2024年3月30日发(作者：毋唱月)
中国心血管杂志2022年4月第27卷第2期 ChinJCardiovascMed,April2022,Vol.27,No.2
·157·
·
基础研究
·
慢性心理应激对高脂饮食ApoE小鼠肠道
菌群的影响
100730
北京医院,国家老年医学中心,国家卫生健康委北京老年医学研究所,国家卫
-/-
王立 孟令丙 徐鸿轩 陈玉辉 尹家文 王倩雯 刘德平 龚涛
生健康委老年医学重点实验室,中国医学科学院老年医学研究院(王立、孟令丙、徐鸿
轩、陈玉辉、尹家文、王倩雯、刘德平、龚涛);100730北京医院神经内科(王立、陈玉辉、
尹家文、王倩雯、龚涛),心血管内科(孟令丙、徐鸿轩、刘德平)
通信作者:刘德平,电子信箱:bjhdpl0909@;龚涛,电子信箱:gb20598@
DOI:10.3969/.1007-5410.2022.02.012
【摘要】 目的 探讨慢性心理应激(CPS)对小鼠动脉粥样硬化(AS)发生发展的影响及观察肠
道菌群的变化。 方法 10只雄性C57BL/6J小鼠设为正常对照(NC)组,予以普通饲料喂养;20只
雄性ApoE
-/-
小鼠均予以高脂饮食,随机分为AS组和AS
+
CPS组。AS
+
CPS组小鼠通过12周的慢性
温和不可预见性应激(CUMS)方案构建CPS模型。检测血浆三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固
醇和高密度脂蛋白胆固醇浓度,血管病理切片HE染色观察斑块形态。采集小鼠粪便扩增肠道菌群
16SrRNA
基因的V3
+
V4区,采用高通量测序检测小鼠肠道菌群组成,分析α和β多样性。 结果
与NC组和AS组小鼠比较,AS
+
CPS组小鼠体重增长缓慢,旷场实验反应箱中心区域停留时间显著减
少(P<0.05)。此外,AS
+
CPS组小鼠AS斑块面积显著增加(P<0.01),管腔狭窄严重(P<0.01)。AS
组和AS
+
CP组小鼠肠道菌群多样性下降,肠道菌群物种组成也发生改变。 结论 高脂饮食可导致
小鼠AS形成及肠道菌群紊乱,有益菌丰度下降,有害菌丰度增加,且CPS可促进AS病变并加重肠道
菌群紊乱。
【关键词】 动脉粥样硬化; 高脂饮食; 肠道菌群; 慢性心理应激
(2018-I2M-1-002);中央卫生科研计划项目(W2017BJ11)
基金项目:国家重点研发计划项目(2020YFC2003000);中国医学科学院医学科学创新基金项目
ImpactofchronicpsychologicalstressonthegutmicrobiotaofApoE
-/-
micefedwithhighfatdiet
WangLi,MengLingbing,XuHongxuan,ChenYuhui,YinJiawen,WangQianwen,LiuDeping,GongTao
TheKeyLaboratoryofGeriatrics,BeijingInstituteofGeriatrics,InstituteofGeriatricsMedicine,Chinese
AcademyofMedicalScience,BeijingHospital,NationalCenterofGerontologyofNationalHealth
Commission,Beijing100730,China
(Wang
L,MengLB,XuHX,ChenYH,YinJW,WangQW,LiuDP,
GongT);DepartmentofNeurology,BeijingHospital,Beijing100730,China
(Wang
L,ChenYH,YinJW,
WangQW,GongT);DepartmentsofCardiology,BeijingHospital,Beijing100730,China
(Meng
LB,Xu
HX,LiuDP)
Correspondingauthor:LiuDeping,Email:bjhdpl0909@;GongTao,Email:gb20598@
【Abstract】 Objective Toinvestigatetheeffectofchronicpsychologicalstress(CPS)on
developmentofatherosclerosisandobservethechangesofgutmicrobiotain
ApoE
-/-
micefedwithhighfat
diet. Methods 10maleC57BL/6Jmicefedwiththenormaldietweresetasnormalcontrolgroup(NC).
20male
ApoE
-/-
micefedwithhigh-fatdietwererandomlydividedintoatheroscleroticgroup(ASgroup)and
atherosclerotic
+
CPSgroup(AS
+
CPSgroup).TheAS
+
CPSmicereceivedchronicmildandunpredictable
stress(CUMS)centrationofplasmatriacylglycerol,totalcholesterol,low-density
lipoproteincholesterol,high-densitylipoproteincholesterolweredetected,andASplaquesofarterialsections
microbiotawasamplifiedtargetingV3
+
V4regionof16S
ciescompositionwasanalyzedbyhigh-throughputsequencingatphylumandgenus
level. Results ComparewithNCgroupandASgroup,theweightofmiceintheAS
+
CPSgroupincreased
slowly,theresidencetimeinthecentralareaofthereactionboxintheopenfieldwasmarkedlyreduced,
andCPSsignificantlyincreasedplaquearea(P<0.01)andaggravatedlumenstenosis(P<0.01).The
·158·
中国心血管杂志2022年4月第27卷第2期 ChinJCardiovascMed,April2022,Vol.27,No.2
diversityofintestinalflorainASgroupandAS
+
CPSgroupdecreased,andthecompositionofgutmicrobiota
wassignificantlydifferentamongthegroups.
Conclusions High
fatdietcancauseASformationand
intestinalmicrofloradisorderinmice,andtherelativeabundanceofbeneficialgutmicrobiotadecreaseswhile
promotethedevelopmentofASand
aggravatedisorderofgutmicrobiotainmice.
【Key
words】 Atherosclerosis; High
fatdiet; Gutmicrobiota; Chronicpsychologicalstress
Fundprogram:
NationalKeyR&DProgramofChina(2020YFC2003000);TheChineseAcademyof
MedicalSciences;CAMSInnovationFundforMedicalSciences(2018-I2M-1-002);CentralHealth
ResearchProject(W2017BJ11)
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种多因
以及动脉内的慢性炎症,导致AS斑块的形成和斑
块破裂
[1]
。AS斑块破裂引起的心肌梗死、脑梗死等
心脑血管疾病及其并发症已成为威胁人类生命和
健康的主要原因。因此,探讨AS性疾病的发病机
制、防治已成为当前的研究热点
[2-3]
。已有研究表
明,社会心理因素尤其是慢性心理应激(chronic
素疾病,其主要原因是脂质成分在血管壁的积聚,
料喂饲,设为正常对照组(normal
controlgroup,NC
组);20只20周龄雄性ApoE
-/-
小鼠随机分为2组:
其中10只为AS组(atherosclerosis
group,AS组),予
以高脂饲料喂养12周;另10只予以高脂饲料喂养叠
加慢性温和不可预知性应激(chronic
unpredictable
mildstress,CUMS)干预12周,为AS
+
CPS组。
psychologicalstress,CPS)在AS的发生发展中起着
楚
[4-5]
。近年来,越来越多的证据表明肠道菌群参
与了血管炎症和AS的发生发展过程
[6-8]
。各种小
鼠模型均证实肠道菌群影响血管炎症表型、心脑血
管疾病的发生和动脉血栓形成。然而,目前尚不清
楚CPS是否通过改变肠道菌群进而影响AS形成和
进展。本研究的目的是探讨CPS对小鼠AS的影
应激方式:(1)夹尾:鼠尾末端1
cm处钳夹1min;
10s;(3)昼夜颠倒:即反转光照周期3次;(4)噪声
CUMS实施方案
[9-10]
如下,每周随机进行以下
重要作用,但其在AS演变中的确切机制尚不清
(2)突发震动:摇晃鼠笼15次,每次持续5s,间隔
刺激:暴露于70
dB的白噪音中7或9h;(5)闪光刺
激:低强度频闪灯照明(150次闪烁/min)9或12
h;
4h;(7)鼠笼倾斜:鼠笼置于45°倾斜角的平台上,
(6)束缚:将小鼠约束于固定器中,无法转身2或
每小时调整角度,共7
h;(8)潮湿的敷料24h。
响,并观察在CPS作用下AS模型小鼠肠道菌群的
变化情况。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
1.4 小鼠体重和血脂浓度检测
穿刺采血,注入EDTA抗凝管,3
000r/min、4℃离心
15min,收集血浆后
-
80℃保存。采用Beckman全自
重。造模结束后小鼠禁食不禁水12
h,麻醉后心脏
分别采集各组小鼠基线(0)和第4、8、12周体
动生化分析仪测定血清三酰甘油、总胆固醇、高密
度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇浓度。
旷场实验反应箱底部分为16个面积相同的小
H10141)购自北京华阜康生物科技有限公司;HE染
色试剂盒(货号G1003)购自武汉赛维尔生物科技
有限公司;全自动生化分析仪购自美国Beckman公
司;旷场装置(尺寸:长50
cm,宽50cm,高40cm)
小鼠普通饲料(货号1022)和高脂饲料(货号
1.5 旷场实验
格,外周12格记为周边区,中间4格为中心区。将
小鼠置于中心区域,动物行为学软件自动记录并分
析5
min内小鼠停留在中心区的时间。旷场实验在
及KEMaze动物行为自动分析软件购自南京卡尔文
1.2 实验动物
生物技术有限公司。
10只SPF级雄性C57BL/6J小鼠和20只SPF
没有干扰的隔音室中进行,每次检测完成一只小鼠
后使用5%的乙醇水溶液擦洗反应箱,挥发干后再
进行下一只检测,以避免由于先前小鼠留下的气味
1.6 小鼠动脉血管组织病理学检查
而产生的偏倚。级雄性ApoE
-/-
(C57BL/6J背景)小鼠购自北京华阜
康生物科技有限公司。所有小鼠单笼饲养,食物和
60%~70%,光照周期12/12h。
水不受限。饲养环境:温度20℃~24℃,相对湿度小鼠麻醉后分离动脉血管,标本于4%多聚甲
1.3 AS和CPS模型构建
醛溶液中固定后,依次进行冲洗、脱水、浸蜡、石蜡
包埋、制片和染色等操作。按试剂使用说明进行苏
木精和伊红(H&E)染色后在显微镜下观察并拍照。
10只20周龄雄性C57BL/6J小鼠接受普通饲
中国心血管杂志2022年4月第27卷第2期 ChinJCardiovascMed,April2022,Vol.27,No.2
·159·
1.7 小鼠肠道菌群检测分析
为了解不同处理对小鼠肠道菌群多样性的影
响,实验最后一天利用无菌离心管接取每只小鼠的
粪便标本,立即置入液氮后转入
-
80℃保存以供进
一步分析。提取并扩增微生物DNA,正向引物为
341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’),反向引物
为806R(5’-
GGACTACHVGGGTATCTAAT-3’),分
别针对V3-V4区扩增微生物16S
rDNA基因。由广
州基迪奥生物科技有限公司在Illumina
Novaseq
6000测序平台上进行16S测序及分析。
1.8 统计学方法
采用SPSS
23.0软件进行数据处理。正态分布
的计量资料以x±s表示,组间比较采用t检验。菌
2024年3月30日发(作者：毋唱月)
中国心血管杂志2022年4月第27卷第2期 ChinJCardiovascMed,April2022,Vol.27,No.2
·157·
·
基础研究
·
慢性心理应激对高脂饮食ApoE小鼠肠道
菌群的影响
100730
北京医院,国家老年医学中心,国家卫生健康委北京老年医学研究所,国家卫
-/-
王立 孟令丙 徐鸿轩 陈玉辉 尹家文 王倩雯 刘德平 龚涛
生健康委老年医学重点实验室,中国医学科学院老年医学研究院(王立、孟令丙、徐鸿
轩、陈玉辉、尹家文、王倩雯、刘德平、龚涛);100730北京医院神经内科(王立、陈玉辉、
尹家文、王倩雯、龚涛),心血管内科(孟令丙、徐鸿轩、刘德平)
通信作者:刘德平,电子信箱:bjhdpl0909@;龚涛,电子信箱:gb20598@
DOI:10.3969/.1007-5410.2022.02.012
【摘要】 目的 探讨慢性心理应激(CPS)对小鼠动脉粥样硬化(AS)发生发展的影响及观察肠
道菌群的变化。 方法 10只雄性C57BL/6J小鼠设为正常对照(NC)组,予以普通饲料喂养;20只
雄性ApoE
-/-
小鼠均予以高脂饮食,随机分为AS组和AS
+
CPS组。AS
+
CPS组小鼠通过12周的慢性
温和不可预见性应激(CUMS)方案构建CPS模型。检测血浆三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固
醇和高密度脂蛋白胆固醇浓度,血管病理切片HE染色观察斑块形态。采集小鼠粪便扩增肠道菌群
16SrRNA
基因的V3
+
V4区,采用高通量测序检测小鼠肠道菌群组成,分析α和β多样性。 结果
与NC组和AS组小鼠比较,AS
+
CPS组小鼠体重增长缓慢,旷场实验反应箱中心区域停留时间显著减
少(P<0.05)。此外,AS
+
CPS组小鼠AS斑块面积显著增加(P<0.01),管腔狭窄严重(P<0.01)。AS
组和AS
+
CP组小鼠肠道菌群多样性下降,肠道菌群物种组成也发生改变。 结论 高脂饮食可导致
小鼠AS形成及肠道菌群紊乱,有益菌丰度下降,有害菌丰度增加,且CPS可促进AS病变并加重肠道
菌群紊乱。
【关键词】 动脉粥样硬化; 高脂饮食; 肠道菌群; 慢性心理应激
(2018-I2M-1-002);中央卫生科研计划项目(W2017BJ11)
基金项目:国家重点研发计划项目(2020YFC2003000);中国医学科学院医学科学创新基金项目
ImpactofchronicpsychologicalstressonthegutmicrobiotaofApoE
-/-
micefedwithhighfatdiet
WangLi,MengLingbing,XuHongxuan,ChenYuhui,YinJiawen,WangQianwen,LiuDeping,GongTao
TheKeyLaboratoryofGeriatrics,BeijingInstituteofGeriatrics,InstituteofGeriatricsMedicine,Chinese
AcademyofMedicalScience,BeijingHospital,NationalCenterofGerontologyofNationalHealth
Commission,Beijing100730,China
(Wang
L,MengLB,XuHX,ChenYH,YinJW,WangQW,LiuDP,
GongT);DepartmentofNeurology,BeijingHospital,Beijing100730,China
(Wang
L,ChenYH,YinJW,
WangQW,GongT);DepartmentsofCardiology,BeijingHospital,Beijing100730,China
(Meng
LB,Xu
HX,LiuDP)
Correspondingauthor:LiuDeping,Email:bjhdpl0909@;GongTao,Email:gb20598@
【Abstract】 Objective Toinvestigatetheeffectofchronicpsychologicalstress(CPS)on
developmentofatherosclerosisandobservethechangesofgutmicrobiotain
ApoE
-/-
micefedwithhighfat
diet. Methods 10maleC57BL/6Jmicefedwiththenormaldietweresetasnormalcontrolgroup(NC).
20male
ApoE
-/-
micefedwithhigh-fatdietwererandomlydividedintoatheroscleroticgroup(ASgroup)and
atherosclerotic
+
CPSgroup(AS
+
CPSgroup).TheAS
+
CPSmicereceivedchronicmildandunpredictable
stress(CUMS)centrationofplasmatriacylglycerol,totalcholesterol,low-density
lipoproteincholesterol,high-densitylipoproteincholesterolweredetected,andASplaquesofarterialsections
microbiotawasamplifiedtargetingV3
+
V4regionof16S
ciescompositionwasanalyzedbyhigh-throughputsequencingatphylumandgenus
level. Results ComparewithNCgroupandASgroup,theweightofmiceintheAS
+
CPSgroupincreased
slowly,theresidencetimeinthecentralareaofthereactionboxintheopenfieldwasmarkedlyreduced,
andCPSsignificantlyincreasedplaquearea(P<0.01)andaggravatedlumenstenosis(P<0.01).The
·158·
中国心血管杂志2022年4月第27卷第2期 ChinJCardiovascMed,April2022,Vol.27,No.2
diversityofintestinalflorainASgroupandAS
+
CPSgroupdecreased,andthecompositionofgutmicrobiota
wassignificantlydifferentamongthegroups.
Conclusions High
fatdietcancauseASformationand
intestinalmicrofloradisorderinmice,andtherelativeabundanceofbeneficialgutmicrobiotadecreaseswhile
promotethedevelopmentofASand
aggravatedisorderofgutmicrobiotainmice.
【Key
words】 Atherosclerosis; High
fatdiet; Gutmicrobiota; Chronicpsychologicalstress
Fundprogram:
NationalKeyR&DProgramofChina(2020YFC2003000);TheChineseAcademyof
MedicalSciences;CAMSInnovationFundforMedicalSciences(2018-I2M-1-002);CentralHealth
ResearchProject(W2017BJ11)
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种多因
以及动脉内的慢性炎症,导致AS斑块的形成和斑
块破裂
[1]
。AS斑块破裂引起的心肌梗死、脑梗死等
心脑血管疾病及其并发症已成为威胁人类生命和
健康的主要原因。因此,探讨AS性疾病的发病机
制、防治已成为当前的研究热点
[2-3]
。已有研究表
明,社会心理因素尤其是慢性心理应激(chronic
素疾病,其主要原因是脂质成分在血管壁的积聚,
料喂饲,设为正常对照组(normal
controlgroup,NC
组);20只20周龄雄性ApoE
-/-
小鼠随机分为2组:
其中10只为AS组(atherosclerosis
group,AS组),予
以高脂饲料喂养12周;另10只予以高脂饲料喂养叠
加慢性温和不可预知性应激(chronic
unpredictable
mildstress,CUMS)干预12周,为AS
+
CPS组。
psychologicalstress,CPS)在AS的发生发展中起着
楚
[4-5]
。近年来,越来越多的证据表明肠道菌群参
与了血管炎症和AS的发生发展过程
[6-8]
。各种小
鼠模型均证实肠道菌群影响血管炎症表型、心脑血
管疾病的发生和动脉血栓形成。然而,目前尚不清
楚CPS是否通过改变肠道菌群进而影响AS形成和
进展。本研究的目的是探讨CPS对小鼠AS的影
应激方式:(1)夹尾:鼠尾末端1
cm处钳夹1min;
10s;(3)昼夜颠倒:即反转光照周期3次;(4)噪声
CUMS实施方案
[9-10]
如下,每周随机进行以下
重要作用,但其在AS演变中的确切机制尚不清
(2)突发震动:摇晃鼠笼15次,每次持续5s,间隔
刺激:暴露于70
dB的白噪音中7或9h;(5)闪光刺
激:低强度频闪灯照明(150次闪烁/min)9或12
h;
4h;(7)鼠笼倾斜:鼠笼置于45°倾斜角的平台上,
(6)束缚:将小鼠约束于固定器中,无法转身2或
每小时调整角度,共7
h;(8)潮湿的敷料24h。
响,并观察在CPS作用下AS模型小鼠肠道菌群的
变化情况。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
1.4 小鼠体重和血脂浓度检测
穿刺采血,注入EDTA抗凝管,3
000r/min、4℃离心
15min,收集血浆后
-
80℃保存。采用Beckman全自
重。造模结束后小鼠禁食不禁水12
h,麻醉后心脏
分别采集各组小鼠基线(0)和第4、8、12周体
动生化分析仪测定血清三酰甘油、总胆固醇、高密
度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇浓度。
旷场实验反应箱底部分为16个面积相同的小
H10141)购自北京华阜康生物科技有限公司;HE染
色试剂盒(货号G1003)购自武汉赛维尔生物科技
有限公司;全自动生化分析仪购自美国Beckman公
司;旷场装置(尺寸:长50
cm,宽50cm,高40cm)
小鼠普通饲料(货号1022)和高脂饲料(货号
1.5 旷场实验
格,外周12格记为周边区,中间4格为中心区。将
小鼠置于中心区域,动物行为学软件自动记录并分
析5
min内小鼠停留在中心区的时间。旷场实验在
及KEMaze动物行为自动分析软件购自南京卡尔文
1.2 实验动物
生物技术有限公司。
10只SPF级雄性C57BL/6J小鼠和20只SPF
没有干扰的隔音室中进行,每次检测完成一只小鼠
后使用5%的乙醇水溶液擦洗反应箱,挥发干后再
进行下一只检测,以避免由于先前小鼠留下的气味
1.6 小鼠动脉血管组织病理学检查
而产生的偏倚。级雄性ApoE
-/-
(C57BL/6J背景)小鼠购自北京华阜
康生物科技有限公司。所有小鼠单笼饲养,食物和
60%~70%,光照周期12/12h。
水不受限。饲养环境:温度20℃~24℃,相对湿度小鼠麻醉后分离动脉血管,标本于4%多聚甲
1.3 AS和CPS模型构建
醛溶液中固定后,依次进行冲洗、脱水、浸蜡、石蜡
包埋、制片和染色等操作。按试剂使用说明进行苏
木精和伊红(H&E)染色后在显微镜下观察并拍照。
10只20周龄雄性C57BL/6J小鼠接受普通饲
中国心血管杂志2022年4月第27卷第2期 ChinJCardiovascMed,April2022,Vol.27,No.2
·159·
1.7 小鼠肠道菌群检测分析
为了解不同处理对小鼠肠道菌群多样性的影
响,实验最后一天利用无菌离心管接取每只小鼠的
粪便标本,立即置入液氮后转入
-
80℃保存以供进
一步分析。提取并扩增微生物DNA,正向引物为
341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’),反向引物
为806R(5’-
GGACTACHVGGGTATCTAAT-3’),分
别针对V3-V4区扩增微生物16S
rDNA基因。由广
州基迪奥生物科技有限公司在Illumina
Novaseq
6000测序平台上进行16S测序及分析。
1.8 统计学方法
采用SPSS
23.0软件进行数据处理。正态分布
的计量资料以x±s表示,组间比较采用t检验。菌