2024年4月25日发(作者：鲜于迈)
选择性剪接变异体的RT-PCR检测及结果分析
勾文峰;杨雪;徐小燕;王建平;郑华川
【摘 要】Objective To detect and analyze the alternative splicing of mRNA
by RT-PCR. Methods The specific primers were designed targeting the
differential DNA sequence of glycogen synthase kinase (CSK) 3β and B-cell
translocation gene (BTC) 3 variants,amplified by RT-PCR and analyzed by
electrophoresis and DNA cloning sequencing. Results Three bands
appeared during the electrophoresis of GSK3β and BTG3 RT-PCR products
respectively. On two lop bands of GSK3β, the same product was found by
electrophoresis and DNA cloning sequencing. On the three bands of
BTG3,the same produce was found after the top (319 bp) and lower (70 bp)
bands of BTG3 were amplified by RT-PCR. Conclusion RT-PCR is a simple
method to detect the alternative splicing, which is helpful for the
evaluation of Western blot results. However, the non-specific bands of PCR
might result from the specific nucleic acid sequence of alternative splicing
and should be confirmed by DNA sequencing.%目的 利用RT-PCR方法检测
并分析mRNA选择性剪接变异体.方法 针对糖原合成酶激酶(GSK)3β和B细胞转
位基因( BTG)3基因变异体差别设计引物,利用RT-PCR扩增后进行电泳和克隆
DNA测序.结果 GSK3β和BTG3的RT-PCR产物电泳均出现3条带,经过电泳和克
隆DNA测序发现GSK-3β中上面2条带为同一产物.对BTG3上(位于319 bp)、
下(位于70 bp)2条带进一步PCR扩增后测序,结果发现3个条带均为同一产物.结
论 RT-PCR法检测选择性剪接产物操作方便,对Western蛋白印迹结果评价具有指
导意义,但是产生的非特异条带可能是由于某种特殊原因造成,如选择性剪接部位的
特异核酸序列,需DNA测序做进一步确定.
【期刊名称】《中国医科大学学报》
【年(卷),期】2012(041)006
【总页数】4页(P490-493)
【关键词】选择性剪接;RT-PCR
【作 者】勾文峰;杨雪;徐小燕;王建平;郑华川
【作者单位】中国医科大学基础医学院病理与病理生理研究所,生物化学与分子生
物学教研室,沈阳110001;中国医科大学基础医学院病理与病理生理研究所,生物化
学与分子生物学教研室,沈阳110001;中国医科大学基础医学院病理与病理生理研
究所,生物化学与分子生物学教研室,沈阳110001;中国医科大学基础医学院病理与
病理生理研究所,生物化学与分子生物学教研室,沈阳110001;中国医科大学基础医
学院病理与病理生理研究所,生物化学与分子生物学教研室,沈阳110001
【正文语种】中 文
【中图分类】Q354
mRNA的选择性剪接增加了蛋白质组的多样性，并且与人类疾病的发生有着密切
联系，了解选择性剪接的机制有助于我们更深入地了解基因组和基因表达的方式、
蛋白质功能以及疾病发生机制［1］。现在已经预测到约60%的基因具有一种以上
选择性剪接体。选择性剪接多发生在参与信号传导和表达调节等复杂过程的基因上，
如受体、信号传导通路（凋亡）、转录因子等。目前多通过RT-PCR法、S1核酸
酶阻断实验、Northern杂交、表达标签序列测序、生物信息学和生物芯片法对选
择性剪接进行检测［2］。本研究小组利用RT-PCR方法探究糖原合成酶激酶
（glycogen synthase kinase，GSK）3β 和 B 细胞转位基因（B-cell
translocation gene，BTG）3基因变异体的作用，并结合电泳图和测序结果进行
深入分析。GSK3β磷酸化后抑制糖原合成酶的活性，阻断Wnt/β-catenin通路，
进而调节细胞增殖和凋亡的平衡［3］。BTG3与E2F1蛋白结合，抑制E2F1-
DP1复合物的转录功能，在细胞周期演进中发挥抑制作用［4］。
1 材料与方法
1.1 材料
胃癌细胞系MKN28（高度分化型腺癌）、AGS（中度分化型腺癌）、MGC-803
和MKN45（低分化型腺癌）、KATO-III（印戒细胞癌）、HGC-27、GT-3 TKB
（未分化型腺癌）购自日本东京物化研究所、中国北京癌症研究所和中国上海的中
国科学院细胞库，QIAGEN RNeasymini试剂盒（Hilden，Germany），SAP试
剂盒（Promega），BLK 磷酸化试剂盒（TaKaRa），RLN裂解液（配方来自
Qiagen公司的RNeasy誖Mini试剂盒）的主要成分为50mmol/LTris-HCl
（pH7.4）、140 mmol/L NaCl、1.5 mmol/L MgCl2和 0.5%（V/V）Nonidet
P-40（1.06 g/mL）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养：胃癌细胞系MKN28、AGS、MGC-803 和 MKN45、KATO-Ⅲ、
HGC-27、GT-3 TKB。使用含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L
链霉素的 RPMI1640（MGC-803、MKN28、MKN45 和KATO Ⅲ）、MEM
（HGC-27）、DMEM（GT-3 TKB）和Ham F12（AGS）培养基在37℃、
5%CO2和饱和湿度的环境下培养上述细胞。
1.2.2 RT-PCR：QIAGEN RNeasymini试剂盒提取胃癌细胞总RNA，利用AMV
转录酶和随机引物（TaKaRa，Japan）将其逆转录合成cDNA。为了检测GSK3β
和BTG3变异体，我们利用Gentyx软件针对变异体差别部位进行引物设计（图
1A和图2A），引物序列见表1。RT-PCR反应条件：95℃5 min，95℃30 s，
58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，35 个循环，2%的琼脂糖凝胶电泳分离
PCR扩增产物。
表1 G SK3β和BTG 3基因R T-PC R扩增引物序列Tab.1 Pri m ersequences f
orG SK3βandBTGam pl i f i ed by R TPC R Gene Type Sequence GSK3β
Sense 5′-GGGGATAGTGGTGTGGATCAG-3′Antisense 5′-
GTTTGACATTTGGGTCCCGTAA-3′BTG3 Sense 5′-
GCAGTTGAGAGGTTTGCTGA-3′Antisense 5′-TAACTTTCCTGGAGATCTCA-3′
1.2.3 DNA测序
1.2.3.1 GSK3β测序：首先，凝胶回收GSK3βPCR产物的DNA直接测序，其次，
对不易分离的313 bp左右的2条带进行凝胶回收，用BLK磷酸化试剂盒磷酸化，
pBluescript载体HincⅡ酶切后经SAP试剂盒去磷酸化，将上述回收处理的DNA
片段经T4连接酶（NEB）连接，转化，摇菌扩增，经过克隆PCR鉴定后，利用
载体T3和T7引物进行克隆测序。
1.2.3.2 BTG3测序：BTG3扩增PCR产物电泳后出现的条带分别凝胶回收后，进
行2次PCR扩增，然后将不同产物进行直接DNA测序。
1.2.4 Western蛋白印迹杂交：利用RLN裂解液（配方来自Qiagen公司的
RNeasy誖Mini试剂盒）的主要成分为 50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）、140
mmol/L NaCl、1.5 mmol/L MgCl2和 0.5%（V/V）Nonidet P-40（1.06
g/mL）提取浆蛋白。用BCA试剂盒（Pierce）蛋白定量后取100 μg蛋白样品经
10%的SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移到Hybond膜（Amersham，德国）上，
用5%脱脂奶粉/0.1%Tween20/TBS（TTBS）4℃封闭过夜。兔抗 Btg3一抗
（Sigma，美国；1∶500）孵育2 h。TBS-T洗3次，加入辣根酶标记到羊抗兔-
IgG（DAKO；1∶1 000）于室温孵育1 h。通过Amersham ECL-Plus（德国）
反应后X光片曝光。
2 结果
2.1 GSK-3β变异体的RT-PCR检测
对GSK-3β实验中设计的引物进行电子PCR检测，显示该对引物可扩增2条
DNA序列，1条为274 bp（1892-1930），另 1 条为 313 bp（1758-2038）
（图1A），分别为GSK3β的2个变异体。RT-PCR后的琼脂糖凝胶电泳显示出3
条带（图1B），分别对上面2条带和最下面的条带进行凝胶回收并测序，发现了
2种变异体DNA序列（图1C）。值得一提的是，上面2条带的凝胶回收产物测
序结果没有出现杂峰现象。克隆测序结果表明，20多个克隆PCR阳性克隆质粒测
序结果证明均为同一个GSK3β313 bp的产物，克隆PCR阳性的克隆均是313 bp
对应的变异体。
2.2 BTG3变异体的RT-PCR检测和Western检测
BTG3实验中，对所设计的引物进行电子PCR检测，结果显示该对引物扩增2条
DNA序列，1条为451 bp，另 1条为 319 bp（图 2A），分别为 BTG3的2个
变异体。RT-PCR后对扩增序列进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示出3条带（图
2B）。对上、中、下3条带凝胶回收后重新PCR，电泳结果（图2B）发现上面条
带的PCR产物和原cDNA PCR产物带型相同，下面条带的PCR产物仍然为小片
段产物，位置没有变化。对图中绿色三角标记的条带进行测序，测序结果显示3
条带为同一个序列（图2C），所有条带的产物均为分子较小的BTG3变异体。同
时，Western结果显示（图2D）MKN45和MGC803中编码的BTG3蛋白出现
2条分子量较小的条带。
3 讨论
选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选
择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产
物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，在相同的细胞中由于表达水平
的不同而导致不同的表型。了解特异细胞型中选择性剪接调控的复杂通路对于解释
细胞表型和疾病的机制是非常必要的，也可能构成基因表达细胞特异性的分子基础
［5］。近年来发现某些病毒内含子的选择性剪接没有细胞特异性。
本实验中GSK3β的实验结果（图1）显示，电泳结果为3条带，313 bp附近的2
条带切割在一起后提取DNA片段，直接测序全部结果未见杂峰，说明此DNA片
段是GSK3β的较大cDNA。同时，我们利用分子克隆技术将313 bp附近的2条
带收集后插入pBluescript载体，经过载体固有T3和T7引物进行测序，20多个
克隆PCR阳性克隆质粒测序结果证明为同一个GSK3β313 bp的产物。分析PCR
产物的时候要特别小心，不能单单看图像及产物条带的分子量大小，更需要结合
DNA测序反复验证自己的结果。
同样，BTG3中PCR产物电泳也显示3条带，增加退火温度3条带仍然存在。上
面（位于319 bp）和下面（位于70 bp）的条带利用BTG3引物进行PCR扩增
后形成的不同分子量的产物。将所有可疑的DNA片段经过测序后发现为同一产物。
再结合BTG3 Western蛋白印迹杂交的结果可以确定编码的条带为BTG3较小的
那条（319 bp）。结合GSK3β的结果，我们推测在选择性剪接形成变异体的时候，
选择性剪接的核酸序列具有一定的特殊性，能够与snRNA及相关蛋白形成剪切体，
可能这些特殊的核酸结构参与形成不同的空间结构，导致产物的泳动速度差异。此
外，利用RT-PCR检测可变剪接的时候，我们要注意如下问题：（1）在差别区域
两侧的PCR产物缺失与否的差别应该稍大一些；（2）经过引物设计软件设计的
引物应该具有较高的扩增效率；（3）电泳检测时要根据PCR产物的差别碱基数
选择合适的琼脂糖凝胶浓度。
目前选择性剪接的鉴定方法主要有RT-PCR法、Northern杂交、S核酸酶阻断实
验、表达标签（EST）序列测序、生物信息学、生物芯片法。生物信息学方法鉴定
周期短，但只能用来辅助鉴定，需要实验证明；EST方法虽能提供丰富的转录信息，
但数据具有一定的偏向性，质量不高，得到的结果并不完全可靠；RT-PCR法简单
方便，成本低，但结果不确切，需要测序认证 ［2］；Northern杂交和S核酸酶
阻断实验操作比较繁琐，需要设计和标记特异探针，同位素标记污染环境，地高辛
标记探针感度低且价格昂贵。比较这些方法，我们认为RT-PCR法在选择性剪接
的鉴定中更佳，其操作方便，大多数实验室均具备实验条件，得到的结果可通过测
序得到确认，简单、方便、易行。
参考文献：
［1］Faustino NA，Cooper -mRNA splicing and human disease
［J］.Genes Dev，2003，17（4）：419-437.
［2］张晓娜，肖华胜.真核生物mRNA选择性剪接体检测方法研究进展［J］.生
命科学仪器，2008，6（3）：8-10.
［3］Zheng HC，Xu XY，Xia P，et ement of inactive GSK3beta
overexpression in tumorigenesis and progression of gastric carcinomas
［J］.Hum Pathol，2010，41（9）：1255-1264.
［4］Ou YH，Chung PH，Hsu FF，et candidate tumor suppressor
BTG3 is a transcriptional target of p53 that inhibits E2F1［J］.EMBO J，
2007，26（17）：3968-3980.
［5］Xiao X，Lee s analysis of alternative splicing and its
regulation［J］.Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med，2010，2（5）：550-
565.
2024年4月25日发(作者：鲜于迈)
选择性剪接变异体的RT-PCR检测及结果分析
勾文峰;杨雪;徐小燕;王建平;郑华川
【摘 要】Objective To detect and analyze the alternative splicing of mRNA
by RT-PCR. Methods The specific primers were designed targeting the
differential DNA sequence of glycogen synthase kinase (CSK) 3β and B-cell
translocation gene (BTC) 3 variants,amplified by RT-PCR and analyzed by
electrophoresis and DNA cloning sequencing. Results Three bands
appeared during the electrophoresis of GSK3β and BTG3 RT-PCR products
respectively. On two lop bands of GSK3β, the same product was found by
electrophoresis and DNA cloning sequencing. On the three bands of
BTG3,the same produce was found after the top (319 bp) and lower (70 bp)
bands of BTG3 were amplified by RT-PCR. Conclusion RT-PCR is a simple
method to detect the alternative splicing, which is helpful for the
evaluation of Western blot results. However, the non-specific bands of PCR
might result from the specific nucleic acid sequence of alternative splicing
and should be confirmed by DNA sequencing.%目的 利用RT-PCR方法检测
并分析mRNA选择性剪接变异体.方法 针对糖原合成酶激酶(GSK)3β和B细胞转
位基因( BTG)3基因变异体差别设计引物,利用RT-PCR扩增后进行电泳和克隆
DNA测序.结果 GSK3β和BTG3的RT-PCR产物电泳均出现3条带,经过电泳和克
隆DNA测序发现GSK-3β中上面2条带为同一产物.对BTG3上(位于319 bp)、
下(位于70 bp)2条带进一步PCR扩增后测序,结果发现3个条带均为同一产物.结
论 RT-PCR法检测选择性剪接产物操作方便,对Western蛋白印迹结果评价具有指
导意义,但是产生的非特异条带可能是由于某种特殊原因造成,如选择性剪接部位的
特异核酸序列,需DNA测序做进一步确定.
【期刊名称】《中国医科大学学报》
【年(卷),期】2012(041)006
【总页数】4页(P490-493)
【关键词】选择性剪接;RT-PCR
【作 者】勾文峰;杨雪;徐小燕;王建平;郑华川
【作者单位】中国医科大学基础医学院病理与病理生理研究所,生物化学与分子生
物学教研室,沈阳110001;中国医科大学基础医学院病理与病理生理研究所,生物化
学与分子生物学教研室,沈阳110001;中国医科大学基础医学院病理与病理生理研
究所,生物化学与分子生物学教研室,沈阳110001;中国医科大学基础医学院病理与
病理生理研究所,生物化学与分子生物学教研室,沈阳110001;中国医科大学基础医
学院病理与病理生理研究所,生物化学与分子生物学教研室,沈阳110001
【正文语种】中 文
【中图分类】Q354
mRNA的选择性剪接增加了蛋白质组的多样性，并且与人类疾病的发生有着密切
联系，了解选择性剪接的机制有助于我们更深入地了解基因组和基因表达的方式、
蛋白质功能以及疾病发生机制［1］。现在已经预测到约60%的基因具有一种以上
选择性剪接体。选择性剪接多发生在参与信号传导和表达调节等复杂过程的基因上，
如受体、信号传导通路（凋亡）、转录因子等。目前多通过RT-PCR法、S1核酸
酶阻断实验、Northern杂交、表达标签序列测序、生物信息学和生物芯片法对选
择性剪接进行检测［2］。本研究小组利用RT-PCR方法探究糖原合成酶激酶
（glycogen synthase kinase，GSK）3β 和 B 细胞转位基因（B-cell
translocation gene，BTG）3基因变异体的作用，并结合电泳图和测序结果进行
深入分析。GSK3β磷酸化后抑制糖原合成酶的活性，阻断Wnt/β-catenin通路，
进而调节细胞增殖和凋亡的平衡［3］。BTG3与E2F1蛋白结合，抑制E2F1-
DP1复合物的转录功能，在细胞周期演进中发挥抑制作用［4］。
1 材料与方法
1.1 材料
胃癌细胞系MKN28（高度分化型腺癌）、AGS（中度分化型腺癌）、MGC-803
和MKN45（低分化型腺癌）、KATO-III（印戒细胞癌）、HGC-27、GT-3 TKB
（未分化型腺癌）购自日本东京物化研究所、中国北京癌症研究所和中国上海的中
国科学院细胞库，QIAGEN RNeasymini试剂盒（Hilden，Germany），SAP试
剂盒（Promega），BLK 磷酸化试剂盒（TaKaRa），RLN裂解液（配方来自
Qiagen公司的RNeasy誖Mini试剂盒）的主要成分为50mmol/LTris-HCl
（pH7.4）、140 mmol/L NaCl、1.5 mmol/L MgCl2和 0.5%（V/V）Nonidet
P-40（1.06 g/mL）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养：胃癌细胞系MKN28、AGS、MGC-803 和 MKN45、KATO-Ⅲ、
HGC-27、GT-3 TKB。使用含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L
链霉素的 RPMI1640（MGC-803、MKN28、MKN45 和KATO Ⅲ）、MEM
（HGC-27）、DMEM（GT-3 TKB）和Ham F12（AGS）培养基在37℃、
5%CO2和饱和湿度的环境下培养上述细胞。
1.2.2 RT-PCR：QIAGEN RNeasymini试剂盒提取胃癌细胞总RNA，利用AMV
转录酶和随机引物（TaKaRa，Japan）将其逆转录合成cDNA。为了检测GSK3β
和BTG3变异体，我们利用Gentyx软件针对变异体差别部位进行引物设计（图
1A和图2A），引物序列见表1。RT-PCR反应条件：95℃5 min，95℃30 s，
58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，35 个循环，2%的琼脂糖凝胶电泳分离
PCR扩增产物。
表1 G SK3β和BTG 3基因R T-PC R扩增引物序列Tab.1 Pri m ersequences f
orG SK3βandBTGam pl i f i ed by R TPC R Gene Type Sequence GSK3β
Sense 5′-GGGGATAGTGGTGTGGATCAG-3′Antisense 5′-
GTTTGACATTTGGGTCCCGTAA-3′BTG3 Sense 5′-
GCAGTTGAGAGGTTTGCTGA-3′Antisense 5′-TAACTTTCCTGGAGATCTCA-3′
1.2.3 DNA测序
1.2.3.1 GSK3β测序：首先，凝胶回收GSK3βPCR产物的DNA直接测序，其次，
对不易分离的313 bp左右的2条带进行凝胶回收，用BLK磷酸化试剂盒磷酸化，
pBluescript载体HincⅡ酶切后经SAP试剂盒去磷酸化，将上述回收处理的DNA
片段经T4连接酶（NEB）连接，转化，摇菌扩增，经过克隆PCR鉴定后，利用
载体T3和T7引物进行克隆测序。
1.2.3.2 BTG3测序：BTG3扩增PCR产物电泳后出现的条带分别凝胶回收后，进
行2次PCR扩增，然后将不同产物进行直接DNA测序。
1.2.4 Western蛋白印迹杂交：利用RLN裂解液（配方来自Qiagen公司的
RNeasy誖Mini试剂盒）的主要成分为 50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）、140
mmol/L NaCl、1.5 mmol/L MgCl2和 0.5%（V/V）Nonidet P-40（1.06
g/mL）提取浆蛋白。用BCA试剂盒（Pierce）蛋白定量后取100 μg蛋白样品经
10%的SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移到Hybond膜（Amersham，德国）上，
用5%脱脂奶粉/0.1%Tween20/TBS（TTBS）4℃封闭过夜。兔抗 Btg3一抗
（Sigma，美国；1∶500）孵育2 h。TBS-T洗3次，加入辣根酶标记到羊抗兔-
IgG（DAKO；1∶1 000）于室温孵育1 h。通过Amersham ECL-Plus（德国）
反应后X光片曝光。
2 结果
2.1 GSK-3β变异体的RT-PCR检测
对GSK-3β实验中设计的引物进行电子PCR检测，显示该对引物可扩增2条
DNA序列，1条为274 bp（1892-1930），另 1 条为 313 bp（1758-2038）
（图1A），分别为GSK3β的2个变异体。RT-PCR后的琼脂糖凝胶电泳显示出3
条带（图1B），分别对上面2条带和最下面的条带进行凝胶回收并测序，发现了
2种变异体DNA序列（图1C）。值得一提的是，上面2条带的凝胶回收产物测
序结果没有出现杂峰现象。克隆测序结果表明，20多个克隆PCR阳性克隆质粒测
序结果证明均为同一个GSK3β313 bp的产物，克隆PCR阳性的克隆均是313 bp
对应的变异体。
2.2 BTG3变异体的RT-PCR检测和Western检测
BTG3实验中，对所设计的引物进行电子PCR检测，结果显示该对引物扩增2条
DNA序列，1条为451 bp，另 1条为 319 bp（图 2A），分别为 BTG3的2个
变异体。RT-PCR后对扩增序列进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示出3条带（图
2B）。对上、中、下3条带凝胶回收后重新PCR，电泳结果（图2B）发现上面条
带的PCR产物和原cDNA PCR产物带型相同，下面条带的PCR产物仍然为小片
段产物，位置没有变化。对图中绿色三角标记的条带进行测序，测序结果显示3
条带为同一个序列（图2C），所有条带的产物均为分子较小的BTG3变异体。同
时，Western结果显示（图2D）MKN45和MGC803中编码的BTG3蛋白出现
2条分子量较小的条带。
3 讨论
选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选
择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产
物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，在相同的细胞中由于表达水平
的不同而导致不同的表型。了解特异细胞型中选择性剪接调控的复杂通路对于解释
细胞表型和疾病的机制是非常必要的，也可能构成基因表达细胞特异性的分子基础
［5］。近年来发现某些病毒内含子的选择性剪接没有细胞特异性。
本实验中GSK3β的实验结果（图1）显示，电泳结果为3条带，313 bp附近的2
条带切割在一起后提取DNA片段，直接测序全部结果未见杂峰，说明此DNA片
段是GSK3β的较大cDNA。同时，我们利用分子克隆技术将313 bp附近的2条
带收集后插入pBluescript载体，经过载体固有T3和T7引物进行测序，20多个
克隆PCR阳性克隆质粒测序结果证明为同一个GSK3β313 bp的产物。分析PCR
产物的时候要特别小心，不能单单看图像及产物条带的分子量大小，更需要结合
DNA测序反复验证自己的结果。
同样，BTG3中PCR产物电泳也显示3条带，增加退火温度3条带仍然存在。上
面（位于319 bp）和下面（位于70 bp）的条带利用BTG3引物进行PCR扩增
后形成的不同分子量的产物。将所有可疑的DNA片段经过测序后发现为同一产物。
再结合BTG3 Western蛋白印迹杂交的结果可以确定编码的条带为BTG3较小的
那条（319 bp）。结合GSK3β的结果，我们推测在选择性剪接形成变异体的时候，
选择性剪接的核酸序列具有一定的特殊性，能够与snRNA及相关蛋白形成剪切体，
可能这些特殊的核酸结构参与形成不同的空间结构，导致产物的泳动速度差异。此
外，利用RT-PCR检测可变剪接的时候，我们要注意如下问题：（1）在差别区域
两侧的PCR产物缺失与否的差别应该稍大一些；（2）经过引物设计软件设计的
引物应该具有较高的扩增效率；（3）电泳检测时要根据PCR产物的差别碱基数
选择合适的琼脂糖凝胶浓度。
目前选择性剪接的鉴定方法主要有RT-PCR法、Northern杂交、S核酸酶阻断实
验、表达标签（EST）序列测序、生物信息学、生物芯片法。生物信息学方法鉴定
周期短，但只能用来辅助鉴定，需要实验证明；EST方法虽能提供丰富的转录信息，
但数据具有一定的偏向性，质量不高，得到的结果并不完全可靠；RT-PCR法简单
方便，成本低，但结果不确切，需要测序认证 ［2］；Northern杂交和S核酸酶
阻断实验操作比较繁琐，需要设计和标记特异探针，同位素标记污染环境，地高辛
标记探针感度低且价格昂贵。比较这些方法，我们认为RT-PCR法在选择性剪接
的鉴定中更佳，其操作方便，大多数实验室均具备实验条件，得到的结果可通过测
序得到确认，简单、方便、易行。
参考文献：
［1］Faustino NA，Cooper -mRNA splicing and human disease
［J］.Genes Dev，2003，17（4）：419-437.
［2］张晓娜，肖华胜.真核生物mRNA选择性剪接体检测方法研究进展［J］.生
命科学仪器，2008，6（3）：8-10.
［3］Zheng HC，Xu XY，Xia P，et ement of inactive GSK3beta
overexpression in tumorigenesis and progression of gastric carcinomas
［J］.Hum Pathol，2010，41（9）：1255-1264.
［4］Ou YH，Chung PH，Hsu FF，et candidate tumor suppressor
BTG3 is a transcriptional target of p53 that inhibits E2F1［J］.EMBO J，
2007，26（17）：3968-3980.
［5］Xiao X，Lee s analysis of alternative splicing and its
regulation［J］.Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med，2010，2（5）：550-
565.