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WB试验常见问题解答
2024年4月2日发(作者：堵秀雅)
[1]
各位朋友：请教关于SDS—PAGE的问题。我的配胶体系如下:15%分离胶 4%浓缩胶水 2.3ml
2.7ml30％丙烯酰胺 5。0ml 0。67mlTris—HCL PH8。8 2。5ml PH6.8 0.5ml10％SDS 0.1ml 0。
04ml10％APS 0。1ml 0.04ml TEMED 0。004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是11kd,浓缩胶
60V,40min，分离胶90V，70min.跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因?我的试剂都
是新配置的。谢谢！！！
答：【1】胶的配制方法；配制不同体积15%胶 SDS—PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15％
胶 （毫升） ： 5 －－ 10 －－15－－ 20－－ 30－－ 50 蒸馏水 : 0。5 －－ 1.0－－ 1.5
－－ 2.0 －－ 3。0 －－5.0 30％Acr-Bis(29:1）: 2。5 －－ 5。0 －－ 7.5 －－ 10。0 －－
15。0－－ 25.0 1M Tris, pH8。8: 1.9－－ 3。8 －－ 5.7－－ 7.6－－ 11。4 －－ 19。0
10%SDS ：0。05－－ 0.1－－ 0。15 －－ 0.2－－ 0。3－－ 0.5 10％过硫酸铵： 0.05 －
－ 0.1 －－0.15－－ 0。2 －－ 0.3 －－ 0.5 TEMED： 0。002－－ 0.004 －－ 0。006 －
－ 0。008 －－ 0.012 －－ 0.02 配制不同体积4%胶 SDS—PAGE浓缩胶所需各成分的体积
（毫升) 4%浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水 ： 3.16ml40％Acr/Bic（37。5：1） : 0。5ml0。5
mol/L Tris•HCl（pH6.8） ： 1.26ml10％SDS ： 50 微升微升10％AP(过硫酸胺） ： 25
TEMED ： 5 微升加TEMED后，立即混匀即可灌胶.【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点
比较重要.如果玻璃板洗不干净,很容易造成楼主所说的现象。【3】注意电泳液不要出问题（是否
过期了,是否把转移液当成电泳液了？），电泳液如果出问题，也会造成楼主所说的现象。
[2] pvdf膜到底能不能用丽春红染色来查看蛋白是否转上去 ？我转过很多次了，都没有看到过
丽春红显色。但是有看到有人说能染上,是在是不知道，请教给位大大了
答:【1】PVDF膜肯定可以用丽春红染色的。我们这里的很多人基本上用 的都是PVDF膜,染膜
用的都是丽春红.大多数时候都能染出条带的.【2】下面是丽春红的配方：10X丽春红染液丽春
红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释10倍。当然现在有很
多公司直接卖配好的丽春红，因为其可以回收重复利用，所以可以买配好的丽春红。下面是一份
丽春红的说明书：1.将PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中,摇动3—5
分钟或更长时间，直至出现清晰条带。对结果作适当 记录。 2。用蒸馏水,PBS或其它适当溶液
漂洗2—3次，每次3—5分钟，去除丽春红,进行后续的Western检测. 从使用说明中，我们可
以看出,PVDF膜是可以用丽春红染色的。【3】我的染色方法是：转膜完成后，取出膜在甲醇里泡
1分钟，然后在双蒸水中过一下，放入丽春红里染色，室温，摇床上，时间是5－30分钟。然后
把染好的膜放到双蒸水中洗一下,不要洗的太久，把表面的丽春红洗掉就可以了。这时就可以看
到红色的蛋白条带了。然后把膜放在TBST中，室温，摇床上洗3次，每次10分钟。然后就可
以往下做了。【4】丽春红的染色敏感性和ECL敏感性差的很远呢。也就是说，及时丽春红染色
染不出来，ECL 也有可能曝光曝出来的.【5】感觉丽春红染色效果不是很好的，有时候清楚，有
时候也不是很清楚。而且染色后再往下做后面的结果会收到一定的影响.所以,如果熟练了，后面
就可以不染色了。也可以上样的时候都上两个孔的样，转膜后把这两个孔对应的膜剪下来染色，
如果染上了，说明其他的也会染上的。
[3] 我做WB，曾跑出过条带,就是有非特异性条带，准备摸一抗和二抗浓度,但后来就什么条带
都显不出来了，就算换成有条带时的浓度，条件也没变，就是做不出来，转膜后膜上能清晰看见
预染的彩虹marker,但用丽春红染膜,却没明显的蛋白条带，就能看见泳道，请教实验室其它人,
就说是我转膜弥散，求助个位大侠，我该怎么做？说说我的wb条件：蛋白大小：50kd5％积层
胶，10％分离胶电泳先100v，后180v转膜条件：冰水中恒压100v 1h 湿转(在转时电流在
200—400ma变，先小，后大，还有就是转移缓冲液在转时会冒好多泡泡），我用的是NC膜,滤
纸两边个四层
答：【1】转膜的时候最好用衡流，试一下380毫安，半小时。转移液注意最好现配先用，不要
用很多次,这很重要，我一般应用不超过两次。【2】转膜的时候,夹胶和膜的夹子的松紧要适中，
可以通过调节滤纸的张数来控制夹子的松紧.【3】电泳的电压太大，减小电泳的电压。可以先用
80伏20分钟,然后120伏.也可以一直用80伏.也可以先用60伏,然后80伏。【4】可以适当增
加曝光时间试一下.
[4]目的蛋白不表达。的leilaliu wrote：这是我的操作步骤:取0.1g 组织，加1ml裂解液（1
mol/l 2。5ml ，NaCl 0.438g, TritonX—100 0。5ml, 蒸馏水至50ml，使用时加了100
ug/ml的PMSF)，机械匀浆2分钟，冰上裂解30分钟,然后14000g 10分钟离心,取上清液。取
20ug上样量，然后80V浓缩胶,130V分离胶,然后80V，180mA转膜2个小时，然后5％封闭一
个小时,室温。然后一抗1：500（5％脱脂奶粉加TBST里面)孵育一个晚上，TBST清洗3次，
每次10分钟。然后二抗1：2000处理方式同一抗,孵育时间为1个小时，室温，TBST清洗3次,
每次10分钟。再用ECL 处理等等.
但是,我的目的蛋白：CaMKIIa总是做不出来。狂哭。分子量是50KD。
答：【1】上样量一般是20－100微克,你的上样量是20微克，你的条带很弱或者出不来,为什么
不加大上样量呢?可以加到100微克左右呀（这点其实挺重要的)。【2】你说:“80V,180mA转膜
2个小时"。一般转膜的时候只能衡流或者衡压吧,怎么你的电流电压都是恒定的呢？转膜感觉还
是衡流好。我一般用380毫安湿转30分钟。当然转膜很多条件都是可以的.【3】一抗孵育最好
在摇床上，一抗孵育后，TBST清洗3次，每次5分钟就可以了。【4】可以适当增加曝光时间。
2024年4月2日发(作者：堵秀雅)
[1]
各位朋友：请教关于SDS—PAGE的问题。我的配胶体系如下:15%分离胶 4%浓缩胶水 2.3ml
2.7ml30％丙烯酰胺 5。0ml 0。67mlTris—HCL PH8。8 2。5ml PH6.8 0.5ml10％SDS 0.1ml 0。
04ml10％APS 0。1ml 0.04ml TEMED 0。004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是11kd,浓缩胶
60V,40min，分离胶90V，70min.跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因?我的试剂都
是新配置的。谢谢！！！
答：【1】胶的配制方法；配制不同体积15%胶 SDS—PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15％
胶 （毫升） ： 5 －－ 10 －－15－－ 20－－ 30－－ 50 蒸馏水 : 0。5 －－ 1.0－－ 1.5
－－ 2.0 －－ 3。0 －－5.0 30％Acr-Bis(29:1）: 2。5 －－ 5。0 －－ 7.5 －－ 10。0 －－
15。0－－ 25.0 1M Tris, pH8。8: 1.9－－ 3。8 －－ 5.7－－ 7.6－－ 11。4 －－ 19。0
10%SDS ：0。05－－ 0.1－－ 0。15 －－ 0.2－－ 0。3－－ 0.5 10％过硫酸铵： 0.05 －
－ 0.1 －－0.15－－ 0。2 －－ 0.3 －－ 0.5 TEMED： 0。002－－ 0.004 －－ 0。006 －
－ 0。008 －－ 0.012 －－ 0.02 配制不同体积4%胶 SDS—PAGE浓缩胶所需各成分的体积
（毫升) 4%浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水 ： 3.16ml40％Acr/Bic（37。5：1） : 0。5ml0。5
mol/L Tris•HCl（pH6.8） ： 1.26ml10％SDS ： 50 微升微升10％AP(过硫酸胺） ： 25
TEMED ： 5 微升加TEMED后，立即混匀即可灌胶.【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点
比较重要.如果玻璃板洗不干净,很容易造成楼主所说的现象。【3】注意电泳液不要出问题（是否
过期了,是否把转移液当成电泳液了？），电泳液如果出问题，也会造成楼主所说的现象。
[2] pvdf膜到底能不能用丽春红染色来查看蛋白是否转上去 ？我转过很多次了，都没有看到过
丽春红显色。但是有看到有人说能染上,是在是不知道，请教给位大大了
答:【1】PVDF膜肯定可以用丽春红染色的。我们这里的很多人基本上用 的都是PVDF膜,染膜
用的都是丽春红.大多数时候都能染出条带的.【2】下面是丽春红的配方：10X丽春红染液丽春
红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释10倍。当然现在有很
多公司直接卖配好的丽春红，因为其可以回收重复利用，所以可以买配好的丽春红。下面是一份
丽春红的说明书：1.将PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中,摇动3—5
分钟或更长时间，直至出现清晰条带。对结果作适当 记录。 2。用蒸馏水,PBS或其它适当溶液
漂洗2—3次，每次3—5分钟，去除丽春红,进行后续的Western检测. 从使用说明中，我们可
以看出,PVDF膜是可以用丽春红染色的。【3】我的染色方法是：转膜完成后，取出膜在甲醇里泡
1分钟，然后在双蒸水中过一下，放入丽春红里染色，室温，摇床上，时间是5－30分钟。然后
把染好的膜放到双蒸水中洗一下,不要洗的太久，把表面的丽春红洗掉就可以了。这时就可以看
到红色的蛋白条带了。然后把膜放在TBST中，室温，摇床上洗3次，每次10分钟。然后就可
以往下做了。【4】丽春红的染色敏感性和ECL敏感性差的很远呢。也就是说，及时丽春红染色
染不出来，ECL 也有可能曝光曝出来的.【5】感觉丽春红染色效果不是很好的，有时候清楚，有
时候也不是很清楚。而且染色后再往下做后面的结果会收到一定的影响.所以,如果熟练了，后面
就可以不染色了。也可以上样的时候都上两个孔的样，转膜后把这两个孔对应的膜剪下来染色，
如果染上了，说明其他的也会染上的。
[3] 我做WB，曾跑出过条带,就是有非特异性条带，准备摸一抗和二抗浓度,但后来就什么条带
都显不出来了，就算换成有条带时的浓度，条件也没变，就是做不出来，转膜后膜上能清晰看见
预染的彩虹marker,但用丽春红染膜,却没明显的蛋白条带，就能看见泳道，请教实验室其它人,
就说是我转膜弥散，求助个位大侠，我该怎么做？说说我的wb条件：蛋白大小：50kd5％积层
胶，10％分离胶电泳先100v，后180v转膜条件：冰水中恒压100v 1h 湿转(在转时电流在
200—400ma变，先小，后大，还有就是转移缓冲液在转时会冒好多泡泡），我用的是NC膜,滤
纸两边个四层
答：【1】转膜的时候最好用衡流，试一下380毫安，半小时。转移液注意最好现配先用，不要
用很多次,这很重要，我一般应用不超过两次。【2】转膜的时候,夹胶和膜的夹子的松紧要适中，
可以通过调节滤纸的张数来控制夹子的松紧.【3】电泳的电压太大，减小电泳的电压。可以先用
80伏20分钟,然后120伏.也可以一直用80伏.也可以先用60伏,然后80伏。【4】可以适当增
加曝光时间试一下.
[4]目的蛋白不表达。的leilaliu wrote：这是我的操作步骤:取0.1g 组织，加1ml裂解液（1
mol/l 2。5ml ，NaCl 0.438g, TritonX—100 0。5ml, 蒸馏水至50ml，使用时加了100
ug/ml的PMSF)，机械匀浆2分钟，冰上裂解30分钟,然后14000g 10分钟离心,取上清液。取
20ug上样量，然后80V浓缩胶,130V分离胶,然后80V，180mA转膜2个小时，然后5％封闭一
个小时,室温。然后一抗1：500（5％脱脂奶粉加TBST里面)孵育一个晚上，TBST清洗3次，
每次10分钟。然后二抗1：2000处理方式同一抗,孵育时间为1个小时，室温，TBST清洗3次,
每次10分钟。再用ECL 处理等等.
但是,我的目的蛋白：CaMKIIa总是做不出来。狂哭。分子量是50KD。
答：【1】上样量一般是20－100微克,你的上样量是20微克，你的条带很弱或者出不来,为什么
不加大上样量呢?可以加到100微克左右呀（这点其实挺重要的)。【2】你说:“80V,180mA转膜
2个小时"。一般转膜的时候只能衡流或者衡压吧,怎么你的电流电压都是恒定的呢？转膜感觉还
是衡流好。我一般用380毫安湿转30分钟。当然转膜很多条件都是可以的.【3】一抗孵育最好
在摇床上，一抗孵育后，TBST清洗3次，每次5分钟就可以了。【4】可以适当增加曝光时间。