2024年4月23日发(作者：庾初蝶)
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２００８年４月
第ｌ６卷第２期
中国实验动物学报
ＡＣＴＡ ＬＡＢＯＲＡＴ０ＲＩＵＭ ＡＮＩＭＡＵＳ ＳＣＩＥＮＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
Ａｐｒｉｌ，２００８
Ｖｏ１．１６ Ｎｏ．２
ｅ
（
研究报告Ｅ
、 、 ；、
小鼠晶体蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定研究
季樱红 ，卢奕 ，李娜 ，金红 ，杨芄原
（１．复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科，上海２０００３１；２．复旦大学化学系，上海２００４３３）
【摘要】 目的应用双向电泳和质谱技术研究５周龄小鼠晶体蛋白质组。方法 提取小鼠晶体总蛋白，进行
固相ｐＨ梯度（ＩＰＧ）等电聚焦双向电泳，胶体考马斯亮蓝Ｒ一２５０染色，使用ＰＤＱｕｅｓｔ ７．３０图像分析软件分析电泳图
像。选择主要蛋白点胶上酶解，应用基质辅助激光解析电离飞行时间／飞行时间（ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ／ＴＯＦ）仪器进行串联
质谱（ＭＳ／ＭＳ）鉴定。结果 上样量为８８２ ｔｔｇ和１９０ ｔｔｇ时，分别检测３７０±４１蛋白点（ｎ＝３）和５７±５个蛋白点（ｎ
＝３）。高上样量能够较好地分离晶体低丰度蛋白，如念珠状纤维结构蛋白ＢＦＳＰ；低上样量可很好地分离高丰度蛋
白一晶体蛋白（包括 、ａＢ；ｐＡｌ～ｐＡ４； ｌ～ ３；”～ 和 等）。质谱鉴定得到１种细胞骨架蛋白和ｌ６种高丰
度晶体蛋白。结论双向电泳和质谱技术有效考察了晶体总蛋白质，为分析白内障形成过程中蛋白质的表达改变
提供了新的方法和途径。
【关键词】 小鼠晶体蛋白；蛋白质组；双向凝胶电泳；质谱
【中图分类号】Ｒ７７６．１；Ｑ５１ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１００５—４８４７（２００８）０２—０１０５—０６
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ０ｆ Ｍｏｕｓｅ Ｌｅｎｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＴＷＯ—Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ
Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒ０ｐｈ０ｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
ｊＩ Ｙｉｎｇ—Ｈｏｎｇ ，ＬＵ Ｙｉ ，ＬＩ Ｎａ ，ＪＩＮ Ｈｏｎｇ ，ＹＡＮＧ Ｐｅｎｇ—Ｙｕａｎ
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｅｙｅ＆ＥＮＴ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３ １，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３３，Ｃｈｉｎａ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｌｅｎｓ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ ５ ｗｅｅｋｓ ｏｌｄ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ）ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｐｒｏｔｒｅｉｎｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｌｅｎｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ
ｇｒａｄｉｅｎｔ（ＩＰＧ）ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ）ａｎｄ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ
ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｕｓｉｎｇ ＰＤＱｕｅｓｔ ７．３０ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ．Ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｇｅｌ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ｍａｔｉｒｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ／
ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ—ｔｉｍｅ ｏｆ ｌｆｉｇｈｔ—ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ／ＭＳ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｗｈｅｎ ａ ８８２ ｔｔｇ ｓａｍｐｌｅ ｏｒ ａ １９０ ｔｔｇ ｓａｍｐｌｅ
ｗａｓ ａｄｄｅｄ，３７０±４１ ｓｐｏｔｓ ａｎｄ ５７±５ ｓｐｏｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｈｅｎ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ，ｌｏｗ—ａｂｕｎｄａｎｃｅ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｂｅａｄｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＦＳＰ）ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ．Ｗｉｔｈ ａ ｌｏｗｅｒ ｓａｍｐｌｅ，ｔｈｅ ｈｉｇｈ—ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ，ｓｕｃｈ ａｓ ａＡ～ａＢ，ｐＡｌ～ｐＡ４，口Ｂｌ～口Ｂ３，７Ａ～７Ｆ ａｎｄ ７Ｓ ｃｒｙｓｔｌａｌｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ＭＡＬＤＩ—
ＴＯＦ／ＴＯＦ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｏｎｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｉｘｔｅｅｎ ｈｉｇｈ・ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｒｙｓｔｌｌｉａｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｌｅｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃａｎ ｂｅ ｗｅｌｌ
ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ２－ＤＥ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙ．Ｐｒｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆｆｅｒｓ ａ ｎｅｗ ａｖｅｎｕｅ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｅｎｓ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅｉｒ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃａｔａｒａｃｔ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｍｉｃｅ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｓ；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ；Ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ）；Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙｒ
晶体为富含蛋白质的组织，蛋白质占了人类晶
体湿重的６０％和干重的绝大部分。而蛋白质的氨
基酸序列、空间结构及数量决定了它们分子问的作
用，对维持晶体的透明起重要作用…。白内障的发
［基金项目］高等学校博士学科点专项科研基金（编号：
２００６０２４６０５６）；上海市卫生局青年基金（２００６Ｙ１０）。
病原因目前不甚明了，有报道表明，年龄、氧化、药
物、外伤、辐射、免疫反应等多种因素可引起蛋白质
的结构、数量的改变，从而导致晶体混浊。同时，晶
体蛋白质易受到各种翻译后修饰作用的影响如磷酸
化、氧化、糖化、乙酰化等。晶体蛋白质一旦被修饰，
其构象和功能将发生改变，晶体蛋白质可溶性下降，
不溶性蛋白含量增加，导致晶体透明度下降，从而产
［作者简介］季樱红（１９７９一），女，主治医师，复旦大学附属眼耳
鼻喉科医院眼科博士。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｉｎｇｈｏｎｇｊｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
［通讯作者］卢奕（１９６５一），男，教授，博士，博士生导师，研究方
向为：白内障的基础与临床。Ｔｅｌ：０２１．６４３７７１３４—１４７；Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｕｙｉ ｅｅｎｔ＠
ｙａｈｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
生白内障。基因虽是遗传信息的源头，而功能性蛋
白是基因功能的执行体，Ｗｉｌｋｉｎｓ和Ｗｉｌｌｉａｍｓ于１９９４
年首次提出蛋白质组的概念 。
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１０６ 中国实验动物学报２００８年４月第ｌ６卷第２期Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｐｒｉｌ，２００８，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２
蛋白质组是一个基因组、一种生物或一种细胞
（组织）所表达的全套蛋白质。应用蛋白质组技术可
研究晶体的蛋白质的结构与功能，为揭示白内障的
发病机制进一步提供实验基础。
１材料与方法
１．１实验试剂
固相ｐＨ梯度干胶条（ＩＰＧ）胶条（１８ ｃｍ，ｐＨ ３
～
１０，线性）、ＩＰＧ两性电解质缓冲液（ｐＨ ３～１０，线
性）为Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司产品。尿素、３．［（３－胆酰胺丙
基）．二乙胺］．丙磺酸（ＣＨＡＰＳ）、二硫苏糖醇（ＤＴｒ）、
硫脲、苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）、溴酚蓝、矿物油、十二
烷基磺酸钠（ＳＤＳ）、甘氨酸、甘油、丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ一甲
叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、过硫酸胺
（ＡＰＳ）、Ｔｒｉｓ、ａ．氰基．４．羟基肉桂酸（ＣＨＣＡ）、柠檬酸
胺、三氟乙酸（ＴＦＡ）、ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ为Ｓｉｇｍａ公司产品。
乙腈（ＡＣＮ）、碘乙酰胺为Ｆｌｕｋａ公司产品，测序级胰
蛋白酶购自Ｒｏｃｈｅ公司。其他常用试剂均为国产分
析纯。实验中所用水为ＭｉｌｌｉＱ去离子水。
裂解液或泡涨液：尿素（７ｍｏｌ／Ｌ）＋ＣＨＡＰＳ
（４％）＋硫脲（２ｍｏｌ／Ｌ）＋ＰＭＳＦ（０．１４％）。
平衡液Ａ／Ｂ： ｓ．ＨＣＬ（１．５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ８．８）＋尿
素（６ｍｏｌ／Ｌ）＋甘油（２０％）＋ＳＤＳ（２％）＋ＤＴｒ
（２％）／碘乙酰胺（２．５％）。
考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝Ｒ．２５０（０．１％）
＋乙醇（４０％）＋乙酸（１０％）。
１．２实验设备
ＩＰＧｐｈｏｒ水平等电聚焦电泳仪（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ＰＯＷＥＲ／ＰＡＣ １０００垂直电泳仪（Ｂｉｏ．
Ｒａｄ），ＧＳ一８００凝胶成像仪（Ｂｉｏ．Ｒａｄ），ＰＤＱＵＥＳＴ ７．３０
２－ＤＥ图像分析软件（Ｂｉｏ—Ｒａｄ），高速低温离心机
（Ｓｉｇｍａ），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｉｌｌｉＱ去离子水仪（法国），紫外分
光光度仪（ＵＶ ｍｉｎｉ １２４０），ＴＳ．１型脱色摇床，ＸＷ．
８０Ａ型漩涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂），
ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ／ＴＯＦ质谱仪（美国ＡＢＩ公司）。
１．３实验方法
１．３．１实验对象：中国科学院上海生命科学院实验
动物中心提供的３只５周龄健康昆明小鼠，合格证
号：ＳＣＸＫ（沪）２００３．０００３。
１．３．２ 晶体全蛋白的提取：脊椎脱臼处死小鼠，在
Ｚｅｉｓｓ显微镜下，行小鼠双眼球摘除术，乳酸林格氏
液冲洗眼球，从后部剪开巩膜，完整取出小鼠晶体，
去除晶体囊膜，立即置于液氮内保存。研钵用液氮
预冷后将晶体组织敲打成粉末状，刮取晶体粉末入
匀浆器研磨，加８００ ｔｔＬ裂解液，冰上孵育３０ ｍｉｎ，
１５℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ ｍｉｎ，吸取上清液，．８０℃冰
箱保存。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定样品蛋白浓度。
１．３．３ 双向电泳和染色：采用ｐＨ ３—１０，１８ ｃｍ胶
条，蛋白上样量分别为８８２ Ｆｇ和１９０ ｔｔｇ，加入重泡涨
液至３５０ ＦＬ。２０℃泡涨１２ ｈ以上。等点聚焦条件
设置：①梯度升压２５０ Ｖ／３０ ｍｉｎ；②梯度升压５００ Ｖ／
３０ ｍｉｎ；③梯度升压１ ０００ Ｖ／ｈ；④梯度升压２０００ Ｖ／
ｈ；⑤快速升压４０００ Ｖ／ｈ；⑥快速升压８ ０００ Ｖ／３ ｈ，
等电聚焦８００００ Ｖｈ。等电聚焦结束后，胶条先后在
平衡液Ａ中平衡１５ ｍｉｎ，平衡液Ｂ中平衡１５ ｍｉｎ，然
后将胶条移至分离胶上端，琼脂糖（０．５％）封胶。
以恒电流方式，２０ ｍＡ／胶电泳至蛋白转至分离胶后，
换用４０ ｍＡ／胶，直至溴酚蓝前沿迁移至距凝胶底边
１ ｃｍ处停止电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色液染色
１２～１６ ｈ，后用脱色液脱色。
１．３．４ 图像采集分析：染色后的凝胶用ＧＳ一８００凝胶
扫描仪透射扫描，用ＰＤＱＵＥＳＴ ７．３０软件进行分析。
１．３．５质谱鉴定分析：①胶上酶解：将选定蛋白斑
点切割下来，切碎置１００ ｔｔＬ脱色液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮＨ４ＨＣＯ ＋５０％乙腈（ＡＣＮ）脱色２０ ｍｉｎ，重复２次。
然后加入１００ ｔｔＬ乙腈干胶１０ ｍｉｎ。接着加入３
浓度为１２．５ ｎｇ／ｔｔＬ Ｔｒｙｐｓｉｎ溶液，４℃冰箱内放置３０
ｍｉｎ，弃去多余的酶液，取出后在３７℃烘箱中酶解过
夜。酶解结束后加入６０ ｔｔＬ ５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ进
行肽段提取，放置３００ ｍｉｎ，重复２次。将肽段溶液
在氮气流下吹干浓缩，备质谱检测。②质谱分析与
数据库检索：将肽段重新溶解于０．７ ｔｔＬ ５ ｍｇ／ｍＬ的
ＣＨＣＡ溶液（溶于０．１％ＴＦＡ＋５０％ＡＣＮ）中，点到
ＭＡＬＤＩ靶板上，在室温下干燥。利用４７００串联飞行
时间质谱仪［４７００ Ｐｍｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＯＦ／ＴＯＦＴＭ）
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）］进行质谱分析，激光源为
３５５ ｎｍ波长的Ｎｄ：ＹＡＧ激光器，加速电压为２０ ｋＶ，
采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。
ＰＭＦ质量扫描范围为７００～３５００，选取强度最大的６
个峰进行串级质谱分析；ＰＭＦ谱图用两个ｔｙｒｐｓｉｎ自
降解的峰ｍ／ｚ ８４２．５１０和ｍ／ｚ ２２１１．１０５进行内标校
正。所得结果用ＧＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）．
ＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｉｒｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）进行数据库检
索。搜索参数设置：数据库为ＮＣＢＩ；检索种属为小
鼠，Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；数据检索的方式为ｃｏｍｂｉｎｅｄ；最大
允许漏切位点为１；酶为胰蛋白酶。质量误差范围
设置：ＰＭＦ ０．３，ＭＳ／ＭＳ ０．４；设置的可变修饰为
ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（半胱氨酸）和氧化（甲硫氨
酸）。在数据库检索时胰酶自降解峰和污染物质的
峰都手工剔除。
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中国实验动物学报２００８年４月第ｌ６卷第２期Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｐｒｉｌ，２００８，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２ ｌ０７
２ 结果
２．１双向凝胶电泳图像及分析结果
点（ｎ＝３）和５７土５个蛋白点（ｎ＝３）。上样量为１９０
ｇ时，任意选取３０个蛋白点进行位置重复性分析，
在ＩＥＦ方向（横向）平均为（０．９２土０．１５）ｍｍ，在
ＳＤＳ．ＰＡＧＥ方向（纵向）（１．２８土０．２１ ｍｍ），表明蛋
较高上样量有利于分离晶体低丰度蛋白；低上
样量有利于分离高丰度蛋白一晶体蛋白（图１）。上
样量为８８２ ｇ和１９０ ｇ时，分别检测３７０±４１蛋白
白质点在位置上具有较好的重复性。
ｌＯ
Ａ
Ａ上样量为８８２，ｕｇ，ａ对应于低丰度蛋白；Ｂ上样量为１９０，ｕｇ，ｂ对应于高丰度蛋白一晶体蛋白。
Ｂ
图１小鼠晶体总蛋白的２一ＤＥ图谱（ｐＨ ３一ｌＯ，考染）
Ａ：８８２，ｕｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｌｏａｄｅｄ．“ａ”ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｌｏｗ—ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｂ：１９０ ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｌｏａｄｅｄ．…ｂ’ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｈｉｇｈ
ｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｒａｏｔｅｉｎｓ．
Ｆｉｇ．１ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ２－ＤＥ ｇｅｌｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｍａｐ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｌｅｎｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｅ．（ｐＨ ３—１０，Ｒ２５０
ｓｔａｉｎｅｄ）．
２．２质谱鉴定结果
采用ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ／ＴＯＦ质谱对样品先进行分析
（表１），鉴定出ｌ７种蛋白质。包括１种低丰度蛋白
念珠状纤维结构蛋白（ｂｅａｄｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＦＳＰ／ｆｉｌｅｎｓｉｎ）（图２），ｌ６种高丰度晶体蛋白
质（晶体蛋白）（图３），其中ＢＦＳＰ／ｆｉｌｅｎｓｉｎ的肽质量指
纹图谱（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ，ＰＭＦ）和离子分数最
高的肽段串联质谱图见图４。
嗣
●
■－■謦
■
．
＿‘Ｉ
３讨论
晶体中的蛋白可分为水溶性和非水溶性两种，
晶体蛋白为水溶性蛋白，占了晶体中蛋白质总量的
９０％左右，包括：ａ、Ｇ、７晶体蛋白。ａ晶体蛋白相对
分子质量最大，为６００ Ｘ １０３～９００ Ｘ １０ ，包括ａＡ和
７ ： ：：尊
ｊＩ
图２与图１Ａ中方框小图对应的放大图谱，ＢＦＳＰ
为念珠状纤维结构蛋白
Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｍａｐ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｑｕａｒｅ ｂｏｘ
ｄｅｆｉｎｅｄ ｉｎ Ｆｉｇ．１ Ａ．ＢＦＳＰ，ｂｅａｄｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ａＢ，亚单位相对分子质量为２０ Ｘ １０ 左右。以包含
１７３个氨基酸，ａＢ包含１７５个氨基酸。０晶体蛋白由
单个相对分质子量介于２３ Ｘ １０３—３２ Ｘ １０３之间的多
肽亚单位聚合而成，包括４种酸性亚单位（ ｌ、
２、ｐＡ３、ｐＡ４）和３种碱性亚单位（ Ｂｌ、 Ｂ２、１３Ｂ３）。
晶体蛋白相对分子质量最小（２０ Ｘ １０ ），包括７个
成员，７Ａ～ 和７ｓ。而其中７Ｃ、７Ｄ、７ｓ构成人类的
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１０８ 中国实验动物学报２００８年４月第１６卷第２期 Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉａｔ Ｓｃｉ Ｓｉｎ．Ａｐｒｉｌ，２００８，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２
主要７晶体蛋白。不溶性蛋白（脲溶性和脲不溶性
配方提高晶体疏水性蛋白的溶解性。尿素作为一种
中性离液剂，可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成
蛋白）包括细胞骨架蛋白、膜蛋白等。晶体内的细
胞骨架蛋白包括微丝、中间纤维和念珠状纤维等。
既往研究主要集中在晶体水溶性蛋白，本研究
完全随机的构象，使所有的离子团暴露于溶液中。
硫脲是一种比尿素具有更强能力的变性剂，两者的
目标是全部晶体蛋白，采用尿素结合硫脲的裂解液
结合提高了溶解蛋白尤其是膜蛋白的能力。
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中国实验动物学报２００８年４月第ｌ６卷第２期Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｐｒｉｌ，２００８，Ｖｏ１．１６。Ｎｏ．２ １０９
ｐＨ－３—
１００×ｉ０ 一
ＭＷ
ｌＯ
量，使得低丰度蛋白的分离受到影响。而低丰度蛋
白在细胞内具有重要的调节功能，因此，分离低丰度
蛋白是一种挑战。从不同上样量的凝胶图像中可以
看到，不同的上样量可用来分析不同丰度的蛋白质：
当上样量为１９０ ｇ时，晶体蛋白可得到很好的分
离，但低丰度蛋白的斑点数很少。结果与国内外文
献报道的晶体组织相似 。当上样量为８８２”ｇ
时，高相对分子质量的低丰度蛋白得到很好的分离，
而高丰度蛋白点互相重叠。
本实验鉴定得到１６种高丰度晶体蛋白，包括
ａＡ、ａＢ；ｐＡ１～８Ａ４；８Ｂｌ～８Ｂ３；ｙＡ～７Ｆ和７Ｓ等。众所
周知，ａＢ晶体蛋白是小分子热休克蛋白的一种，具
有分子伴侣作用，能保护其他蛋白，对各种变性剂包
括加热、紫外线和化学处理造成的蛋白质的凝聚具
图３ 正常晶体所有高丰度蛋白一结构蛋白（ａ、８、
）的分布（上样量１９０ ｔｔｇ）
有抑制作用，并对其他蛋白的溶解性具有促进作
Ｆｉｇ．２ ２－ＤＥ ｇｅｌｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
用 。应激状态时，ａＢ晶体蛋白主要和细胞骨架蛋
ｓｕｃｈ ａｓ ａ，８ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｌｅｎｓｅｓ（１９０ ｔｔｇ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｌｏａｄｅｄ）
白相结合，对细胞产生保护作用…。
晶体蛋白在结构上具有自身的特点，由于晶体
本实验还鉴定出１种低丰度蛋白念珠状纤维结
蛋白的含量过高（９０％左右），限制了样品的上样
构蛋白（ｂｅａｄｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＦＳＰ／
４７００ Ｒｅｆｌｅｄｏｒ ｓｐｅｃ ＭＣ［ＢＰ＝１４５６８．１６８４６１
．
苦
器 ｇ
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．
船Ｉ－『ｌ脚
盯加 ｓ，■ｓ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ１ｄ５６ ７８ ｓｐｅｅ ＭＣ［ＢＰ＝２３２’．１０￣Ｏｌ
图４小鼠ＢＦＳＰ／ｉｉｌｅｎｓｉｎ的ＭＳ（上图）和ｍ／ｚ １４５６．７８的ＭＳ／ＭＳ分析图（下
图）
Ｆｉｇ．４ ＭＳ ａｎｄ ＭＳ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｍ０ｕｓｅ ＢＦＳＰ／ｆｉｌｅｎｓｉｎ．Ｕｐｐｅｒ：ＭＳ ｓｐｅｃｔｕｒｍ：
ｌｏｗｅｒ：ＭＳ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｍ／ｚ １４５６．７８
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ｌ ｌ０ 中国实验动物学报２００８年４月第ｌ６卷第２期Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｐｒｉｌ，２００８，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ ２
ｉｆｌｅｎｓｉｎ）。它属细胞骨架蛋白，具有晶体特异性，只
在分化的晶体纤维细胞中表达。细胞骨架起着提供
胞质结构骨架、细胞运动和细胞大小、形态的决定和
维持作用。正常的细胞骨架蛋白功能和它们与晶体
蛋白的相互作用是透明晶体细胞结构的发育和维持
的基础。前面提及应激状态时ａＢ可和细胞骨架蛋
参 考 文 献
ｌ ｌ Ｊ Ｄｅｌａｙｅ Ｍ，Ｔａｒｄｉｅｕ Ａ ｓｈｏｒｔ－ｒａｎｇｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｃｃｏｕｎｔｓ
ｆｏｒ ｅｙｅ ｌｅｎｓ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８３，３０２（５９０７）：４１５—４１７
［２］Ｓｗｉｎｂａｎｋｓ Ｄ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｂａｃｋｓ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｐｒｏｐｏｓａｌ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，
１９９５，７８（６５５８）：６５３．
【３］Ｌａｍｐｉ ＫＪ，Ｓｈｉｈ Ｍ，Ｕｅｄａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｌｅｎｓ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｔ
ｃｒｙｓｔｌａｌｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｓｉｒｓ ｍａｐ［Ｊ］．
Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ，２００２，４３（１）：２１６—２２４．
白相结合，与之结合的主要是中间纤维ＢＦＳＰ 。
ＢＦＳＰ的两大核心成分包括ｐｈａｋｉｎｉｎ（ＢＦＳＰ．２、ＣＰ４９）
【４］ Ｕｅｄａ Ｙ，Ｄｕｎｃａｎ ＭＫ，Ｄａｖｉｄ ＬＬ．Ｌｅｎｓ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
和ｆｉｌｅｎｓｉｎ（ＢＦＳＰ．１、ＣＰ９４、ＣＰ９５、ＣＰ１１５）。已明确细
胞骨架蛋白的缺失可在大鼠中引起白内障 。
Ｊａｋｏｂｓ等 首次发现细胞骨架蛋白突变可造成人类
先天性白内障，在一先天性白内障家系研究发现是
由于ＢＦＳＰ．２第三个外显子的核苷酸发生缺失突变，
导致读码框内２３３位的谷氨酸密码子缺失，蛋白结
构发生异常，使晶体失去透明。
晶体是一个无血管分布、无神经支配的组织，其
生理和病理变化受其它因素的影响较少。既往研究
热点晶体的研究集中在基因组水平，但随着技术的
发展，研究的对象由传统的单个基因、单个蛋白质转
变为基因组和蛋白质组。蛋白质组研究比基因组研
究更有实用性，有希望在蛋白质水平上（尤其是一
些重要蛋白）阐明白内障、后发障及白内障术后并
发症等晶体相关疾病的发病机制，并有可能提供此
类疾病预防与治疗的更有效的方法。
ｏｆ ｃｒｙｓｔｌａｌｉｎ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｌｅｎｓ ｗｉｔｈ ａｇｅ［Ｊ］．Ｉｎｖｅｓｔ
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Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ，１９９９，加（５）：９５１—９５８
［８］ Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ｈ，Ｄａｖｉｄ ＬＬ，Ｈｉｒａｏｋａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ
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ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃａｔｒａｃｔａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ
ｂｅａｄｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ＢＦＳＰ２［Ｊ Ｊ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，２０００，６６
（４）：１４３２—１４３６．
［收稿１５１期］２００７—１０一ｌ１
声明：本刊已入编：万方数据一数字化期刊群；中国核心期刊（遴选）数据库；中国科学引文
数据库；中国学术期刊（光盘版）电子杂志；中文生物医学期刊文献数据库（ＣＭＣＣ）；中国生物医
学期刊引文数据库（ＣＭＣＩ）中国学术期刊文摘；作者著作权使用费与本刊稿酬一次性给付，不
再另行发放。作者如不同意将文章入编，投稿时敬请说明。
2024年4月23日发(作者：庾初蝶)
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２００８年４月
第ｌ６卷第２期
中国实验动物学报
ＡＣＴＡ ＬＡＢＯＲＡＴ０ＲＩＵＭ ＡＮＩＭＡＵＳ ＳＣＩＥＮＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
Ａｐｒｉｌ，２００８
Ｖｏ１．１６ Ｎｏ．２
ｅ
（
研究报告Ｅ
、 、 ；、
小鼠晶体蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定研究
季樱红 ，卢奕 ，李娜 ，金红 ，杨芄原
（１．复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科，上海２０００３１；２．复旦大学化学系，上海２００４３３）
【摘要】 目的应用双向电泳和质谱技术研究５周龄小鼠晶体蛋白质组。方法 提取小鼠晶体总蛋白，进行
固相ｐＨ梯度（ＩＰＧ）等电聚焦双向电泳，胶体考马斯亮蓝Ｒ一２５０染色，使用ＰＤＱｕｅｓｔ ７．３０图像分析软件分析电泳图
像。选择主要蛋白点胶上酶解，应用基质辅助激光解析电离飞行时间／飞行时间（ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ／ＴＯＦ）仪器进行串联
质谱（ＭＳ／ＭＳ）鉴定。结果 上样量为８８２ ｔｔｇ和１９０ ｔｔｇ时，分别检测３７０±４１蛋白点（ｎ＝３）和５７±５个蛋白点（ｎ
＝３）。高上样量能够较好地分离晶体低丰度蛋白，如念珠状纤维结构蛋白ＢＦＳＰ；低上样量可很好地分离高丰度蛋
白一晶体蛋白（包括 、ａＢ；ｐＡｌ～ｐＡ４； ｌ～ ３；”～ 和 等）。质谱鉴定得到１种细胞骨架蛋白和ｌ６种高丰
度晶体蛋白。结论双向电泳和质谱技术有效考察了晶体总蛋白质，为分析白内障形成过程中蛋白质的表达改变
提供了新的方法和途径。
【关键词】 小鼠晶体蛋白；蛋白质组；双向凝胶电泳；质谱
【中图分类号】Ｒ７７６．１；Ｑ５１ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１００５—４８４７（２００８）０２—０１０５—０６
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ０ｆ Ｍｏｕｓｅ Ｌｅｎｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＴＷＯ—Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ
Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒ０ｐｈ０ｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
ｊＩ Ｙｉｎｇ—Ｈｏｎｇ ，ＬＵ Ｙｉ ，ＬＩ Ｎａ ，ＪＩＮ Ｈｏｎｇ ，ＹＡＮＧ Ｐｅｎｇ—Ｙｕａｎ
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｅｙｅ＆ＥＮＴ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３ １，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３３，Ｃｈｉｎａ）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｌｅｎｓ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ ５ ｗｅｅｋｓ ｏｌｄ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ）ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｐｒｏｔｒｅｉｎｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｌｅｎｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ
ｇｒａｄｉｅｎｔ（ＩＰＧ）ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ）ａｎｄ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ
ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｕｓｉｎｇ ＰＤＱｕｅｓｔ ７．３０ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ．Ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｇｅｌ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ｍａｔｉｒｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ／
ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ—ｔｉｍｅ ｏｆ ｌｆｉｇｈｔ—ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ／ＭＳ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｗｈｅｎ ａ ８８２ ｔｔｇ ｓａｍｐｌｅ ｏｒ ａ １９０ ｔｔｇ ｓａｍｐｌｅ
ｗａｓ ａｄｄｅｄ，３７０±４１ ｓｐｏｔｓ ａｎｄ ５７±５ ｓｐｏｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｈｅｎ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ，ｌｏｗ—ａｂｕｎｄａｎｃｅ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｂｅａｄｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＦＳＰ）ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ．Ｗｉｔｈ ａ ｌｏｗｅｒ ｓａｍｐｌｅ，ｔｈｅ ｈｉｇｈ—ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ，ｓｕｃｈ ａｓ ａＡ～ａＢ，ｐＡｌ～ｐＡ４，口Ｂｌ～口Ｂ３，７Ａ～７Ｆ ａｎｄ ７Ｓ ｃｒｙｓｔｌａｌｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ＭＡＬＤＩ—
ＴＯＦ／ＴＯＦ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｏｎｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｉｘｔｅｅｎ ｈｉｇｈ・ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｒｙｓｔｌｌｉａｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｌｅｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃａｎ ｂｅ ｗｅｌｌ
ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ２－ＤＥ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙ．Ｐｒｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆｆｅｒｓ ａ ｎｅｗ ａｖｅｎｕｅ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｅｎｓ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅｉｒ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃａｔａｒａｃｔ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｍｉｃｅ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｓ；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ；Ｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ）；Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｙｒ
晶体为富含蛋白质的组织，蛋白质占了人类晶
体湿重的６０％和干重的绝大部分。而蛋白质的氨
基酸序列、空间结构及数量决定了它们分子问的作
用，对维持晶体的透明起重要作用…。白内障的发
［基金项目］高等学校博士学科点专项科研基金（编号：
２００６０２４６０５６）；上海市卫生局青年基金（２００６Ｙ１０）。
病原因目前不甚明了，有报道表明，年龄、氧化、药
物、外伤、辐射、免疫反应等多种因素可引起蛋白质
的结构、数量的改变，从而导致晶体混浊。同时，晶
体蛋白质易受到各种翻译后修饰作用的影响如磷酸
化、氧化、糖化、乙酰化等。晶体蛋白质一旦被修饰，
其构象和功能将发生改变，晶体蛋白质可溶性下降，
不溶性蛋白含量增加，导致晶体透明度下降，从而产
［作者简介］季樱红（１９７９一），女，主治医师，复旦大学附属眼耳
鼻喉科医院眼科博士。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｉｎｇｈｏｎｇｊｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
［通讯作者］卢奕（１９６５一），男，教授，博士，博士生导师，研究方
向为：白内障的基础与临床。Ｔｅｌ：０２１．６４３７７１３４—１４７；Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｕｙｉ ｅｅｎｔ＠
ｙａｈｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
生白内障。基因虽是遗传信息的源头，而功能性蛋
白是基因功能的执行体，Ｗｉｌｋｉｎｓ和Ｗｉｌｌｉａｍｓ于１９９４
年首次提出蛋白质组的概念 。
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１０６ 中国实验动物学报２００８年４月第ｌ６卷第２期Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｐｒｉｌ，２００８，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２
蛋白质组是一个基因组、一种生物或一种细胞
（组织）所表达的全套蛋白质。应用蛋白质组技术可
研究晶体的蛋白质的结构与功能，为揭示白内障的
发病机制进一步提供实验基础。
１材料与方法
１．１实验试剂
固相ｐＨ梯度干胶条（ＩＰＧ）胶条（１８ ｃｍ，ｐＨ ３
～
１０，线性）、ＩＰＧ两性电解质缓冲液（ｐＨ ３～１０，线
性）为Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司产品。尿素、３．［（３－胆酰胺丙
基）．二乙胺］．丙磺酸（ＣＨＡＰＳ）、二硫苏糖醇（ＤＴｒ）、
硫脲、苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）、溴酚蓝、矿物油、十二
烷基磺酸钠（ＳＤＳ）、甘氨酸、甘油、丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ一甲
叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、过硫酸胺
（ＡＰＳ）、Ｔｒｉｓ、ａ．氰基．４．羟基肉桂酸（ＣＨＣＡ）、柠檬酸
胺、三氟乙酸（ＴＦＡ）、ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ为Ｓｉｇｍａ公司产品。
乙腈（ＡＣＮ）、碘乙酰胺为Ｆｌｕｋａ公司产品，测序级胰
蛋白酶购自Ｒｏｃｈｅ公司。其他常用试剂均为国产分
析纯。实验中所用水为ＭｉｌｌｉＱ去离子水。
裂解液或泡涨液：尿素（７ｍｏｌ／Ｌ）＋ＣＨＡＰＳ
（４％）＋硫脲（２ｍｏｌ／Ｌ）＋ＰＭＳＦ（０．１４％）。
平衡液Ａ／Ｂ： ｓ．ＨＣＬ（１．５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ８．８）＋尿
素（６ｍｏｌ／Ｌ）＋甘油（２０％）＋ＳＤＳ（２％）＋ＤＴｒ
（２％）／碘乙酰胺（２．５％）。
考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝Ｒ．２５０（０．１％）
＋乙醇（４０％）＋乙酸（１０％）。
１．２实验设备
ＩＰＧｐｈｏｒ水平等电聚焦电泳仪（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ＰＯＷＥＲ／ＰＡＣ １０００垂直电泳仪（Ｂｉｏ．
Ｒａｄ），ＧＳ一８００凝胶成像仪（Ｂｉｏ．Ｒａｄ），ＰＤＱＵＥＳＴ ７．３０
２－ＤＥ图像分析软件（Ｂｉｏ—Ｒａｄ），高速低温离心机
（Ｓｉｇｍａ），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｉｌｌｉＱ去离子水仪（法国），紫外分
光光度仪（ＵＶ ｍｉｎｉ １２４０），ＴＳ．１型脱色摇床，ＸＷ．
８０Ａ型漩涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂），
ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ／ＴＯＦ质谱仪（美国ＡＢＩ公司）。
１．３实验方法
１．３．１实验对象：中国科学院上海生命科学院实验
动物中心提供的３只５周龄健康昆明小鼠，合格证
号：ＳＣＸＫ（沪）２００３．０００３。
１．３．２ 晶体全蛋白的提取：脊椎脱臼处死小鼠，在
Ｚｅｉｓｓ显微镜下，行小鼠双眼球摘除术，乳酸林格氏
液冲洗眼球，从后部剪开巩膜，完整取出小鼠晶体，
去除晶体囊膜，立即置于液氮内保存。研钵用液氮
预冷后将晶体组织敲打成粉末状，刮取晶体粉末入
匀浆器研磨，加８００ ｔｔＬ裂解液，冰上孵育３０ ｍｉｎ，
１５℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ ｍｉｎ，吸取上清液，．８０℃冰
箱保存。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定样品蛋白浓度。
１．３．３ 双向电泳和染色：采用ｐＨ ３—１０，１８ ｃｍ胶
条，蛋白上样量分别为８８２ Ｆｇ和１９０ ｔｔｇ，加入重泡涨
液至３５０ ＦＬ。２０℃泡涨１２ ｈ以上。等点聚焦条件
设置：①梯度升压２５０ Ｖ／３０ ｍｉｎ；②梯度升压５００ Ｖ／
３０ ｍｉｎ；③梯度升压１ ０００ Ｖ／ｈ；④梯度升压２０００ Ｖ／
ｈ；⑤快速升压４０００ Ｖ／ｈ；⑥快速升压８ ０００ Ｖ／３ ｈ，
等电聚焦８００００ Ｖｈ。等电聚焦结束后，胶条先后在
平衡液Ａ中平衡１５ ｍｉｎ，平衡液Ｂ中平衡１５ ｍｉｎ，然
后将胶条移至分离胶上端，琼脂糖（０．５％）封胶。
以恒电流方式，２０ ｍＡ／胶电泳至蛋白转至分离胶后，
换用４０ ｍＡ／胶，直至溴酚蓝前沿迁移至距凝胶底边
１ ｃｍ处停止电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色液染色
１２～１６ ｈ，后用脱色液脱色。
１．３．４ 图像采集分析：染色后的凝胶用ＧＳ一８００凝胶
扫描仪透射扫描，用ＰＤＱＵＥＳＴ ７．３０软件进行分析。
１．３．５质谱鉴定分析：①胶上酶解：将选定蛋白斑
点切割下来，切碎置１００ ｔｔＬ脱色液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮＨ４ＨＣＯ ＋５０％乙腈（ＡＣＮ）脱色２０ ｍｉｎ，重复２次。
然后加入１００ ｔｔＬ乙腈干胶１０ ｍｉｎ。接着加入３
浓度为１２．５ ｎｇ／ｔｔＬ Ｔｒｙｐｓｉｎ溶液，４℃冰箱内放置３０
ｍｉｎ，弃去多余的酶液，取出后在３７℃烘箱中酶解过
夜。酶解结束后加入６０ ｔｔＬ ５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ进
行肽段提取，放置３００ ｍｉｎ，重复２次。将肽段溶液
在氮气流下吹干浓缩，备质谱检测。②质谱分析与
数据库检索：将肽段重新溶解于０．７ ｔｔＬ ５ ｍｇ／ｍＬ的
ＣＨＣＡ溶液（溶于０．１％ＴＦＡ＋５０％ＡＣＮ）中，点到
ＭＡＬＤＩ靶板上，在室温下干燥。利用４７００串联飞行
时间质谱仪［４７００ Ｐｍｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＯＦ／ＴＯＦＴＭ）
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）］进行质谱分析，激光源为
３５５ ｎｍ波长的Ｎｄ：ＹＡＧ激光器，加速电压为２０ ｋＶ，
采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。
ＰＭＦ质量扫描范围为７００～３５００，选取强度最大的６
个峰进行串级质谱分析；ＰＭＦ谱图用两个ｔｙｒｐｓｉｎ自
降解的峰ｍ／ｚ ８４２．５１０和ｍ／ｚ ２２１１．１０５进行内标校
正。所得结果用ＧＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）．
ＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｉｒｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）进行数据库检
索。搜索参数设置：数据库为ＮＣＢＩ；检索种属为小
鼠，Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；数据检索的方式为ｃｏｍｂｉｎｅｄ；最大
允许漏切位点为１；酶为胰蛋白酶。质量误差范围
设置：ＰＭＦ ０．３，ＭＳ／ＭＳ ０．４；设置的可变修饰为
ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ（半胱氨酸）和氧化（甲硫氨
酸）。在数据库检索时胰酶自降解峰和污染物质的
峰都手工剔除。
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中国实验动物学报２００８年４月第ｌ６卷第２期Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｐｒｉｌ，２００８，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２ ｌ０７
２ 结果
２．１双向凝胶电泳图像及分析结果
点（ｎ＝３）和５７土５个蛋白点（ｎ＝３）。上样量为１９０
ｇ时，任意选取３０个蛋白点进行位置重复性分析，
在ＩＥＦ方向（横向）平均为（０．９２土０．１５）ｍｍ，在
ＳＤＳ．ＰＡＧＥ方向（纵向）（１．２８土０．２１ ｍｍ），表明蛋
较高上样量有利于分离晶体低丰度蛋白；低上
样量有利于分离高丰度蛋白一晶体蛋白（图１）。上
样量为８８２ ｇ和１９０ ｇ时，分别检测３７０±４１蛋白
白质点在位置上具有较好的重复性。
ｌＯ
Ａ
Ａ上样量为８８２，ｕｇ，ａ对应于低丰度蛋白；Ｂ上样量为１９０，ｕｇ，ｂ对应于高丰度蛋白一晶体蛋白。
Ｂ
图１小鼠晶体总蛋白的２一ＤＥ图谱（ｐＨ ３一ｌＯ，考染）
Ａ：８８２，ｕｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｌｏａｄｅｄ．“ａ”ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｌｏｗ—ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｂ：１９０ ｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｌｏａｄｅｄ．…ｂ’ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｈｉｇｈ
ｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｒａｏｔｅｉｎｓ．
Ｆｉｇ．１ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ２－ＤＥ ｇｅｌｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｍａｐ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｌｅｎｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｅ．（ｐＨ ３—１０，Ｒ２５０
ｓｔａｉｎｅｄ）．
２．２质谱鉴定结果
采用ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ／ＴＯＦ质谱对样品先进行分析
（表１），鉴定出ｌ７种蛋白质。包括１种低丰度蛋白
念珠状纤维结构蛋白（ｂｅａｄｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＦＳＰ／ｆｉｌｅｎｓｉｎ）（图２），ｌ６种高丰度晶体蛋白
质（晶体蛋白）（图３），其中ＢＦＳＰ／ｆｉｌｅｎｓｉｎ的肽质量指
纹图谱（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ，ＰＭＦ）和离子分数最
高的肽段串联质谱图见图４。
嗣
●
■－■謦
■
．
＿‘Ｉ
３讨论
晶体中的蛋白可分为水溶性和非水溶性两种，
晶体蛋白为水溶性蛋白，占了晶体中蛋白质总量的
９０％左右，包括：ａ、Ｇ、７晶体蛋白。ａ晶体蛋白相对
分子质量最大，为６００ Ｘ １０３～９００ Ｘ １０ ，包括ａＡ和
７ ： ：：尊
ｊＩ
图２与图１Ａ中方框小图对应的放大图谱，ＢＦＳＰ
为念珠状纤维结构蛋白
Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｍａｐ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｑｕａｒｅ ｂｏｘ
ｄｅｆｉｎｅｄ ｉｎ Ｆｉｇ．１ Ａ．ＢＦＳＰ，ｂｅａｄｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ａＢ，亚单位相对分子质量为２０ Ｘ １０ 左右。以包含
１７３个氨基酸，ａＢ包含１７５个氨基酸。０晶体蛋白由
单个相对分质子量介于２３ Ｘ １０３—３２ Ｘ １０３之间的多
肽亚单位聚合而成，包括４种酸性亚单位（ ｌ、
２、ｐＡ３、ｐＡ４）和３种碱性亚单位（ Ｂｌ、 Ｂ２、１３Ｂ３）。
晶体蛋白相对分子质量最小（２０ Ｘ １０ ），包括７个
成员，７Ａ～ 和７ｓ。而其中７Ｃ、７Ｄ、７ｓ构成人类的
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１０８ 中国实验动物学报２００８年４月第１６卷第２期 Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉａｔ Ｓｃｉ Ｓｉｎ．Ａｐｒｉｌ，２００８，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ．２
主要７晶体蛋白。不溶性蛋白（脲溶性和脲不溶性
配方提高晶体疏水性蛋白的溶解性。尿素作为一种
中性离液剂，可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成
蛋白）包括细胞骨架蛋白、膜蛋白等。晶体内的细
胞骨架蛋白包括微丝、中间纤维和念珠状纤维等。
既往研究主要集中在晶体水溶性蛋白，本研究
完全随机的构象，使所有的离子团暴露于溶液中。
硫脲是一种比尿素具有更强能力的变性剂，两者的
目标是全部晶体蛋白，采用尿素结合硫脲的裂解液
结合提高了溶解蛋白尤其是膜蛋白的能力。
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中国实验动物学报２００８年４月第ｌ６卷第２期Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｐｒｉｌ，２００８，Ｖｏ１．１６。Ｎｏ．２ １０９
ｐＨ－３—
１００×ｉ０ 一
ＭＷ
ｌＯ
量，使得低丰度蛋白的分离受到影响。而低丰度蛋
白在细胞内具有重要的调节功能，因此，分离低丰度
蛋白是一种挑战。从不同上样量的凝胶图像中可以
看到，不同的上样量可用来分析不同丰度的蛋白质：
当上样量为１９０ ｇ时，晶体蛋白可得到很好的分
离，但低丰度蛋白的斑点数很少。结果与国内外文
献报道的晶体组织相似 。当上样量为８８２”ｇ
时，高相对分子质量的低丰度蛋白得到很好的分离，
而高丰度蛋白点互相重叠。
本实验鉴定得到１６种高丰度晶体蛋白，包括
ａＡ、ａＢ；ｐＡ１～８Ａ４；８Ｂｌ～８Ｂ３；ｙＡ～７Ｆ和７Ｓ等。众所
周知，ａＢ晶体蛋白是小分子热休克蛋白的一种，具
有分子伴侣作用，能保护其他蛋白，对各种变性剂包
括加热、紫外线和化学处理造成的蛋白质的凝聚具
图３ 正常晶体所有高丰度蛋白一结构蛋白（ａ、８、
）的分布（上样量１９０ ｔｔｇ）
有抑制作用，并对其他蛋白的溶解性具有促进作
Ｆｉｇ．２ ２－ＤＥ ｇｅｌｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
用 。应激状态时，ａＢ晶体蛋白主要和细胞骨架蛋
ｓｕｃｈ ａｓ ａ，８ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｌｅｎｓｅｓ（１９０ ｔｔｇ ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｌｏａｄｅｄ）
白相结合，对细胞产生保护作用…。
晶体蛋白在结构上具有自身的特点，由于晶体
本实验还鉴定出１种低丰度蛋白念珠状纤维结
蛋白的含量过高（９０％左右），限制了样品的上样
构蛋白（ｂｅａｄｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＦＳＰ／
４７００ Ｒｅｆｌｅｄｏｒ ｓｐｅｃ ＭＣ［ＢＰ＝１４５６８．１６８４６１
．
苦
器 ｇ
辇
．
船Ｉ－『ｌ脚
盯加 ｓ，■ｓ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ１ｄ５６ ７８ ｓｐｅｅ ＭＣ［ＢＰ＝２３２’．１０￣Ｏｌ
图４小鼠ＢＦＳＰ／ｉｉｌｅｎｓｉｎ的ＭＳ（上图）和ｍ／ｚ １４５６．７８的ＭＳ／ＭＳ分析图（下
图）
Ｆｉｇ．４ ＭＳ ａｎｄ ＭＳ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｍ０ｕｓｅ ＢＦＳＰ／ｆｉｌｅｎｓｉｎ．Ｕｐｐｅｒ：ＭＳ ｓｐｅｃｔｕｒｍ：
ｌｏｗｅｒ：ＭＳ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｍ／ｚ １４５６．７８
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ｌ ｌ０ 中国实验动物学报２００８年４月第ｌ６卷第２期Ａｃｔａ Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ Ｓｉｎ，Ａｐｒｉｌ，２００８，Ｖｏ１．１６，Ｎｏ ２
ｉｆｌｅｎｓｉｎ）。它属细胞骨架蛋白，具有晶体特异性，只
在分化的晶体纤维细胞中表达。细胞骨架起着提供
胞质结构骨架、细胞运动和细胞大小、形态的决定和
维持作用。正常的细胞骨架蛋白功能和它们与晶体
蛋白的相互作用是透明晶体细胞结构的发育和维持
的基础。前面提及应激状态时ａＢ可和细胞骨架蛋
参 考 文 献
ｌ ｌ Ｊ Ｄｅｌａｙｅ Ｍ，Ｔａｒｄｉｅｕ Ａ ｓｈｏｒｔ－ｒａｎｇｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｃｃｏｕｎｔｓ
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白相结合，与之结合的主要是中间纤维ＢＦＳＰ 。
ＢＦＳＰ的两大核心成分包括ｐｈａｋｉｎｉｎ（ＢＦＳＰ．２、ＣＰ４９）
【４］ Ｕｅｄａ Ｙ，Ｄｕｎｃａｎ ＭＫ，Ｄａｖｉｄ ＬＬ．Ｌｅｎｓ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
和ｆｉｌｅｎｓｉｎ（ＢＦＳＰ．１、ＣＰ９４、ＣＰ９５、ＣＰ１１５）。已明确细
胞骨架蛋白的缺失可在大鼠中引起白内障 。
Ｊａｋｏｂｓ等 首次发现细胞骨架蛋白突变可造成人类
先天性白内障，在一先天性白内障家系研究发现是
由于ＢＦＳＰ．２第三个外显子的核苷酸发生缺失突变，
导致读码框内２３３位的谷氨酸密码子缺失，蛋白结
构发生异常，使晶体失去透明。
晶体是一个无血管分布、无神经支配的组织，其
生理和病理变化受其它因素的影响较少。既往研究
热点晶体的研究集中在基因组水平，但随着技术的
发展，研究的对象由传统的单个基因、单个蛋白质转
变为基因组和蛋白质组。蛋白质组研究比基因组研
究更有实用性，有希望在蛋白质水平上（尤其是一
些重要蛋白）阐明白内障、后发障及白内障术后并
发症等晶体相关疾病的发病机制，并有可能提供此
类疾病预防与治疗的更有效的方法。
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ｂｅａｄｅｄ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ＢＦＳＰ２［Ｊ Ｊ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，２０００，６６
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［收稿１５１期］２００７—１０一ｌ１
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