青蒿素对糖尿病大鼠肾组织AP_1的DNA结合活性升高的抑制作用_周凤娇

2024年4月6日发(作者：渠阳飙)

23（24）

现代中西医结合杂志

ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2014Aug，

·2651·

青蒿素对糖尿病大鼠肾组织

AP－1

的

DNA

结合活性升高的抑制作用

周凤娇

，

张建勇

，

张丽坤

，

苏彦君

，

安志霞

(

河北省石家庄市第二医院

，

河北石家庄

050051)

［

摘要

］

目的探讨青蒿素对实验糖尿病大鼠肾组织转录因子活化蛋白

－1(AP－1)

的

将

只实验大鼠分成正常对照组

组

)、

糖尿病非

DNA

结合活性升高的抑制作用

。

方法

B、C

组应用腹腔单剂量注射链脲佐菌素

(STZ)65mg/

治疗组

组

)

及青蒿素治疗组

组

)，

建立糖尿病大鼠模型

。C

组给予腹腔注射青蒿素

300mg/(kg·d)。

于实验进行到第

周

时处死各组大鼠

，

取部分右肾皮质

，

应用电泳迁移率改变分析

(EMSA)

法观察青蒿素对实验

糖尿病大鼠肾组织

AP－1

的

DNA

结合活性的影响

，

并制备病理切片以观察肾组织的病理学

变化

。

结果

论

组大鼠肾细胞

AP－1

的

DNA

结合活性较

组显著上升

，C

组大鼠对肾细胞

AP－1

的

DNA

结合活性有显著抑制作用

，

并显著改善糖尿病大鼠肾脏组织的病理变化

。

结

青蒿素通过下调糖尿病大鼠肾组织

AP－1

的

DNA

结合活性上调而改善糖尿病大鼠肾脏组织病理改变

。

［

关键词

］

糖尿病肾病

;

青蒿素

;AP－1;

电泳迁移率改变分析

doi:10．3969/j．issn．1008－8849．2014．24．009

［

中图分类号

］Ｒ－332［

文献标识码

］A［

文章编号

］1008－8849（2014）24－2651－03

InhibitoryeffectofartemisininontheupregulationoftheDNA－bindingactivityofAP－1

inthekidneytissueofexperimentaldiabeticrats

ZhouFengjiao，ZhangJianyong，ZhangLikun，SuYanjun，AnZhixia

（TheSecondHospitalofShijiazhuangCity，Shijiazhuang050051，Hebei，China）

Abstract：ObjectiveItistoapproachtheinhibitoryeffectofartemisininontheupregulationoftheDNA－bindingactivi-

tyofAP－1inthekidneytissueofexperimentaldiabeticrats．Methods15ratsweredividedintonormalcontrolrats（group

A），STZ－induceddiabeticrats（groupB），STZ－induceddiabeticratstreatedwithartemisinin300mg/（kg·d）intraper-

itoneally（groupC）．TheDNA－bindingactivityofAP－1inthekidneytissuewasdetectedbyelectrophoreticmobilityshift

assay（EMSA），whilerenalpathologicchangeswereobservedafter4weeksoftreatment．ＲesultsTheDNA－bindingactivity

ofAP－1wassignificantlyactivatedinrenalcorticesinuntreated－diabeticratsafter4weeks．TheabnormalleveloftheDNA－

bindingactivityofAP－1waspartlyreversedindiabeticratstreatedbyartemisinin．Accordingly，renalpathologicchangesin

diabeticratstreatedwithartemisininweresignificantlyimproved．ConclusionArtemisininhassomerenoprotectiveeffectsin

experimentaldiabeticratspartlythroughinhibitingtheDNA－bindingactivityofAP－1inrenalcortices．

Keywords：diabeticnephropathy；artemisinin；AP－1；electrophoreticmobilityshiftassay

糖尿病导致的肾脏损害几乎可以累及肾脏所有结构

，

糖

尿病患者一旦出现肾损害

，

其进展速度远快于非糖尿病患

者

［1］

展

［3－4］

。

本实验通过研究青蒿素对糖尿病大鼠肾脏

AP－1

的

DNA

结合活性升高的作用

，

为临床探寻防治糖尿病肾病提

供新的视角

。

1.1

实验资料

实验材料实验用

只雄性

大鼠

，

体质量

180～

。

多种细胞因子

、

氧化应激

、

糖代谢异常

、

血流动力学的

改变

、

遗传因素都参与糖尿病肾病的发展

。

糖尿病肾病时

，

化

过氧化氢学性质活泼的反应氧产物

（ＲOS）

如羟自由基

（OH）、

（H

）

和超氧阴离子

（O

应激状态

［2］

－2

）

等在肾组织中产生过多

，

破坏了

220g；STZ

购自

Sigma；

青蒿素购自成都伟辉生物科技有限公

Gel－shiftAssaySystem、

司

；AP－2ConsensusOligonucleotide、

多核苷酸激酶

、AP－1ConsensusOligonucleotide

购买自

Promega

公司

；

抗

c－Jun

和抗

c－Fos

多克隆抗体购买自

Santa

CruzBiotech

公司

；

达优血糖仪购自广州达优医疗设备有限公

司

。

实验用缓冲液配方

：bufferA（pH7．9）∶0．5%NP－40，

10mmol/LHEPES，1．5mmol/LMgCl

，10mmol/LKCl，0．5

mmol/LDTT，0．5mmol/LPMSF；bufferB：bufferA

中去掉

NP－

肾组织中氧化

还原反应的动态平衡

，

从而造成肾组织的氧化

。

反应氧产物可激活转录因子

AP－1，

是通过激

活丝裂原活化蛋白激酶

（MAPK）

及蛋白激酶

C（PKC）

来实现

从而启动下游基因转录

，

如层黏连蛋白

B（lamininB）、

纤的

，

维连接蛋白

（FN）

及转化生长因子β

（TGF－

）

等

，

使肾组

织产生细胞外基质

，

导致糖尿病肾病

（DN）

的发生及病情进

［

作者简介

］

周凤娇

，

女

，

主治医师

，

研究方向为糖尿病肾病

。

·2652·

23（24）

现代中西医结合杂志

ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2014Aug，

40；bufferC（pH7．9）：0．2mmol/LEDTA，20mmol/L

HEPES，10mmol/LKCl，1．5mmol/LMgCl

，0．5mmol/L

PMSF，20%

甘油

，0．5mmol/LDTT；bufferD：bufferC

中加

入

400mmol/L

的

KCl；Gelloadingbuffer（10×）：250mmol/L，

0．2%

溴酚蓝

，40%

甘油

；TEbuffer：10mmol/LTrisbase，1

mmol/LEDTA；

高渗裂解液

（pH8．0）：75mmol/LNaCl，24

mmol/LEDTA。

1.2

1.2.1

方法

大鼠分组与糖尿病模型制备实验大鼠随机分为

45min。

结束电泳后

，－70℃

低温环境进行将凝胶进行干燥

，

放射自显影

，

时间为

48h。

1.2.6

大鼠肾脏病理改变右肾肾皮质部分

，

置于浓度为

10%

的甲醛溶液中予以浸泡完全并固定

，

制备常规石蜡病理

切片

，

然后在光学显微镜下予以观察

。

1.3

统计学方法

±s

表示

，

计量结果用

珋使用统计分析软

两两比较使用

S－N－K

件

SPSS12．0

予以单因素方差分析

，

方法

。P＜0．05

为差异有统计学意义

。

2.1

结果

阳性反应对

AP－1

蛋白与其

AP－1

探针结合特异性

组

，

即正常对照组

（A

组

）、

糖尿病非治疗组

（B

组

）

及糖尿病

组予腹腔单剂量青蒿素治疗组

（C

组

），

每组

只大鼠

。B、

组只腹腔注射等注射

STZ65mg/kg

建立糖尿病大鼠模型

，

剂量柠檬酸缓冲溶液

。

实验进行

72h，

采大鼠尾静脉血

，

使用

血糖≥

16．7mmol/L

为造模成功

。

达优血糖仪测血糖

，

1.2.2

大鼠用药

组大鼠予以青蒿素从造模成功当天起

，

300mg/（kg·d）

溶于二甲基亚砜

（DMSO）

中腹腔注射

，A

组

与

组分别给予等量

DMSO

腹腔注射

。

实验大鼠均自由饮

egd

不应用任何降糖药物如胰岛素等

。

水及进食

，

1.2.3

提取核蛋白在实验进行到第

周时

，

处死各组大

将大鼠右侧肾脏分离

，

切开肾静脉和动脉

，

在

0～4℃

环境鼠

，

下

，

采用

0．1mol/LPBS

冲洗右侧肾脏

，

灌洗

5min。

去掉右侧

肾脏肾包膜

，

留取右侧肾脏部分肾皮质

300mg，

采用

0．1mol/

LPBS

在冰浴上漂洗

，

漂洗时间约

3min。

之后再用

3mLbuff-

erA

将右侧部分肾脏皮质匀浆

，

再转离心管内冰浴

10min，

低温离心

10min

后

，

弃掉上清液

，

再加

4mLbufferB，

混合均

匀

，

再次低温离心

10min，

弃掉上清液

，

加

400

LbufferB，

混

合均匀后予以冰浴

30min，

转入离心管内予以低温

20000g

离心

，

时间

15min，

留取上清液

，

此即为肾组织细胞核蛋白成

分

，

将其放入离心管内

－80℃

冰箱保存

。

1.2.4

同位素标记所用

AP－1

双链探针实验所用

AP－1

双链探针的序列如下

：5’－CGCTTGATGACTCAGCCGATC－

，ATP，3’

应用

多核苷酸激酶予以

5’－

末端标记

［

－32P］

最后用乙醇沉淀法来纯化标记的寡核苷酸

。

详细实验程序按

照所附说明书操作

。

1.2.5

1.2.5.1

1.2.5.2

电泳迁移率改变分析

对照反应阴性对照反应

（

反应中不加细胞核提取

特异抑制

：

反应中加

L（1．75

照证实所采用的方法能顺利检测到

AP－1

与

DNA

的复合

物

。

而同位素标记

AP－1

探针浓度为未标记同位素

AP－1

探针浓度的两倍

，

能完全进行抑制

DNA

与蛋白复合物的形成

过程

。

而同样浓度未标记同位素的

AP－2

探针不能抑制

DNA

与蛋白复合物的形成

。

抗

c－Jun

和抗

c－Fos

多抗均可

充分证实

DNA

蛋白复导致

DNA

与蛋白复合物的超级转变

，

合物中有含

AP－1

的蛋白成分

。

2.2

各组大鼠肾细胞

AP－1DNA

活性比较

组

AP－1

的

DNA

结合活性

188．56±17．49，B

组

801．41±19．83，C

组

298．92±18．71。

与

组比较

，B

组

、C

组大鼠肾细胞的

AP－

的

DNA

活性均明显上调

（P

均

＜0．01）；

与

组比较

，C

组

糖尿病大鼠肾细胞

AP－1

的

DNA

活性明显下调

（P＜0．01）。

2.3

各组大鼠肾脏组织学改变比较

组大鼠肾脏肾小球

肾小管未见异常改变

，

肾脏组织无病理异常

；

毛细血管襻薄

，

组大鼠肾小球的面积变大

，

可见肾小球系膜区面积变宽

，

并

且基底膜明显变厚

，

肾小管未见明显病变

，

且未发现肾小球发

生硬化

；C

组大鼠肾小球病理改变较对照组重

，

但明显轻于

组

。

讨论

糖尿病肾病是糖尿病主要的微血管并发症之一

，

过多的

反应性氧化产物是各种糖尿病并发症的共同致病机制

，

包括

DN。

高糖可诱导产生反应性氧化产物过多

，

同时多种抗氧化

使肾组织不能有效清除反应性氧化产物

，

从而酶的活性下降

，

使机体处于过度氧化应激状态

。

反应性氧化产物可激活

PKC

和

MAPK

［2－4］

，PKC

和

MAPK

激活转录因子

AP－1

激活使之

与受其调控的基因启动子上

DNA

序列结合

，

启动转录下游基

因如纤维连接蛋白

、

纤溶酶原激活物抑制物

（PAI－1）、

层黏

［3－5］

。

上述基因表达增加可促进肾

连蛋白

及

TGF－

等物

）

和阳性对照反应

（

反应中加

HeLa

细胞核提取物

）。

抑制结合反应

pmol）

未标记

AP－1

探针

。

非特异抑制

：

反应中加

L（1.75

pmol）

未标记

AP－2

探针

。

1.2.5.3

1.2.5.4

探针

。

1.2.5.5

电泳结果分析反应最终产物经过浓度为

的

非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳

，

所用电压为

350V，

时间为

AP－1

抗体试验反应中加

L（2

g）

抗

c－Jun、

抗

c－Fos

多抗

。

实验大鼠肾细胞

AP－1

的

DNA

结合活性的检测

L（1．75fmol）

标记同位素的

AP－1

反应中加

核蛋白

，

细胞肥大

、

增殖

，

使细胞合成胶原蛋白增加而降解减少

，

导致

肾小球基底膜增厚及细胞基质堆积

，

从而引起肾脏肥大

，

启动

6－7］。

研究证实

，

糖尿病肾病的发病及病情发展

［

肾组织细

AP－1

在基中起胞周期改变为糖尿病肾病的发病机制之一

，

关键作用

［8］

。

本研究采用电泳迁移实验方法

，

在体外证实大于标记探

针浓度

100

倍的未标记

AP－1

结合双链探针

，

可完全阻断

DNA－

蛋白复合物形成的电泳滞后带

，

相同浓度的未标记

AP－2

结合双链探针因不含

AP－1

的特异

DNA

结合序列而无

抑制作用

，

抗

c－Fos、

抗

c－Jun

多克降抗

（

下转第

2655

页

）

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现代中西医结合杂志

ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2014Aug，

·2655·

非黄酮类多酚化合物

。

它是许多植物受到真菌感染

、

紫外线

照射或病理状况下产生的一种植物抗毒素

，

已在

种植物中

被发现

，

在葡萄中含量尤为丰富

发现其亦具有抑制肿瘤的效能

［4］

［

参考文献

］

［1］DaiY，LiuM，TangW，etal．ASmac-mimeticsensitizesprostate

cancercellstoTＲAIL-inducedapoptosisviamodulatingbothIAPs

J］．BMCCancer，2009，6（9）：392andNF－kappaB［

［2］JinCY，ParkC，KimGY，etal．GenisteinenhancesTＲAIL－in-

ducedapoptosisthroughinhibitionofp38MAPKsignalinginhuman

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2009，180（2）：143－150

［3］IvanovVN，PartridgeMA，JohnsonGE，etal．Ｒesveratrolsensitizes

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Vitaceae：biosynthesisphytoaIexingeneexpressionintransgenicpIa-

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［7］KunduJK，SurhYJ．Cancerchemopreventiveandtherapeuticpoten-

J］．CancerLett，2008，tiaIofresveratroI：mechanisticperspectives［

269（2）：243－261

［8］

李勇

，

马荣

，

苏燕燕

，

等

．

白藜芦醇对肝癌

SMMC－7721

细胞的

．

安徽农业科学

，2010，38（25）：1345－1346；1349

抑制作用

［J］

［

收稿日期

］2014－03－04

。

早期研究表明

Ｒes

具有

。

李勇等

［8］

研究表明

Ｒes

抗血栓

、

抗突变

、

抗氧化

、

抗炎等功效

，

近年来

，

随着研究深入

，

［5－7］

对人体肝癌细胞

SMMC－7721

生长具有抑制作用

，

使其细胞

周期阻滞于

期并诱导其凋亡

。

但是国内外尚未研究

Ｒes

可

否增加肝癌细胞对

TＲAIL

诱导凋亡的敏感性

。

mol/L

的

Ｒes

本研究通过

TUNEL

染色法检测发现

，

加强

TＲAIL

诱导

SMMC－7721

细胞凋亡的作用不明显

，

但

100

mol/L

的白藜芦醇均可明显加强

TＲAIL

诱导μ

mol/L、

SMMC－7721

细胞凋亡

，

而且这种加强作用呈剂量依赖性

，

从

而为

Ｒes

作为

TＲAIL

致敏剂的研究提供了新的实验依据

。

为进一步研究

Ｒes

加强

TＲAIL

诱导肝癌细胞凋亡的相

Blot

方法检测不同浓度的白关机制

，

与此同时采用

Western-

藜芦醇作用于

SMMC－7721

细胞

24h

后生存素

Survivin

蛋白

100

mol/L

的白藜芦醇可的表达变化

，

结果发现

mol/L、

以明显下调

Survivin

蛋白表达

，

并与白藜芦醇加强

TＲAIL

诱

导

SMMC－7721

细胞凋亡作用一致

。

综合上述文献和实验结

可以推测

Survivin

可能参与了肝癌细胞

SMMC－7721

对果

，

TＲAIL

的耐受机制

，

可能通过下调

Survivin

蛋白表达增加

SMMC－7721

细胞对

TＲAIL

诱导凋亡的敏感性

。

虽然

Ｒes

加强

TＲAIL

诱导

SMMC－7721

细胞凋亡的机

本研究结果显示

，

致敏剂

Ｒes/

诱导剂

（TＲAIL）

制尚未明确

，

联合应用的策略在肿瘤的治疗领域中将具有广阔的应用前

景

。

本实验将为

TＲAIL

诱导肝癌细胞凋亡提供了实验依据

，

也为肝癌的治疗提供了新的思路

。

櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵

（

上接第

2652

页

）

体均引起

DNA－

蛋白复合物的凝胶超迁

移

，

说明该实验使用的探针特异性高

、

结果可靠

。

本研究结果证实

，

青蒿素能通过抑制实验糖尿病大鼠肾

从而减轻肾脏的病理变组织细胞

AP－1

的

DNA

结合活性

，

化

。

青蒿素对

的肾脏保护作用是否与其逆转肾组织细胞

周期有关尚需进一步证实

。

［

参

2008：8

［2］BerrouJ，TostivintI，VerrecchiaF，etal．Advancedglycationend

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Int，2000，58（Suppl77）：S59－S62

［

收稿日期

］2014－02－20

考文献

］

［1］

黎磊石

，．

北京

：

人民军医出版社

，

刘志红

．

中国肾脏病学

［M］