2024年4月25日发(作者：练天亦)
史堡塞堕处型苤查！Ｑ！！生！旦筮塑鲞筮！塑鱼！ｉ！』垦翌！！！ｇ：』！些！Ｑ！！：Ｙ！！：翌：盟！：垒
・１５４５・
・实验研究・
＾ｙ一氨基丁酸抑制胆管癌细胞生长的机制
王成黄强
朱成林刘臣海谢放黄朝君王伟
作者单位：２３０００１合肥，安徽医科大学附属省立医院普外科胆胰病区肝胆胰外科安徽
省重点实验室（王成、黄强、朱成林、刘臣海、谢放），肿瘤化疗科（王伟）；２３００３１合肥，
解放军１０５医院普外科（黄朝君）
通信作者：王成，Ｅｍａｉｌ：５３２１１９９０２＠ｑｑ．ｅｏｍ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．Ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－９０３０．２０１６．０６．０３４
【摘要】
目的探讨１．氨基丁酸（ＧＡＢＡ）通过环磷酸腺苷／蛋白激酶Ａ（ｃＡＭＰ／ＰＫＡ）通路抑
制胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９生长的分子机制。方法分别以ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ＋环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）激动
剂（８Ｂｒ）、ＧＡＢＡ＋蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）拮抗剂（Ｈ８９）孵育胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９
４８
ｈ，采用噻唑蓝
（ＭｒＩ’Ｉ．）法及膜联蛋白ｖ一异硫氰酸荧光素／碘化丙锭（ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ／ＰＩ）流式细胞术检测细胞的增
殖及凋亡，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法检测ｃＡＭＰ、ＰＫＡ表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测蛋白激酶Ａ
Ｉ
（ＰＫＡＩ）、蛋白激酶ＡⅡ（ＰＫＡＩＩ）及细胞外调节蛋白激酶（ＥＲＫ）表达。构建人胆管癌裸鼠皮下种
植瘤模型，随机分为对照组和ＧＡＢＡ治疗组，用药５周后观察肿瘤体积，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测种植瘤
ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡ
ＩＩ及ＥＲＫ的表达。结果ＭＴＩ＂及流式细胞术检测结果显示８Ｂｒ协同ＧＡＢＡ所导致的
增殖抑制和凋亡效应，而Ｈ８９拮抗此效应；ＥＬＩＳＡ检测结果显示ＧＡＢＡ明显上调ｃＡＭＰ及ＰＫＡ的含
量，８Ｂｒ协同ＧＡＢＡ增加ｃＡＭＰ含量，Ｈ８９拮抗ＧＡＢＡ所导致ＰＫＡ的含量；Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ检测结果显
示，ＧＡＢＡ较对照组能明显下调ＰＫＡＩ（０．０８７
０．０５），上调ＰＫＡ１１（０．２０４
ＥＲＫ蛋白的表达（Ｏ．３６８
８±０．００３
０比０．１５２
ｌ±０．００３
０，ｔ＝２９．６８７，Ｐ＜
２４－０．０１２
０比０．１４６
１±０．０７２
０，ｔ＝８．１５２，Ｐ＜０．０５）蛋白的表达，且下调
３±０．００７
０比０．４６８７±０．０１００，ｔ＝１３．６４７，Ｐ＜０．０５）；与对照组比较，治疗组
的种植瘤体积明显缩小［（０．５００±０．０２０）ｃｍ３比（０．３２０４－０．０３０）ｅｍ３，ｔ＝１５．３５４，Ｐ＜０．０５］，ＰＡＫ
Ｉ、
ＥＲＫ蛋白表达下降，ＰＫＡ
ＩＩ表达上升。结论ＧＡＢＡ抑制胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９生长可能由ｃＡＭＰ／
ＰＫＡ信号通路介导，通过下调ＰＫＡＩ及上调ＰＫＡＩＩ的表达发挥调控作用，而下调ＥＲＫ蛋白的表达
可能发挥抗肿瘤作用。
【关键词】胆管肿瘤；＾ｒ一氨基丁酸；环磷酸腺苷；蛋白激酶Ａ；细胞外调节蛋白激酶
基金项目：安徽省科技攻关项目（１３０１０４３０４２）
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ａｎｔｂｒ：Ｗａｎｇ
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ＱＢＣ９３９
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ＱＢＣ９３９
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ｇｒｏｕｐｓ
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ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ），ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（ｃＡＭＰａｇｏｎｉｓｔｓ），ＧＡＢＡ＋Ｈ８９（ＰＫＡａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）
ｆｏｒ４８
ｈｏｕｒｓ．（４，５一ｄｉｍｅｔｈｙｌ一２一ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）一２，５一ｄｉｐｈｅｎｙｌ一２一Ｈ—ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ
ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＦ）ａｓ—
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（ＦＩＴＣ）／ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）ｂｉｎｄｉｎｇ
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ｋｉｎａｓｅｓ
（ＥＲＫ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ
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ｅｆｆｅｃｔｏｆＧＡＢＡｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄａｆｔｅｒ
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ＱＢＣ９３９
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０．３２０±０．０３０）ｃｍ３，ｔ＝１５．３５４，Ｐ＜０．０５１．Ｔｈｅ
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ｎｅｏｐｌａｓｍｓ；Ｇａｍｍａ—ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ；Ｃｙｃｌｉｃ
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ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐｒｏｊｅｃｔ（１３０１０４３０４２）
１一氨基丁酸（ＧＡＢＡ）是体内重要的抑制性神经递
质，研究结果显示该物质不仅存在于中枢神经系统，还
广泛存在于外周组织中，更与肿瘤的发生、发展及侵袭
转移密切相关¨Ｊ。我们的前期研究结果证实ＧＡＢＡ
在体外能明显抑制胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９的生长，且
第２信使环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）起介导作用，但其具体
作用机制尚不清楚旧Ｊ。本实验旨在探讨ｃＡＭＰ介导的
蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）信号通路在ＧＡＢＡ抑制胆管癌细胞
生长中的分子机制。
材料与方法
为无细胞等体积的培养基，实验组分别加入ＧＡＢＡ
（１００
ｉｘｍｏＬ／Ｌ）、ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（２０斗ｍｏｌ／Ｌ）、ＧＡＢＡ＋Ｈ８９
（１０
ＩｕＬｍｏｌ／Ｌ）组，每组细胞各设６个复孔。４８
ｈ后按
Ｍ，Ｉ，Ｉ＇步骤操作后用酶联免疫检测仪测定各孔４９２
ｎｍ
波长处的吸光度（Ａ）值，最后取６孔的平均值，空白对
照调零并计算生长抑制率。实验重复３次。生长抑制
率（％）＝［１一（Ａ药物组一Ａ空白组）／（Ａ对照组一Ａ空白组）］×
１００％。
４．流式细胞术检测各组细胞凋亡：将细胞传代后
接种于６孔板内，待生长至约８０％融合时，弃去上清
液，以磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）冲洗２次。设空白组、
ＧＡＢＡ（１００
Ｉｘｍｏｌ／Ｌ）、ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（２０Ｉｘｍｏｌ／Ｌ）、ＧＡＢＡ＋
Ｈ８９（１０Ｉ山ｍｏｌ／Ｌ）组。干预４８
ｈ后，离心收集细胞，用预
１．材料：人胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９购自中国科学
院上海生命科学研究院，由肝胆胰外科安徽省重点实
验室传代保存；ＰＫＡ抑制剂（Ｈ８９）、ｃＡＭＰ刺激剂
（８Ｂｒ）、噻唑蓝（Ｍ１Ｔ１１）均购自美国Ｓｉｇｍａ公司；ＧＡＢＡ
冷ＰＢＳ洗涤细胞２次，用连接缓冲液悬浮细胞后调整细
胞浓度为１×１０９／Ｌ。细胞悬液中加入５山Ａｎｎｅｘｉｎ
Ｖ—
ＦＩＴＣ摇匀避光孵育１５
ｍｉｎ后加入１０斗ｌ
ＰＩ染液避光
孵育５ｍｉｎ后立即上流式细胞仪分析。每组实验重复
４次，得出的图像和数据在ＷｉｎＭＤＩ２．９软件上进行分
析处理。
购自Ｔｏｃｒｉｓ公司；膜联蛋白Ｖ一异硫氰酸荧光素／碘化
丙锭（Ａｎｎｅｘｉｎ
Ｖ—ＦＩＴＣ／ＰＩ）凋亡检测试剂盒购自美国
Ｒｏｃｈｅ公司；ＰＫＡ抗体购自Ａｂｃａｍ公司；其他常规试
剂均为进口分装或国产分析纯化。ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠购自
北京维通利华实验动物技术有限公司，均为雌性，４周
龄，１８～２０
ｇ，无特殊病原菌（ＳＰＦ）条件下分笼饲养。
５．酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法检测ＧＡＢＡ控制
条件下ｃＡＭＰ及ＰＫＡ表达：取出４℃保存板条，室温
平衡２０ｍｉｎ。设置标准品孔、样品孔和空白孑Ｌ，标准品
孔各加不同浓度的标准品５０斗ｌ。待测孔先加样本稀
释液４０斗ｌ，再加待测样本１０斗ｌ；随后标准品孑Ｌ和样本
孔中（空白孔不加）加入辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记
的检测抗体１００斗ｌ，用封板膜封住反应孔，恒温箱温育
６０
２．细胞培养及药物准备：将胆管癌细胞株
ＱＢＣ９３９细胞贴壁生长在含１０％胎牛血清的１６４０培
养基中，于培养箱中培养传代，条件为３７
ｏＣ、５％ＣＯ：
饱和湿度，每２～３ｄ传代１次，取对数生长期细胞用
于实验。分为空白对照组、ＧＡＢＡ（１００
ｉｘｍｏｌ／Ｌ）、
ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（２０Ｉ山ｍｏｌ／Ｌ）、ＧＡＢＡ＋Ｈ８９（１０Ｉ上ｍｏｌ／Ｌ）
组。
ｍｉｎ。弃去液体，每孔加满洗涤液，静置１
ｍｉｎ，甩去
洗涤液，如此重复洗板５次。所有孔加入底物各
３．ＭＴＹ法检测ＧＡＢＡ及相应激动剂或拮抗剂对
５０肛ｌ，３７℃避光孵育１５
ｍｉｎ，加入终止液５０
ｍ，１５
ｍｉｎ
内，在４５０
ｎｍ波长处测定各孔的Ａ值。绘制出标准品
线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
６．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ检测ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡ
ＩＩ、ＥＲＫ蛋白表
胆管癌ＱＢＣ９３９细胞增殖活性的影响：取对数生长期
的胆管癌细胞，以５×１０３个／孔接种于９６孔板中，用
含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ
１６４０培养基培养。待细胞
贴壁生长至８０％融合后进行实验。空白组细胞用含
１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基培养，空白调零孔
达水平：空白组用含１０％胎牛血清的培养基培养，实
验组细胞处理同前，作用４８ｈ后提取总蛋白。采用聚
万方数据
主堡塞堕窆Ｅ型盘查垫！！生！旦筮箜鲞筮！翅垦丛！』垦理！！堡：』！！！！Ｑ！！：！塑：塑：塑！：！
。１５４７・
丙烯酰胺凝胶电泳和半干式转膜，经化学发光、显影、
定影后，对胶片进行扫描。通过低电压保护（ＵＶＰ）凝
胶图像处理系统与Ａｂｗｏｒｋｓ４．６软件分析目的条带与
甘油醛．３．磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）条带灰度值之比来表
示目的蛋白的相对表达水平。抗ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡＩＩ、ＥＲＫ
一抗稀释浓度为ｌ：２００；肌动蛋白（ａｃｔｉｎ）一抗稀释浓
度为１：５００；二抗稀释度为１：５
０００。
７．裸鼠胆管癌皮下种植瘤模型的建立：取对数生长
期的ＱＢＣ９３９细胞，调整细胞数５×１０９／Ｌ，１５０山注射
于裸鼠左侧背部皮下，待成瘤大约至０．１ｅｍ３后，随机分
成两组，每组６只。治疗组瘤内注射ＧＡＢＡ
（１
０００
ｍｇ／ｋｇ溶于生理盐水）１５０ｔｘｌ，对照组注射等量
的生理盐水，隔日１次，每隔５
ｄ测量裸鼠重量，种植瘤
长（ａ）、短径（ｂ），计算体积：Ｖ＝ａ×ｂ２／２，抑瘤率（％）＝
（１一实验组瘤重／对照组瘤重）×１００％。治疗５周后
劲椎脱臼法处死裸鼠，切取肿瘤，等渗盐水漂洗干净，
部分新鲜冰冻保存，部分中性福马林浸泡。
８．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ检测种植瘤ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡⅡ、ＥＲＫ
蛋白表达水平：用ＲＩＰＡ裂解液从种植瘤组织中提取
总蛋白。每：ｆＬｉｒｔ入８０斗ｇ蛋白，采用聚丙烯酰胺凝胶
电泳和半干式转膜，具体步骤同前。
９．统计学方法：应用ＳＰＳＳ１６．０统计软件分析。
组间均数比较采用ｔ检验，多组问均数比较采用单因
素方差分析，两两比较采用Ｄｕｎｃａｎ法。以Ｐ＜０．０５为
差异有统计学意义。
结果
１．胆管癌细胞增殖检测结果：ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ
（ｃＡＭＰ激动剂）、ＧＡＢＡ＋Ｈ８９（ＰＫＡ拮抗剂）孵育胆管
癌细胞株ＱＢＣ９３９
４８
ｈ，其抑制率分别为（１６．１ｌ±
０．７３）％、（２０．３０±０．５７）％、（４．０６±０．２９）％。与对
照组比较，ＧＡＢＡ可明显抑制胆管癌ＱＢＣ９３９细胞的
增殖（ｔ＝４３．５８６，Ｐ＜０．０５），ＧＡＢＡ＋ｃＡＭＰ激动剂也
可达到上述效果，与ＧＡＢＡ组比较，其抑制癌细胞增
殖作用更加明显（ｔ＝８．９７７，Ｐ＜０．０５）。ＧＡＢＡ＋Ｈ８９
组虽然可抑制胆管癌细胞增殖，但较ＧＡＢＡ组效果下
降，其差异有统计学意义（ｔ＝３０．２４３，Ｐ＜０．０５）。
２．胆管癌细胞凋亡检测结果：对照组、ＧＡＢＡ、
ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（ｃＡＭＰ激动剂）、ＧＡＢＡ＋Ｈ８９（ＰＫＡ拮抗
剂）孵育胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９
４８
ｈ，其凋亡率分别为
（８．０７±１．２４）％、（２８．３８±１．５３）％、（３２．６２±
２．４５）％、（９．９０±２．４２）％。与对照组比较，ＧＡＢＡ可
明显促进胆管癌ＱＢＣ９３９细胞的凋亡（ｔ＝２０．５９１，Ｐ＜
０．０５），ＧＡＢＡ＋ｃＡＭＰ激动剂也可达到上述效果，与
ＧＡＢＡ组比较，其促进胆管癌细胞凋亡的作用更加明
万方数据
显（ｔ＝２．９２９，Ｐ＜０．０５）。ＧＡＢＡ＋Ｈ８９组虽然可促进
胆管癌细胞凋亡，但较ＧＡＢＡ组效果下降，差异有统
计学意义（ｔ＝１２．９１６，Ｐ＜０．０５）。ＥＬＩＳＡ检测ｃＡＭＰ
及ＰＫＡ表达：应用酶联免疫法检测各细胞培养组中
ｃＡＭＰ表达可见，ＧＡＢＡ作为调控组中ｃＡＭＰ含量均升
高。对照组、ＧＡＢＡ组、ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ组、ＧＡＢＡ＋Ｈ８９
组ｃＡＭＰ含量平均值分别为２５．１１０
４－０．１５０、２５．８８０
４－
０．０６０、２６．０８０±０．１５０、２５．７６０
４－０．０６０，各组与对照组
比较，差异均有统计学意义（ｔ＝８．４９１、８．０２１、７．０８５，
Ｐ＜Ｏ．０５）。检测各组ＰＫＡ表达，可见ＧＡＢＡ控制组
（９４７．７１０±６．５１０）较对照组（９２１．６７０±４．７７０）ＰＫＡ表
达升高（ｔ＝５．５９０，Ｐ＜０．０５），ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（９７３．７５０
４－
１６．５４０）作用更明显，而ＧＡＢＡ＋Ｈ８９组ＰＫＡ表达含量
（９３３．１３０
４－３．１３０）较对照组有升高，但差异无统计学意
义（￡＝１．９０８，Ｐ＞０。０５）。
３．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡ
１１、ＥＲＫ蛋白
表达：Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测结果显示，ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡＩＩ、
ＥＲＫ蛋自在胆管癌细胞ＱＢＣ９３９中均有表达。其中
ＧＡＢＡ组ＰＫＡＩ／ＧＡＰＤＨ（０．０８７
８±０．００３
０）较对照
组（０．１５２
１
４－０．００３
０）表达下降（ｔ＝２９．６８７，Ｐ＜
０．０５），ＧＡＢＡ组ＰＫＡｌＩ／ＧＡＰＤＨ（０．２０４
２
４－０．０１２０）
较对照组（０．１４６
１
４－０．０７２
０）表达升高（ｔ＝８．１５２，
Ｐ＜０．０５），差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；ＧＡＢＡ组
ＥＲＫ／ＧＡＰＤＨ（０．３６８
３４－０．００７
０），较对照组（０．４６８
７－４－
０．０１００）表达下降，差异有统计学意义（ｔ＝１３．６４７，Ｐ＜
０．０５），ｃ－ＡＭＰ激动剂起协同作用（０．３１９
１４－０．００９
０），
而ＰＫＡ拮抗剂组（０．３９５
９±０．１６６
０）拮抗此效应。
４．裸鼠胆管癌皮下种植瘤体积的变化：ＧＡＢＡ明
显抑制ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠皮下胆管癌种植瘤的生长。
ＧＡＢＡ治疗组裸鼠的肿瘤体积为（０．３２０
４－０．０３０）ｃｍ３，
对照组为（ｏ．５００４－０．０２０）ｃｍ３，两组比较差异有统计学
意义（ｔ＝１５．３５４，Ｐ＜０．０５），１５、２０、２５、３０
ｄ的抑瘤率分
别为２０．４５％、２６．４２％、３１．８５％、３４．８７％。
５．种植瘤组织中ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡ
ＩＩ、ＥＲＫ蛋白的表
达：Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测移植瘤组织中ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡＩＩ、
ＥＲＫ蛋白的表达对照组及ＧＡＢＡ治疗组移植瘤组织
中ＰＫＡ
Ｉ／ＧＡＰＤＨ比值分别为０．１３０±０．００１和
０．０８０±０．００２，明显下降，差异有统计学意义（ｔ＝
２７．１９，ｔ＜０．０５）。ＰＫＡＩＶＧＡＰＤＨ比值分别为０．０１０
４－
０．００１和０．０１５±０．００２，明显上升，差异有统计学意义
（ｔ＝２８。１４，Ｐ＜０．０５）。ＧＡＢＡ治疗组ＥＲＫ／ＧＡＰＤＨ
（０．６３７
８４－０．００７
０）较对照组（０．９４４
１±０．０２２
０）明
显下降（ｔ＝２３．１９９，Ｐ＜０．０５）。
讨论
本研究结果显示，ＧＡＢＡ作用后能够明显上调
・１５４８・
史堡塞坠窆Ｅ型盘查！！！垒生！旦筮垫鲞箜垒翅鱼塾也』垦翌！！垡：』！！！！Ｑ！！：ｙ！！：！！：№：！
ｃＡＭＰ及ＰＫＡ的含量，ｃＡＭＰ的激动剂８Ｂｒ能明显协
同ＧＡＢＡ抑制胆管癌细胞ＱＢＣ９３９的增殖和促进其凋
亡，ＰＫＡ阻断剂Ｈ８９能够明显拮抗ＧＡＢＡ抑制胆管癌
生长的效应，说明ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路在ＧＡＢＡ抑制
胆管癌细胞生长的过程中发挥调控作用，但ＰＫＡ亚基
众多，不同亚基发挥不同的作用，根据亚基不同主要分
为ＰＫＡＩ和ＰＫＡ
１１，具体是何种亚基发挥作用还不确
定【３
Ｊ。因此，我们进一步实验研究结果发现ＧＡＢＡ作
用４８ｈ后ＰＫＡ
Ｉ蛋白表达较对照组下降，而ＰＫＡ
ＩＩ表
量研究结果报道，ＥＲＫ与肿瘤的生长密切相关，Ｃｈｅｎ
等Ｎｏ发现其与肾癌的侵袭、转移密切相关。
本研究结果表明，ＧＡＢＡ具有抑制胆管癌细胞
ＱＢＣ９３９生长的作用，其抑癌作用可能主要由
ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路介导，通过下调ＰＫＡ
Ｉ及上调
ＰＫＡｌＩ的表达发挥调控作用，而下调ＥＲＫ蛋白的表达
可能在其中发挥重要作用。
参考文献
［１］
ＹｏｕｎｇＳＺ，Ｂｏｒｄｅｙ
Ａ．ＧＡＢＡ’Ｓｃｏｎｔｒｏｌ
ｏｆｓｔｅｍ
ａｎｄ
ｃａｎｃｅｒ
ｃｅｌｌ
ｐｒｏｌｉｆｅｒ－
ａｔｉｏｎｉｎａｄｕｌｔｎｅｕｒａｌａｎｄ
ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
达明显升高，差异有统计学意义。在动物实验中也发
现ＧＡＢＡ治疗组种植瘤组织中ＰＫＡＩ蛋白亦表达下
降，ＰＫＡ１１蛋白表达亦上升，因此推测在此过程中
ＧＡＢＡ可能是通过下调ＰＫＡＩ及上调ＰＫＡＩＩ的表达抑
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ｄａ），２００９，２４：１７１・１８５．
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［２］
制胆管癌细胞生长。
ＧＡＢＡ可以通过ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路调控胆管
癌细胞生长，但其作用靶基因尚不明确，有研究显示，
ＥＲＫ参与胆管癌细胞的增殖与分化，而信号通路蛋白
在细胞生长程中是互相交叉发挥作用的ＨＪ。我们在
实验中发现ＧＡＢＡ作用后能够明显下调ＥＲＫ蛋白的
含量，且ｃＡＭＰ的激动剂８Ｂｒ能明显协同此效应，而
ＰＫＡ阻断剂Ｈ８９拮抗此效应，在动物实验中同样观察
到ＧＡＢＡ治疗组种植瘤组织中ＥＲＫ蛋白表达下降，说
明ＥＲＫ蛋白可能在ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路介导ＧＡＢＡ
抑制胆管癌细胞生长的过程中发挥重要作用。已有大
王成，刘臣海，黄强．１．氨基丁酸对胆管癌细胞株ＱＢＣ一（９３９）增殖
和侵袭转移的影响［Ｊ］．中华消化外科杂志，２００９，８（５）：３７０—３７３．
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Ｃ，Ｌｉｕ
ＣＨ，Ｈｕａｎｇ
Ｑ．Ｅｆｆｅｃｔｓ
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ｇａｍｍａ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ
ａｃｉｄ
ｏｎ
ｔｈｅ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ
ｉｎｖａｓｉｏｎｏｆ
ｅｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
ｃｅｌｌｌｉｎｅ
ＱＢＣ９３
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Ｊ
Ｄｉｇｅｓｔ
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ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－９７５２．２００９．０５．０２０．
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ａｃｉｄ
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
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Ｍ∞ｍｕｒａ
Ｋ，ＳｈｉｒａｉｓｈｉＮ，ＳａｋａｇａｍｉＫ，ｅｔ
ａ１．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ
ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ
ｇ—
ｔｈｅ
ｇａｓｔｒｉｃ
ｃａｎｃｅｒ
ｃｅｌｌｌｉｎｅ
ａＩｅ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ
ｓｉｓ，ｌａｌ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｋｉｎａｓｅ１／２
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ
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［５］Ｃｈｅｎ
Ｆ，Ｄｅｎｇ
Ｊ，ｕｕ
Ｘ，ｅｔ
ａ１．ＨＣＲＰ一１
ｒｅｇｕｌａｔｅｓ
ｎｏｓｔｉｃ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
ｉｎ
５：１３４７０．
ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐｌ３４７０．
ｃｅｌｌ
ｍｉｇｒａｔｉｏｎ
ａｎｄｉｎ－
ｐｒｅｇ－
ｖａｓｉｏｎｖｉａＥＧＦＲ—ＥＲＫ
ｍｅｄｉａｔｅｄ“Ｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆＭＭＰ－２ｗｉｔｈ
ｈｕｍａｎ
ｒｅｎａｌｃｅｌｌ
ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｓｃｉ
Ｒｅｐ，２０１５，
（收稿日期：２０１５－１１－１０）
・读者・作者・编者・
中华医学会系列杂志对论文统计学处理的有关要求
１．统计研究设计：应交代统计研究设计的名称和主要做法。如调查设计（分为前瞻性、回顾性还是横断面调查研究），实验研究
（应交代具体的设计类型，如自身配对设计、成组设计、交叉设计、析因设计、正交设计等），临床试验设计（应交代属于第几期临床试
验，采用了何种盲法措施等）；主要做法应围绕４个基本原则（重复、随机、对照、均衡）概要说明，尤其要交代如何控制重要非试验因
素的干扰和影响。
２．资料的表达与描述：用面±ｓ表达近似服从正态分布的定量资料，用Ｍ（Ｑ。）表达呈偏态分布的定量资料；用统计表时，要合理
安排纵横标目，并将数据的含义表达清楚；用统计图时，所用统计图的类型应与资料性质相匹配，并使数轴上刻度值的标法符合数
学原则；用相对数时，分母不宜小于２０，要注意区分百分率与百分比。
３．统计分析方法的选择：对于定量资料，应根据所采用的设计类型、资料所具备的条件和分析目的，选用合适的统计分析方法，
不应盲目套用ｔ检验和单因素方差分析；对于定性资料，应根据所采用的设计类型、定性变量的性质和频数所具备的条件以及分析
目的，选用合适的统计分析方法，不应盲目套用ｘ２检验。对于回归分析，应结合专业知识和散布图，选用合适的回归类型，不应盲
目套用简单直线回归分析，对具有重复实验数据检验回归分析资料，不应简单化处理；对于多因素、多指标资料，要在一元分析的基
础上，尽可能应用多元统计分析方法，以便对因素之间的交互作用和多指标之间的内在联系作出全面、合理的解释和评价。
４．统计结果的解释和表达：当Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１时，应说对比组之间的差异有统计学意义，而不应说对比组之间具有显著性
（或非常显著性）的差异；应写明所用统计分析方法的具体名称（如：成组设计资料的ｔ检验、两因素析因设计资料的方差分析、多个
均数之间两两比较的ｑ检验等），统计量的具体值（如：ｔ＝３．４５痛２＝４．６８，Ｆ＝６．７９等）；当涉及到总体参数（如总体均数、总体率等）
时，在给出显著性检验结果的同时，再给街够％可信区间。
万方数据
2024年4月25日发(作者：练天亦)
史堡塞堕处型苤查！Ｑ！！生！旦筮塑鲞筮！塑鱼！ｉ！』垦翌！！！ｇ：』！些！Ｑ！！：Ｙ！！：翌：盟！：垒
・１５４５・
・实验研究・
＾ｙ一氨基丁酸抑制胆管癌细胞生长的机制
王成黄强
朱成林刘臣海谢放黄朝君王伟
作者单位：２３０００１合肥，安徽医科大学附属省立医院普外科胆胰病区肝胆胰外科安徽
省重点实验室（王成、黄强、朱成林、刘臣海、谢放），肿瘤化疗科（王伟）；２３００３１合肥，
解放军１０５医院普外科（黄朝君）
通信作者：王成，Ｅｍａｉｌ：５３２１１９９０２＠ｑｑ．ｅｏｍ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．Ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－９０３０．２０１６．０６．０３４
【摘要】
目的探讨１．氨基丁酸（ＧＡＢＡ）通过环磷酸腺苷／蛋白激酶Ａ（ｃＡＭＰ／ＰＫＡ）通路抑
制胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９生长的分子机制。方法分别以ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ＋环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）激动
剂（８Ｂｒ）、ＧＡＢＡ＋蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）拮抗剂（Ｈ８９）孵育胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９
４８
ｈ，采用噻唑蓝
（ＭｒＩ’Ｉ．）法及膜联蛋白ｖ一异硫氰酸荧光素／碘化丙锭（ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ／ＰＩ）流式细胞术检测细胞的增
殖及凋亡，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法检测ｃＡＭＰ、ＰＫＡ表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测蛋白激酶Ａ
Ｉ
（ＰＫＡＩ）、蛋白激酶ＡⅡ（ＰＫＡＩＩ）及细胞外调节蛋白激酶（ＥＲＫ）表达。构建人胆管癌裸鼠皮下种
植瘤模型，随机分为对照组和ＧＡＢＡ治疗组，用药５周后观察肿瘤体积，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测种植瘤
ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡ
ＩＩ及ＥＲＫ的表达。结果ＭＴＩ＂及流式细胞术检测结果显示８Ｂｒ协同ＧＡＢＡ所导致的
增殖抑制和凋亡效应，而Ｈ８９拮抗此效应；ＥＬＩＳＡ检测结果显示ＧＡＢＡ明显上调ｃＡＭＰ及ＰＫＡ的含
量，８Ｂｒ协同ＧＡＢＡ增加ｃＡＭＰ含量，Ｈ８９拮抗ＧＡＢＡ所导致ＰＫＡ的含量；Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ检测结果显
示，ＧＡＢＡ较对照组能明显下调ＰＫＡＩ（０．０８７
０．０５），上调ＰＫＡ１１（０．２０４
ＥＲＫ蛋白的表达（Ｏ．３６８
８±０．００３
０比０．１５２
ｌ±０．００３
０，ｔ＝２９．６８７，Ｐ＜
２４－０．０１２
０比０．１４６
１±０．０７２
０，ｔ＝８．１５２，Ｐ＜０．０５）蛋白的表达，且下调
３±０．００７
０比０．４６８７±０．０１００，ｔ＝１３．６４７，Ｐ＜０．０５）；与对照组比较，治疗组
的种植瘤体积明显缩小［（０．５００±０．０２０）ｃｍ３比（０．３２０４－０．０３０）ｅｍ３，ｔ＝１５．３５４，Ｐ＜０．０５］，ＰＡＫ
Ｉ、
ＥＲＫ蛋白表达下降，ＰＫＡ
ＩＩ表达上升。结论ＧＡＢＡ抑制胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９生长可能由ｃＡＭＰ／
ＰＫＡ信号通路介导，通过下调ＰＫＡＩ及上调ＰＫＡＩＩ的表达发挥调控作用，而下调ＥＲＫ蛋白的表达
可能发挥抗肿瘤作用。
【关键词】胆管肿瘤；＾ｒ一氨基丁酸；环磷酸腺苷；蛋白激酶Ａ；细胞外调节蛋白激酶
基金项目：安徽省科技攻关项目（１３０１０４３０４２）
Ｔｈｅ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
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ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
ＱＢＣ９３９
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ｌｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＱＢＣ９３９
ｃｅｌｌｓ
ｗｅｒｅ
ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｇｒｏｕｐｓ
ａｎｄ
ｔｒｅａ—
ｔｅｄ
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ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ），ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（ｃＡＭＰａｇｏｎｉｓｔｓ），ＧＡＢＡ＋Ｈ８９（ＰＫＡａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）
ｆｏｒ４８
ｈｏｕｒｓ．（４，５一ｄｉｍｅｔｈｙｌ一２一ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）一２，５一ｄｉｐｈｅｎｙｌ一２一Ｈ—ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ
ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＦ）ａｓ—
ｓａｖ
ｗａｓ
ｕｓｅｄ
ｔｏ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ
ＱＢＣ９３９
ｃｅｌｌｓ．ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｅ
ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ
（ＦＩＴＣ）／ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）ｂｉｎｄｉｎｇ
ａｓｓａｙ
ｗａｓ
ｕｓｅｄ
ｔｏ
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ｉｎｔｈｅ
ＱＢＣ９３９
ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｚ－
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ＥＬＩＳＡ）ａｓｓａｙ
ｗａｓ
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ＰＫＡ．Ｗｅｓｔｅｒｎ
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Ｈｏｓｐｉｔａｌ
ｂｌｏｔｔｉｎｇ
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ａｎｄ
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ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅｓ
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ｉｎ
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ｇｒｏｕｐｓ
ｏｆ
ＱＢＣ９３９
ｃｅｌｌｓ．Ａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｏｆ
ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａｂｅａｒｉｎｇ
ｎｕｄｅ
ｍｉｃｅ
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ｂｙ
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ｇｒｏｕｐｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ
ａｎｄ
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ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ
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ｂｙ
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ｎｏｔ
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ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｉｎ．
ｃｒｅａｓｅｄｔｈｅ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ｏｆｃＡＭＰａｎｄ
ＰＫＡ，ｔｈｅ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ｏｆ
ｃＡＭＰ
ｗａｓ
ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｂｙ
８Ｂｒ．ｔｈｅ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ｏｆ
ＰＫＡ
Ｗａｓ
ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｄ
ｂｙ
Ｈ８９．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＧＡＢＡ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｄｏｗｎ——ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆＰＡＫＩ
ｐｒｏｔｅｉｎ（０．０８７
８±０．００３０ＶＳ．０．１５２ｌ±０．００３
０，ｔ＝２９．６８７，Ｐ＜０．０５），ｕｐ—
ｒｅｇｕｌａｔｅｄ山ｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆＰＫＡ
１１。ａｎｄ
ａｌＳＯｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ
ＥＲＫ
ｐｒｏｔｅｉｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ（０．３６８
３±
０．００７０ｖｓ．０．４６８７±０．０１０
０，ｔ＝１３．６４７，Ｐ＜０．０５）．Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ
ｔｕｍｏｒ
ｖｏｌｕｍｅ『（０．５００±０．０２０
ＶＳ．
０．３２０±０．０３０）ｃｍ３，ｔ＝１５．３５４，Ｐ＜０．０５１．Ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆＰＫＡＩ
ａｎｄ
ＥＲＫ
ｗｅｒｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｄｅ．
ｃｒｅａｓｅｄ．ａｎｄＰＫＡＩＩＷａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎＧＡＢＡ—ｔｒｅａｔｅｄ
ｇｒｏｕｐ
ａｓ
ｃｏｍｐａｒｅｄ
ｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
ＧＡＢＡ
ｍａｙ
ｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈ
ｏｆ
ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
ｃｅＨｓ
ｔｈｒｏｕｇｈ
ｃＡＭＰ／ＰＫＡ．ｄｏｗｎ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ＰＡＫ
Ｉ，ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ＰＫＡ
ＩＩ．ａｎｄ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆｔｈｅＥＲＫ
ｐｅｒｈａｐｓ
ｉｓ
ｏｎｅ
ｏｆｉｔｓ
ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ
ＱＢＣ９３９
ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】
Ｂｉｌｅｄｕｃｔ
ｎｅｏｐｌａｓｍｓ；Ｇａｍｍａ—ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ；Ｃｙｃｌｉｃ
ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
ｍｏｎｏｐｈｏｓ－
ｐｈａｔｅ；Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅ
Ａ：
Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅｓ
Ｆｕｎｄ
ｐｒｏｇｒａｒａ：Ａｎｈｕｉ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐｒｏｊｅｃｔ（１３０１０４３０４２）
１一氨基丁酸（ＧＡＢＡ）是体内重要的抑制性神经递
质，研究结果显示该物质不仅存在于中枢神经系统，还
广泛存在于外周组织中，更与肿瘤的发生、发展及侵袭
转移密切相关¨Ｊ。我们的前期研究结果证实ＧＡＢＡ
在体外能明显抑制胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９的生长，且
第２信使环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）起介导作用，但其具体
作用机制尚不清楚旧Ｊ。本实验旨在探讨ｃＡＭＰ介导的
蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）信号通路在ＧＡＢＡ抑制胆管癌细胞
生长中的分子机制。
材料与方法
为无细胞等体积的培养基，实验组分别加入ＧＡＢＡ
（１００
ｉｘｍｏＬ／Ｌ）、ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（２０斗ｍｏｌ／Ｌ）、ＧＡＢＡ＋Ｈ８９
（１０
ＩｕＬｍｏｌ／Ｌ）组，每组细胞各设６个复孔。４８
ｈ后按
Ｍ，Ｉ，Ｉ＇步骤操作后用酶联免疫检测仪测定各孔４９２
ｎｍ
波长处的吸光度（Ａ）值，最后取６孔的平均值，空白对
照调零并计算生长抑制率。实验重复３次。生长抑制
率（％）＝［１一（Ａ药物组一Ａ空白组）／（Ａ对照组一Ａ空白组）］×
１００％。
４．流式细胞术检测各组细胞凋亡：将细胞传代后
接种于６孔板内，待生长至约８０％融合时，弃去上清
液，以磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）冲洗２次。设空白组、
ＧＡＢＡ（１００
Ｉｘｍｏｌ／Ｌ）、ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（２０Ｉｘｍｏｌ／Ｌ）、ＧＡＢＡ＋
Ｈ８９（１０Ｉ山ｍｏｌ／Ｌ）组。干预４８
ｈ后，离心收集细胞，用预
１．材料：人胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９购自中国科学
院上海生命科学研究院，由肝胆胰外科安徽省重点实
验室传代保存；ＰＫＡ抑制剂（Ｈ８９）、ｃＡＭＰ刺激剂
（８Ｂｒ）、噻唑蓝（Ｍ１Ｔ１１）均购自美国Ｓｉｇｍａ公司；ＧＡＢＡ
冷ＰＢＳ洗涤细胞２次，用连接缓冲液悬浮细胞后调整细
胞浓度为１×１０９／Ｌ。细胞悬液中加入５山Ａｎｎｅｘｉｎ
Ｖ—
ＦＩＴＣ摇匀避光孵育１５
ｍｉｎ后加入１０斗ｌ
ＰＩ染液避光
孵育５ｍｉｎ后立即上流式细胞仪分析。每组实验重复
４次，得出的图像和数据在ＷｉｎＭＤＩ２．９软件上进行分
析处理。
购自Ｔｏｃｒｉｓ公司；膜联蛋白Ｖ一异硫氰酸荧光素／碘化
丙锭（Ａｎｎｅｘｉｎ
Ｖ—ＦＩＴＣ／ＰＩ）凋亡检测试剂盒购自美国
Ｒｏｃｈｅ公司；ＰＫＡ抗体购自Ａｂｃａｍ公司；其他常规试
剂均为进口分装或国产分析纯化。ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠购自
北京维通利华实验动物技术有限公司，均为雌性，４周
龄，１８～２０
ｇ，无特殊病原菌（ＳＰＦ）条件下分笼饲养。
５．酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）法检测ＧＡＢＡ控制
条件下ｃＡＭＰ及ＰＫＡ表达：取出４℃保存板条，室温
平衡２０ｍｉｎ。设置标准品孔、样品孔和空白孑Ｌ，标准品
孔各加不同浓度的标准品５０斗ｌ。待测孔先加样本稀
释液４０斗ｌ，再加待测样本１０斗ｌ；随后标准品孑Ｌ和样本
孔中（空白孔不加）加入辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记
的检测抗体１００斗ｌ，用封板膜封住反应孔，恒温箱温育
６０
２．细胞培养及药物准备：将胆管癌细胞株
ＱＢＣ９３９细胞贴壁生长在含１０％胎牛血清的１６４０培
养基中，于培养箱中培养传代，条件为３７
ｏＣ、５％ＣＯ：
饱和湿度，每２～３ｄ传代１次，取对数生长期细胞用
于实验。分为空白对照组、ＧＡＢＡ（１００
ｉｘｍｏｌ／Ｌ）、
ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（２０Ｉ山ｍｏｌ／Ｌ）、ＧＡＢＡ＋Ｈ８９（１０Ｉ上ｍｏｌ／Ｌ）
组。
ｍｉｎ。弃去液体，每孔加满洗涤液，静置１
ｍｉｎ，甩去
洗涤液，如此重复洗板５次。所有孔加入底物各
３．ＭＴＹ法检测ＧＡＢＡ及相应激动剂或拮抗剂对
５０肛ｌ，３７℃避光孵育１５
ｍｉｎ，加入终止液５０
ｍ，１５
ｍｉｎ
内，在４５０
ｎｍ波长处测定各孔的Ａ值。绘制出标准品
线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
６．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ检测ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡ
ＩＩ、ＥＲＫ蛋白表
胆管癌ＱＢＣ９３９细胞增殖活性的影响：取对数生长期
的胆管癌细胞，以５×１０３个／孔接种于９６孔板中，用
含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ
１６４０培养基培养。待细胞
贴壁生长至８０％融合后进行实验。空白组细胞用含
１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基培养，空白调零孔
达水平：空白组用含１０％胎牛血清的培养基培养，实
验组细胞处理同前，作用４８ｈ后提取总蛋白。采用聚
万方数据
主堡塞堕窆Ｅ型盘查垫！！生！旦筮箜鲞筮！翅垦丛！』垦理！！堡：』！！！！Ｑ！！：！塑：塑：塑！：！
。１５４７・
丙烯酰胺凝胶电泳和半干式转膜，经化学发光、显影、
定影后，对胶片进行扫描。通过低电压保护（ＵＶＰ）凝
胶图像处理系统与Ａｂｗｏｒｋｓ４．６软件分析目的条带与
甘油醛．３．磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）条带灰度值之比来表
示目的蛋白的相对表达水平。抗ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡＩＩ、ＥＲＫ
一抗稀释浓度为ｌ：２００；肌动蛋白（ａｃｔｉｎ）一抗稀释浓
度为１：５００；二抗稀释度为１：５
０００。
７．裸鼠胆管癌皮下种植瘤模型的建立：取对数生长
期的ＱＢＣ９３９细胞，调整细胞数５×１０９／Ｌ，１５０山注射
于裸鼠左侧背部皮下，待成瘤大约至０．１ｅｍ３后，随机分
成两组，每组６只。治疗组瘤内注射ＧＡＢＡ
（１
０００
ｍｇ／ｋｇ溶于生理盐水）１５０ｔｘｌ，对照组注射等量
的生理盐水，隔日１次，每隔５
ｄ测量裸鼠重量，种植瘤
长（ａ）、短径（ｂ），计算体积：Ｖ＝ａ×ｂ２／２，抑瘤率（％）＝
（１一实验组瘤重／对照组瘤重）×１００％。治疗５周后
劲椎脱臼法处死裸鼠，切取肿瘤，等渗盐水漂洗干净，
部分新鲜冰冻保存，部分中性福马林浸泡。
８．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ检测种植瘤ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡⅡ、ＥＲＫ
蛋白表达水平：用ＲＩＰＡ裂解液从种植瘤组织中提取
总蛋白。每：ｆＬｉｒｔ入８０斗ｇ蛋白，采用聚丙烯酰胺凝胶
电泳和半干式转膜，具体步骤同前。
９．统计学方法：应用ＳＰＳＳ１６．０统计软件分析。
组间均数比较采用ｔ检验，多组问均数比较采用单因
素方差分析，两两比较采用Ｄｕｎｃａｎ法。以Ｐ＜０．０５为
差异有统计学意义。
结果
１．胆管癌细胞增殖检测结果：ＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ
（ｃＡＭＰ激动剂）、ＧＡＢＡ＋Ｈ８９（ＰＫＡ拮抗剂）孵育胆管
癌细胞株ＱＢＣ９３９
４８
ｈ，其抑制率分别为（１６．１ｌ±
０．７３）％、（２０．３０±０．５７）％、（４．０６±０．２９）％。与对
照组比较，ＧＡＢＡ可明显抑制胆管癌ＱＢＣ９３９细胞的
增殖（ｔ＝４３．５８６，Ｐ＜０．０５），ＧＡＢＡ＋ｃＡＭＰ激动剂也
可达到上述效果，与ＧＡＢＡ组比较，其抑制癌细胞增
殖作用更加明显（ｔ＝８．９７７，Ｐ＜０．０５）。ＧＡＢＡ＋Ｈ８９
组虽然可抑制胆管癌细胞增殖，但较ＧＡＢＡ组效果下
降，其差异有统计学意义（ｔ＝３０．２４３，Ｐ＜０．０５）。
２．胆管癌细胞凋亡检测结果：对照组、ＧＡＢＡ、
ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（ｃＡＭＰ激动剂）、ＧＡＢＡ＋Ｈ８９（ＰＫＡ拮抗
剂）孵育胆管癌细胞株ＱＢＣ９３９
４８
ｈ，其凋亡率分别为
（８．０７±１．２４）％、（２８．３８±１．５３）％、（３２．６２±
２．４５）％、（９．９０±２．４２）％。与对照组比较，ＧＡＢＡ可
明显促进胆管癌ＱＢＣ９３９细胞的凋亡（ｔ＝２０．５９１，Ｐ＜
０．０５），ＧＡＢＡ＋ｃＡＭＰ激动剂也可达到上述效果，与
ＧＡＢＡ组比较，其促进胆管癌细胞凋亡的作用更加明
万方数据
显（ｔ＝２．９２９，Ｐ＜０．０５）。ＧＡＢＡ＋Ｈ８９组虽然可促进
胆管癌细胞凋亡，但较ＧＡＢＡ组效果下降，差异有统
计学意义（ｔ＝１２．９１６，Ｐ＜０．０５）。ＥＬＩＳＡ检测ｃＡＭＰ
及ＰＫＡ表达：应用酶联免疫法检测各细胞培养组中
ｃＡＭＰ表达可见，ＧＡＢＡ作为调控组中ｃＡＭＰ含量均升
高。对照组、ＧＡＢＡ组、ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ组、ＧＡＢＡ＋Ｈ８９
组ｃＡＭＰ含量平均值分别为２５．１１０
４－０．１５０、２５．８８０
４－
０．０６０、２６．０８０±０．１５０、２５．７６０
４－０．０６０，各组与对照组
比较，差异均有统计学意义（ｔ＝８．４９１、８．０２１、７．０８５，
Ｐ＜Ｏ．０５）。检测各组ＰＫＡ表达，可见ＧＡＢＡ控制组
（９４７．７１０±６．５１０）较对照组（９２１．６７０±４．７７０）ＰＫＡ表
达升高（ｔ＝５．５９０，Ｐ＜０．０５），ＧＡＢＡ＋８Ｂｒ（９７３．７５０
４－
１６．５４０）作用更明显，而ＧＡＢＡ＋Ｈ８９组ＰＫＡ表达含量
（９３３．１３０
４－３．１３０）较对照组有升高，但差异无统计学意
义（￡＝１．９０８，Ｐ＞０。０５）。
３．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡ
１１、ＥＲＫ蛋白
表达：Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测结果显示，ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡＩＩ、
ＥＲＫ蛋自在胆管癌细胞ＱＢＣ９３９中均有表达。其中
ＧＡＢＡ组ＰＫＡＩ／ＧＡＰＤＨ（０．０８７
８±０．００３
０）较对照
组（０．１５２
１
４－０．００３
０）表达下降（ｔ＝２９．６８７，Ｐ＜
０．０５），ＧＡＢＡ组ＰＫＡｌＩ／ＧＡＰＤＨ（０．２０４
２
４－０．０１２０）
较对照组（０．１４６
１
４－０．０７２
０）表达升高（ｔ＝８．１５２，
Ｐ＜０．０５），差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；ＧＡＢＡ组
ＥＲＫ／ＧＡＰＤＨ（０．３６８
３４－０．００７
０），较对照组（０．４６８
７－４－
０．０１００）表达下降，差异有统计学意义（ｔ＝１３．６４７，Ｐ＜
０．０５），ｃ－ＡＭＰ激动剂起协同作用（０．３１９
１４－０．００９
０），
而ＰＫＡ拮抗剂组（０．３９５
９±０．１６６
０）拮抗此效应。
４．裸鼠胆管癌皮下种植瘤体积的变化：ＧＡＢＡ明
显抑制ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠皮下胆管癌种植瘤的生长。
ＧＡＢＡ治疗组裸鼠的肿瘤体积为（０．３２０
４－０．０３０）ｃｍ３，
对照组为（ｏ．５００４－０．０２０）ｃｍ３，两组比较差异有统计学
意义（ｔ＝１５．３５４，Ｐ＜０．０５），１５、２０、２５、３０
ｄ的抑瘤率分
别为２０．４５％、２６．４２％、３１．８５％、３４．８７％。
５．种植瘤组织中ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡ
ＩＩ、ＥＲＫ蛋白的表
达：Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测移植瘤组织中ＰＫＡ
Ｉ、ＰＫＡＩＩ、
ＥＲＫ蛋白的表达对照组及ＧＡＢＡ治疗组移植瘤组织
中ＰＫＡ
Ｉ／ＧＡＰＤＨ比值分别为０．１３０±０．００１和
０．０８０±０．００２，明显下降，差异有统计学意义（ｔ＝
２７．１９，ｔ＜０．０５）。ＰＫＡＩＶＧＡＰＤＨ比值分别为０．０１０
４－
０．００１和０．０１５±０．００２，明显上升，差异有统计学意义
（ｔ＝２８。１４，Ｐ＜０．０５）。ＧＡＢＡ治疗组ＥＲＫ／ＧＡＰＤＨ
（０．６３７
８４－０．００７
０）较对照组（０．９４４
１±０．０２２
０）明
显下降（ｔ＝２３．１９９，Ｐ＜０．０５）。
讨论
本研究结果显示，ＧＡＢＡ作用后能够明显上调
・１５４８・
史堡塞坠窆Ｅ型盘查！！！垒生！旦筮垫鲞箜垒翅鱼塾也』垦翌！！垡：』！！！！Ｑ！！：ｙ！！：！！：№：！
ｃＡＭＰ及ＰＫＡ的含量，ｃＡＭＰ的激动剂８Ｂｒ能明显协
同ＧＡＢＡ抑制胆管癌细胞ＱＢＣ９３９的增殖和促进其凋
亡，ＰＫＡ阻断剂Ｈ８９能够明显拮抗ＧＡＢＡ抑制胆管癌
生长的效应，说明ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路在ＧＡＢＡ抑制
胆管癌细胞生长的过程中发挥调控作用，但ＰＫＡ亚基
众多，不同亚基发挥不同的作用，根据亚基不同主要分
为ＰＫＡＩ和ＰＫＡ
１１，具体是何种亚基发挥作用还不确
定【３
Ｊ。因此，我们进一步实验研究结果发现ＧＡＢＡ作
用４８ｈ后ＰＫＡ
Ｉ蛋白表达较对照组下降，而ＰＫＡ
ＩＩ表
量研究结果报道，ＥＲＫ与肿瘤的生长密切相关，Ｃｈｅｎ
等Ｎｏ发现其与肾癌的侵袭、转移密切相关。
本研究结果表明，ＧＡＢＡ具有抑制胆管癌细胞
ＱＢＣ９３９生长的作用，其抑癌作用可能主要由
ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路介导，通过下调ＰＫＡ
Ｉ及上调
ＰＫＡｌＩ的表达发挥调控作用，而下调ＥＲＫ蛋白的表达
可能在其中发挥重要作用。
参考文献
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ａｔｉｏｎｉｎａｄｕｌｔｎｅｕｒａｌａｎｄ
ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
达明显升高，差异有统计学意义。在动物实验中也发
现ＧＡＢＡ治疗组种植瘤组织中ＰＫＡＩ蛋白亦表达下
降，ＰＫＡ１１蛋白表达亦上升，因此推测在此过程中
ＧＡＢＡ可能是通过下调ＰＫＡＩ及上调ＰＫＡＩＩ的表达抑
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制胆管癌细胞生长。
ＧＡＢＡ可以通过ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路调控胆管
癌细胞生长，但其作用靶基因尚不明确，有研究显示，
ＥＲＫ参与胆管癌细胞的增殖与分化，而信号通路蛋白
在细胞生长程中是互相交叉发挥作用的ＨＪ。我们在
实验中发现ＧＡＢＡ作用后能够明显下调ＥＲＫ蛋白的
含量，且ｃＡＭＰ的激动剂８Ｂｒ能明显协同此效应，而
ＰＫＡ阻断剂Ｈ８９拮抗此效应，在动物实验中同样观察
到ＧＡＢＡ治疗组种植瘤组织中ＥＲＫ蛋白表达下降，说
明ＥＲＫ蛋白可能在ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号通路介导ＧＡＢＡ
抑制胆管癌细胞生长的过程中发挥重要作用。已有大
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ｅｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ
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ｇ—
ｔｈｅ
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ｃｅｌｌｌｉｎｅ
ａＩｅ
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ｓｉｓ，ｌａｌ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
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Ｆ，Ｄｅｎｇ
Ｊ，ｕｕ
Ｘ，ｅｔ
ａ１．ＨＣＲＰ一１
ｒｅｇｕｌａｔｅｓ
ｎｏｓｔｉｃ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
ｉｎ
５：１３４７０．
ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐｌ３４７０．
ｃｅｌｌ
ｍｉｇｒａｔｉｏｎ
ａｎｄｉｎ－
ｐｒｅｇ－
ｖａｓｉｏｎｖｉａＥＧＦＲ—ＥＲＫ
ｍｅｄｉａｔｅｄ“Ｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆＭＭＰ－２ｗｉｔｈ
ｈｕｍａｎ
ｒｅｎａｌｃｅｌｌ
ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｓｃｉ
Ｒｅｐ，２０１５，
（收稿日期：２０１５－１１－１０）
・读者・作者・编者・
中华医学会系列杂志对论文统计学处理的有关要求
１．统计研究设计：应交代统计研究设计的名称和主要做法。如调查设计（分为前瞻性、回顾性还是横断面调查研究），实验研究
（应交代具体的设计类型，如自身配对设计、成组设计、交叉设计、析因设计、正交设计等），临床试验设计（应交代属于第几期临床试
验，采用了何种盲法措施等）；主要做法应围绕４个基本原则（重复、随机、对照、均衡）概要说明，尤其要交代如何控制重要非试验因
素的干扰和影响。
２．资料的表达与描述：用面±ｓ表达近似服从正态分布的定量资料，用Ｍ（Ｑ。）表达呈偏态分布的定量资料；用统计表时，要合理
安排纵横标目，并将数据的含义表达清楚；用统计图时，所用统计图的类型应与资料性质相匹配，并使数轴上刻度值的标法符合数
学原则；用相对数时，分母不宜小于２０，要注意区分百分率与百分比。
３．统计分析方法的选择：对于定量资料，应根据所采用的设计类型、资料所具备的条件和分析目的，选用合适的统计分析方法，
不应盲目套用ｔ检验和单因素方差分析；对于定性资料，应根据所采用的设计类型、定性变量的性质和频数所具备的条件以及分析
目的，选用合适的统计分析方法，不应盲目套用ｘ２检验。对于回归分析，应结合专业知识和散布图，选用合适的回归类型，不应盲
目套用简单直线回归分析，对具有重复实验数据检验回归分析资料，不应简单化处理；对于多因素、多指标资料，要在一元分析的基
础上，尽可能应用多元统计分析方法，以便对因素之间的交互作用和多指标之间的内在联系作出全面、合理的解释和评价。
４．统计结果的解释和表达：当Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１时，应说对比组之间的差异有统计学意义，而不应说对比组之间具有显著性
（或非常显著性）的差异；应写明所用统计分析方法的具体名称（如：成组设计资料的ｔ检验、两因素析因设计资料的方差分析、多个
均数之间两两比较的ｑ检验等），统计量的具体值（如：ｔ＝３．４５痛２＝４．６８，Ｆ＝６．７９等）；当涉及到总体参数（如总体均数、总体率等）
时，在给出显著性检验结果的同时，再给街够％可信区间。
万方数据