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枯草杆菌酶变体

IT圈 admin 2024-04-26 52浏览 0评论

2024年4月26日发(作者：赤昆鹏)

宿主细胞

导入宿主细胞中的编码本发明酶的DNA序列可以与此宿主同源或异源。如果与所

述宿主细胞同源，即由该宿主细胞天然产生，则该DNA序列一般可操作地与非其

天然环境中的另一启动子序列相连接，或者适当时与另一分泌信号序列和／或终止

子序列相连接。术语”同源”旨在包括编码天然存在于所讨论的宿主生物体中的酶的

DNA序列。术语“异源的”旨在包括所述宿主细胞本身不表达的DNA序列。因此该

DNA序列可以来源于另一生物体或者是合成的序列。

可导入本发明的DNA构建体或重组载体的宿主细胞可以是任何能够产生本发明的

酶的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞，包括植物。

通过培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性细菌，如芽孢杆

菌菌株，如枯草芽孢杆菌(is)、地衣芽孢杆菌(iformis)、迟缓芽孢杆

菌()、短芽孢杆菌()、嗜热脂肪芽孢杆菌(thermophilus)、嗜

碱芽孢杆菌(philus)、解淀粉芽孢杆菌(iquefaciens)、凝结芽孢杆菌

(ans)、环状芽孢杆菌(ans)、灿烂芽孢杆菌()、巨大芽孢杆菌

(rium)或苏云金芽孢杆菌(giensis)菌株，或链霉菌(streptomyces)菌

株，如变铅青链霉菌(ns)或鼠灰链霉菌(s)，或革兰氏阴性细菌如大

肠杆菌(Echerichia coli)。

细菌的转化可以通过本身已知的方式用原生质体转化、电穿孔、接合或使用感受态

细胞进行(参见Sambrook等人，见上)。

当在细菌如大肠杆菌中表达酶时，该酶一般可以以不溶性颗粒形式驻留于细胞质中

(称作包涵体)，或可以由细菌分泌序列引导到周质间隙。在前一种情况下，将细胞

裂解，回收所述颗粒，变性，其后通过稀释变性试剂使酶重新折叠。后一种情况下，

该酶可以通过以下操作从周质间隙中回收：如利用超声或渗透压休克破坏细胞，使

所述的周质间隙的内容物释放，再回收该酶。

当在革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属或链霉菌属菌株中表达该酶时，该酶可以驻留于

细胞质中，或由细菌分泌序列引导到胞外培养基中。在后一种情况下，该酶可按下

述方法从培养基中回收。

产生枯草杆菌酶变体的方法

本发明提供了产生本发明的分离酶的方法，其中在允许该酶产生的条件下培养已用

编码该酶的DNA序列转化的合适宿主细胞，以及从培养物中回收所得的酶。

当将含有编码该酶的DNA序列的表达载体转化入异源宿主细胞中时，即可使本发

明的酶异源重组产生。由此可以产生以不含同源杂质为特征的高度纯化的枯草杆菌

酶组合物。

用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合于所讨论的宿主细胞生长的常规

培养基。所表达的枯草杆菌酶可方便地分泌到培养基中，然后可以通过已知的方法

回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，再利用盐如硫酸铵沉淀

培养基中的蛋白质成分，接下来进行层析，如离子交换层析、亲和层析等。

清洁和洗涤剂组合物

本发明的酶可以添加到洗涤剂组合物中而成为其中的组分。一般来说，清洁和洗涤

剂组合物已在本领域中有充分描述，对合适的清洁和洗涤剂组合物的进一步描述可

以参见WO96／34946；WO97／07202；WO95／30011。

本发明的洗涤剂组合物可以制成手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理

污染织物的洗衣添加剂组合物和漂洗时添加的织物柔软剂组合物，或制成用于普通

家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制以用于手洗或机洗洗盘操作。

在一特定的方面，本发明提供包含本发明枯草杆菌酶的洗涤添加剂。所述的洗涤添

加剂和洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它的酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀

粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖

酶、氧化酶、例如漆酶，和／或过氧化物酶。

一般来说，所选择的酶的性质应当与所选择的洗涤剂相适应(即最适pH，与其它酶

和非酶组分具相容性等)，且所述的酶应以有效量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括来自动物、植物或微生物的蛋白酶。来源于微

生物的蛋白酶是优选的。也包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。所述的蛋白

酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。

碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例

如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯

草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(WO89／06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白

酶的实例为胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)和如WO89／06270和WO94／25583中所

公开的镰孢霉属(Fusarium)的蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是如WO92／19729，WO98／20115，WO98／20116和WO98

／34946所描述的变体，特别是在一个或多个下述位置发生替换的变体：27，36，

57，76，87，97，10l，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，

235和274。

优选的可商购的蛋白酶包括和(Novozymes A／S)、

Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、

Properase^TM、Purafect^TM、

Purafect OxP^TM、FN2^TM、FN3^TM和

FN4^TM(Genencor International，Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括那些来源于细菌或真菌的脂肪酶。也包括经化

学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属

(Humicola)(Thermomyces与之同物异名)，如EP258068和EP305216中所述的来自

nosa(nosus)的脂肪酶或如WO96／13580中所述的来自ns的

脂肪酶；假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(genes)或

类产碱假单胞菌(alcaligenes)(EP218272)，洋葱假单胞菌

(a)(EP331376)，施氏假单胞菌(ri)(GB1，372,034)，荧光假单胞菌

(scens)，假单胞菌菌株SD705(WO95／06720和WO96／27002)，

sinensis(WO96／12012)的脂肪酶；芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆

菌(Dartois等人(1993)，生物化学与生物物理学学报(Biochemicaet Biophysica Acta)，

1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌

(s)(WO91/16422)的脂肪酶。

其它的实例为如WO92/05249，WO94/01541，EP407225，EP260105，WO95/35381，

WO96/00292，WO95/30744，WO94/25578，WO95/14783，WO95/22615，

WO97/04079和WO97/07202中所述的脂肪酶变体。

优选的可商购的脂肪酶包括和Lipolase(Novozymes A/S)。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括那些来源于细菌或真菌的淀粉酶。

也包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如来源于芽孢杆菌的

α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌的特定菌株，详细内容参见GB1,296,839。

有用的淀粉酶的实例是如WO94/02597，WO94/18314，WO96/23873和

WO97/43424中所描述的变体，尤其是那些在一个或多个下列位置发生替换的变体：

15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，

209，243，264，304，305，391，408和444。

可商购的淀粉酶是和(Novozymes A/S)，

Rapidase^TM和Purastar^TM(来自

Genencor InternationalInc.)。

纤维素酶：合适的纤维素酶包括来源于细菌或真菌的纤维素酶。也包括其

经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单

胞菌属、腐质霉属(Humicola)、镰孢霉属(Fusarium)、草根霉属(Thielavia)、枝顶孢

霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如在US4,435,307，US5,648,263，US5,691,178，

US5,776,757和WO89/09259中公开的由Humicola insolens、嗜热毁丝霉

(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。

特别合适的纤维素酶是具有颜色保护优势的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶

的实例为如EP 0495257，EP 0531372，WO96/11262，WO96/29397，WO98/08940

中所公开的纤维素酶。其它的实例为如那些在WO94/07998，EP 0531315，

US5,457,046，US5,686,593，US5,763,254，WO95/24471，WO98/12307和

PCT/DK98/00299中所公开的纤维素酶变体。

可商购的纤维素酶包括和(Novozymes A/S)，

Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)

和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些来源于植物、细

菌或真菌的过氧化物酶/氧化酶。也包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用

的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)(例如来自灰盖鬼伞(us))的过

氧化物酶和其变体，如WO93/24618，WO95/10602和WO98/15257所述的那些。

可商购的过氧化物酶包括(Novozymes A/S)。

这些洗涤剂酶可以通过添加含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加含所有这些

酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，也就是独立

添加剂或组合添加剂可以制成例如颗粒状、液体、浆状等等。优选的洗涤剂添加剂

制剂为颗粒(特别是无粉尘颗粒)、液体(特别是被稳定化的液体)或浆。

无粉尘颗粒可依照例如US4,106,991和4,661,452所述进行生产并可任选地用本领

域已知的方法加包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1000到20000的聚(环

氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；

乙氧基化脂肪醇，其中，醇含12到20个碳原子且其中存在15到80个环氧乙烷单

位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三酸甘油酯。GB1483591中给出了适

合于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。液体酶制剂可以例如依照现成的

方法通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以稳定。受保护的酶可依

照EP238,216中所公开的方法进行制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如棒状、片状、粉末、颗粒、糊

或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般含高达70％的水和0-30％的有机溶剂，

或是不含水的。

所述的洗涤剂组合物一般包含一种或多种表面活性剂，它们可以是非离子(包括半

极性的)和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。所述的表面活性剂一

般占到0.1％到60％的重量。当包含在所述洗涤剂中时，洗涤剂通常包含约1％到

约40％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸盐、烷基硫酸盐

(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧化硫酸盐、仲链烷磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链

烯基琥珀酸或皂。

当包含在所述洗涤剂中时，通常含有约0.2％到约40％的非离子表面活性剂，例如

醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂

肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酰胺或葡糖胺的N-酰基N-

烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

所述的洗涤剂可以包含0-65％的洗涤剂助洗剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三

磷酸盐、膦酸酯、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三

胺五乙酸、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层叠式硅酸盐(例如购自

Hoechst的SKS-6)。

所述的洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷

酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧

酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。

所述的洗涤剂可以含有漂白体系，所述漂白体系可以包含

H₂O₂来源如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的

漂白活化剂如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐相结合。可选择地，所述的漂白

体系可以包含例如酰胺、二酰亚胺或砜类的过氧酸。

所述的洗涤剂还可以包含其它的常规洗涤剂成分，例如织物调理剂包括粘土、发泡

剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学

增白剂、增溶剂、晦暗抑制剂或香料。

由于局部和区域条件如水硬度和洗涤温度的不同而需要区域洗涤剂组合物。洗涤剂

例子1和2分别提供了典型的拉丁美洲洗涤剂组合物和典型的欧洲粉状洗涤剂组合

物的成分。

洗涤剂例子1.典型的拉丁美洲洗涤剂组合物

洗涤剂例子2.典型的欧洲粉末洗涤剂组合物

本发明的洗涤剂组合物中的酶可以通过诸如以下的常规稳定剂稳定：多元醇如丙二

醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物

如4-甲酰基苯基硼酸，且所述的组合物可以按例如WO92/19709和WO92/19708中

所述配制。

目前认为在所述洗涤剂组合物中任何单一的酶，特别是本发明的酶可以以相当于每

升洗涤液中具有0.01-200mg酶蛋白质，优选每升洗涤液0.05-50mg酶蛋白质，特

别优选每升洗涤液中具有0.1-10mg酶蛋白质的量加入。

此外，本发明的酶可以额外地添加到如WO97/07202所公开的洗涤剂制剂中，该文

献引入本文作为参考。

材料和方法

织物：

标准织物片获得自瑞士的EMPA ，Lerchfeldstrasse5，。

尤其是类型EMPA116(具有血液、奶和墨水污渍的棉织物)和EMPA117(具有血液、

奶和墨水污渍的聚酯/棉织物)。

菌株和质粒：

迟缓芽孢杆菌309保藏在NCIB且保藏号为NCIB10309，在美国专利号

3,723,250(此处引用作为参考)中进行了描述。亲本枯草杆菌酶309或可获

自菌株309。表达所用的宿主菌为枯草芽孢杆菌。

质粒pSX222用作大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体和枯草芽孢杆菌表达载体(描述

见WO96/34946)。

常规的分子生物学方法：

除非另外指出，DNA操作和转化使用分子生物学标准方法进行(Sambrook等人，

(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约;Ausubel，F.M.等

人(编辑)“分子生物学最新方法”(“Current protocolsin Molecular Biology”)，

John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编辑)“用于芽孢杆菌的

分子生物学方法”(“MolecularBiological Methods for Bacillus”)，John Wiley和Sons，

1990)。

用于DNA操作的酶：

除非另外指出，所有用于DNA操作的酶如限制性内切酶、连接酶等均来自

New England Biolabs，Inc。DNA操作中使用的酶按照供应商的说明书进行操作。

发酵：

产生枯草杆菌酶的发酵是通过将含有15ml双TY培养基的50ml试管在回转式摇床

上(225转/分钟)于37℃，pH7.3培养2-3天而进行的。

TY培养基的描述见Harwood，C.R.和Cutting，S.M.编辑

的″Currentprotocols in Molecular Biology″(JohnWiley and Sons，1995)一书中的1.1.3

页，培养基的制备和细菌学方法。

纯化：

自宿主细胞分泌的枯草杆菌酶变体可通过熟知的方法自培养基中常规回收，包括通

过离心或过滤自培养基分离细胞，通过盐如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质组分，然

后应用层析法如离子交换层析、亲和层析等。

洗涤性能试验

为评估所选择的枯草杆菌酶变体在洗涤剂组合物中的洗涤性能，进行了洗涤实验。

本发明的酶变体使用自动机械应力试验(AMSA)测试。使用AMSA试验可快速检查

大量的小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。所述AMSA板具有许多装受试溶液的槽

和将织物小条紧紧挤压以使之在槽穴中洗涤的盖子。在洗涤期间，将板、受试溶液、

织物和盖子剧烈摇动，以使受试溶液与织物接触并施加机械应力。进一步的描述见

W002/42740，尤其见23-24页“特定方法的实施方案”。

洗涤剂

用于本发明枯草杆菌酶洗涤性能试验的洗涤剂可通过在市场上购买完全制剂好的市

售洗涤剂并接下来通过热处理(在水溶液中于85℃加热5分钟)灭活酶成分而获得。

而且不含酶的市售洗涤剂基础可直接自供应商处购买。进一步地，合适的模型

(model)洗涤剂可根据文中19-24页的教导而组成并用于洗涤性能试验。

实施例1

酶变体的构建和表达：

定点诱变：

包含特定插入/缺失/替换的本发明枯草杆菌酶309()定点变体通过DNA片

段的常规克隆(Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，1989)制

备，其中所述DNA片段通过用包含所需突变的寡聚物进行PCR而产生。

模板质粒DNA可以为pSX222，或为其包含枯草杆菌酶309的变体的类似物。通

过寡聚物定向诱变导入突变来构建变体。

将枯草杆菌酶309变体转化入大肠杆菌。从这些转化体的过夜培养物中纯化的

DNA通过限制性内切酶消化、DNA片段的纯化、连接、枯草芽孢杆菌的转化，从

而转化入枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌的转化如Dubnau等人，1971，分子生物学

杂志，56，209-221页中所述进行。

定点诱变以在特定区域导入突变：

用于进行定点诱变的总体策略是：

合成诱变引物(寡核苷酸)，该引物对应于被限定插入/缺失/替换的DNA碱基对分隔

开的突变位点两翼的DNA序列。

接下来，所得的诱变引物与改变了的质粒pSX222用于PCR反应。纯化得到的

PCR片段，并在第二轮PCR反应中延伸，纯化所得的PCR产物并在第三轮PCR

反应中延伸，然后用核酸内切酶消化，并克隆入大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体。

PCR反应在通常条件下进行。利用熟知技术将质粒DNA转化至大肠杆菌中，并测

序一个大肠杆菌菌落以验证所设计的突变。

可如上所述构建每一在文中第2页表I所列出的变体。

为了纯化本发明的枯草杆菌酶变体，将包含本发明变体的pSX222表达质粒转化入

感受态枯草芽孢杆菌菌株，并如上所述发酵。

实施例2

纯化及酶浓度的评估

发酵后使用疏水电荷感应层析(HCIC)和接下来使用真空过滤纯化枯草杆菌蛋白酶

变体。为了捕获酶，HCIC使用的纤维素基质结合有4-巯基-乙基-吡啶(4-MEP)。

将大小为80-100μm的纤维素基质珠与含酵母提取物的培养基和可分泌枯草杆菌蛋

白酶变体的经转化枯草芽孢杆菌混合，并在微孔板中于pH9.5孵育。

由于4-MEP在pH>7时疏水，且枯草杆菌蛋白酶变体在pH9.5时疏水，所以所

分泌的酶和在珠上的4-MEP之间存在疏水相互作用。孵育后，通过真空过滤除去

培养基和细胞碎片，而珠子和酶位于滤器上。

为了将酶自珠子上洗脱，通过用洗脱缓冲液(pH5)洗滤器而降低pH。由此将酶与珠

子分离，并可从缓冲液中回收。

经纯化的枯草杆菌蛋白酶变体的浓度通过活性部位滴定(AST)评估。将经纯化酶与

不同浓度的高亲和力抑制剂CI-2A孵育，以抑制不同量的活性位点。所述蛋白酶

与抑制剂以1：1的比例相互结合，因此酶浓度可直接与抑制剂浓度相关，在抑制

剂浓度下，所有的蛋白酶是失活的。为了测定残余蛋白酶活性，在与抑制剂孵育后

加入底物(在Tris/HCl缓冲液中的0.6mMSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA)，接下来的4分

钟降解产物pNA(对硝基酚)的显色使用Elisa读数仪定时于405nm处测定。

在文中第2页表I所列出的每一本发明变体根据上述方法纯化并随后测定酶浓度。

对已知浓度的表I变体如下所述测试在洗涤剂中的洗涤性能。

实施例3

SAVINASE变体的洗涤性能

为了评估所选择的枯草杆菌酶变体在市售洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，进行了

洗涤实验。本发明的酶变体使用自动机械应力试验(AMSA)测试。使用AMSA试验

可快速检查大量的小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。所述AMSA板具有许多装受

试溶液的槽和将织物小条紧紧挤压以使之在槽穴中洗涤的盖子。在洗涤期间，将板、

受试溶液、织物和盖子剧烈摇动，以使受试溶液与织物接触并施加机械应力。进一

步的描述见WO02/42740，尤其见23-24页“特定方法的实施方案”。

在下述实验条件下进行了两种测试：

测试A

拉丁美洲型洗涤剂根据文中24页洗涤剂实施例1的教导组成。通过向测试系统中

添加CaCl₂和MgCl₂(Ca²⁺：

Mg²⁺=4：1)将水硬度调节到6-9°dH。洗涤后织物片用自来水冲洗并

于空气中干燥。

测试B

市
售洗涤剂基础欧洲粉末1型洗涤剂剂
量6g/l受试溶液体积
160ulpH如在洗涤剂中
的pH(约10-10.5)洗涤时间20分钟
温度30℃
水硬度6-9°dH受试溶液中的酶浓度
5nM、10nM和30nM受试材料
EMPA116
Table>

欧洲粉末型洗涤剂根据文中24页洗涤剂实施例2的教导组成。通过向测试系统中
添加CaCl₂·2H₂O；
MgCl₂·6H₂O；NaHCO₃(Ca²⁺：
Mg²⁺：HCO₃^-=4：1：10)将水硬度调节到
15°dH。洗涤后织物片用自来水冲洗并于空气中干燥。

酶变体的洗涤性能测定为用特定酶变体洗涤的织物样本颜色的亮度。亮度可表示为
当用白色光照射时自织物样本反射的光强度。当织物有污渍时，反射光的强度较干
净的织物低。因此反射光的强度可用于测定酶变体的洗涤性能。

颜色测定用专门的平台扫描仪(PFU DL2400pro)进行，该仪器用于捕捉经洗涤织物
样本的成像。使用分辨率200dpi和输出色浓度24比特进行扫描。为了获得准确的
结果，将扫描仪经常用柯达反射性IT8靶标校正。

为了从扫描图像获得光强度的值，使用了专门设计的软件
(NovozymesColor Vector Analyzer)。该程序自图像获取24比特象素值，并将它们
转化为红、绿和兰(RGB)的值。通过将作为向量的RGB值相加然后得到向量长度
而计算强度值(Int)：

$> Int = \sqrt{r^{<}}$
mn>2+g2+
mo>b2>

变体的洗涤性能(P)根据下式计算：

P=Int(v)-Int(r)

其中Int(v)为用酶变体洗涤的织物表面的光强度值，且Int(r)为用参照酶枯草杆菌蛋
白酶309(BLSAVI)洗涤的织物表面的光强度值。

在下面的表IV和V中给出的结果为性能分值(S)，其如下概括了受试酶变体的性能
(P)：

S(2)表明在所有三个酶浓度(5、10和30nM)下变体表现出优于参照物，且

S(1)表明在一个或两个浓度下变体表现出优于参照物。

表IV 测试A的洗涤性能试验结果

表V测试B的洗涤性能试验结果

突
变分值
S9R+A15T+T22TW+N204D+Q245I2
entry>S9R+A15T+G97GG+P131S+Q137H2
ntry>S9R+A15T+T22TG+N62D+V139L+Q245G
>2S9R+A15T+T22TL+N62D+I107V+V139L+Q245W<
/entry>2S9G+A15T+G97GA+Q137H
ntry>1S9R+A15T+V68A+Q245R2
ry>S9R+A15T+G97GA+H120N+S212L2
y>S9R+A15T+L96LG+H120D+P131H+R186L
2S9R+A15T+G97GA+H120D+Q137D2

S9
R+A15T+A16P+G97GA+P131S+Q137D+N204S2
w>S9R+A15T+L21LP+T22TV+M119I+N218D+Q245I2
>S9R+A15T+G97GV+H120D+Q137H1
>S9R+A15T+L96LG+H120N+P131H+Q137E2
S9R+A15T+L96LG+H120D+P131S+Q137E
ntry>2S9R+A15T+H120N+P131T+N218D
ry>2V4A+S9R+A15T+G97GV+H120D
1S9R+A15T+L96LG+H120D+G160D2
S9R+A15T+T22TG+N62D+V139L+Q245S
try>2S9R+A15T+G61E+A85T+P239L+Q245C
2S9R+A15T+P131H+S144P2
entry>S9R+A15T+G97GA+Q137E2
ow>S9R+A15T+G97GA+H120Q+P131H+Q137E2
ry>S9R+A15T+L21LW+G100S+V139L+Q245V
>1S9R+A15T+G97GA+Q137H+N218S
2S9R+A15T+L96LG+H120N+P131S+Q137H<
entry>2S9R+A15T+G97GA+H120N+Q137E
ntry>2S9R+A15T+L96LG+P131T+Q137H
ry>2S9R+A15T+L96LG+H120N+P131S
>2S9R+A15T+V68A+Q137D1
S9R+A15T+G97GA+H120Y+Q137H2
S9R+A15T+G97GA+Q137D2<
Row>S9R+A15T+K94N+H120N+P131H1
w>S9R+A15T+L96LG+P131H+Q137D2
>S9R+A15T+F50S+H120D+P131H2
ntry>S9R+A15T+G97GA+H120N+Q137D+N248D2<
Row>S9R+A15T+L96LG+P131Q+Q137D2
body>

S9
R+A15T+T22G+V139L+Q245L2V139
L+Q245R2S9R+A15T+Q245F
2S9R+A15T+Q245S2<
/Row>S9R+A15T+G97GV+H120Q1
ow>S9R+A15T+G97GA+Q137E+L262V1
w>S9R+A15T+G127E+P131R+Q137H2
>S9R+A13V+A15T+135V+N62D+Q245F2
ow>S9R+A15T+Q245V2V139
L+Q245F2S9R+A15T+T22A+V139L+
Q245E2S9R+A15T+T22L+V139L+Q2
45V+A254S2S9R+R19L+A98AD
y>2P14R+A98AD2
ow>S9R+A15T+Q245L2
>S9R+A15T+G61E+A85T+P239S+Q245V2
ntry>S9R+A15T+G61E+A85T+Q206L+Q245R2
>P239T+Q245R2S9R+A15T+N
62NG+Q245T2S9R+A15T+G61GP+Q2
45L2S9R+A15T+G61E+A85T+Q137H
+Y209C+Q245G2S9R+A15T+G61E+A
85T+P239S+Q245C2V68I+A98AD
try>2V68A+N269K1
Row>N62D+Q245A+N252G+S265G2<
Row>N218D+Q245G+N252H2
S9R+A15T+G102S+M175T+Q245R+N252D2
>

S9
R+A15T+N62D+Q245W+N252V2S9R
+A15T+N62D+Q245R+N252M2S9R+
A15T+N62D+Q245W+N252S2S99SD+
N204S+Q245R1N62D+Q245R
2N62D+A151G1
>V68A+S106T2S99A+S
99SD+V203L2A98AD+A215T
2N62D+Q245G+N252T2
y>A152P+Q245R+N252T2
w>S163N+T213A+Q245R2S10
6L+Q245R+N252E2Q245W+N252Y
entry>2Q245W+N252V2
>R45H+Y171C+Q245W+N252S2
w>G20R+A48T+R170C+Q245W+N252Q2
ow>N62D+N252T2N21
8D+Q245W+N252E2G20R+R170C+Q
245R+N252V2S9R+P14I+R19K+A98A
D+T274S2A98AE+V203I
y>2V51A+V68A+S163G+V203A2
try>N62D+Q245W+N252H2
ow>N62D+Q245W+N252A2G2
0R+N62D+V244I+Q245W+N252E2N2
04D+Q245S2
>

N
62D+Q245W+N252E2N62D+Q245R+
N252V2S9R+A15T+S24P+G61E+A85
T+P239S+Q245A2G102S+M222S+Q24
5L+N252D2A15M+V30I+N62D+S99N
+L111I+V244A+S265N2V68A+S106A
+G118D+Q245R+T255S+L257G+T274L2
y>S3T+Q12D+R19W+V30I+S106G+I107M2<
entry>V68A+A88T+V139L2V51I+L11
1I+G118D+Q245R2V68A+V203L
ry>1A1T+V68A+N116D+G118D
>1V68A+G118D+Q245R2
ow>N62D+V139I+N183D+N185S+V203I+Q245R+L262S
y>2N62D+I72V1
>N62D+V81A+Q245R1T22A+
V68A+S106T+G118D1V68A+L111I+
V203I1G61E+V68A+A169G
ntry>1V68A+L111V1<
Row>V68A+G118D+V203A+K251R1
V68A+G118D1A1V+V51A+V6
8A+V203I2V68A+V139L+A223G
ry>1N62D+Y214H+K237R1
ntry>V68A+S106A+G118D+Q245R2
Row>S9R+A15T+T22A+N62D2
>A98Q+S99D1
eFormula>

S9
R+P14I+R19K+A98AD2S9R+A15M+
A16P+T22S+S99AD1S99AD+T255R+
S256N2S9R+A15T+T22TQ+S101P
try>1S9R+A15T+H120R+Q137D+N173S
y>2G97E1
w>Q245W2S9R+A15T+L96LG
+Q137E+Y209H2S9R+A15T+L111V+
Q137E+G211D1S9R+A15T+L111I+Q1
37E2S9R+A15T+L111I+H120N+Q137
E2S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E
1S9R+A15T+T260M2<
/entry>S9R+A15T2
ry>Q245I2S9R+A15T+H120G+Q137E
+N218D2S9R+A15T+S130P
ntry>2Q245F2<
entry>S9R+A15T+N218D2G63E+N76
D+A194P+A230V2S9R+A15T+T224A
2G100S2
w>S9R+A15T+D60DG1
A138V+V139I+A194P+N218D+A230V2
>A108V+A169G+R170A+Y171H118V
+P14L+R19L+V30I+135V+S57P+P129S+Q137D+S144D+S256N2
try>A133D+T134S+Q137A1
Tbody>

Q
137D2A98AH1
>V51D2Q12E+
P14L+A15T2G63E+N76D+A194P+A2
30V2Q12E+P14L+A15T
>2G97GS1
ry>M222S+Q245G+N252G1V68I+V20
3L2V51A+S163T2
try>S106A+A138G2
try>V139I+A151G2S9R+A15T+S99C+
H120N+P131S+Q137H+M222S2S9R+
A15T+S99G+G100S+H120N+P131S+Q137H2
A15T+N185D+M222S+Q245R+N252V2
>S9R+A15T+T22TL+G61E+L96LG+Q137D+Q245R2
S9R+T22TL+G61E+G97GG+M119I+P131T2
entry>Y209H+M222S+Q245G+N252L2
>M222S+Q245M+N252E2
w>S9R+A15T+N62D+H120N+P131T2
S9R+A15T+V68A+N218D+Q245R2
ntry>S9R+A15T+V68A+H120N+N218D+Q245R1
w>S9R+A15T+V68A+A174V+Q245R2
S9R+A15T+G46D+V68A+N218D+Q245R2
ow>G97D+A98N+S128G+S130T+P131D+T134A2
ow>S9R+A15T+V68A+A98M+Q245R+N248D2
>S9R+A15T+V68A+A98L+S99G+Q245R2
try>

S9
R+A15T+A98G+S99C+H120N+P131S+Q137H2
>S9R+A15T+T38S+A98R+S99C+G100S+H120N+P131S+Q137H
y>2A98V+S99C+Q245R1
w>S9R+A15T+A98S+G100S+H120N+P131S+Q137H1
S9R+A15T+G20^*+L21F+N62D+Q245R<
/entry>2S9R+A15T+G20^*+L21F+
N62D+Q245R+S259G2A98S+G100S+
Q245R2A98L+S99C+Q245R<
entry>2S9R+A15T+G20^*+L21F+N62E+
Q245R2S9R+A15T+G20^*
>+L21F+P52T+N62D+Q245R2S9R+A
15T+V68A+S99G+Q245R+N261D2N6
2D+P131F+A172V2N62D+P131F
ry>2S99SD+Q245R2
Row>S9R+A13T+S99A+S99SD+P131F2
w>S9R+A15T+N62S+H120N+P131T+N218D2
A98R+G100C+Q245R2
A98G+S99C+Q245R2A98T+S9
9G+G100S+S240F+Q245R2S9R+A15T
+H120N+P131T+N218D+N269T2S9R
+A15T+G61E+H120S+Q137D+V139L+N218D2
>S9R+A15T+L96LG+H120N+P131S+Q137H+M222S1
>S9R+A15T+G61E+A98S+S99M+Q245R2
try>A98G+G100S+Q245R+N261D2
Row>S9R+A15T+V68A+A98L+Q245R1
>S9R+A15T+V68A+A98G+S99V+Q245R1
ow>S9R+A15T+V68A+A98M+S99G+Q245R+T274A2

S9
R+A15T+G61E+V68A+A98S+S99G+Q245R2
S9R+A15T+A88V+A98R+S99G+G100C+H120N+P131S+Q137H
y>1S9R+A15T+A98C+G100S+H120N+P131S+Q137H
1S9R+A15T+G20^*+L21F
+G61E+^*61aP+Q245R1S
9R+A15T+V68A+A98G+S99I+K237R+Q245R
S9R+A15T+V68A+H120N+P131S+Q137H+Q245R2
Row>A98S+S99G+G100S+Q245R2
ow>S9R+A15T+V68A+H120D+P131S+Q137H+Q245R2
y>A98T+S99G+G100S+Q245R2
>S9R+A15T+A98S+S99G+G100S+H120N+P131S+Q137H
ry>2V68A+S106A+Q245R+N252D2
entry>V68A+S106A+Q245W2
V68A+S106A+N252M+Y263C1
>V68A+S106A+Q245W+N252K0
y>V68A+S106A+A174V+Q245R+N252D1
try>S9R+A15T+V68A+Q245R+N252S2
>S9R+A15T+V68A2S9R+A15T+G20<
Sup>*+L21F+^*61aS+V68A+G160D+Q245R2
try>S9R+A15T+Y167I+R170L2
>S9R+A15T+G20^*+L21F+^*63aG+Q245R+
N272V2S9R+A15T+G20^*
>+L21F+^*61aA+V68A+Q245R2
S9R+A15T+V68A+A194T+Q245R+N252E2<
Row>S9R+A15T+G20^*+L21F+^*62aS+N218D+Q24
5R2V68A+S106A+T213A
ry>2S9R+A15T+V28I+V68A+Q245R+N252A
2V68A+S105G+S106A2
>S9R+A15T+V68A+H120N+P131S+Q137H+Q245M<
entry>2

测试C

市
售洗涤剂基础欧洲粉末2型洗涤剂剂
量4g/l受试溶液体积
160μlpH如在洗涤剂中
的pH(约10-10.5)洗涤时间20分钟
温度30℃
水硬度6-9°dH受试溶液中的酶浓度
5nM、10nM和30nM受试材料
EMPA116
Table>

欧洲粉末型洗涤剂根据文中24页洗涤剂实施例2的教导组成。通过向测试系统中
添加CaCl₂·2H₂O；
MgCl₂·6H₂O；NaHCO₃(Ca²⁺：
Mg²⁺：HCO₃^-＝4∶1∶10)将水硬度调节到
15°dH。洗涤后织物片用自来水冲洗并于空气中干燥。

表VI测试C的洗涤性能试验结果

突
变分值
Q12E+P14L+A15T2<
Row>P14R+A98AD2G100S
ntry>2A169G+R170H1
A98AD+A169G1
>A138V+V139I+A194P+N218D+A230V2
ry>S99A+S99SD+V203L1V68A+S106
T1A98AD+A215T2
ntry>A108V+A169G+R170A+Y171H1
S3L+N62D+S163A+S190A2
ow>S9R+P14I+R19K+A98AD+T274S2
S9R+A15T+G61E+A85T+N218D+P239S+Q245L2
ow>S9R+A15T+S24P+G61E+A85T+P239S+Q245A2
entry>S99SD+P131F1<
entry>N62D+P131F+A172V1

N
62D+P131F1V68A+A88T+V139L
ry>2V68A+G118D+V203A2
ntry>P40L+V68A+A108T+A138V+V203I2
try>8T+A98AD+T274R2
>A98AE+V203I2V51A+V68A
+S163G+V203A2A1V+V51A+V68A+
V203I2V68A+G100S1
V68A+V203L1
A1T+V68A+N116D+G118D1N
62D+A169G+V203I+Q245R1G23S+S9
9SD+A194P+S242T+Q245R+T274R1S
99SD+N204S+Q245R2N62D+Q245R
entry>2V68A+S106A+G118D+Q245R
2V51Ｉ
+L111I+G118D+Q245R2N62D+V139I
+N183D+N185S+V203I+Q245R+L262S2
y>N62D+172V1S9R+R19L+A98AD
ntry>2S9G+P14R+R19I+A98AD
>1S9R+A15T+T22L+V139L+Q245V+A254S<
entry>2S9R+A15T+T224A2
Row>S9R+A15T+Q245L2
y>S9R+A15T+N62NG+Q245T1S9R+A
15T+N62ND+V139L+Q245E1S9R+A1
5T+N62ND+V139L+N261D2Y167I+R
170L+Q245E1Y167I+R170L+Q245R
entry>2Y167I+R170L+Q245M1
Y167I+R170L1
S99SE+Q245R2
leFormula>

S9
R+A15T+G61E+A85T+Q137H+Y209C+Q245G2
w>S9R+A15T+G61E+A85T+P239S+Q245C1<
Row>G102S+M222S+Q245L+N252D1
N62D+Q245A+N252G+S265G1
>N62D+Q245G+N252T1S9R+A15T+N
62D+Q245W+N252V2S9R+A15T+N62
D+Q245R+N252M2S9R+A15T+N62D
+Q245W+N252S1S163N+T213A+Q24
5R2S106L+Q245R+N252E
try>2Q245W+N252Y2
Q245W+N252V1G20R+
A48T+R170C+Q245W+N252Q2N62D
+N252T2N218D+Q245W+N252E
y>2G20R+R170C+Q245R+N252V
ry>2N62D+Q245W+N252H2
Row>N62D+Q245W+N252A2<
entry>G20R+N62D+V244I+Q245W+N252E2<
entry>N204D+Q245S1N62D+Q245W+
N252E2N62D+Q245R+N252V
2A98L+S99C+Q245R2
N62D+A98R+Q245R2<
entry>S9R+A15T+V68A+S99G+Q245R+N261D2
w>S9R+A15T+G20^*+L21F+N62D+Q245R2
ry>S9R+A15T+G20^*+L21F+N62E+Q245R
>2V68I+A98AD2
w>

测试D

市
售洗涤剂基础欧洲粉末1型洗涤剂剂
量6g/l受试溶液体积
160μlpH如在洗涤剂中
的pH(约10-10.5)洗涤时间20分钟
温度30℃
水硬度6-9°dH受试溶液中的酶浓度
5nM、10nM和30nM受试材料
来自Vlaardingen，NL受试材料中心的C10小片

欧洲粉末型洗涤剂根据文中24页洗涤剂实施例2的教导组成。通过向测试系统中

添加CaCl₂·2H₂O；

MgCl₂·6H₂O；NaHCO₃(Ca²⁺：

Mg²⁺：HCO₃^-＝4∶1∶10)将水硬度调节到

15°dH。洗涤后织物片用自来水冲洗并于空气中干燥。

表VII 测试D的洗涤性能试验结果

突
变分值
G97GS1
>S9V+P14R+R19F+A98AD1S9R+A15
T+L111I+Q137E1S9R+A15T+G97GA
+Q137E2S9R+A15T+L96LG+Q137E+
Y209H1S9R+A15T+L96LG+H120N+P
131S2S9R+A15T+G97GV+H120Q
try>2S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E
y>2S9R+A15T+G97GV+P131S
2S9R+A15T+K94N+H120N+P131H1
entry>S9R+A15T+N76S+L111V+P131H+Q137D
>1S9R+A15T+F50S+H120D+P131H2<
/entry>S9R+A15T+L96LG+S130^*
2S9R+A15T+L96LG+P131Q+Q137D2
S9R+A15T+G97GA+H120D+Q137H+M222V
1S9R+A15T+G97GA+H120N+Q137D+N248D
2S9R+A15T+L21LW+G100S+V139L+
Q245V1S9R+A15T+G20*+L21F+N62
D+Q245N2

S9
R+A15T+L21LC+V139L+R186H+Q245M1
try>S132G+Q245F1S9R+A15T+T22T
G+N62D+V139L+Q245G2S9R+A15T+
T22TL+N62D+I107V+V139L+Q245W2
>S9R+A15T+T22TQ+S101P2S9R+A15
T+T22TG+N62D+V139L+Q245V1S9R
+A15T+T22TL+N62D+Q245W2S9R+
A15T+T22TW+N204D+Q245I2S9R+A
15T+T22TG+N62D+V139L+Q245S2S
9R+A15T+L21LP+T22TY+V139L+G160D+Q245L1<
Row>Q245W2S9R+A15T+S13
0P2S9R+A15T+G61E+A85T+P239L+
Q245C2S9R+A15T+L21LP+T22TV+M
119I+N218D+Q245I2S9R+A15T+V68
A+Q245R2S9R+A15T+T22A+V139L+
Q245E2V139L+Q245R
2S9R+A15T+Q245F2<
Row>S9R+A15T+Q245S2S9R+
A15T+T260M2S9R+A15T
ry>2S9R+A15T+L21LG+T22TV+V139L+N204D+Q24
5N1V139L+Q245F2
ntry>S9R+A15T+T22G+V139L+Q245L2
y>S9R+A15T+Q245V1
Q245F2S9R+Q245C
ntry>2S9R+A15T+N218D1
ow>S9R+A13V+A15T+135V+N62D+Q245F2<
/Row>S99G+S128N+N183D+A232L+Q236T+Q245R2
S163N+A232L+Q236A+Q245G2
y>S163C+Q236M+Q245T+S256G1
ow>

N
218D+A232L+Q236F+Q245F1S163N+
A232L+Q236S+Q245E2G97GA+H120
E1G97GG+P131H2
ntry>S9R+A15T+G97GA+H120D+P131H+Q137E
y>1S9R+A15T+G97GV+Q137H2
y>S9R+A15T+G97GV+H120N2
>S9R+A15T+G97GG+P131S+Q137H2
S9R+A15T+G97GG+H120N+Q137D2
S9R+A15T+H120Q+P131C+Q137H2<
Row>S9R+A15T+G97GV+H120D+Q137H2<
Row>S9R+A15T+A16P+G97GA+P131S+Q137D+N204S2
try>S9R+A15T+G97GG+H120D+P131H+Q137H
>1S9R+A15T+G97GV+H120E+Q137H
2S9R+A15T+G97GV+P131T+Q137H1
S9R+A15T+G97GV+H120Q+Y263F2<
/entry>S9R+A15T+G97GV+S106A+P131H1
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>1S9R+A15T+G97GV+P131H+Q137H
2S9R+A15T+G20A+G97GV+H120D+P131H<
entry>1S9R+A15T+G97GA+H120D+P131S+Q137E
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ry>1S9R+A15T+H120R+Q137D+N173S
>1S9R+A15T+L96LG+H120N+P131H+Q137E
2S9R+A15T+L96LG+H120D+P131S+Q137E
entry>2S9R+A15T+H120N+P131T+N218D
try>2S9R+A15T+G97GA+H120D+Q137D
ry>2S9R+A15T+L96LG+H120D+P131H+R186
L2S9R+A15T+G97GA+R186C
2V4A+S9R+A15T+G97GV+H120D
try>1S9R+A15T+L96LG+H120D+G160D
y>2S9R+A15T+G97GA+H120N+S212L
>2

S9
R+A15T+G97GA+Q137H+N218S2S9R
+A15T+H120D+Q137D2S9R+A15T+N
77S+L96LG+H120D+P131Q1S9R+A1
5T+G97GA+H120N+Q137E1S9R+A15
T+G97GA+Q137E+L262V2S9R+A15T
+P131H+S144P2S9R+A15T+G127E+P
131R+Q137H2
a>