2024年5月18日发(作者：程筠)
热带作物学报２０１２，３３（６）：１０７７—１０８３
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓ
重瓣茶花‘红十八学士’ＭＡＤＳ—ｂｏｘ家族
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列分析与原核表达
朱高浦 ｔ一，李纪元 ，范正琪 ，倪 穗。，李辛雷 ，周兴文 ，孙迎坤
１中国林业科学研究院亚热带林业研究所．浙江富阳 ３１１４００
２中国林业科学研究院经济林研究开发中心．河南郑州４５０００３
３宁波大学海洋学院．浙江宁波３１５２１１
摘要对山茶重瓣花‘红十八学士’（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ‘Ｈｏｎｇ Ｓｈｉｂａｘｕｅｓｈｉ’）中的４个Ｂ类功能基因构建了系
统进化树，预测了其蛋白结构，并构建了相应的原核表达载体。生物信息学分析结果表明：４个基因分属３个
亚家族，其中ＣｊＨＧＬＯ１和ｑＨＧＬ０２属ＰＩ亚家族，ＣｊＨＴＭ６属ＴＭ６一ｌｉｋｅ亚家族，ＣｊＨＤＥＦ属ＡＰ３亚家族；４个
基因的编码蛋白均为不稳定蛋白，均无信号肽存在；其蛋白二、三级结构均以０【一螺旋为主，其次是无规则卷曲，
然后以延伸链三种构象形式存在；分析的特定位点中磷酸化位点数量最多，尤其是蛋白激酶Ｃ磷酸化位点最多。
原核表达实验结果显示：当ＩＰＴＧ浓度在０．２ｍｍｏ］］Ｌ、３０℃、经１ ｈ诱导ＣｊＨＧＬＯ１蛋白可获表达：当ＩＰＴＧ浓度在
０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ、３０ ｏＣ、诱导１．５ ｈ ｃｊＨＧＬ０２蛋白可获表达；当ＩＰＴＧ浓度在０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ、１６℃、过夜（＞１６ ｈ）诱导
ｃｊＨＤＥＦ蛋白可获表达；当ＩＰＴＧ浓度在Ｏ．３ ｍｍｏｌ／Ｌ、２０℃、诱导５ ｈ ＣｊＨＴＭ６蛋白可获表达。这些研究为山茶
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因的更深人研究奠定了基础
关键词 重瓣；山茶花；Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因；生物信息学分析；原核表达
中图分类号０７８ 文献标识码Ａ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ｂ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＭＡＤＳ・－－ｂｏｘ Ｇｅｎｅ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｄｏｕｂｌｅ Ｆｌｏｗｅｒ
Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ‘Ｈｏｎｇ Ｓｈｉｂａｘｕｅｓｈｉ’
ＺＨＵ Ｇａｏｐｕ ，ＬＩ Ｊｉｙｕａｎ ，ＦＡＮ Ｚｈｅｎｇｑｉ ，ＮＩ Ｓｕｉ ，
・
ＬＩ Ｘｉｎｌｅｉ ，ＺＨＯＵ Ｘｉｎｇｗｅｎ ，ＳＵＮ Ｙｉｎｇｋｕｎ
１ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｆｕｙａｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１１４００，Ｃｈｉｎａ
２ Ｎｏｎ—ｔｉｍｂｅｒ Ｆｏｒｅｓｔｙｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｒｉｔ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ ４５０００３，Ｃｈｉｎａ
３ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｍｉ￣＃ｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１５２１１，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｄｏｕｂｌｅ ｆｌｏｗｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｆａｐｏｎｉｃａ．ｔｌｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ ＢＬ２１ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｅ ｊａｐｏｎｉｃａ‘Ｈｏｎｇ Ｓｈｉｂａｘｕｅｓｈｉ’．１１ｌｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ
ｔｈａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｒｅｅ ｓｕｂ－ｆａｍｉｌｉｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ。ａｎｄ ｎｏ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ
ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ．Ｔｈｅ ｓｐａｃｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ａｌｐｈａ—ｈｅｌｉｘ．ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ ａｎｄ ｆｅｗ ｅｘｔｅｎｄ ｓｔｒａｎｄ．Ｔｈｅ
ｍｏｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｐｅｃｉａｌ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＣｊＨＧＬ０１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ Ｉ Ｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ．ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｗａｓ ３０ ，ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ ｏｎｅ ｈｏｕｒ．ａｎｄ ＣｊＨＧＬ０２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０．１ ｍｍｏ１／Ｌ．
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ１６℃，ｉｎｄｕｃｅｔｉｍｅｗａｓ１．５ｈ．ａｎｄＣｊＨＤＥＦｐｒｏｔｅｉｎＷａｓｉｎｄｕｃｅｄｗｈｅｎｔｈｅＩ ＧｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＷａｓ０．５ｍｍｏ］］Ｌ．
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ １６ ｏＣ，ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ＞１６ ｈ．ａｎｄ 日 ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ＩＰ１ＩＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ
Ｏ．３ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ２０℃，ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ ５ ｈ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｅｐ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ
ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃ ｊａｐｏｎｉｃａ．．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｄｏｕｂｌｅ ｆｌｏｗｅｒｓ；Ｃａｍｅｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ；Ｂ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｄｏｉ １０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１０００—２５６１．２０１２．０６．０２１
收稿日期
２０１２—０３—２７ 修回日期：２０１２—０６—０２
基金项目
科技部国际合作项目（Ｎｏ．２０１１ＤＦＡ３０４９０）；“十二五’’国家科技支撑计划课题（Ｎ０
．
２０１２ＢＡＤ０１Ｂ０７０３）：中央级公益性科研院所基本
科研业务费专项资金（ＮＯ．ＲＩＳＦ６１４１）。
作者简介
朱高浦（１９８１年一），男，博士，助理研究员。研究方向：经济林栽培育种研究。｝通讯作者：李纪元
，
Ｅ－ｍａｉｌ：Ｊｉｙｕａｎ＿１ｉ＠１２６－ｃ０ｍ。
一
ｌ０７８一 热带作物学报 第３３卷
ＭＡＤＳ—ｂｏｘ基因是广泛存在于生物中一类基因
功能鉴定奠定了基础．也希望为将来山茶重瓣花的
分子设计育种提供参考。
的统称，因其具有共同的保守区域而归为一类 它
的命名是由最初从酵母中发现的ＭＣＭ！基因、拟南
芥中的ＡＧＡＭＯＵＳ基因、金鱼草中的ＤＥＦＩＣＩＥＮＳ
基因和人的 ４个基因的首字母拼写而成ｆ１］
１材料与方法
１．１材料
ＭＡＤＳ—ｂｏｘ基因在被子植物花进化和多样性等花器
官发育方面起着关键作用［２－３］ 关于花器官发育的
理论中，“ＡＢＣ模型”理论受到广泛认可．该模型
‘红十八学士’是我国传统茶花栽培品种．适应
性强，分布在我国热带、亚热带地区。花径约８ ｃｍ，
花瓣１１０～１３０片，完全重瓣花，成六角塔形花冠，
认为：Ａ、Ｂ、Ｃ等３类同源异型基因单独或组合 花瓣鲜红。花期１２月到次年４月。 ‘红十八学士’
调控４轮花器官的发育 其中Ａ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因单独
调控萼片的发育：Ａ一和Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因共同调控
花瓣的发育：Ｂ一和Ｃ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因共同控制雄蕊
的发育：Ｃ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因单独控制心皮的发育 Ａ一
和Ｃ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因互相拮抗 尽管花器官发育模
型理论被不断发展和完善，但Ａ、Ｂ、Ｃ等３类基
因在植物中仍然被认为是最保守的．受到广泛关注
和研究［６１
对重瓣花器官发育的分子机理研究．大多集中
在Ｃ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因突变导致下游和其相互作用的因
子方面 ”，此外对Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ［１２—１４］和Ｂ一、Ｃ—
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因互作也有一些研究［１５—１６３ 考虑到完全重
瓣山茶的花瓣多达上百片．而Ｂ类功能基因是同
时参与了真核植物花瓣和雄蕊发育从而影响到花器
官第二轮和第三轮结构确定性的关键因子．暗示了
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因在山茶重瓣花形成中起到关键作用
或是与其它功能基因共同起作用 在山茶花中存在
非常普遍的萼片瓣化现象．暗示Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因可
能拓展表达域促使山茶重瓣花的形成 现有研究
结果表明．山茶中Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因可分为３个亚家
族，即ＰＩ（ ＧＬＯ１和ｃｊＧＬ０２）、ＡＰ３（ＣｊＤＥＦ）和
ＴＭ６一ｌｉｋｅ（ｃｊＴＭ６）［３； 很显然．山茶中这些重瓣花
的形成是与Ｃ功能基因缺失等造成的重瓣花起源
方式不同，可能涉及了雌雄蕊起源、苞（萼）片起源
等方式。
茶花是我国传统十大名花．我国是茶花的故
乡．但对茶花的开发利用以及新品种培育等方面起
步较晚，即使在茶花产业化最好的云南、浙江等
地．市场流行品种也以外来茶花品种为多 随着世
人对茶花文化的了解和审美价值回归．对中国传统
茶花的热情正悄然升温 本研究在前期从传统的完
全重瓣型茶花品种‘红十八学士’中分离到Ｂ—
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因家族４个成员ｃＤＮＡ全长的基础上．
进行了生物信息学分析并构建了原核表达载体．通
过优化最佳诱导表达条件．最后将相应的蛋白诱导
出来．这为以后山茶Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因所编码蛋白的
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因４个成员ＣｊＨＧＬＯ１ ｆＧｅｎＢａｎｋ登录
号：ＨＱ１４１３４１．１）、ＣｊＨＧＬ０２（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：
ＨＱ１４１３４２．１）、ＣｊＨＤＥＦ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＨＭ７７３—
０２４．１）、ＣｊＨＴＭ６（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＨＭ７４８６４６．１）
的ｃＤＮＡ全长由本实验室从花芽中克隆获得 Ｅ．ｃｏｌｉ
ＢＬ２１大肠杆菌、原核表达载体ｐＧＥＸ一４Ｔ一１载体为
本实验室保存，ｐＭＤ一１８载体购自ＴａＫａＲａ（沈阳）
公司。
１．２试剂
高保真酶、限制性内切酶 Ｉ和 Ｉ购自
ＴａＫａＲａ（沈阳）公司，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、
Ｔｒｉｓ、ＳＤＳ．、ＴＥＭＥＤ、ＩＰＴＧ、考马斯亮蓝Ｒ一２５０等
均为分析纯试剂
１．３方法
１．３．１ 生物信息学分析 利用ＤＮＡＭＡＮ ６．０软件
与ＧｅｎＢａｎｋ中已登录的Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因家族成员的
氨基酸序列进行同源性比较．按照最大似然法
（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）构建系统发育树 利用瑞士
生物信息学研究所（Ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）提供的
ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件，在线分析氨基酸残基数目、组成、
蛋白质相对分子量、理论等电点等参数：利用
ＰｒｏｔＳｅａｌｅ、ＨＮＮ软件在线分析仪一螺旋（Ａｌｐｈａ—
ｈｅｌｉｘ）、Ｂ一转角（Ｂｅｔａ ｔｕｒｎ）、无规卷曲（Ｒａｎｄｏｍ
ｃｏｉｌ）、延伸链（Ｅｘｔｅｎｄ ｓｔｒａｎｄ）。利用ＳｉｇｎａｌＰ进行信
号肽分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ｓｉｇｎａｌＰ／）；
米用ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｗｉｓｓｍｏｄ）
同源建模（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）ＮＮＩＪ该基因编码蛋白
质的三维结构。利用ＰＲＯＳＣＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ—ｐｂｉｌ．
ｉｂｃｐ．ｆｒ）预测编码蛋白质的特定位点
１．３．２原核表达分析 根据已获得的ＣｊＨＧＬＯ１、
ＣｊＨＧＬ０２、 ＣｊＨＤＥＦ、 ＣｊＨＴＭ６的ｃＤＮＡ全长序
列，设计引物（表１），扩增４个基因的开放阅读框
（ＯＲＦ），经ＴＡ克隆连接到ｐＭＤ一１８载体上，根据
原核表达载体ＤＧＥＸ一４Ｔ一１多克隆位点选择合适的
内切酶（Ｋｐｎ Ｉ和 Ｉ），将４个基因从ｐＭＤ一１８
载体上双酶切后连接到ｐＧＥＸ一４Ｔ一１载体上 将重
第６期朱高浦等：重瓣茶花‘红十八学士’ＭＡＤＳ—ｂ０ｘ家族Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列分析与原核表达
组ＤＧＥＸ一４Ｔ一１质粒转化到大肠杆菌Ｅ ｃｏｌｉ ＤＨ５（ｘ
感受态细胞中．利用菌液ＰＣＲ和质粒酶切鉴定阳
性质粒。
一１０７９－
蛋白质诱导表达条件。将诱导出的含‘红十八学
士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因家族ＭＡＤＳ—ｂ０ｘ蛋白的菌液离
心收集菌体．加入ＳＤＳ—ＰＡＧＥ上样缓冲液煮沸
５ ｍｉｎ裂解细胞。１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、室温离心５ ｍｉｎ，
取上清进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分离蛋白．再用考马
挑取阳性克隆接种于ＬＢ液体培养基．１８０ ｒ／ｍｉｎ
恒温振荡培养．送上海生工生物公司测序确保片
段正确插入。按照正交实验设计（表２）分别从
ＩＰＴＧ浓度、诱导时间、诱导温度三个方面优化
斯亮蓝Ｒ一２５０染色、固定液固定和脱色液脱色后
拍照、分析
表１ 红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因ＯＲＦ全长特异扩增引物
表２重组蛋白诱导表达条件的正交设计
因素 因素
ＩＰＴＧ浓度／ｍＭ
１
２
３
４
５
诱导时间／ｌＩ
０．５
１．０
３
５
＞６
诱导温度，℃
３７
３０
２５
２Ｏ
１６
ＩＰＴＧ浓度／ｍｍ０Ｉ／Ｌ
１４
１５
１６
１７
ｌ８
诱导时间／ｈ
５
＞６
０．５
１．Ｏ
３
诱导温度／ｏｃ
２０
１６
３７
３０
２５
Ｏ．１
Ｏ．１
Ｏ．１
０．１
０．１
０．３
０．３
０．４
０－４
Ｏ．４
６
７
Ｏ＿２
０＿２
Ｏ．５
１．Ｏ
３７
３０
１９
２０
０．４
Ｏ．４
５
＞６
２０
１６
８
９
１０
０＿２
０．２
０．２
３
５
＞６
２５
２Ｏ
１６
２１
２２
２３
Ｏ．５
Ｏ．５
０．５
０．５
１．０
３
３７
３Ｏ
２５
１１
１２
１３
０＿３
０．３
Ｏ－３
Ｏ．５
１．０
３
３７
３０
２５
２４
２５
０．５
０．５
５
＞６
２０
１６
２结果与分析
２．１ ‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列的生物
信息学分析
２．１．２‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测编码蛋白
的一级结构分析 对‘红十八学士’中分离的Ｂ—
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测编码的蛋白质一级结构进行了分
２．１．１ ‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列在系统
进化中的位置 ‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因与
其它植物的氨基酸序列的系统进化树见图１．由图
１可以看出，从４个基因在系统发育树中的位置，
析（表３），结果表明：分子量ｃｊＨＤＥＦ蛋白最大。
达２６．Ｏ９，而ｃｊＨＴＭ６最小，为２４－３１；理论等电点
ｃｊＨＴＭ６最高，为９．５３，ＣｊＨＧＬＯ１最低，为６．７７：
ｃｊＨＧＬＯ１的酸性氨基酸残基最多．为３４个．碱性
氨基酸残基则最少，为３３个。而ＣｊＨＴＭ６酸性氨
清晰表明它们分属Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因的３个亚家族
其中ＣｊＨＧＬＯ１和ＣｊＨＧＬ０２属ＰＩ亚家族．ＣｊＨＴＭ６
属ＴＭ６一ｌｉｋｅ亚家族．ＣｊＨＤＥＦ属ＡＰ３亚家族．并
且这４个基因与雪山茶（Ｃ＿ ａｐＯｎ ｃ０ ｓ ｂｓ．
ｒｕｓｔｉｃａｎａ）中Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因４个成员的氨基酸序列
聚在一起．表明它们之间的亲缘关系最近．这与实
基酸残基最少．为２７个。同时碱性氨基酸残基最
多，为３８个；原子数ＣｊＨＤＥＦ最多．达３ ６６５个．
比最少的ｃｊＨＴＭ６蛋白的３ ４２０个残基多了２４５
个；４个蛋白不稳定系数均高．表明均为不稳定蛋
白。并且根据不稳定系数可大致将４个家族成员分
为２组．即ＣｊＨＧＬＯ１和ＣｊＨＧＬＯ２较为接近为一
际的植物分类情况一致
——
１０８０－ 热带作物学报 第３３卷
组，ＣｊＨＤＥＦ和ＣｊＨＴＭ６较为接近为另外一组。在
析（表４），结果表明： ‘红十八学士’中４个Ｂ—
４个基因中均未发现信号肽存在（数据未列出）。
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测的蛋白以仅一螺旋、无规卷曲和延伸
２．１．３‘红十八学士’Ｂ一￣ｎｃｔｉｏｎ基因预测编码蛋白
链接３种构象存在，且以前两种为主要结构．占到３
的二级结构分析 对‘红十八学士’中分离的Ｂ—
种构象比例的８３％以上，而延伸链结构比重最少，
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测编码的蛋白质序列二级结构进行分
均在１７％以下。在它们中间均不存在Ｂ一转角构象。
０．１２５
Ｂ
功
能
基
因
图ｌ ‘红十八学士’基因与其它植物Ｂ一￣ｎｃｔｉｏｎ基因的氨基酸序列的系统进化树
表３推测的‘红十八学士，Ｂ一￣ｎｃｔｉｏｎ基因编码蛋白质的一级结构
表４‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因推测蛋白质二级结构
第６期朱高浦等：重瓣茶花‘红十八学士’ＭＡＤＳ—ｂｏｘ家族Ｂ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列分析与原核表达一１０８１—
２．１．４ ‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测编码蛋
白的三级结构分析 蛋白质的功能很大程度上取
中可以看出． ‘红十八学士’中分离的Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ
基因中蛋白特定位点有５０个．其中蛋白激酶Ｃ磷
酸化位点均最多（１７个）。其次为酪蛋白激酶Ⅱ磷
酸化位点（１５个）。总体上，在所有的特定位点中
磷酸化位点的数量最多（３６个），因此可以推测这
决于其空间结构。 一螺旋主要功能是对蛋白质骨
架起到稳定作用．而无规卷曲结构决定了蛋白质的
功能．特别是酶的功能部位常常处于这种构象区
域．通过对蛋白质三级结构预测与分析．对理解该
蛋白质功能与结构之间的关系有着非常重要的意
义 ‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因推导的蛋白质
三级结构见图２．由图２可以看出，４个基因采用
些基因在‘红十八学士’花器官发育的细胞信号传
递过程中占有重要地位。
同源建模的方式预测的三级结构与二级结构预测的
结果基本一致．也是以仅一螺旋为主。并占最大比
重。其次为无规卷曲。而延伸链所占比重最小。根
据４个成员的空间构象。可明显的将其分为２组：
即ＣｊＨＧＬＯ１和ＣｊＨＧＬＯ２为一组，ｃｉＨＤＥＦ和
ｃｉＨＴＭ６为一组。这与不稳定系数分析的结果一致。
２．１．５‘红十八学士’中Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因推测编码的
蛋白质特定位点 蛋白质的磷酸化反应在生物细
胞信号的传递中占有极其重要的地位【－鄹 其中蛋白
激酶Ｃ是Ｇ蛋白偶联受体系统中的效应物．受
Ｃａ２￣的作用而被激活．蛋白激酶Ｃ能激活细胞质中
的靶酶参与生化反应的调控．同时也能作用于细胞
核中的转录因子．参与基因表达的调控【堋。从表５
Ａ为ＣｊＨＧＬＯ１编码蛋白；Ｂ为ＣｊＨＧＬ０２编码蛋白；Ｃ为
ＣｊＨＤＥＦ编码蛋白；Ｄ为ＣｊＨＴＭ６编码蛋白『１４１。
图２‘红十八学士’Ｂ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因推导的蛋白质三级结构
表５ ‘红＋八学士，Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测编码蛋白质特定位点
２．２ ‘红十八学士’Ｂ基因家族编码蛋白的ＳＤＳ—
ＰＡＧＥ分析
个基因的ＤＧＥＸ一４Ｔ一１载体有相应的靶蛋白被诱导
出来．它们将和ＧＳＴ构成融合蛋白被ＩＰＴＧ诱导表
达出来。根据‘红十八学士’中分离的Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ 原核表达载体ｐＧＥＸ一４Ｔ一１中谷胱甘肽巯基转
移酶（ＧＳＴ）标签蛋白大小约为２６ ｋｕ．这样在添加
基因编码蛋白大小和ＧｓＴ标签蛋白分子量大小．
可以预测４个基因与ＧＳＴ融合后靶蛋白的分子量
大小．分子量大小见表６。
ＩＰＴＧ后诱导物在２６ ｋｕ位置被诱导高度表达．而
其它蛋白因受到限制表达量下降．这样可以明显地
将诱导的靶蛋白鉴定出来。因此。如果构建的含４
ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析ＩＰＴＧ诱导的重组蛋白见图３．
表６重组蛋白分子量预测
第６期朱高浦等：重瓣茶花‘红十八学士’ＭＡＤＳ—ｂｏｘ家族Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列分析与原核表达一１０８３一
两个亚家族０９］．而Ｖｉａｅｎｅ等同的研究则将雪山茶中
ｂｅｔｗｅｅｎ ＷＵＳＨＥＬ ａｎｄ ＡＧＡＭＯＵＳ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００１，１０５：８０５—
８１４．
的Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因分为３个亚家族。本研究中．依
据生物信息学分析的不稳定系数和同源建模的三维
结构模型．可将在‘红十八学士’分离的Ｂ—
【１０】Ｌｏｈｍａｎｎ ＪＵ，Ｈｏｎｇ ＲＬ，Ｈｏｂｅ Ｍ，ｅｔ ｏ１．Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｎｋ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｏｒａｌ ｐａｔｔｅｍｉｎｇ ｉｎ
Ａ， ｃ ｓ 【Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００１，１０５：７９３—８０３．
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因家族成员分为两组．即ＣｊＨＧＬＯ１和
ＨＧＬ０２较为接近为一组．可归为ＧＬＯ—ｌｉｋｅ亚家
［１ １］Ｍｉｎｇ Ｆ，Ｍａ Ｈ．Ａ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｏｆ ｆｌｏｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ．２００９．２３：１ ７０５—１ ７０８．
族：而Ｃ 和 为另外一组．可归入
ｉＨＤＥＦ ＣｊＨＴＭ６
．
【１２】Ｓａｓａｋｉ Ｋ，Ａｉｄａ Ｒ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｈ，ｅｔ ｏ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ
ＤＥ 触ｅ亚家族 蛋白质的磷酸化修饰是生物体
内重要的共价修饰方式．反应了生物细胞内对外界
ｗｉｔｈｉｎ ｃｌｓｓａ Ｂ ＭＡＤＳ－ｂｏｘ ｇｅｎｅｓ ｒｆＧＬＯ ａｎｄ ＴｆＤＥＦ ｉｎ Ｔｏｒｅｎｉａ
ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ Ｌｉｎｄ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，２８４（５）：３９９—
信号的应答 本研究分离的Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因家族
成员均来自‘红十八学士’的幼小花芽．而分离的
４个基因编码的蛋白质特定位点中磷酸化位点高达
７２％．这表明本研究分离的４个Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ家族成
员可能在‘红十八学士’花器官发育的细胞信号转
导途径中发挥重要功能 通过本文已经知道分离的
４个Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ家族成员编码的蛋白质大小约在
５０．３１～５２．０９ ｋｕ范围．．并且生物信息学分析结果显
示它们可能在山茶花器官发育的信号转导途径中扮
演重要角色．但每个成员具体行使什么样的功能还
不清楚
参考文献
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ＭＡＤＳ－ｂｏｘ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ：ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ
‘
ｏｒｃｈｉｄ ｃｏｄｅ’［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｊ，２０１１，６６（６）：１ ００８—１ ０１９．
责任编辑：叶庆亮
2024年5月18日发(作者：程筠)
热带作物学报２０１２，３３（６）：１０７７—１０８３
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓ
重瓣茶花‘红十八学士’ＭＡＤＳ—ｂｏｘ家族
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列分析与原核表达
朱高浦 ｔ一，李纪元 ，范正琪 ，倪 穗。，李辛雷 ，周兴文 ，孙迎坤
１中国林业科学研究院亚热带林业研究所．浙江富阳 ３１１４００
２中国林业科学研究院经济林研究开发中心．河南郑州４５０００３
３宁波大学海洋学院．浙江宁波３１５２１１
摘要对山茶重瓣花‘红十八学士’（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ‘Ｈｏｎｇ Ｓｈｉｂａｘｕｅｓｈｉ’）中的４个Ｂ类功能基因构建了系
统进化树，预测了其蛋白结构，并构建了相应的原核表达载体。生物信息学分析结果表明：４个基因分属３个
亚家族，其中ＣｊＨＧＬＯ１和ｑＨＧＬ０２属ＰＩ亚家族，ＣｊＨＴＭ６属ＴＭ６一ｌｉｋｅ亚家族，ＣｊＨＤＥＦ属ＡＰ３亚家族；４个
基因的编码蛋白均为不稳定蛋白，均无信号肽存在；其蛋白二、三级结构均以０【一螺旋为主，其次是无规则卷曲，
然后以延伸链三种构象形式存在；分析的特定位点中磷酸化位点数量最多，尤其是蛋白激酶Ｃ磷酸化位点最多。
原核表达实验结果显示：当ＩＰＴＧ浓度在０．２ｍｍｏ］］Ｌ、３０℃、经１ ｈ诱导ＣｊＨＧＬＯ１蛋白可获表达：当ＩＰＴＧ浓度在
０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ、３０ ｏＣ、诱导１．５ ｈ ｃｊＨＧＬ０２蛋白可获表达；当ＩＰＴＧ浓度在０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ、１６℃、过夜（＞１６ ｈ）诱导
ｃｊＨＤＥＦ蛋白可获表达；当ＩＰＴＧ浓度在Ｏ．３ ｍｍｏｌ／Ｌ、２０℃、诱导５ ｈ ＣｊＨＴＭ６蛋白可获表达。这些研究为山茶
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因的更深人研究奠定了基础
关键词 重瓣；山茶花；Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因；生物信息学分析；原核表达
中图分类号０７８ 文献标识码Ａ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ｂ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＭＡＤＳ・－－ｂｏｘ Ｇｅｎｅ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｄｏｕｂｌｅ Ｆｌｏｗｅｒ
Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ‘Ｈｏｎｇ Ｓｈｉｂａｘｕｅｓｈｉ’
ＺＨＵ Ｇａｏｐｕ ，ＬＩ Ｊｉｙｕａｎ ，ＦＡＮ Ｚｈｅｎｇｑｉ ，ＮＩ Ｓｕｉ ，
・
ＬＩ Ｘｉｎｌｅｉ ，ＺＨＯＵ Ｘｉｎｇｗｅｎ ，ＳＵＮ Ｙｉｎｇｋｕｎ
１ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｆｕｙａｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１１４００，Ｃｈｉｎａ
２ Ｎｏｎ—ｔｉｍｂｅｒ Ｆｏｒｅｓｔｙｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｒｉｔ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ ４５０００３，Ｃｈｉｎａ
３ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｍｉ￣＃ｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１５２１１，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｄｏｕｂｌｅ ｆｌｏｗｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｆａｐｏｎｉｃａ．ｔｌｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ ＢＬ２１ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｅ ｊａｐｏｎｉｃａ‘Ｈｏｎｇ Ｓｈｉｂａｘｕｅｓｈｉ’．１１ｌｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ
ｔｈａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｒｅｅ ｓｕｂ－ｆａｍｉｌｉｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ。ａｎｄ ｎｏ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ
ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ．Ｔｈｅ ｓｐａｃｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ａｌｐｈａ—ｈｅｌｉｘ．ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ ａｎｄ ｆｅｗ ｅｘｔｅｎｄ ｓｔｒａｎｄ．Ｔｈｅ
ｍｏｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｐｅｃｉａｌ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＣｊＨＧＬ０１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ Ｉ Ｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ．ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｗａｓ ３０ ，ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ ｏｎｅ ｈｏｕｒ．ａｎｄ ＣｊＨＧＬ０２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ＩＰＴＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０．１ ｍｍｏ１／Ｌ．
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ１６℃，ｉｎｄｕｃｅｔｉｍｅｗａｓ１．５ｈ．ａｎｄＣｊＨＤＥＦｐｒｏｔｅｉｎＷａｓｉｎｄｕｃｅｄｗｈｅｎｔｈｅＩ ＧｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＷａｓ０．５ｍｍｏ］］Ｌ．
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ １６ ｏＣ，ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ＞１６ ｈ．ａｎｄ 日 ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ＩＰ１ＩＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ
Ｏ．３ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ２０℃，ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ ５ ｈ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｅｐ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ
ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃ ｊａｐｏｎｉｃａ．．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｄｏｕｂｌｅ ｆｌｏｗｅｒｓ；Ｃａｍｅｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ；Ｂ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｄｏｉ １０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１０００—２５６１．２０１２．０６．０２１
收稿日期
２０１２—０３—２７ 修回日期：２０１２—０６—０２
基金项目
科技部国际合作项目（Ｎｏ．２０１１ＤＦＡ３０４９０）；“十二五’’国家科技支撑计划课题（Ｎ０
．
２０１２ＢＡＤ０１Ｂ０７０３）：中央级公益性科研院所基本
科研业务费专项资金（ＮＯ．ＲＩＳＦ６１４１）。
作者简介
朱高浦（１９８１年一），男，博士，助理研究员。研究方向：经济林栽培育种研究。｝通讯作者：李纪元
，
Ｅ－ｍａｉｌ：Ｊｉｙｕａｎ＿１ｉ＠１２６－ｃ０ｍ。
一
ｌ０７８一 热带作物学报 第３３卷
ＭＡＤＳ—ｂｏｘ基因是广泛存在于生物中一类基因
功能鉴定奠定了基础．也希望为将来山茶重瓣花的
分子设计育种提供参考。
的统称，因其具有共同的保守区域而归为一类 它
的命名是由最初从酵母中发现的ＭＣＭ！基因、拟南
芥中的ＡＧＡＭＯＵＳ基因、金鱼草中的ＤＥＦＩＣＩＥＮＳ
基因和人的 ４个基因的首字母拼写而成ｆ１］
１材料与方法
１．１材料
ＭＡＤＳ—ｂｏｘ基因在被子植物花进化和多样性等花器
官发育方面起着关键作用［２－３］ 关于花器官发育的
理论中，“ＡＢＣ模型”理论受到广泛认可．该模型
‘红十八学士’是我国传统茶花栽培品种．适应
性强，分布在我国热带、亚热带地区。花径约８ ｃｍ，
花瓣１１０～１３０片，完全重瓣花，成六角塔形花冠，
认为：Ａ、Ｂ、Ｃ等３类同源异型基因单独或组合 花瓣鲜红。花期１２月到次年４月。 ‘红十八学士’
调控４轮花器官的发育 其中Ａ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因单独
调控萼片的发育：Ａ一和Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因共同调控
花瓣的发育：Ｂ一和Ｃ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因共同控制雄蕊
的发育：Ｃ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因单独控制心皮的发育 Ａ一
和Ｃ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因互相拮抗 尽管花器官发育模
型理论被不断发展和完善，但Ａ、Ｂ、Ｃ等３类基
因在植物中仍然被认为是最保守的．受到广泛关注
和研究［６１
对重瓣花器官发育的分子机理研究．大多集中
在Ｃ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因突变导致下游和其相互作用的因
子方面 ”，此外对Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ［１２—１４］和Ｂ一、Ｃ—
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因互作也有一些研究［１５—１６３ 考虑到完全重
瓣山茶的花瓣多达上百片．而Ｂ类功能基因是同
时参与了真核植物花瓣和雄蕊发育从而影响到花器
官第二轮和第三轮结构确定性的关键因子．暗示了
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因在山茶重瓣花形成中起到关键作用
或是与其它功能基因共同起作用 在山茶花中存在
非常普遍的萼片瓣化现象．暗示Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因可
能拓展表达域促使山茶重瓣花的形成 现有研究
结果表明．山茶中Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因可分为３个亚家
族，即ＰＩ（ ＧＬＯ１和ｃｊＧＬ０２）、ＡＰ３（ＣｊＤＥＦ）和
ＴＭ６一ｌｉｋｅ（ｃｊＴＭ６）［３； 很显然．山茶中这些重瓣花
的形成是与Ｃ功能基因缺失等造成的重瓣花起源
方式不同，可能涉及了雌雄蕊起源、苞（萼）片起源
等方式。
茶花是我国传统十大名花．我国是茶花的故
乡．但对茶花的开发利用以及新品种培育等方面起
步较晚，即使在茶花产业化最好的云南、浙江等
地．市场流行品种也以外来茶花品种为多 随着世
人对茶花文化的了解和审美价值回归．对中国传统
茶花的热情正悄然升温 本研究在前期从传统的完
全重瓣型茶花品种‘红十八学士’中分离到Ｂ—
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因家族４个成员ｃＤＮＡ全长的基础上．
进行了生物信息学分析并构建了原核表达载体．通
过优化最佳诱导表达条件．最后将相应的蛋白诱导
出来．这为以后山茶Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因所编码蛋白的
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因４个成员ＣｊＨＧＬＯ１ ｆＧｅｎＢａｎｋ登录
号：ＨＱ１４１３４１．１）、ＣｊＨＧＬ０２（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：
ＨＱ１４１３４２．１）、ＣｊＨＤＥＦ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＨＭ７７３—
０２４．１）、ＣｊＨＴＭ６（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＨＭ７４８６４６．１）
的ｃＤＮＡ全长由本实验室从花芽中克隆获得 Ｅ．ｃｏｌｉ
ＢＬ２１大肠杆菌、原核表达载体ｐＧＥＸ一４Ｔ一１载体为
本实验室保存，ｐＭＤ一１８载体购自ＴａＫａＲａ（沈阳）
公司。
１．２试剂
高保真酶、限制性内切酶 Ｉ和 Ｉ购自
ＴａＫａＲａ（沈阳）公司，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、
Ｔｒｉｓ、ＳＤＳ．、ＴＥＭＥＤ、ＩＰＴＧ、考马斯亮蓝Ｒ一２５０等
均为分析纯试剂
１．３方法
１．３．１ 生物信息学分析 利用ＤＮＡＭＡＮ ６．０软件
与ＧｅｎＢａｎｋ中已登录的Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因家族成员的
氨基酸序列进行同源性比较．按照最大似然法
（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）构建系统发育树 利用瑞士
生物信息学研究所（Ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）提供的
ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件，在线分析氨基酸残基数目、组成、
蛋白质相对分子量、理论等电点等参数：利用
ＰｒｏｔＳｅａｌｅ、ＨＮＮ软件在线分析仪一螺旋（Ａｌｐｈａ—
ｈｅｌｉｘ）、Ｂ一转角（Ｂｅｔａ ｔｕｒｎ）、无规卷曲（Ｒａｎｄｏｍ
ｃｏｉｌ）、延伸链（Ｅｘｔｅｎｄ ｓｔｒａｎｄ）。利用ＳｉｇｎａｌＰ进行信
号肽分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ｓｉｇｎａｌＰ／）；
米用ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｗｉｓｓｍｏｄ）
同源建模（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）ＮＮＩＪ该基因编码蛋白
质的三维结构。利用ＰＲＯＳＣＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ—ｐｂｉｌ．
ｉｂｃｐ．ｆｒ）预测编码蛋白质的特定位点
１．３．２原核表达分析 根据已获得的ＣｊＨＧＬＯ１、
ＣｊＨＧＬ０２、 ＣｊＨＤＥＦ、 ＣｊＨＴＭ６的ｃＤＮＡ全长序
列，设计引物（表１），扩增４个基因的开放阅读框
（ＯＲＦ），经ＴＡ克隆连接到ｐＭＤ一１８载体上，根据
原核表达载体ＤＧＥＸ一４Ｔ一１多克隆位点选择合适的
内切酶（Ｋｐｎ Ｉ和 Ｉ），将４个基因从ｐＭＤ一１８
载体上双酶切后连接到ｐＧＥＸ一４Ｔ一１载体上 将重
第６期朱高浦等：重瓣茶花‘红十八学士’ＭＡＤＳ—ｂ０ｘ家族Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列分析与原核表达
组ＤＧＥＸ一４Ｔ一１质粒转化到大肠杆菌Ｅ ｃｏｌｉ ＤＨ５（ｘ
感受态细胞中．利用菌液ＰＣＲ和质粒酶切鉴定阳
性质粒。
一１０７９－
蛋白质诱导表达条件。将诱导出的含‘红十八学
士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ基因家族ＭＡＤＳ—ｂ０ｘ蛋白的菌液离
心收集菌体．加入ＳＤＳ—ＰＡＧＥ上样缓冲液煮沸
５ ｍｉｎ裂解细胞。１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、室温离心５ ｍｉｎ，
取上清进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分离蛋白．再用考马
挑取阳性克隆接种于ＬＢ液体培养基．１８０ ｒ／ｍｉｎ
恒温振荡培养．送上海生工生物公司测序确保片
段正确插入。按照正交实验设计（表２）分别从
ＩＰＴＧ浓度、诱导时间、诱导温度三个方面优化
斯亮蓝Ｒ一２５０染色、固定液固定和脱色液脱色后
拍照、分析
表１ 红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因ＯＲＦ全长特异扩增引物
表２重组蛋白诱导表达条件的正交设计
因素 因素
ＩＰＴＧ浓度／ｍＭ
１
２
３
４
５
诱导时间／ｌＩ
０．５
１．０
３
５
＞６
诱导温度，℃
３７
３０
２５
２Ｏ
１６
ＩＰＴＧ浓度／ｍｍ０Ｉ／Ｌ
１４
１５
１６
１７
ｌ８
诱导时间／ｈ
５
＞６
０．５
１．Ｏ
３
诱导温度／ｏｃ
２０
１６
３７
３０
２５
Ｏ．１
Ｏ．１
Ｏ．１
０．１
０．１
０．３
０．３
０．４
０－４
Ｏ．４
６
７
Ｏ＿２
０＿２
Ｏ．５
１．Ｏ
３７
３０
１９
２０
０．４
Ｏ．４
５
＞６
２０
１６
８
９
１０
０＿２
０．２
０．２
３
５
＞６
２５
２Ｏ
１６
２１
２２
２３
Ｏ．５
Ｏ．５
０．５
０．５
１．０
３
３７
３Ｏ
２５
１１
１２
１３
０＿３
０．３
Ｏ－３
Ｏ．５
１．０
３
３７
３０
２５
２４
２５
０．５
０．５
５
＞６
２０
１６
２结果与分析
２．１ ‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列的生物
信息学分析
２．１．２‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测编码蛋白
的一级结构分析 对‘红十八学士’中分离的Ｂ—
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测编码的蛋白质一级结构进行了分
２．１．１ ‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列在系统
进化中的位置 ‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因与
其它植物的氨基酸序列的系统进化树见图１．由图
１可以看出，从４个基因在系统发育树中的位置，
析（表３），结果表明：分子量ｃｊＨＤＥＦ蛋白最大。
达２６．Ｏ９，而ｃｊＨＴＭ６最小，为２４－３１；理论等电点
ｃｊＨＴＭ６最高，为９．５３，ＣｊＨＧＬＯ１最低，为６．７７：
ｃｊＨＧＬＯ１的酸性氨基酸残基最多．为３４个．碱性
氨基酸残基则最少，为３３个。而ＣｊＨＴＭ６酸性氨
清晰表明它们分属Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因的３个亚家族
其中ＣｊＨＧＬＯ１和ＣｊＨＧＬ０２属ＰＩ亚家族．ＣｊＨＴＭ６
属ＴＭ６一ｌｉｋｅ亚家族．ＣｊＨＤＥＦ属ＡＰ３亚家族．并
且这４个基因与雪山茶（Ｃ＿ ａｐＯｎ ｃ０ ｓ ｂｓ．
ｒｕｓｔｉｃａｎａ）中Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因４个成员的氨基酸序列
聚在一起．表明它们之间的亲缘关系最近．这与实
基酸残基最少．为２７个。同时碱性氨基酸残基最
多，为３８个；原子数ＣｊＨＤＥＦ最多．达３ ６６５个．
比最少的ｃｊＨＴＭ６蛋白的３ ４２０个残基多了２４５
个；４个蛋白不稳定系数均高．表明均为不稳定蛋
白。并且根据不稳定系数可大致将４个家族成员分
为２组．即ＣｊＨＧＬＯ１和ＣｊＨＧＬＯ２较为接近为一
际的植物分类情况一致
——
１０８０－ 热带作物学报 第３３卷
组，ＣｊＨＤＥＦ和ＣｊＨＴＭ６较为接近为另外一组。在
析（表４），结果表明： ‘红十八学士’中４个Ｂ—
４个基因中均未发现信号肽存在（数据未列出）。
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测的蛋白以仅一螺旋、无规卷曲和延伸
２．１．３‘红十八学士’Ｂ一￣ｎｃｔｉｏｎ基因预测编码蛋白
链接３种构象存在，且以前两种为主要结构．占到３
的二级结构分析 对‘红十八学士’中分离的Ｂ—
种构象比例的８３％以上，而延伸链结构比重最少，
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测编码的蛋白质序列二级结构进行分
均在１７％以下。在它们中间均不存在Ｂ一转角构象。
０．１２５
Ｂ
功
能
基
因
图ｌ ‘红十八学士’基因与其它植物Ｂ一￣ｎｃｔｉｏｎ基因的氨基酸序列的系统进化树
表３推测的‘红十八学士，Ｂ一￣ｎｃｔｉｏｎ基因编码蛋白质的一级结构
表４‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因推测蛋白质二级结构
第６期朱高浦等：重瓣茶花‘红十八学士’ＭＡＤＳ—ｂｏｘ家族Ｂ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列分析与原核表达一１０８１—
２．１．４ ‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测编码蛋
白的三级结构分析 蛋白质的功能很大程度上取
中可以看出． ‘红十八学士’中分离的Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ
基因中蛋白特定位点有５０个．其中蛋白激酶Ｃ磷
酸化位点均最多（１７个）。其次为酪蛋白激酶Ⅱ磷
酸化位点（１５个）。总体上，在所有的特定位点中
磷酸化位点的数量最多（３６个），因此可以推测这
决于其空间结构。 一螺旋主要功能是对蛋白质骨
架起到稳定作用．而无规卷曲结构决定了蛋白质的
功能．特别是酶的功能部位常常处于这种构象区
域．通过对蛋白质三级结构预测与分析．对理解该
蛋白质功能与结构之间的关系有着非常重要的意
义 ‘红十八学士’Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因推导的蛋白质
三级结构见图２．由图２可以看出，４个基因采用
些基因在‘红十八学士’花器官发育的细胞信号传
递过程中占有重要地位。
同源建模的方式预测的三级结构与二级结构预测的
结果基本一致．也是以仅一螺旋为主。并占最大比
重。其次为无规卷曲。而延伸链所占比重最小。根
据４个成员的空间构象。可明显的将其分为２组：
即ＣｊＨＧＬＯ１和ＣｊＨＧＬＯ２为一组，ｃｉＨＤＥＦ和
ｃｉＨＴＭ６为一组。这与不稳定系数分析的结果一致。
２．１．５‘红十八学士’中Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因推测编码的
蛋白质特定位点 蛋白质的磷酸化反应在生物细
胞信号的传递中占有极其重要的地位【－鄹 其中蛋白
激酶Ｃ是Ｇ蛋白偶联受体系统中的效应物．受
Ｃａ２￣的作用而被激活．蛋白激酶Ｃ能激活细胞质中
的靶酶参与生化反应的调控．同时也能作用于细胞
核中的转录因子．参与基因表达的调控【堋。从表５
Ａ为ＣｊＨＧＬＯ１编码蛋白；Ｂ为ＣｊＨＧＬ０２编码蛋白；Ｃ为
ＣｊＨＤＥＦ编码蛋白；Ｄ为ＣｊＨＴＭ６编码蛋白『１４１。
图２‘红十八学士’Ｂ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因推导的蛋白质三级结构
表５ ‘红＋八学士，Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因预测编码蛋白质特定位点
２．２ ‘红十八学士’Ｂ基因家族编码蛋白的ＳＤＳ—
ＰＡＧＥ分析
个基因的ＤＧＥＸ一４Ｔ一１载体有相应的靶蛋白被诱导
出来．它们将和ＧＳＴ构成融合蛋白被ＩＰＴＧ诱导表
达出来。根据‘红十八学士’中分离的Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ 原核表达载体ｐＧＥＸ一４Ｔ一１中谷胱甘肽巯基转
移酶（ＧＳＴ）标签蛋白大小约为２６ ｋｕ．这样在添加
基因编码蛋白大小和ＧｓＴ标签蛋白分子量大小．
可以预测４个基因与ＧＳＴ融合后靶蛋白的分子量
大小．分子量大小见表６。
ＩＰＴＧ后诱导物在２６ ｋｕ位置被诱导高度表达．而
其它蛋白因受到限制表达量下降．这样可以明显地
将诱导的靶蛋白鉴定出来。因此。如果构建的含４
ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析ＩＰＴＧ诱导的重组蛋白见图３．
表６重组蛋白分子量预测
第６期朱高浦等：重瓣茶花‘红十八学士’ＭＡＤＳ—ｂｏｘ家族Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因序列分析与原核表达一１０８３一
两个亚家族０９］．而Ｖｉａｅｎｅ等同的研究则将雪山茶中
ｂｅｔｗｅｅｎ ＷＵＳＨＥＬ ａｎｄ ＡＧＡＭＯＵＳ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００１，１０５：８０５—
８１４．
的Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因分为３个亚家族。本研究中．依
据生物信息学分析的不稳定系数和同源建模的三维
结构模型．可将在‘红十八学士’分离的Ｂ—
【１０】Ｌｏｈｍａｎｎ ＪＵ，Ｈｏｎｇ ＲＬ，Ｈｏｂｅ Ｍ，ｅｔ ｏ１．Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｎｋ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｏｒａｌ ｐａｔｔｅｍｉｎｇ ｉｎ
Ａ， ｃ ｓ 【Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００１，１０５：７９３—８０３．
ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因家族成员分为两组．即ＣｊＨＧＬＯ１和
ＨＧＬ０２较为接近为一组．可归为ＧＬＯ—ｌｉｋｅ亚家
［１ １］Ｍｉｎｇ Ｆ，Ｍａ Ｈ．Ａ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｏｆ ｆｌｏｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ．２００９．２３：１ ７０５—１ ７０８．
族：而Ｃ 和 为另外一组．可归入
ｉＨＤＥＦ ＣｊＨＴＭ６
．
【１２】Ｓａｓａｋｉ Ｋ，Ａｉｄａ Ｒ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｈ，ｅｔ ｏ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ
ＤＥ 触ｅ亚家族 蛋白质的磷酸化修饰是生物体
内重要的共价修饰方式．反应了生物细胞内对外界
ｗｉｔｈｉｎ ｃｌｓｓａ Ｂ ＭＡＤＳ－ｂｏｘ ｇｅｎｅｓ ｒｆＧＬＯ ａｎｄ ＴｆＤＥＦ ｉｎ Ｔｏｒｅｎｉａ
ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ Ｌｉｎｄ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，２８４（５）：３９９—
信号的应答 本研究分离的Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ基因家族
成员均来自‘红十八学士’的幼小花芽．而分离的
４个基因编码的蛋白质特定位点中磷酸化位点高达
７２％．这表明本研究分离的４个Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ家族成
员可能在‘红十八学士’花器官发育的细胞信号转
导途径中发挥重要功能 通过本文已经知道分离的
４个Ｂ—ｆｕｎｃｔｉ０ｎ家族成员编码的蛋白质大小约在
５０．３１～５２．０９ ｋｕ范围．．并且生物信息学分析结果显
示它们可能在山茶花器官发育的信号转导途径中扮
演重要角色．但每个成员具体行使什么样的功能还
不清楚
参考文献
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［８】Ｔｈｅｉｓｓｅｎ Ｇ，Ｂｅｃｋｅｒ Ａ，Ｄｉｒｏｓａ Ａ，ｅｔⅡｆ．Ａ ｓｈｏｒｔ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ
ＭＡＤＳ—ｂｏｘ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０００，４２（１）：
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［９］Ｌｅｎｈａｒｄ Ｍ，Ｂｏｈｎｅｒ Ａ，Ｊｆｉｒｇｅｎｓ Ｇ，ｅｔ ．Ｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ
ｃｅｌ１ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｉｎ Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｆｌｏｒａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍｓ ｂｙ ｉｎｅｒａｔｉｏｎｓ
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［１３】朱高浦，李纪元，范正琪，等．ｑＨＤＥＦ，重瓣山茶‘红十八学
士’中一个新的Ｂ类功能基因克隆与表达分析［Ｊ］．农业生物技术
学报，２０１ｌａ，１９（３）：４４２—４４８．
［１４］朱高浦，李纪元，范正琪，等．完全重瓣型山茶花品种‘红十
八学士’ＣｊＨＴＭ６；￣因ｃＤＮＡ克隆与分析【Ｊ】＿热带作物学报，
２０１ｌｂ，３２（３）：４５６－４６２．
［１５］Ｊａｃｋ Ｔ．Ｒｅｌｅａｒｎｉｎｇ ｏｕｒ ＡＢＣｓ：ＦｌｅＷ ｔｗｉｓｔｓ ｏｎ ａｎ ｏｌｄ ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．
Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，２００１，７：３１０—３１６．
［１６］Ｋｉｍ ＳＹ，Ｚｈｕ Ｔ，Ｓｕｎｇ Ｚ Ｒ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ
ｐｒｏ￣ａｍｓ ｂｙ ＥＭＦ１ ａｎｄ ＥＭＦ２ ｉｎ Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ，
２０１０，１５２（２）：５１６—５２８．
［１７］Ｇａｏｐｕ Ｚｈｕ，Ｊｉｙｕａｎ Ｌｉ，Ｓｕｉ Ｎｉ，ｅｔ ｏ１．Ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉｌａ ｒｏｌｅ ｏｆ
Ｂ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｆｌｏｒａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｄｏｕｂｌｅ
ｌｆｏｗｅｒｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｃｈａｎｇｉｉ Ｙｅ［Ｊ］．Ａｆｒｉ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
２０１１，１０（７３）：１６ ７５７—１６７６２．
［１８】孙大业，崔素娟，孙颖．细胞信号转导［Ｍ］．４版．北京：科
学出版社．２０１０．
【１９］Ｍｏｎｄｒａｇ６ｎ－Ｐａｌｏｍｉｎｏ Ｍ，Ｔｈｅｉｓｓｅｎ Ｇ．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐａｒａｌｏｇｏｕｓ ＤＥＦＩＣＩＥＮＳ——ａｎｄ ＧＬＯＢＯＳＡ——ｌｉｋｅ
ＭＡＤＳ－ｂｏｘ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ：ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ
‘
ｏｒｃｈｉｄ ｃｏｄｅ’［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ Ｊ，２０１１，６６（６）：１ ００８—１ ０１９．
责任编辑：叶庆亮