare
cloned,whoselengthare2880bp,1812bp,1254bp,680bpand355bprespectively.
ThesefivepromotersandplasmidpCAMBIA1301whichcontainsGUSreportergene
areattachedtoconstructpCAM2880GUSandfour5’missingpromotercarriers
whosenamearepCAM1812GUS,
allplant
pCAM1254GUS,
expressional
pCAM680GUS
torice
and
by
pCAM355GUSrespectively.
erringvectors
Agrobacterium-mediatedtransformation,ing
toexperimentalresults,theGUSstainingresultofcallustissuerelatedto
pCAM2880GUSvectorisblue,whereas,othervectorssuchaspCAM1812GUS,
pCAM1254GUS,lusion,the
coreareaofP2880promoterisbetween2880bpand1812bpbeforetranscriptionstart
site.
Tosumup,weclonea
WRKY
genepromoterinmaize,andfoundthatthe
snoreportof
WRKY
genewhichis
ningofthispromoterhasthevitalsignificance.
-II-
Keywords:Maize,Promoters,Ricegenetictransformation,GUSstaining,
callus-specific
-III-
1文献综述
1.1植物启动子概述
1.1.1启动子的概念
启动子（promoter）位与基因的上游，是一段提供RNA聚合酶识别和结合
的DNA序列。一旦RNA聚合酶定位并且结合到启动子序列上，即可启动转录
基因的表达首先是该基因5’端启动子序列能否被植物的RNA聚合酶所识别，
从而启动基因的转录
[1]
。RNA聚合酶转录过程的开始必须定位并且和启动子结
合，所以使基因表达的启动子是一个重要的顺式作用元件，启动子调控的实质是
它与RNA聚合酶或者其他的蛋白辅助因子等反式作用元件相互作用的结果。
启动子作为基因的表达调控重要的顺式作用元件，具有下面四个特征：1)
序列特异性。在启动子的基因序列中，一般含有若干个保守序列框，在序列框中，
若碱基序列发生改变，会使得转录启动滞后并且使得转录速度减慢。2)方向性。
启动子具有方向性，在其正反两个方向中，只有一个方向具有启动的功能。3)
位置特性。启动子在所要启动的转录基因上游或者基因内部的前端。4)种属特异
性。通常亲缘关系越相近的两种生物，启动子通用的可能性越大。
1.1.2启动子的结构
真核生物中，有三种RNA聚合酶，并因此将这三种RNA聚合酶作用的启
动子分为三类:类别I启动子、类别Ⅱ启动子、类别Ⅲ启动子。真核生物的启动
子Ⅱ由两大部分组成：核心启动子元件（corepromoterelement）和上游启动子元
件
(1)
（upstreampromoterelement）。
核心启动子元件（corepromoterelement）
核心启动子区域包括了启动子必须的转录起始位点和TATA盒。TATA盒是
位于转录起始位点上游的一段保守的基因序列，它富含AT碱基对。TATA盒有
7对保守的碱基序列：5’-TATA（A/T）A(A/T)-3’，提供RNA聚合酶Ⅱ的结
合位置，在很多情况下也会影响到基因的转录水平。TATAbox是第一个被确定
的RNA聚合酶Ⅱ的启动子元件，也是一些反式作用因子与DNA相互作用的位
点之一。植物的启动子的TATA框是在转录起点的上游约50bp处的一段序列，
富含AT碱基对，它的保守的序列为TCACTATATATAG。
(2)上游启动子元件（upstreampromoterelement）
在许多真核基因启动子中，位于转录起始位点上游大约80bp-220bp的序列
都有上游启动子元件，它们可以很大程度上提高基础启动子的转录活性。较为重
要的上游元件有两种：一种是一般上游元件，比如CCAAT盒和GC盒，普遍存
在于真核基因启动子中；另一种上游元件是启动子特有的上游元件。
-1-
(3)其他影响基因表达的调控序列
除启动子外还有一些特定序列能提高基因的转录速率或加工效率，比如增强
子、5’UTR(5’-非翻译序列)、3’UTR(3’-非翻译序列)、Kozak序列、沉寂子
等。
1.1.3植物启动子的分类
可以依据不同的标准对启动子进行分类。按启动子来源可分为：原核启动子
和真核启动子；从转录模式上，启动子又可以分为组成型启动子和诱导型启动子。
植物基因工程常其作用方式及功能可分为三类:组成型启动子、诱导型启动
子和组织特异性启动子。
(1)组成型启动子
组成型启动子能在所有细胞中都能启动基因表达，基因表达的产物具有稳定
性和持续性，基因的表达量随着植物的生长发育不发生明显的变化。研究发现，
在组成型启动子的转录起点的上游的几百个核昔酸处，有共有序列TGACTG
[2]
。
现在被广泛应用的组成型启动子有如下几种：水稻actin基因启动子(Act1)、花椰
菜花叶病毒CaMv35S启动子、水稻Ubiquntin基因启动子、章鱼碱合成酶基因(oes)
启动子以及土壤根癌杆菌Ti质粒的胭脂碱合成酶基因(Nos)启动子。花椰菜花叶
病毒355启动子现在被广泛的应用，它的启动活性强，而且表达量高，所以在双
子叶植物中的应用己经得到人们的认可，但在单子叶植物中，它的调控表达能力
较弱
[3,4,5]
。水稻Actl启动子也是表达量高、启动性强的组成型启动子，actin基
因表达的产物是植物细胞骨架的基本组成成分，所以在所有的组织中，它的启动
子都有活性
[6]
。水稻ubiquntin基因启动子近年来越来越受到人们的重视，由于它
的转录活性较高，所以现在已经在植物转基因中得到应用
(2)诱导型启动子
植物在生长发育的过程中如果受外界环境的影响，就会使得基因表达发生改
变。在物理或者化学信号的诱导下调节基因转录水平的启动子是诱导型启动子。
根据不同的诱导因素，诱导型启动子可被分为如下几种：环境响应启动子、激素
响应启动子、创伤诱导型启动子、真菌诱导型启动子等
[8]
。
1
[7]
。
环境响应启动子
在长期进化的过程中，植物已经对一定范围内的光、温、水等环境因素做出
反应，环境响应启动子对基因转录表达起了关键的作用。这一类启动子主要包括
光效应启动子、温度效应启动子和水效应启动子
[9]
。
A.光效应启动子
LampPa等(1985)克隆出小麦Cab基因，并经研究发现，在转基因的烟草中，
Cab基因具有光调控效应和器官特异性
[10]
。王念捷等(1996)克隆出水稻R4CL-1
-2-
基因，并与Gus基因融合构建表达载体，转化烟草，在紫外光诱导下，R4CL-1
启动子能在植物发育过程中特异性的表达
[11]
。Awinderks等(1999)发现在光诱导
下，LTP启动子可以启动GUS基因在转基因的拟南芥侧根、花药、柱头和维管
组织中的表达，它的启动子中存在有GT-1位点、I-盒、G-盒和AT-rich等顺式作
用元件
[12]
。水稻中的三个八番茄红素合成酶基因OsPSYI，OsPSYⅡ和OsPSYⅢ
的启动子都受到脱落酸的诱导；前两者受光诱导，后者则不表现出光诱导性。
[13,14]
。
Mariaac等(1996)从向日葵中克隆出编码小热激蛋白(sHSPS)HaHsp18.6G2和
B.温度效应启动子
HaHspl7.7G4的基因，发现前者只具有热诱导活性，而后者对高温(42℃)、ABA
和水分诱导都有应答
异序列
2
[16]
[15]
。通过比较番茄中的两个热胁迫转录因子(Hsfs)LPHsfA1
和LPHsfA2的序列得出：Hsf启动子的选择度依赖于高温诱导响应元件的一段特
。
真菌诱导表达启动子
在进化的过程中，高等植物在应对病原菌的侵染时，形成了非常严密的抗病
防御系统，病原菌的侵染能够诱导许多启动子的表达。几丁质酶基因在植物受到
病原菌侵染后进行的抗病防御中起着重要的作用，在烟草的悬浮培养细胞中，真
菌的强烈诱导类型Ⅰ的几丁质酶的表达，转录起始位点上游-788bp至-345bp是
转录的核心区域，是诱导表达所必需的
[17]
。Jorda等(2000)把马铃薯P68B和P69C
基因的启动子分别与GUS和LUC报告基因融合转化拟南芥，实验结果发现在受
到水杨酸诱导和假单胞菌的诱导下，P68B和P69C启动子启动抗性作用
[18]
。
Gulderdoni等(2002)发现水稻中的脂质转移蛋白基因LtpI的启动子是真菌诱导表
达启动子
[19]
。SaskiK等(2004，2007)克隆出水稻的两个过氧化物酶基因R2329
和R2184，结果得出这两个启动子受到稻瘟病菌感染的诱导表达，进一步研究发
现，R2329基因启动子的-1798bp至-748bp，R2184启动子的-1975bp到-548bp的
序列中含有许多诱导响应元件，包括脱落酸响应元件，茉莉酮酸响应元件和乙烯
响应元件等
[20,21]
。
3
创伤诱导表达启动子
在植物遭受自然创伤或者害虫造成的机械损伤时，许多植物能够受到创伤的
诱导，使得基因特异性的表达。李红等(1997)发现水稻受到创伤诱导后，RCH8
启动子启动GUS基因的表达。而后进行缺失分析发现该启动子缺失至-676bp的
后，GUS酶活性显著下降，当缺失到-68bp处时，启动子的活性极低
[22]
。此外，
泛素-核糖体蛋白融合基因ubi3基因启动子同样也是创伤诱导型启动子
[23]
。在水
稻的叶片中，水稻蛋白酶抑制蛋白基因(OsPI8-I)启动子也受到创伤诱导
[24]
。
-3-
Alexandre等(2007)在研究puroindoline-a基因(PinA)启动子时发现：在水稻中，
PinA启动子同样也是创伤诱导型启动子
[25]
。
4
植物激素诱导表达启动子
生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯等都是植物生长发育中不可缺
少的激素。
A.生长素诱导表达启动子
Nagao等克隆出GH3启动子并且发现：该启动子序列中含有两个相互独立
的生长素效应元件，且二者都含有一个生长素诱导表达必需的TGTCTC基元
(motif)
[26]
。
B.赤霉素诱导表达启动子
wolf等(1992)研究发现：在一些禾本科植物α淀粉酶启动子中，可能是元件
之间组合或者赤霉素效应复合体得作用导致了赤霉素响应的产生
[27]
。Gubler等
(l992)研究发现：在低等电点的大麦α淀粉酶启动子Amy32b中，若嘧啶序列发
生突变，则会导致赤霉素诱导的表达丧失；而相反的，在某些高等电点的α淀粉
酶启动子中，如果嘧啶序列发生缺失，赤霉素诱导的效应活性并没有太大影响。
在这高低等电点的α淀粉酶启动子中，若TATCCAC序列突变，则赤霉素的诱
导表达均基本丧失
[28]
。
C.脱落酸效应启动子
脱落酸效应元件一般含有G-box结构，其特异表达元件的序列为5’-(C/G/T)
[28]
。ACGTGG(C/G)-3’ABA诱导水稻Osem基因，该基因的启动子含有类似ABA
效应元件的结构5’-ACGTG-3’和5’-CATGCATG-3’（SPh-盒）
D.乙烯效应启动子
[29]
。
在某些植物中，乙烯大量的合成和释放对果实的成熟起非常重要的作用。在
番茄果实成熟过程中，乙烯激活E8基因，并且使其高效的表达
[30]
。在抗病的启
动子中，GCC-盒以及其它的一些元件，比如G-box，对产生乙烯效应有着重要
的作用
(3)
[31]
。因此，乙烯效应元件可能有多种类型。
组织特异性启动子
组织特异性启动子即器官特异性启动子（organ-specificpromoter）。在这些
启动子调控下，外源基因在某些特定的器官或者组织中表达。这种类型的启动子
最大的优点是：它启动外源基因在受体植物中特异的表达，在需要该基因大量表
达的特定组织部位则高效的表达，得到预期的效果
[32]
。因此，组织特异性启动子
一直以来都是植物基因工程中研究的重点和难点。
1
维管组织特异性启动子
木质部和韧皮部是植物维管组织的组成部分，维管组织可以形成和维持植物
-4-
器官的形态，可以运输水分、养分，但是也是许多植物病虫害直接侵害的部位。
因此，利用维管组织特异性启动子驱动目标基因在植物的维管组织中特异表达，
可以有效的发挥目的基因的作用。维管束特异性启动子可以使抗病、抗虫基因在
维管束中高效特异表达，能够运用于防治病虫害
[33]
。现在己经克隆出了拟南芥
Prof基因、菜豆富甘氨酸细胞壁蛋白GRPl.8基因以及黄豆蔗糖结合蛋白基因
SBP2的启动子
[34]
，并对它们进行了功能分析。国外有人将菜豆富甘氨酸细胞壁
蛋白GRPl.8基因的启动子与报告基因相连，转化烟草，实验结果发现在烟草的
根、茎、叶的木质部内有特异性的表达，其中根的表达最强，茎的表达低于根，
叶的表达最弱
[35,36]
。
2
根特异型启动子
Tittareth等克隆了AtAGP18基因启动子，发现它能够使得GUS基因在根，
花和茎中高效的表达，在根中的表达最强，而在莲座叶和幼苗中表达相对较弱
[37]
。
3
茎特异性启动子
在茎特异性启动子中橡胶树乳管特异表达REF启动子，长度为306bp片段，
是一个强启动子，能够实现该启动子的全部功能，可以通过光、热、损伤等诱导
启动子活性
[38]
。此外，有人认为长度800bp的GBSS启动子能够驱动GUS基因
在块茎和葡匐茎中高表达，长度400bp的启动子也可以表现块茎专一性
是块茎表达专一性最强烈的启动子
[40]
。
4
[39]
；也
有研究者认为1600bp的启动子才能表现块茎的专一性，而长度2900bp的启动子
叶特异性启动子
拟南芥绿色组织特异表达AtSTP3启动子，可通过受伤诱导，驱动GUS基
因在转基因水稻叶片中特异表达
米及马铃薯等植物中都有发现
达，且受光诱导
[43]
[41]
。水稻rbcS启动子含两个顺式作用元件，一
是光效应启动子调控元件；二是rbcS保守序列，这两个元件在烟草、拟南芥玉
[42]
。rbcS启动子（1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧
酶的小亚基）可驱动GUS基因在转基因玉米和水稻叶片及叶鞘内的叶肉细胞表
。王利军等克隆了拟南芥atslA基因启动子，并且构建了植
[44]
物的瞬时表达载体，为植物叶绿体中的特异高效表达提供新途径
性高于355启动子9倍
[45]
。
5
。杨予涛克
隆了PNZIP基因启动子，并且证明了在叶片组织中，全长的PNZIP启动子的活
花器官组织特异性启动子
植物花特异表达启动子的分离克隆为花卉的品质改良提供了重要作用，在植
物开花时期可以启动基因表达，而在其它时期、植物的其它部位或者组织中不表
达或者表达量低。近年来人们分离和鉴定了许多花的特异表达基因启动子，其中
对查尔酮合成酶基因家族的CHS启动子的研究最为深入。Yu
[46]
等分离得到了兰
-5-
花同源异型基因DOMADS1，并证实了几个推断的DNA结合位点；当AP3启动
子转录因子TF激活后，AP3启动子可以驱动GUS基因在转基因植物的花瓣中
表达活性剧增
[47]
。此外，花特异表达的启动子还有矮牵牛PchsA和菊花UEPl花
特异表达启动子
[48,49]
。
6
果实特异性启动子
果实对植物的繁衍有着重要作用，研究果实特异性启动子对我们了解启动子
的调控机制和果实的发育过程有着非常重要的理论意义。植物果实相关基因启动
子一般与乙烯形成有关，研究比较深入的有E4、E8、PG、2All等基因的启动子
[50]
。目前对双子叶植物启动子研究最多的是番茄，Chen等从番茄中克隆了ACO
基因家族的Ell启动子，将1200bp和2000bp的序列区域与报道基因gusA融合
并且转化番茄
[51]
。结果发现2000bp的序列区域都能引起果实特异的高表达，而
1200bp的序列区域可以在缺水和创伤诱导时在果实中表达。
7
种子特异性启动子
时间和空间可以调节种子特异性启动子的表达。石东乔
[52]
等从甘蓝型油菜
(Brassicanapus)品种H165中克隆了种子贮藏蛋白基因BcNA1的启动子，将此启
动子与gus基因融合转化烟草，结果发现BcNA1基因启动子是种子特异性启动
子。
1.2启动子分析的方法
目前，生物信息数据库服务己实现高度的计算机化和网络化，现在可通过数
据库的生物信息学方法分析调控元件
[53]
。植物启动子顺式作用元件数据库如下：
1.2.1TRANSAFC数据库(TRANSAFC)
TARNSFAC数据库(TranseriptionalFaetorDatabase)是由德国生物工程研究所
开发，它是真核生物基因调控转录因子的数据库，它是一个较为全面的二次数据
库，包括六个子库，依次为顺式调控位点、基因、转录因子、细胞来源、分类和
调控位点核甘酸分布。TARNSFAC数据库于1988年建立，运用关系数据库模式。
近几年，该数据库进行进一步的开发，特别在植物方面快速发展
[54,55]
。
1.2.2PLACE数据库(/sigsean/)
随着水稻、玉米等植物基因组计划的完成，大量的植物基因序列出现，但是
TRANSFAC中所包含较少的植物基因的顺式作用元件，所以从包含植物转录因
子的数据库PALCE(Plnatcis-actingregulatoryNDAelmenets)产生。由日本的农、林、
渔部门主管开发的PLACE数据库，主要收集己发表的维管植物基因的顺式作用
元件。用户可以在该数据库中查询自己序列中存在的顺式作用元件，数据库可以
快速的报告相关顺式作用元件的介绍
[56,57]
。
-6-
1.2.3PlantCARE数据库(:8080/PlantCARE/)
PlantCARE数据库是包含了植物顺式作用元件、增强子和抑制子，大概介绍
了高等植物的160个启动子，共收集了417个顺式作用元件，其中单子叶植物
150个，双子叶植物263个，松柏科植物4个。Plant数据库是一个可以自动更新
的数据库，但是必须经过一段时间监控这些调控元件才能够补充到该数据库中去
[58]
。
1.3启动子克隆的方法
目前，克隆启动子的方法主要有两种:一是利用探针筛选启动子；二是利用
PCR技术获得启动子，其中主要包括己普通的PCR技术、反向环化PCR技术、
染色体步移等
[59]
。
1.3.1探针载体筛选启动子
启动子探针载体筛选启动子的方法非常常用，它是利用缺失启动子产物易检
测的报告基因系统，构建出启动子探针质粒载体，克隆出具有启动子功能的DNA
片段。启动子探针载体包括了两个部分：转化单元和检测单元。构建启动子探针
型载体时，常见的检测标记基因有β-半乳糖甘酶基因(LacZ)，氯霉素乙酰转移
酶基因(cat)，四环素抗性基因(Tetr)和卡那霉素抗性基因(Kanr)。近些年来人们开
始较多的使用潮霉素β-磷酸转移酶基因(hyg)作为检测标记的基因。有研究者以
氯霉素作为报告基因
[60]
。Fodor
[61]
等以大肠杆菌LacZ为报告基因，以其作为探
针获得一些启动子片段。李维等
[62]
设计了含有潮霉素抗性基因的启动子探针，从
大肠杆菌中克隆出黄抱原毛平革菌基因的启动子。该方法具有时间短，效率高的
特点。
1.3.2普通PCR克隆启动子
根据己知的序列设计引物然后进行PCR扩增，从基因中克隆出启动子的方
法十分简单，所以常用此方法克隆启动子。设计引物时，在序列两端加入酶切位
点，得到的产物经酶切回收后可以直接连接到载体上相应的酶切位点上便可得到
重组质粒。所得序列进行测序后与原先序列比对，确定是否克隆正确。使用这种
方法是必须已知基因的全序列，而且只能扩增己知序列之间的DNA序列，因此，
这种方法有很大的局限性。曹军利用PCR技术成功的从番茄中分离出2A11基
因启动子序列
[63]
。苏宁等
[64]
以水稻叶绿体DNA为模板克隆出水稻叶绿体
16SrRNA基因启动子。彭仁旺等
[65]
根据烟草TA29基因序列设计特异性引物，
以烟草基因组为模板，PCR扩增到花药特异表达基因TA29启动子的片段。
1.3.3以PCR技术为基础的技术克隆启动子
利用PCR的方法扩增DNA片段非常简便快捷而且经济，随着PCR技术的
发展，人们越来越多的开始使用PCR的方法来克隆基因的启动子。目前已经开
-7-
发出多种克隆启动子的方法，包括：①环状PCR；②利用载体或接头的染色体
步行技术；③热不对称交错PCR等。
(1)环状PCR
环状PCR是基于已知的序列设计出嵌套式的引物，PCR克隆出启动子，包
括I-PCR和P-PCR两种类型。韩志勇等利用I-PCR技术克隆出转基因水稻外源
基因的旁侧序列
[66]
。利用改进的I-PCR方法，李竹红等克隆出Tcl转座子左侧
反向重复序列的旁侧序列
[67]
。利用改进的P-PCR技术，在形成panhandle结构之
前Jones等在3’端的末端连上ddCTP碱基，大大减少了引物的错配机率，使得
特异性增加。P-PCR有很高的特异性，因为它是现今可以扩增出距离我们已知的
序列最远未知DNA序列的方法
(2)
[68,69]
。
利用载体或接头的染色体步移技术
染色体步移技术是将基因组DNA经过限制性酶切，将其酶切产物与特定的
载体或者接头连接，根据已知的基因组DNA序列设计特异性引物和载体二者的
通用引物或接头序列，再进行PCR扩增。利用加接头的方法，王新国等PCR克
隆出胡萝卜Ⅱ型转化酶基因的启动子部分序列，增加了反应的特异性
[70]
。利用此
项技术，Chen等克隆出拟南芥AtGPR9基因启动子区域约3000bp的序列
[71]
。
(3)TAIL-PCR
利用改良的TAIL-PCR技术，刘耀光等从突变体中克隆出了外源插入基因的
旁侧序列，成功的为启动子的克隆提供了新的有效的方法
[72]
。
TAIL-PCR方法具有特异性高、灵敏性强的优点，在分子生物学技术研究中
已经被越来越广泛的应用。在现今国内外的研究中，TAIL-PCR主要应用确定
T-DNA的旁侧序列的插入位点并且扩增己知序列的旁侧序列，根据实验结果可
以绘制出遗传图谱或者为基因进行定位
[73-80]
。利用TAILPCR技术，Wang等在
一种小球藻属椭球体中扩增出硝酸盐还原酶基因(NR基因)的5’端，与GUS基
因连接，在藻类(alga)中检测表达，证明扩增出的序列是有驱动表达的启动子作
用元件
[81]
。利用TAIL-PCR技术，杨国栋等克隆出棉花GhNHX1基因的启动子
片段，长度为1610bp
[82]
。运用此项技术，刘召华等克隆出ACA基因5’端起始
密码子上游约700bp的序列
[83]
。
1.4植物遗传转化法
植物的遗传转化方法有农杆菌介导法。农杆菌是革兰氏阴性土壤杆菌，它有
两种类型：一种为根癌农杆菌，其中含有Ti质粒，能够诱导被侵染的植物细胞
诱发冠瘦瘤；另一种为发根农杆菌，含有Ri质粒，能诱导被侵染的植物细胞产
生毛发状根。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti质粒基因转化系统是现今
研究最多的，机理最清楚的，技术最成熟的基因转化途径。
-8-
1.5本课题研究的目的和意义
目前，商业化生产的转基因植物中广泛应用的是组成型启动子，它们驱动植
物各种组织和所有发育阶段表达
[84]
，增加了植物的代谢负担，并且造成物质和能
量的巨大浪费，往往还会引起植物形态发生改变，甚至影响植物的生长发育。所
以，采用特异性启动子可以使外源基因能够定时、定点、定量地在植物中表达，
是植物基因工程研究的重要内容。因而就需要从农作物中分离诱导特异性启动子
和组织特异性启动子。通过鉴定，确定它们的特异性元件，将这些特异元件组装
起来，形成一种能定时、定量和定点驱动目的基因表达的复合启动子为我们所用。
在水稻转化体系中转化周期是非常长的，抗性愈伤的筛选决定了水稻转化
率。利用愈伤特异性启动子可以在很短的时间内确定是否为抗性愈伤组织，进而
可以确定是否为抗性苗，可以大大减少不必要的浪费，节约成本，减少人力物力
的浪费。
-9-
2材料与方法
2.1技术路线
2.2实验材料
2.2.1植物材料
本实验所用的植物材料粳稻（ca）中花11号为国
家植物基因研究中心（北京）惠赠。
2.2.2菌株与质粒
(1)大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α菌株为安徽农业大学生物物理重点实验室
所保存。
(2)农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105菌株为安徽农业大学生物物理
重点实验室所保存。
(3)质粒pCAMBIA1301，全长11837bp。由本实验室保存。
-10-
图2-1植物表达载体pCAMBIA1301质粒图谱
Fig2-1SchematicdiagramofplasmidpCAMBIA1301
2.2.3转化受体材料与外植体培养
本实验用于转化的受体材料为粳稻（ca）中花11
号。将成熟的水稻种子去掉颖壳，用70%的酒精灭菌1-2min，0.1%的升汞浸泡
10-15min，无菌水冲洗两次，再用10-15%的次氯酸钠浸泡30-45min，用无菌水
冲洗3-4次，接种在诱导培养基上。暗培养7-10d后，剥离种子胚，接到继代培
养基上培养至长出愈伤组织。
2.2.4培养基
(1)细菌培养基
1
大肠杆菌培养基
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L；若为固体培养加琼
脂15g/L，pH=7。
2
农杆菌培养基
YEB培养基：牛肉膏5g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L；若为固体培养
加琼脂15g/L，pH=7。
(2)粳稻转化培养基
1
水稻N
6
基本培养基：N
6
大量+MS-Fe盐+B
5
有机+500mg/L脯氨酸+300mg/L
水解酪蛋白+1.0g/L肌醇30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉。
诱导继代培养基：N
6
基本培养基+2,4-D2.5mg/L。
共培养培养基：诱导培养基+100μMAS。
筛选培养基：诱导培养基+500mg/L羧苄青霉素+50mg/L潮霉素。
2
3
4
-11-
5
分化培养基：N
6
基本培养基+0.25mg/LNAA+2mg/L6-BA+0.5mg/LKT+
500mg/L羧苄青霉素+50mg/L潮霉素。
生根培养基：1/2MS基本培养基+NAA1mg/L。
所有培养基pH均为5.8，热不稳定性化合物如抗生素、AS、6-BA及KT细
6
菌滤器除菌后于培养基温度降至50℃左右时加入。
(3)抗生素储液配制（见表）
表2-1抗生素储液配制
Table2-1Confectofantibiotics
抗生素种类
Nameofantibiotic
氨卞青霉素(Amp)
卡那霉素(Kan)
利福霉素(Rif)
羧卞青霉素(Carb)
溶剂
Solvent
H
2
O
H
2
O
甲醇
H
2
O
储存液浓度
Concentrationofstock
100mg/mL
100mmol/L
10mg/mL
100mg/mL
使用浓度
Usageoncentration
100mg/L
50mg/L
50mg/L
500mg/L
(4)主要试剂和仪器
PCR引物、DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物有限公司；
LA-Taq-MixDNA聚合酶、碱性磷酸酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购
自大连宝生物工程有限公司；
卡那霉素（Kan）、氨苄青霉素（Amp）、羧苄青霉素（Cb）、利福平（Rif）、
潮霉素B（HygromycinB）均购自Sigma公司；
其它常用化学试剂均为国产分析纯。
光照培养箱、高速冷冻离心机(LCJ-64-0,SCR20B)、小型高速离心机
(HemaTGL-16H)、5810R型大型冷冻离心机（eppendorf）、制冰机（Sanyo）、
PCR扩增仪（WhatmanBiometra-96PCR仪）、紫外分光光度计(HitechU2001)、
VORTEX-2型涡旋振荡器（Genie）、酸度计、电子天平（Sarhorius，BS210S
型）、电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)、Kodak凝胶成像系统、恒温水浴
(Grant)、常温冰箱、-20℃低温冰箱（Sanyo）、-70℃超低温冰箱（Sanyo）、琼
脂糖凝胶电泳仪（DYY-6C型）、电泳槽（北京六一厂）、高压灭菌锅（Hirayama
HVE50）、恒温摇床（武汉中科院科学仪器厂）、手提式紫外检测仪、超净工
作台（苏净）及其它分子生物学实验常用设备。
2.3实验方法
2.3.1CTAB法提取玉米基因组总DNA
(1)
1
试剂的配制
CTAB提取液：2%（w/v）CTAB、100mmol/LTris-HCl（pH8.0）、20mmol/L
-12-
EDTA（pH8.0）、1.4mol/LNaCl，临用前65℃提前水浴，然后再根据所用
体系加2%的β-疏基乙醇。
2
3
CTAB/NaCl溶液：10%（w/v）CTAB、0.7mol/LNaCl。
CTAB沉淀液：1%（w/v）CTAB、50mmol/LTris-HCl（pH8.0）、10mmol/L
EDTA（pH8.0）。
高盐TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），0.1mmol/LEDTA（pH8.0），
1mol/LNaCl。
4
(2)基因组DNA的提取方法
1
2
提取前将材料在暗处处置24h，以降低材料的淀粉含量（视材料而定）
剪取大约1g叶片，置于研钵中，倒入液氮研成粉末，分装入50mL的离心管
中，每管加入6mL预热的CTAB提取缓冲液，温和彻底的混匀，静置，使裂解
彻底；
3
4
65℃水浴中保温1-1.5h；
冷至室温后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分温和混匀直
至叶片粉末由绿转白（水相，酚相混匀成乳状液）；
室温下13000rpm离心10min，吸取上层水相，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：
1）在抽提一次，13000rpm离心10min；
取上层水相，加入十分之一体积的3M醋酸钠，加入2倍体积的无水乙醇沉淀
DNA，-20℃放置30min，13000rpm离心10min；
小心倒出每管中的液体，用70%乙醇洗涤沉淀1-2次，每次将沉淀适当浸泡以
充分洗涤，最后一次稍加离心，将洗涤液尽量去除干净，通风橱中晾干，约
10min左右（不要过分干燥）；
5
6
7
8
加200μLTE溶解沉淀，加入适量的RNaseA至终浓度为50μg/mL，37℃保温1h
溶解沉淀，充分混匀，并消化RNA；
取3μL样品在0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分
光光度计法检测DNA纯度（将DNA稀释50倍后分别测OD
260
和OD
280
，并计算
OD
260
/OD
280
的比值）。
9
2.3.2PCR克隆启动子序列
(1)引物
根据目的基因片段序列和植物表达载体设计引物，一般引物序列中GC含量
在40%-60%之间。四种碱基最好随机分布，尽量避免聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
一般引物长度为在15至30个碱基之间，Tm值最好不要相差太大，并且尽量少
少含发夹结构和引物二聚体。根据这些原则设计的引物如下：
引物1（上游引物）：5’-CCGAAGCTTATGACAAGAGAAGTTGGACAAG-3’
-13-
引物2（上游引物）：5’-CCGAAGCTTGGCTGCTTGTTATTATGC-3’
引物3（上游引物）：5’-CCGAAGCTTCCCCTTCACTCATTACAC-3’
引物4（上游引物）：5’-CCGAAGCTTCACTCTTATTGTCGGCTTG-3’
引物5（上游引物）：5’-CCGAAGCTTCTAAAATGTCACCTTTGCCCCT-3’
引物6（下游引物）：5’-GCGAGATCTTCAGATCGACCTCCTAGCTCTA-3’
(2)反应体系
表2-2
Table2-2
PCR扩增的反应体系
PCRamplificationreactionsystem
ddH2O
5’primer(10μmol/L)
3’primer(10μmol/L)
Template(50ng/μL
）
LA-TaqDNApolymerase(5U/μL)
Total
(3)反应程序
21.5μL
1μL
1μL
1.5μL
25μL
50μL
94℃预变性5min，94℃30s，55℃40s，72℃2min，共35个循环，然后72
℃延伸10min。4℃保温。扩增后的产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果拍
照记录。
2.3.3PLACE分析
PLACE是一款专业的植物DNA顺式调控元件分析在线数据库。
(/PLACE/)，使用该软件在线进行分析，
操作步骤如下：
(1)进入PLACE数据库网站界面；
(2)将pi-hit-1基因转录起始位点前DNA序列输入序列对话框中；
(3)点击submit键，开始进行预测；
(4)对预测结果进行分析。
2.3.4质粒的重组与转化
(1)大肠杆菌感受态细胞的制备
1
2
挑取单菌落接种于3-5mLLB液体培养基（LB）中，37℃过夜活化；
按1:50-100的比例接种于100mLLB液体培养基上扩大培养2-3h，37℃220
rpm培养至OD
600
=0.3左右；
取10mL培养菌液移入10mL离心管中，冰上放置10min后，4℃下5000rpm
离心10min；
弃上清收集菌液，用预冷的100mmol/LCaCl
2
溶液5mL轻轻悬浮细胞，冰浴
-14-
3
4
15min，4℃下5000rpm离心10min；
5
弃去上清，加入0.5ml预冷100mmol/LCaCl
2
溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置几
min，即为感受态细胞；
取200μL感受态细胞分装到1.5mLeppendorf管中，用占总体积15%的甘油
（灭菌的）混匀保存，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
6
(2)DNA片段的回收和纯化
使用DNA快速纯化/回收试剂盒（生工生物工程公司生产的UNIQ-10柱式
DNA胶回收试剂盒）进行纯化。
1
2
割下含目的DNA的琼脂糖块，使它尽可能小，放入1.5mL离心管中；
估计液体总量，加入3倍体积的结合液BindingBuffer，充分混匀，置于55-65℃
水浴中10min，至胶完全融化；
将溶液转移到离心柱中，静置2min，12000rpm室温离心1min；
取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的溶液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管
中，室温离心12000rpm离心1min；
将离心柱重新装在收集管中，置于室温或37℃烘干箱中数min，充分晾干以
除掉洗涤液中的乙醇；
将晾干后的离心柱装在一个高压灭菌处理过的1.5mL离心管中，向离心柱
膜中间位置悬空加入20‐50μL洗脱液EB或去离子水，室温静置2min，
12,000rpm离心1min，洗脱DNA；
3
4
5
6
7
洗脱得到的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测，或分光光度计定量后，冻存于‐
20℃备用。
(3)PCR扩增片段与Easyvector的连接
表2-3
Table2-3
克隆载体的构建
Thepathwayofcloningvectorconstruction
PCRfragment
PMD18-TVector
Ligase
10×LigaseBuffer
ddH2O
Total
(4)连接产物转化大肠杆菌DH5α
1
2
3
5.5μL
1μL
1μL
1μL
1.5μL
10μL
将5μL的连接液移入含有20μL感受态细胞的1.5mL离心管中；
冰浴30min，每隔5min轻弹管壁；
42℃水浴热激90s，立即冰浴5min；
-15-
4
5
加入100μL不含Amp的LB液体培养基，37℃下180rpm/h；
在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基表面，加40μL20mg/mLX-gal、
4μL200mg/mLIPTG涂布于平板表面；
分别吸取80μL培养液涂布含Amp（100μg/mL）的LB固体培养基上，涂布
均匀，待液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养16-24h；
6
(5)质粒DNA的小量提取
1
挑取含有Amp（100μg/mL）平板上的单菌落，接种到7mLLB液体培养基，
37℃下220rpm培养过夜；
将菌液倒入1.5mL的eppendorf管中，12000rpm离心1min收集菌体；
弃上清，将管倒置于吸水纸上，使液体流尽；
加入预冷的溶液Ⅰ100μL，让悬浮菌体沉淀，室温下放置5-10min；
加入新配制的200μL溶液Ⅱ，轻轻混合均匀，至冰上5min；
加入150μL预冷的溶液Ⅲ，轻轻颠倒混合均匀，冰浴5-10min；
在室温下12000rpm离心15min；
将上清倒入干净的1.5mLeppendorf管中，加入等体积（约450μL）酚/氯仿
（1：1），剧烈震荡混匀，12000rpm离心5min；
注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。
将上层水相移入干净的1.5mLeppendorf管中，加入2.5倍体积的异戊醇充分
震荡混匀后置于-20℃冰箱中2-3min，12000rpm离心10min；
彻底弃上清，沿管壁加1mL70%乙醇漂洗沉淀（颠倒两次），立即倒去上清
后，自然干燥；
将沉淀溶于30μLTE缓冲液（PH8.0，含20μg/mL的RNaseA）中，37℃保
温30min，储于-20℃冰箱中；
取5μL样品于在1.1%琼脂糖凝胶上电泳检查质粒提取情况。提取的质粒于
-20℃保存备用。
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
2.3.5转基因水稻的获得
(1)重组质粒转化根癌农杆菌
1
2
3
4
5
将3-5μL载体质粒DNA加入到200μL感受态细胞中混匀；
冰浴5min，液氮冷冻1min后置于37℃水浴5min；
加入300μLYEP液体培养基，28℃，150-200rpm/min预表达4-5h；
吸取上述菌液80μL左右涂布于含相应抗生素的YEP固体平板上，涂布均匀；
28℃培养1-2d。
从-70℃超低温冰箱里取出冻存的农杆菌EHA105在冰上融化后，划线接种
(2)根癌农杆菌感受态的制备
1
-16-
于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP固体平板上，于28℃暗培
养2d左右；
2
从将单菌落接种于5mL含50mg/L利福霉素的YEP液体培养基中，
28℃160-250rpm，培养过夜，取2mL菌液转入50mlYEB培养基中扩大培养，
5h暗培养；
3
4
4℃5000rpm离心5min；
弃去上清液，加入10mL100mmol/LCaC1
2
溶液，重新轻轻悬浮菌体，冰浴
20min；
制备好的农杆菌感受态细胞，分装于无菌eppendorf管中，每管约200μL，
经过液氮速冻1min后，贮存于-70℃长期保存。
5
(3)农杆菌转化水稻
通过农杆菌感受态的方法将含目的基因的质粒导入农杆菌菌株EHA105中，
经菌落PCR筛选出阳性克隆，然后用共培养法将含有目的基因的农杆菌导入植
物受体材料转化水稻。
1
水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养与继代培养
将水稻去壳用灭菌水冲洗二次，再用70%的乙醇浸泡1-2min，然后用50%次
氯酸钠浸泡10min，进行表面消毒。消毒后用无菌水冲洗3-4次，再将胚放在无菌
滤纸上吸干表面水分，接种到含2,4-D2.5mg/L的N
6
培养基上诱导愈伤组织，28
℃强光培养。
约10-15d后，水稻幼胚盾片长出的愈伤组织，将这些愈伤组织切下转入继
代培养基上，在相同条件下继续培养，5-7d后，挑选继代培养色泽淡黄、愈伤块
紧密的的愈伤组织作为受体材料。
2
用于转化水稻的农杆菌菌液的准备
将含有植物表达载体的农杆菌接种于YEB液体培养基（含有50μg/MLrif和
100μg/mLKan）中，28℃振荡培养至OD
600
为0.5-0.6，将菌液在室温下5000rpm，
离心5min去除含抗生素的液体培养基，将收集到的菌体悬浮于含AS的液体共培
养基中，调整菌体浓度至OD
600
为0.3-0.5，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮
液。
3
愈伤组织与农杆菌的共培养
挑选金黄色致密的愈伤组织放入100mL无菌三角瓶中，加入50mL农杆菌
悬浮液，放入摇床上28℃150rpm振荡培养20min。倒掉菌液，将愈伤组织放在
无菌滤纸上吸去表面多余菌液，最后接种到固体共培养培养基上，22℃暗培养
3d。
4
洗菌及抗性愈伤的筛选
-17-
用无菌水清洗愈伤3-4次至清洗液透明，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面水分，
转入附加有50mg/L羧苄青霉素的溶液中振荡30min，用无菌滤纸吸干，将愈伤
转移至加有50mg/L羧苄青霉素的选择培养基中。
5
抗性愈伤组织的分化
经过一个月的潮霉素筛选后愈伤组织周围长出乳黄色的抗性愈伤，挑选乳黄
色致密的潮霉素抗性愈伤转至附加有50mg/L潮霉素的分化培养基上，28℃强光
照条件下培养，15-25d左右出现绿点，30-40d后分化出小苗。
6
生根、壮苗和移栽
当分化出的抗性小苗长到高度大于2cm时，移到附加有50mg/L潮霉素的生
根培养基上培养2周。选择高15cm以上、根系发达的抗性小苗，洗去根表面的
培养基，最后移栽到温室。
2.3.6转基因植株的PCR分析
(1)潮霉素引物
引物7（上游引物）：5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’
引物8（下游引物）：5’-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3’
(2)反应体系
表2-4PCR扩增的反应体系
Table2-4PCRamplificationreactionsystem
ddH2O
5’primer(10μmol/L)
3’primer(10μmol/L)
Template(50ng/μL）
LA-TaqDNApolymerase(5U/μL)
Total
(3)反应程序
21.5μL
1μL
1μL
1.5μL
25μL
50μL
94℃预变性5min，94℃30s，55℃40s，72℃2min，共35个循环，然后72℃
延伸10min，4℃保温。扩增后的产物在含有0.5μg/mL溴化乙锭（Ethidium
Bromide）的2%琼脂糖凝胶上电泳，电压为5v/cm，电泳结果由Kodark凝胶成
像系统拍照记录分析。实得片段大小约1Kb。
2.3.7GUS活性检测
(1)GUS染液配制
1
200mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0），制备方法：
A液：称取NaHPO·2HO3.12g溶于蒸馏水，定容至100mL；
B液：称取NaHPO·12HO7.17g溶于蒸馏水，定容至100mL；
-18-
取100mLB液与40mLA液混合（混合后pH值约7.03），用NaHPO·2HO调
至7.0。
2
GUS缓冲液（4℃保存）配方：
磷酸钠缓冲液（PH7.0）50mmol/L
Na
2
EDTA10mmol/L
K
3
[Fe(CN)
6
]2mmol/L
K
4
[Fe(CN)
6
]2mmol/L
TritonX-1001%(v/v)
甲醇20%(v/v)
3
GUS染色液：N，N-二甲基甲酰胺溶解x-Gluc粉剂，配制成20mM的溶液，
-20℃下保存备用。
(2)染色方法
1
取待检测的植物组织于小离心管中，加入GUS染液浸没组织块，混匀后37℃
下保存16-24h；
叶片等绿色材料转入70%乙醇溶液中脱色2-3次，直至阴性对照材料呈白色；
肉眼或显微镜下观察，白色背景下的蓝色小点即为GUS表达载体。
2
3
-19-
3结果与分析
3.1启动子的克隆与序列分析
3.1.1启动子的克隆和生物信息学分析
(1)启动子目标片段的克隆
根据预测的基因设计引物（引物1），从玉米B73基因组中扩增出编码区5’
端上游大小为2880bp的调控序列，命名为P2880(图3-1)。将扩增产物处理后连
接到pMD18-T-vector载体上得到ZMW2880，仍需测序验证。
图3-1PCR扩增P2880的DNA序列
M：DL2000plus；1：PCR产物
icationofP2880DNAsequence
M：DL2000plus；1：PCRproduct
(2)特异性启动子片段的生物信息学分析
将鉴定正确的阳性克隆菌测序，结果表明，该基因长度为2880bp，并且与
已发表的基因相似性为99%，所以将其确定为目的基因。将所测片段的序列放
在启动子顺式作用元件预测网站PLACE数据库（
/sigsean
）
上进行分析，结果表明，它含有多种在其它植物启动子中存在的通用启动子元件
（图3-2），如TATA盒和CAAT盒，GATA-box等顺式作用元件和ACGT
核心序列，及诱导物(应答元件W-box（（T）TGAC（C））AACA（AAACAA））。
因此，可以推测克隆的片段为具有完整功能的启动子。
-20-
图3-2：
WRKY
的DNA序列
uenceof
WRKY
(3)
缺失启动子目标片段的克隆
根据28740的基因组序列，设计引物，以玉米B73为模板，利用PCR技术
扩增基因上游2880bp、1812bp、1254bp、680bp、355bp的5个不同长度的DNA
片段，依次命名为
P2880
、
P1812
、
P1254
、
P680
、
P355
。用浓度为
0.8%
的琼脂
糖胶(含EB)检测（图3-3）。将片段克隆进pMD18-T-vector，然后将五个片段克
隆进T载体，依次命名为ZmW2880、ZmW1812、ZmW1254、ZmW680、ZmW355
启动子。
-21-
图3-3不同长度Zmwrky5’端缺失图
M：DL2000plus；1-5：PCR产物
ticdiagramof5’terminaldeletionofZmwrky
M：DL2000plus；1-5：PCRproducts
3.2载体构建
将克隆进T载体的ZmW2880、ZmW1812、ZmW1254、ZmW680、ZmW355
启动子分别用
Hind
Ⅲ和
Bgl
Ⅱ切下，连接到
pCAMBIA1301
上相应的酶切位点中，
获得载体pCAM2880GUS。
图3-4植物表达载体pCma一owsglp构建的策略图
uctionofAgrobacteriumbinaryvectorpCAM2880GUS.
用同样的方法依次获得缺失载体pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、
pCAM680GUS、pCAM355GUS（图3-5）。这4个缺失载体上的GUS基因分别
由各载体5’端缺失后剩下的启动子部分驱动。
-22-
图3-5：不同长度5’端缺失载体图
Fig.3-5Schematicdiagramof5’terminaldeletionsvectorof
Zmwrky
阳性对照载体采用pCAMBIA1301(含有35S启动子)。启动子载体
pCAM2880GUS、pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、pCAM680GUS、
pCAM355GUS经HindⅢ和BglⅡ酶切鉴定正确（图3-6）。
图3-6：缺失载体的酶切图谱
M：DL2000plus；1-5：缺失载体酶切
ctionpatternofdeletionvector
M：DL2000plus；1-5：Restrictionofdeletionvector
3.3水稻的遗传转化及转基因植株的检测
3.3.1水稻的遗传转化
将重组表达载体pCAM2880GUS及阳性对照载体pCAMBIA1301分别转化
根癌农杆菌EHA105，在确定阳性克隆后，通过农杆菌介导法转化水稻的愈伤组
织。将水稻成熟胚诱导培养出愈伤组织（图3-7A），在继代培养基中培养一个
星期后与农杆菌共培养；然后将共培养后的愈伤组织放在的筛选培养基上，经过
10d左右，部分愈伤组织出现褐化，其中的一部分褐化了的组织之后在周围又重
新生长出金黄色的抗性愈伤组织（图3-7B）；经过大约一个月的两轮筛选，从
-23-
抗性愈伤组织中挑选出紧密的乳黄色的抗性愈伤组织，将其转至分化培养基上诱
导分化，再经过2-3星期左右，出现绿色的芽点；经过一个月左右分化出了小苗
（图3-7C）；当苗的高度大于3cm时，将小苗移入生根培养基中，将具有潮霉
素抗性的苗在生根培养基上培养2-3星期（图3-7D）；选择生长状况良好的小
苗，用灭菌水洗去附着的培养基，移入大田，精细管理（图3-7E）。
图3-7农杆菌介导的水稻转化
A：诱导愈伤；B：转化后的筛选及抗性愈伤增殖；C：抗性愈伤分化出绿色组织；
D：生根培养基中的转化苗；E：定植于培养土中的转化苗
enicriceby
Agrobacterium
-mediated
A:Inductioncalli;B:Transformedcallionselectionmedium;C:Regenerationofresistantcalli;
D:Youngseedlingsinrootingmedium;E:Transformedplantsinplasticbarrel
3.3.2转基因植株的PCR检测
经潮霉素抗性平板筛选得到的抗性转基因植株分别为
37
棵（转
P2880
）和
15棵（转1301）。用潮霉素基因设计的引物，分别以37棵和15棵转基因水稻
叶片总DNA为模板，进行PCR扩增，结果显示pCAMBIA1301的转基因植株含
有大小约为
1Kb
的目的条带，而作为阴性对照的野生型植株则没有该条带。
37
棵转基因（P2880）植株中有28棵经潮霉素PCR检测为阳性。下图给出部分转
基因植株的电泳图，8棵中有6颗验证为阳性，两颗则为阴性。
-24-
图3-8转基因水稻PCR检测结果
M：DL2000plus;1:阳性质粒;2:中花11;3-8:转基因植株
lysisfordetectingthe
WRKY
geneintransgenicrice
M：DL2000plus;Lane1:Positivecontrol;Lane2:ZH11;Lane3-Lane8:Transgenicplant
3.4GUS染色结果与分析
对获得的转基因水稻植株的不同组织进行GUS染色，检测其GUS活性。作
为阳性对照的15棵含有35S启动子的转基因植株所有组织GUS染色结果均为阳
性。37棵P2880启动子转基因植株中有22棵植株的愈伤组织的GUS染色均呈
阳性（图3-9B），而相对应的阳性植株的根、茎、叶、种子等组织中未观察到
GUS表达（图3-10A’-D’）。P1812、P1254、P680、P355启动子对应的愈伤
组织染色均未出现蓝色（图3-9C-F）。作为阴性对照的野生型植株各组织中未
检测到GUS基因的表达（图3-10A”-D”）。GUS活性的组织化学分析结果显
示Zm2880启动子能够启动GUS基因在水稻愈伤组织中特异性表达，而不能在
其它组织中表达。
-25-
图3-9转基因水稻愈伤组织的GUS组织化学染色
A:转pCAMBIA1301载体水稻愈伤的GUS染色结果;
B-F:依次为转P2880、P1812、P1254、P680、P355水稻愈伤的GUS染色结果;
G:中花水稻愈伤的GUS染色结果;
iningofthecallustissueinricegenetictransformation
A:GUSstainingofpCAMBIA1301vector
B-F:GUSstainingofP2880、P1812、P1254、P680andP355vectors
G:GUSstainingofZH11
-26-
图3-10转基因水稻根，茎，叶，种子的GUS组织化学染色
A-D:转pCAMBIA1301载体水稻的根，茎，叶，种子的GUS染色结果;
A’-D’:转pCAMBIA2880GUS水稻的根，茎，叶，种子的GUS染色结果;
A’’-D’’:对照水稻的根，茎，叶，种子的GUS染色结果;
Fig..iningoftheroots、stems、leavesandseedsinricegenetictransformation
A-D:GUSstainingoftheroots、stems、leavesandseedsofpCAMBIA1301vector
A’-D’:GUSstainingoftheroots、stems、leavesandseedsofpCAMBIA2880GUSvector
A’’-D’’:GUSstainingoftheroots、stems、leavesandseedsofZH11
以上结果表明，转基因水稻的GUS基因是在愈伤特异性启动子Zm2880的
调控下在愈伤中特异性表达。
-27-
4讨论
4.1计算机数据分析与生物实验结合的方法具有可行性
启动子是控制基因表达的转录调控区，具有高度的保守性，因此利用已有的
植物启动子分析预测数据库，对新的植物基因的启动子进行分析与预测，能够高
效经济的分析研究新基因的启动子。现在对于动物新基因启动子的研究，主要就
是采用序列分析和实验验证相结合的方式进行研究的，相对于动物基因的启动
子，高等植物基因的启动子区结构具有高度保守性和同源性，这也就为通过已知
基因启动子预测分析未知基因的启动子奠定了理论依据。但是，由于已经研究清
楚的植物基因启动子远没有动物的多，所以真对植物的启动子分析的数据库还存
在数据量小，软件自我学习能力较慢的缺点。但通过本实验证明，软件预测与实
验数据存在一致性，证明这种基于计算机数据分析与生物实验结合的方法，对于
研究玉米基因的启动子具有可行性。
4.2Zm2880启动子是一个愈伤特异性启动子
转基因植物的研究，在许多情况下，外源基因的表达需要经过严格的调控，
选择正确的启动子显得尤为重要。组成型启动子在转基因研究已被广泛使用，但
组成型启动子在空间和时间上不能得到有效的表达，而且可能造成植物能源的浪
费，甚至危害植物。组织特异型启动子摒弃了组成型启动子的缺点，在植物遗传
工程中成为转基因研究中的理想选择之一，得到越来越广泛的应用。
从玉米中克隆的
WRKY
基因启动子Zm2880与GUS报告基因融合，并构建
了融合表达载体，然后进行水稻的遗传转化，通过检测转基因水稻各个组织的
GUS活性，得到这个启动子驱动GUS基因的表达特性。结果表明克隆的玉米启
动子Zm2880为愈伤特异性表达的启动子。据Coca等报道，在水稻中和玉米中
ZmPR4启动子通过病原、真菌激动子、机械创伤激活诱导，能驱动GUS报告
基因表达，并且该启动子仅在病原侵袭部位有活性；与之相比，本实验研究的启
动子不用任何条件诱导便可在愈伤组织中特异性表达，并且表达量相较报导的未
经诱导的启动子高，与其诱导后的在肉眼观察上表达量相近。
WRKY
基因启动子
已报道的均是抗旱、抗寒、抗盐胁迫、抗病虫害等抗逆境胁迫类型的启动子，而
作为愈伤特异性启动子是首次发现。
在植物基因工程中，转化的外源基因能否在植物体中正确、高效并且按照人
们的意愿特异的表达，这是人们非常关注的问题。目前植物基因工程中常用的启
动子是组成型表达启动子。外源基因在组成型启动子的控制下，在转基因植物的
所有部位和所有发育阶段都会表达，这样不但造成植物能量和养分的浪费，而且
-28-
还会造成转基因植物的一些性状发生改变，影响植物正常的生长发育。而愈伤特
异性启动子可以控制外源基因在植物愈伤组织中高效表达，避免外源基因在植物
的其它部位表达，减少对植物的不利影响。
4.3Zm2880启动子的核心区域
由实验结果可知，pCAM2880GUS载体对应的愈伤组织染色结果为染上了蓝
色，而pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、pCAM680GUS、pCAM355GUS载体
对应的愈伤组织均未染上蓝色，由此可知Zm2880启动子的核心区域位于转录起
始位点前2880bp至1812bp之间。
-29-
5结论
(1)根据
Zmwrky
基因设计特异性引物，以玉米基因组DNA为模板，扩增出该基
因的启动子部分，命名为P2880。
(2)将P2880启动子的序列放在启动子顺式作用元件预测网站上进行分析，预测
到存在TATA盒、CAAT盒和GATA盒等多个顺式作用元件，所以该启动子
是一个具有完整功能的启动子。
(3)利用农杆菌介导法将构建的pCAM2880GUS植物表达载体转化水稻，获得了
37棵转基因植株，对获得的转基因植株进行潮霉素检测，其中22棵检测为阳性，
转化率约为67%。
(4)将检测为阳性的转基因各个组织进行GUS染色，根据染色结果得出，GUS
基因只在愈伤组织中表达，在其余组织中未发现有表达。所以Zm2880启动子是
一个愈伤特异性启动子。
(5)只有pCAM2880GUS载体对应的转基因植株的愈伤组织染色结果为染上了
蓝色，其余缺失载体对应的转基因植株的愈伤组织均未染上颜色，所以Zm2880
启动子的核心区域位于转录起始位点前2880bp-1812bp之间。
-30-
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