2024年5月19日发(作者：蓬长运)
中国老年学杂志２０１８年４月第３８卷
端粒结合蛋白Ｒａｐｌ促进化疗药物诱导的胃癌细胞衰老相关分泌表型
姚婷婷王静云 陆文全 吕 帅 李 昕 宁寒冰
（郑州大学第一附属医院消化内科，河南 郑州４５００５２）
［摘要］ 目的探讨端粒结合蛋白Ｒａｐｌ在化疗药物诱导的胃癌细胞衰老相关分泌表型（ＳＡＳＰ）中的作用。方法低剂量
依托泊苷（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，５ ｔｘｍｏｌ／Ｌ）处理胃癌ＳＧＣ７９０１细胞（试验组），观察细胞衰老，ＳＡＳＰ相关因子的表达和分泌水平及Ｒａｐ１表达情
况。利用ｓｉＲＮＡ抑制ＳＧＣ７９０１细胞Ｒａｐ１表达（ＳＧＣ７９０１．Ｒａｐｌ ＫＤ），阴性对照采用ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＳＧＣ７９０１－ＮＣ），检测Ｒａｐ１
表达下降对ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ诱导的ＳＧＣ７９０１细胞衰老及ＳＡＳＰ的影响。结果试验组第３天ＳＧＣ７９０１细胞停止生长；与对照组比较，第５
天试验组Ｂ．半乳糖苷酶（ＳＡ．Ｂ．Ｇａ１）染色显著增加，ｐ５３和ｐｌ６ 蛋白表达明显升高，ＳＡＳＰ相关因子白细胞介素（ＩＬ）一１Ａ、ＩＬ－６、ＩＬ－
８、血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）。Ａ和干扰素（ＩＦＮ）． 在ＳＧＣ７９０１细胞和条件培养液中表达明显升高（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．００１），证实低剂
量ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ成功诱导ＳＧＣ７９０１细胞衰老及ＳＡＳＰ；同时Ｒａｐｌ表达也明显升高，Ｒａｐｌ表达升高出现在ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ处理后早期（第１
天），早于ＳＡＳＰ相关因子的出现，并在衰老细胞持续存在。Ｒａｐｌ ｓｉＲＮＡ下调ＳＧＣ７９０１细胞Ｒａｐｌ的表达对ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ诱导的细胞衰
老没有影响；但ＳＧＣ７９０１．Ｒａｐｌ ＫＤ细胞和条件培养液中ＳＡＳＰ相关因子表达明显下降且延迟，ＳＧＣ７９０１一Ｎｃ细胞ＳＡＳＰ相关因子表
达出现在第５或７天，ＳＧＣ７９０１．Ｒａｐｌ ＫＤ细胞出现在第９天。结论在低剂量化疗药物诱导的胃癌细胞衰老过程中伴随Ｒａｐｌ表达
升高，Ｒａｐｌ促进ＳＡＳＰ相关因子的表达。
［关键词］端粒结合蛋白；Ｒａｐ１；化疗；细胞衰老；衰老相关分泌表型；胃癌
［中图分类号］Ｒ７３５．２ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００５－９２０２（２０１８）０８－１９１２－０５；ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－９２０２．２０１８．０８．０５１
衰老细胞分泌炎症细胞因子、趋化因子、生长因子
１材料和方法
和蛋白酶等，称为细胞衰老相关分泌表型（ＳＡＳＰ）¨Ｊ。 １．１细胞和试剂人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１来源于第
治疗（包括化疗、放疗等）诱导的肿瘤细胞ＳＡＳＰ（ＴＩＳ）
四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验
促进肿瘤发展、转移、复发、耐药及化疗药物引起的短 室。细胞生长于含１０％灭活小牛血清的ＲＰＭＩ １６４０
期和长期副作用 ］。端粒是位于染色体末端的ＤＮＡ．
培养基中，于３７￣Ｃ、５％ＣＯ 条件下常规培养。ｅｔｏｐｏ—
蛋白结构，由３￣ＦＡＧＧＧ重复序列和大量的端粒结合蛋 ｓｉｄｅ购自Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ。抗体：抗Ｒａｐｌ（Ａｂｃａｍ，
白组成。６个端粒结合蛋白ＴＲＦ１、ＴＲＦ２、Ｒａｐｌ、ＰＯＴ１、
ａｂｌ４４０４），抗ｐｌ６“ （Ａｂｅａｍ，ａｂ１６１２３），抗ｐ５３（Ｃｅｌｌ
ＴＩＮ２和ＴＰＰ１组成Ｓｈｅｌｔｅｒｉｎ复合体 。研究证明端粒 Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，９２８２），抗白细胞介素（ＩＬ）－１Ａ（Ａｂｃａｍ，
结合蛋白在肿瘤的发生发展中起重要作用 。Ｒａｐｌ
ａｂ９６１４），抗ＩＬ－６（Ａｂｃａｍ，ａｂ９３２４），抗ＩＬ－８（Ａｂｃａｍ，
是Ｓｈｅｌｔｅｒｉｎ复合体中一个特殊的因子，研究显示哺乳 ａｂ７７４７），抗血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）一Ａ（Ａｂｃａｍ，
动物Ｒａｐｌ至少拥有３种独特的功能：端粒功能；转录
ａｂ５１７４５），抗干扰素（ＩＦＮ）一＿ｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ，３Ｆ１Ｅ３），
调控；在胞质抑制核转录因子（ＮＦ）．ＫＢ信号通路 Ｊ。
抗 一ｔｕｂｕｌｉｎ（Ａｂｃａｍ，ａｂｌ１３１６）。
在酿酒酵母衰老过程中，Ｒａｐｌ离开端粒并重新定位于
１．２诱导细胞衰老１×１０ 个细胞接种于直径１０ ｃｍ
数百个新靶基因的上游启动子区域，促进衰老相关基
的培养皿，３７ｃＩ＝培养过夜；将培养液更换为低血清２％
因表达，推动衰老进程 ；在皮肤成纤维细胞衰老和
ＦＢＳ，分别加入空白培养液（对照组）和５ ｉｘｍｏｌ／Ｌ ｅｔｏ—
氧化应激时，Ｒａｐｌ水平下降 ］。研究显示：依托泊苷
ｐｏｓｉｄｅ（试验组），处理１、５、７、９ ｄ，每３ ｄ更换含有ｖｅ—
（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）或阿霉素（ＡＤＲ）诱导胃癌细胞Ｒａｐ１表达
ｈｉｃｌｅ或５ ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ的新鲜培养液。收集条件
增高，药物诱导的Ｒａｐｌ表达升高通过参与ＤＮＡ损伤
培养液时，更换为新鲜不含药物培养液继续培养２４ ｈ。
修复，促进胃癌细胞多药耐药 ｊ。本研究探讨端粒结
１．３ ３－半乳糖苷酶（ＳＡ—ｐ—Ｇａ１）染色根据衰老细胞
合蛋白Ｒａｐｌ在化疗药物诱导的胃癌ＳＡＳＰ中的作用。
组织化学染色试剂盒（Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ）说明书进行ＳＡ—
ｐ—Ｇａｌ染色，显微镜下观察细胞ＳＡ—ｐ—Ｇａｌ染色。
１．４ ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ检测 细胞生长曲线采用Ａｌａｍａｒ－
基金项目：国家自然科学基金（Ｕ１３０４８１４）；郑州市肿瘤生物学院士工作
Ｂｌｕｅ分析（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。细胞按照１×１０ ／孔接
站（１４２ＰＹＳＧＺ６８８）
种于９６孔板，３７℃培养过夜。ｖｅｈｉｃｌｅ或５ Ｉ￣ｍｏｌＺＬ ｅｔｏ—
ｌ 郑州大学第二附属医院神经内科
ｐｏｓｉｄｅ处理后，加入ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ试剂，３７℃继续培养
通信作者：宁寒冰（１９７６一），女，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，
２ ｈ，检测５７０ ｎｍ吸光值（Ａ），实验重复３次，细胞活
主要从事消化道肿瘤研究。
力＝（实验组Ａ值一空白对照组Ａ值）／（阴性对照组Ａ
第一作者：姚婷婷（１９８９一），女，在读硕士，主要从事消化道肿瘤研究。
值一空白对照组Ａ值）×１００％。
蛙笠缝熊结盒 臼旦业 选 也＿疗 透 盥 区塑 ．量熊 塑盂型…望
９ｌ３
１．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测 裂解细胞提取总蛋白，．卜二
及ｐ１６ “ 蛋白表达升高， 图ｌ、 ２。与对照组比
较，试验组第１、５、７、９ ｄ ＲａｐＩ ｍＲＮＡ显著升高（Ｐ＜
０．００１），第５、７、９天ＳＡＳＰ卡Ｈ关因子（ＩＬ １Ａ、１１ 一６、ＩＩ 一
８、ＶＥＧＩ￣、Ａ、ＩＦＮ一 ＩＴｌＲＮＡ均 著升高（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜
烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—Ｉ ＡｃＦ）分离蛋
白，应用电转移将电泳分离后的蛋白转移至硝酸纤维
一
素滤膜上，滤膜经５％脱脂奶粉 ｊ二室温封闭后，依次与
抗及辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的二抗孵育，以电
０．００１）。与对照组比较，试验组细胞条件培养液中第
５、７、９天ｌＬ—ｌ Ａ、ｌＩ 、Ｉ１ 一８ ｍＲＮＡ均显著升高（Ｐ＜
０．０５，Ｐ＜Ｏ．Ｏ０１），第７、９犬ＶＥＧＦ—Ａ、ＩＦＮ一 ｍＲＮＡ均
显著升高（Ｐ＜Ｏ。０５）。见表３、表４
对照组 试验组
化学发光法（ＥＣＩ ）显色
１．６ ＲＴ—ＰＣＲ ＲＮｅａｓ）试剂盒（Ｑｉａｇｅｎ）提取细胞总
ＲＮＡ，逆转录试剂盒（Ｒｏｃｈｅ）台成ｅＤＮＡ，ＲＴ—ｌ ＣＲ采用
Ｒｏｃｈｅ公司ＬｉｇｈｔＣｙ（’ｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｌｍ ＳＹＢＲ
ＧＩ ｎ Ｉ Ｓｙｓｔｅｍ，将ＧＡＰＤＩ｛没为内参。引物见表１
表１ Ｒｅａｌ·ｔｉｍｅ ＰＣＲ引物列表
基因
Ｒａｔ）１
１１．一１ｎ
ＩＩ ４３
１１ ｛
Ｎ一
七游５ ３
Ｆ游５．ｕ３
ＧＧＧＴＧ（ ＡＴ【：ＡＴＣＡ＿ｒＣＡＣＡＣＡＴＡＧ Ｆ
ＧＣＣＡＣＣＣＧＧ（ Ａ【 几 ｒＧＡ
ＡＴＣＡＣＴＡＣＣｌｒＣ ～ＣＣＧ（ ｌｒＧＣ ｒ ＿ｒＧＣＧＴＡＴＣ ｌ ＣＡ（ ＣＣＡ Ｉ℃ＴＣＣ
ＡＴＧＣＡＡ＿ｒＡ１、【：ＣＡＣＣＣ【 ＴＧＡＣ ＧＡＧＧｑ’Ｇ（：ｔ ＣＡＴＧＣＴＡＣＡ ｒ门’
ｒＩ、ＧＧｔ：ＣＴ ＡＡ Ｉ’Ｉ Ｉ’ｒＣＣＴＡ
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ＶＥＧＦ－Ａ ＣＣＡＣＧＧｔ：（：＿ｒ（，ＧＡＧ ＦＧ ＦＧＴ
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（ ＡＰＤＩ１
（ Ａ【 ＴＣＡＡＣ（；（；ＡＴ ｌｖＩ” （ ＴＣ【 ．ｒ １Ｔｒ‘ ＡＴ 几 ｌ、（；（ Ａ（：ＣＧＡＴＣ ＦＣＧ
图１ 两组ＳＧＣ７９０１细胞第５天ＳＡ－３－Ｇａｌ染色（ｘ４００）
１．７酶联免疫吸附法（Ｅ１ ＩＳＡ）检测 收集不同细胞
对照纽 试验组
ｐ５３
条件培养液，根据Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ试剂合
（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）说明 检测Ｉ１ ～１Ａ、ＩＩ 一６、Ｉ１ 一８、ＶＥＧｌ￣’、
ＩＦＮ一 表达，结果表示为与阴性对照组检测值的比值。
１．８转染前期实验构建的Ｒａｐｌ ｓｉＲＮＡ和阴性对照
ｓｉＲＮＡ载体 采用１Ａｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ…２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）分
别瞬时转染ＳＧＣ７９０ｌ细胞（分别命名为ＳＧＣ７９０１一
ＲａｐＩ ＫＤ和ＳＧＣ７９０１一ＮＣ），ＳＧＣ７９０１ Ｒａｐｌ ＫＤ分别用
空白培养液及５ ｐｍｕ）ｌ／Ｉ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ处理１、５、７、９ ｄ（分
别为Ｒａｐｌ ＫＤ对照组及Ｒａｐｌ ＫＤ试验组），ＳＧＣ７９０１一
ＮＣ分别用空白培养液及５ ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ处理１、
５、７、９ ｄ（分别为ＮＣ对照组及ＮＣ试验组）。４组检测
指标及方法同对照组及实验组。
１．９统计学方法
２ 结 果
图２两组培养第５天ｐ５３及ＰＩ６ “ 表达
对照组 试验组
０ １ ５ ７ ９ ０ １ ５ ７ ９ （ｄ）
ＲａｐＩ
ＩＬ—ｌＡ
ＩＬ一６
ＩＬ一８
ＶＥＧＦ—Ａ
ＩＦＮ—Ｙ
Ｔ—ｔｕｂｕｌｉｎ
使用ＳＰＳＳ２１．０软件进行ｔ检验。
２．１两组细胞增殖情况及Ｒａｐｌ、ＳＡＳＰ卡甘关因子表达
比较试验组第３天后细胞停止生长，见表２。与对
照组比较，试验组第５天细胞ＳＡ一 Ｇａｌ染色增加，ｐ５３
图３两组Ｒａｐｌ和ＳＡＳＰ相关因子蛋白表达
表２两组ＳＧＣ７９０１细胞增殖情况比较（ｘ：ｅ．ｓ，细胞相对密度，Ｈ＝３）
组别
对照组
第０天
１．ｏ（）±（）．７４
１．【ＭＪ±０ Ｏ５
第１天
ｌ ｌ４±Ｏ．Ｏ３
１．８９±Ｏ．Ｏ８
第２天
１．９３±０．２０
１．４７士（）ｌ１
第３天
３．５ｌ土Ｏ．２４
１ ６０￣０．１０Ｉ）
第４天
５．３３±０．２２
．
第５火
６ ２５±０ ｌ９
１．６０±０ ２０
第６人
６．８０＿＋０．２６
Ｉ ４９±ｔＩ １３
第７天
６．８０±０ ０８
５２ｉｌＩ１．２３Ｉ】
试验组
６０±０ ０９
与对照组比较：１）Ｐ＜Ｏ．０５
ｌ９Ｉ４·
目老年学杂志２０Ｉ８年４门第３８卷
表３两组Ｒａｐｌ和ＳＡＳＰ相关因子ｍＲＮＡ表达比较（ ＋ｊ，，ｌ＝３）
与对照组比较：１）Ｐ＜０．０５，２）Ｐ＜０．００１；下表同
表４两组细胞条件培养液中ＳＡＳＰ相关因子表达比较（ ＋ｊ，，ｌ＝３）
２．２ ４组细胞增殖情况及Ｒａｐｌ ｍＲＮＡ、ｐ５３、ｐ１６州
表达比较ＲａｐＩ ＫＤ对照组、Ｒａｐｌ ＫＤ试验组、ＮＣ对
ＮＣ试验组比较，Ｒａｐｌ ＫＤ试验组细胞条件培养液中第
５、７、９天ＩＬ一１ Ａ、ＩＬ一６、ＩＬ一８ ＶＥＧＦ—Ａ、ＩＦＮ一 ｍＲＮＡ均显
照组及ＮＣ试验组Ｒａｐｌ ｍＲＮＡ表达相对密度分别为
０．４３±０．０４、０．６４±０．０５、１．１７±０．０２、４．１３±０．１９，Ｒａｐｌ
著升高（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．００１）。见图７、表６。
ＲａｐＩ ＫＤ对照组 Ｒａｐｌ ＫＤ试验纽
ＫＤ对照组与ＮＣ对照组、Ｒａｐｌ ＫＤ试验组与ＮＣ试验
组比较Ｒａｐｌ ｍＲＮＡ表达相对密度均显著降低（Ｐ＜
０．０５），见图４。Ｒａｐｌ ＫＤ试验组及ＮＣ试验组第３天
后细胞均停止生长，见表５。ＮＣ试验组与ＮＣ对照组
比较、Ｒａｐｌ ＫＤ试验组与Ｒａｐｌ ＫＤ对照组比较，第５
天细胞ＳＡ．Ｂ．Ｇａｌ染色增加，ｐ５３及ｐ１６Ⅲ 蛋白表达显
著升高，见图５、图６。
ＲａｐＩ
ＮＣ对照组 ＮＣ试验组
＂ｔ－ｔｕｂｕｌｉｎ
１：Ｒａｐｌ ＫＤ对照组，２：Ｒａｐｌ ＫＤ试验组，３：ＮＣ对照组，４：ＮＣ试验组
图４ ４组Ｒａｐｌ蛋白表达
２．３ Ｒａｐｌ敲除抑制ＳＡＳＰ表达与ＮＣ试验组比较，
Ｒａｐｌ ＫＤ试验组第５天ＩＬ一１ Ａ、ＩＬ一６、ＩＬ一８、ＶＥＧＦ—Ａ、
ＩＦＮ一＾ｙ ｍＲＮＡ均显著降低（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．００１）。与
图５ ４组细胞第５天ＳＡ· Ｇａｌ染色（ｘ４００）
表５ ４组细胞增殖情况比较（ｉ ，细胞相对密度。ｎ＝３ Ｊ
表６ ＮＣ试验组及Ｒａｐｌ ＫＤ试验组细胞条件培养液中ＳＡＳＰ相关因子表达比较（ｉ＋ｊ。ｎ＝３】
ｐ５３
上皮一间质转化（ＥＭＴ）和增加肿瘤细胞侵袭力促进肿
瘤转移…］。
Ｒａｐｌ是具有多种端粒和端粒外功能的调控蛋白，
与衰老和肿瘤发展密切相关。在乳腺癌和肝癌中发现
ＲａｐＩ表达升高，抑制细胞凋亡，增加肿瘤侵袭性 。
Ｒａｐｌ结合于染色体的某些非端粒位点，调节细胞黏附
因子、肿瘤及代谢等相关基因转录。Ｒａｐｌ通过转录调
控和ＮＦ．ＫＢ信号通路调节炎性因子表达，抑制Ｒａｐｌ
降低间充质干细胞肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）一 、ＩＬ一６和单
核细胞趋化蛋白一１的分泌，提高细胞存活及在心肌梗
ｐ１６ “
Ｔ—ｔｕｂｕｌｉｎ
１ ２ ３ ４
Ｒａｐｌ ＫＩ）对照组．２：ＩｌａＩ ｌ ＫＤ试验Ⅲ，３：ＮＣ刈照绀，４：ＮＣ试验组
图６ ４组ｐ５６、ｐ１６ 蛋白表达
ＲａｐＩ ＫＤ试验 ＮＣ试验组
０ ｌ ５ ７ ９ （ｄ）
Ｒａｐ１
ＩＬ ｌＡ
ＩＬ．６
ＩＬ培
ＶＥＧＦ—Ａ
ＩＦＮ—Ｔ
死中的治疗效果；Ｒａｐｌ促进ＮＬＲＰ３炎性小体，导致移
植肝脏损伤 １３）；Ｒａｐｌ促进巨噬细胞分泌炎性因子，促
进动脉粥样硬化发展¨ 。研究显示，胞质Ｒａｐ１和胞
核ＮＦ—ＫＢ ｐ６５在胃癌组织中的表达呈显著正相关，可
能与ＮＦ．ＫＢ信号转导通路共同参与胃癌的发生发展
有关¨ ；Ｒａｐｌ调控ＴＲＦ２在化疗药物诱导的ＤＮＡ损
Ｔ－ｔｕｂｕｌｉｎ
伤修复中的作用，参与胃癌耐药的发生 。而ＤＮＡ损
伤反应和ＮＦ．ＫＢ信号通路都是ＳＡＳＰ调控因子 ，本
研究进一步证实，Ｒａｐｌ调控化疗药物诱导的胃癌细胞
ＳＡＳＰ。在低剂量ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ诱导的胃癌细胞衰老过程
中伴随Ｒａｐｌ表达升高，Ｒａｐｌ表达升高出现于ｅｔｏｐｏ—
ｓｉｄｅ处理的早期阶段，并在衰老细胞中持续存在；Ｒａｐｌ
图７ Ｒａｐｌ ＫＤ试验组及ＮＣ试验组Ｒａｐｌ和
ＳＡＳＰ相关因子蛋白表达
３讨论
ＴＩＳ在肿瘤治疗中发挥着复杂的“双刃剑”式作
片ｊ，一方面细胞处于生长停滞状态，抑制细胞增殖，并
敲除不影响ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ诱导的细胞衰老，但抑制并延迟
ＳＡＳＰ表达。因此，Ｒａｐｌ可能通过调控ＴＩＳ促进胃癌
发展及耐药，抑制Ｒａｐｌ将为胃癌治疗提供新的靶点。
４参考文献
１ Ｋａｎｇ Ｃ，Ｘｕ Ｑ，Ｍａｒｔｉｎ ＴＤ，ｅｌ ａ１． ｆｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｉｌ＇．４￣＂ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｎ—
通过ＳＡＳＰ相关因子促进免疫清除 ；另一方面，证据
证实：ＴＩＳ诱发局部和全身性炎症，促进化疗药物引起
的短期和Ｋ期副作用，包括骨髓抑制、心脏损伤、肿瘤
复发、衰竭等 ”：此外，ＴＩＳ促进肿瘤耐药，通过诱导
·
ｌ９１６·
中国老年学杂志２０１８年４月第３８卷
ｌｆａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｏｆ ＧＡＴＡ４［Ｊ］
．
ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｌａｐｓｅ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ，
２０１７；７（２）：１６５－７６．
１１
Ｔａｔｏ·Ｃ０ｓｔａ Ｊ，Ｃａｓｉｍｉｏ Ｓ，Ｐａｃｈｅｃｏ Ｔ，ｒｅｔ ａ１．Ｔｈｅｒａｐｙ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅ－
ｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ··ｔｏ··ｍｅｓｃｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ－
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５；３４９（６２５）：ａ５６１２．
２ Ｏｂｅｎａｕｆ ＡＣ，Ｚｏｕ Ｙ，Ｊｉ ＡＬ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅｒａｐｙ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｕｒ ｓｅｃｒｅｔｏｍｅｓ
ｐｒｏｍｏｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１５；５２０
（７５４７）：３６８－７２．
３ Ｌａｎｇｅ ＴＤ．Ｓｈｅｌｔｅｒｉｎ：ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｈａｔ ｓｈａｐｅｓ ａｎｄ ｓａｆｅｇｕａｒｄｓ ｈｕ－
ｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｒｅｃｔｌａ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ，２０１６；１５
（２）：１７０．
Ｔｅｏ Ｈ，Ｇｈｏｓｈ Ｓ，Ｌｕｅｓｅｈ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ·ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｒａｐｌ ｉｓ ａｌｌ ＩＫＫ
ｍａｌｌ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００５；１９（１８）：２１００—１０．
４ Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｐ，Ｂｌａｓｃｏ ＭＡ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｈｅｈｅｒｉｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ａｇｉｎｇ［Ｊ］．Ａｇｉｎｇ
Ｃｅｌｌ，２０１０；９（５）：６５３－６６．
５ Ｋａｂｉｒ Ｓ，Ｓｆｅｉｒ Ａ，ｄｅ Ｌａｎｇｅ Ｔａｋｉｎｇ ａｐａｒｔ Ｒａｐｌ Ｉ ａｎ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ
ａｄａｐｔｏｒ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔ
Ｃｅｌｌ Ｂｉ０１，２０１０；１２（８）：７５８－６７．
Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｃｈｉｕ Ｓ，Ｌｉａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｌ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ—ｋａｐｐａＢ
ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ａｎｄ ｎｏｎ－ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，２０１０；９（２０）：
４０６１．７．
（ＮＦ—ＫＢ）ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅａｒｔ ｒｅｐａｉｒ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ￣Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓｃｏｖ，２０１５；
１：１５００７．
１４ Ｌｉｕ Ｈ，Ｙｅｕｎｇ ＯＷ，Ｌｉ ＣＸ，ｅｔ ａ１．ＮＬＲＰ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ
６ Ｐｌａｔｔ ＪＭ，Ｒｙｖｋｉｎ Ｐ，Ｗａｎａｔ ＪＪ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｌ ｒｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｉｒｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ
ｅｈｒｏｍａｔｉｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎｄ ｐａｃｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ，Ｄｅｖ，２０１３；２７（１２）：１４０６－２０．
７ Ｓｗａｎｓｏｎ ＭＪ，Ｂａｒｉｂａｕｌｔ ＭＥ，Ｉｓｒａｅｌ ＪＮ，ｅｔ ａ１．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＡＰ１ ｌｅｖｅｌｓ
Ｇｒａｆｔ Ｉｎｊｕｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｅ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＡＰ１／ＫＣ ａｘｉｓ
［Ｊ］．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２０１７；２４２（３）：２８４－９６
Ｃａｉ Ｙ，Ｓｕｋｈｏｖａ ＧＫ，Ｗｏｎｇ ＨＫ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｌ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｉｎ ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＮＦＫＢ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ
ａｒｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｐ，
２０１６；５（２）：１８１－７．
８ Ｌｉ Ｘ，Ｌｉｕ Ｗ，Ｗａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｌ ｉｓ ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ＴＲＦ２ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，２０１５；１４
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ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ［Ｊ］．
Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０１５；４（３）：ｅ１４４．
９ Ｃｏｐｐｅ ＪＰ，Ｄｅｓｐｒｅｚ ＰＹ，Ｋｒｔｏｌｉｅａ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ
赵丹，王进，宁寒冰，等．胞质Ｒａｐ１与胞核ＮＦ—ＫＢ ｐ６５在胃癌
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组织中的表达及相关性［Ｊ］．中国老年学杂志，２０１６；３６（１）：３５０－２．
ｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：ｔｈｅ ｄａｒｋ ｓｉｄｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ，
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１０ Ｄｅｍａｒｉａ Ｍ，Ｏ ＭＮ，Ｃｈａｎｇ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｃｅｌｌｕｌｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒａｏｍｏｔｅｓ
（编辑王一涵）
中风回语颗粒对脑缺血再灌注损伤小鼠的影响及机制
俞￣－ＪＡＬ韩冬李娜李晓华石晓征阚 默修凡懿王健
（长春中医药大学，吉林
［摘要］ 目的
长春１３０１１７）
观察中风回语颗粒对脑缺血再灌注损伤小鼠的影响并探讨其作用机制。方法 １２０只小鼠随机分为假手
术组、模型组、中风回语颗粒低剂量组（１．２ ｇ／ｋｇ）、中风回语颗粒中剂量组（２．４ ｇ／ｋｇ）、中风回语颗粒高剂量组（４．８ ｇ／ｋｇ）及盐酸美
金刚组（３ ｍｅ，／ｋｇ），每组２０只，各组均连续给药７ ｄ。末次给药３０ ｍｉｎ后，除假手术组，其余各组小鼠均制备脑缺血再灌注损伤模
型，假手术组只进行手术，不实施缺血再灌注损伤。各组小鼠进行神经行为学评分，并且测定脑组织超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、谷胱
甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ—Ｐｘ）、一氧化氮（ＮＯ）合酶（ＮＯＳ）、Ｔ—ＡＴＰａｓｅ、Ｎａ Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ“．Ｍ ＋－ＡＴＰａｓｅ的活性和丙二醛（ＭＤＡ）、ＮＯ
的含量。结果与模型组比较，中风回语颗粒中、高剂量组可以显著降低小鼠神经功能评分、降低脑组织ＭＤＡ、ＮＯ含量及ＮＯＳ活
性，升高ＳＯＤ、ＧＳＨ—Ｐｘ、Ｔ－ＡＴＰａｓｅ、Ｎａ －Ｋ￣－ＡＴＰａｓｅ及ｃａ“－Ｍ －ＡＴＰａｓｅ活性（均Ｐ＜０．０５）。结论中风回语颗粒对缺血再灌注引起
的小鼠脑组织损伤具有保护作用，其机制可能与提高脑组织抗氧化活性及改善能量耗竭状态有关。
［关键词］ 中风回语颗粒；缺血再灌注损伤；抗氧化
［中图分类号］Ｒ２Ｂ５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００５－９２０２（２０１８）０８．１９１６－０３；ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－９２０２．２０１８．０８．０５２
脑血管疾病为临床常见病，以缺血性脑血管病最
为普遍，在治疗过程中首先应该恢复缺血区的血流供
基金项目：科技部重大新药创制（２Ｏ１０ｚｘｏ９ｌ０２－２０５）；吉林省“大学生创
新创业训练计划”（２０１７１０１９９１ １６）；吉林省卫生计生青年科
技骨干培养计划项目（２０１６Ｑ０５０）；吉林省中医药科技项目
（２０１７００２）；长春中医药大学“百青计划”（２０１７）
１长春中医药大学附属医院
应，但是，同时又会造成脑缺血再灌注损伤¨ｌ２Ｊ。中风
回语颗粒是临床经验方，作为院内制剂应用多年，由石
昌蒲、郁金、黄连、冰片、川芍等１０味中药组成，具有化
痰宣窍，清热化癖，透脑清神等功效，用于缺血性脑卒
中的治疗 Ｊ。本研究观察中风回语颗粒对缺血再灌
注引起脑组织损伤的影响及机制。
１材料与方法
１．１动物成年昆明种小鼠，雄性，体重２２～２６ ｇ，清
通信作者：王健（１９７０－），男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事
脑病学研究。
第一作者：俞之胤（１９８２．），男，助教，主要从事脑病学研究。
洁级，由吉林大学实验动物中心提供，合格证号ＳＣＸＫ—
2024年5月19日发(作者：蓬长运)
中国老年学杂志２０１８年４月第３８卷
端粒结合蛋白Ｒａｐｌ促进化疗药物诱导的胃癌细胞衰老相关分泌表型
姚婷婷王静云 陆文全 吕 帅 李 昕 宁寒冰
（郑州大学第一附属医院消化内科，河南 郑州４５００５２）
［摘要］ 目的探讨端粒结合蛋白Ｒａｐｌ在化疗药物诱导的胃癌细胞衰老相关分泌表型（ＳＡＳＰ）中的作用。方法低剂量
依托泊苷（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，５ ｔｘｍｏｌ／Ｌ）处理胃癌ＳＧＣ７９０１细胞（试验组），观察细胞衰老，ＳＡＳＰ相关因子的表达和分泌水平及Ｒａｐ１表达情
况。利用ｓｉＲＮＡ抑制ＳＧＣ７９０１细胞Ｒａｐ１表达（ＳＧＣ７９０１．Ｒａｐｌ ＫＤ），阴性对照采用ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＳＧＣ７９０１－ＮＣ），检测Ｒａｐ１
表达下降对ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ诱导的ＳＧＣ７９０１细胞衰老及ＳＡＳＰ的影响。结果试验组第３天ＳＧＣ７９０１细胞停止生长；与对照组比较，第５
天试验组Ｂ．半乳糖苷酶（ＳＡ．Ｂ．Ｇａ１）染色显著增加，ｐ５３和ｐｌ６ 蛋白表达明显升高，ＳＡＳＰ相关因子白细胞介素（ＩＬ）一１Ａ、ＩＬ－６、ＩＬ－
８、血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）。Ａ和干扰素（ＩＦＮ）． 在ＳＧＣ７９０１细胞和条件培养液中表达明显升高（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．００１），证实低剂
量ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ成功诱导ＳＧＣ７９０１细胞衰老及ＳＡＳＰ；同时Ｒａｐｌ表达也明显升高，Ｒａｐｌ表达升高出现在ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ处理后早期（第１
天），早于ＳＡＳＰ相关因子的出现，并在衰老细胞持续存在。Ｒａｐｌ ｓｉＲＮＡ下调ＳＧＣ７９０１细胞Ｒａｐｌ的表达对ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ诱导的细胞衰
老没有影响；但ＳＧＣ７９０１．Ｒａｐｌ ＫＤ细胞和条件培养液中ＳＡＳＰ相关因子表达明显下降且延迟，ＳＧＣ７９０１一Ｎｃ细胞ＳＡＳＰ相关因子表
达出现在第５或７天，ＳＧＣ７９０１．Ｒａｐｌ ＫＤ细胞出现在第９天。结论在低剂量化疗药物诱导的胃癌细胞衰老过程中伴随Ｒａｐｌ表达
升高，Ｒａｐｌ促进ＳＡＳＰ相关因子的表达。
［关键词］端粒结合蛋白；Ｒａｐ１；化疗；细胞衰老；衰老相关分泌表型；胃癌
［中图分类号］Ｒ７３５．２ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００５－９２０２（２０１８）０８－１９１２－０５；ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－９２０２．２０１８．０８．０５１
衰老细胞分泌炎症细胞因子、趋化因子、生长因子
１材料和方法
和蛋白酶等，称为细胞衰老相关分泌表型（ＳＡＳＰ）¨Ｊ。 １．１细胞和试剂人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１来源于第
治疗（包括化疗、放疗等）诱导的肿瘤细胞ＳＡＳＰ（ＴＩＳ）
四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验
促进肿瘤发展、转移、复发、耐药及化疗药物引起的短 室。细胞生长于含１０％灭活小牛血清的ＲＰＭＩ １６４０
期和长期副作用 ］。端粒是位于染色体末端的ＤＮＡ．
培养基中，于３７￣Ｃ、５％ＣＯ 条件下常规培养。ｅｔｏｐｏ—
蛋白结构，由３￣ＦＡＧＧＧ重复序列和大量的端粒结合蛋 ｓｉｄｅ购自Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ。抗体：抗Ｒａｐｌ（Ａｂｃａｍ，
白组成。６个端粒结合蛋白ＴＲＦ１、ＴＲＦ２、Ｒａｐｌ、ＰＯＴ１、
ａｂｌ４４０４），抗ｐｌ６“ （Ａｂｅａｍ，ａｂ１６１２３），抗ｐ５３（Ｃｅｌｌ
ＴＩＮ２和ＴＰＰ１组成Ｓｈｅｌｔｅｒｉｎ复合体 。研究证明端粒 Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，９２８２），抗白细胞介素（ＩＬ）－１Ａ（Ａｂｃａｍ，
结合蛋白在肿瘤的发生发展中起重要作用 。Ｒａｐｌ
ａｂ９６１４），抗ＩＬ－６（Ａｂｃａｍ，ａｂ９３２４），抗ＩＬ－８（Ａｂｃａｍ，
是Ｓｈｅｌｔｅｒｉｎ复合体中一个特殊的因子，研究显示哺乳 ａｂ７７４７），抗血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）一Ａ（Ａｂｃａｍ，
动物Ｒａｐｌ至少拥有３种独特的功能：端粒功能；转录
ａｂ５１７４５），抗干扰素（ＩＦＮ）一＿ｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ，３Ｆ１Ｅ３），
调控；在胞质抑制核转录因子（ＮＦ）．ＫＢ信号通路 Ｊ。
抗 一ｔｕｂｕｌｉｎ（Ａｂｃａｍ，ａｂｌ１３１６）。
在酿酒酵母衰老过程中，Ｒａｐｌ离开端粒并重新定位于
１．２诱导细胞衰老１×１０ 个细胞接种于直径１０ ｃｍ
数百个新靶基因的上游启动子区域，促进衰老相关基
的培养皿，３７ｃＩ＝培养过夜；将培养液更换为低血清２％
因表达，推动衰老进程 ；在皮肤成纤维细胞衰老和
ＦＢＳ，分别加入空白培养液（对照组）和５ ｉｘｍｏｌ／Ｌ ｅｔｏ—
氧化应激时，Ｒａｐｌ水平下降 ］。研究显示：依托泊苷
ｐｏｓｉｄｅ（试验组），处理１、５、７、９ ｄ，每３ ｄ更换含有ｖｅ—
（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）或阿霉素（ＡＤＲ）诱导胃癌细胞Ｒａｐ１表达
ｈｉｃｌｅ或５ ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ的新鲜培养液。收集条件
增高，药物诱导的Ｒａｐｌ表达升高通过参与ＤＮＡ损伤
培养液时，更换为新鲜不含药物培养液继续培养２４ ｈ。
修复，促进胃癌细胞多药耐药 ｊ。本研究探讨端粒结
１．３ ３－半乳糖苷酶（ＳＡ—ｐ—Ｇａ１）染色根据衰老细胞
合蛋白Ｒａｐｌ在化疗药物诱导的胃癌ＳＡＳＰ中的作用。
组织化学染色试剂盒（Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ）说明书进行ＳＡ—
ｐ—Ｇａｌ染色，显微镜下观察细胞ＳＡ—ｐ—Ｇａｌ染色。
１．４ ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ检测 细胞生长曲线采用Ａｌａｍａｒ－
基金项目：国家自然科学基金（Ｕ１３０４８１４）；郑州市肿瘤生物学院士工作
Ｂｌｕｅ分析（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。细胞按照１×１０ ／孔接
站（１４２ＰＹＳＧＺ６８８）
种于９６孔板，３７℃培养过夜。ｖｅｈｉｃｌｅ或５ Ｉ￣ｍｏｌＺＬ ｅｔｏ—
ｌ 郑州大学第二附属医院神经内科
ｐｏｓｉｄｅ处理后，加入ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ试剂，３７℃继续培养
通信作者：宁寒冰（１９７６一），女，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，
２ ｈ，检测５７０ ｎｍ吸光值（Ａ），实验重复３次，细胞活
主要从事消化道肿瘤研究。
力＝（实验组Ａ值一空白对照组Ａ值）／（阴性对照组Ａ
第一作者：姚婷婷（１９８９一），女，在读硕士，主要从事消化道肿瘤研究。
值一空白对照组Ａ值）×１００％。
蛙笠缝熊结盒 臼旦业 选 也＿疗 透 盥 区塑 ．量熊 塑盂型…望
９ｌ３
１．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测 裂解细胞提取总蛋白，．卜二
及ｐ１６ “ 蛋白表达升高， 图ｌ、 ２。与对照组比
较，试验组第１、５、７、９ ｄ ＲａｐＩ ｍＲＮＡ显著升高（Ｐ＜
０．００１），第５、７、９天ＳＡＳＰ卡Ｈ关因子（ＩＬ １Ａ、１１ 一６、ＩＩ 一
８、ＶＥＧＩ￣、Ａ、ＩＦＮ一 ＩＴｌＲＮＡ均 著升高（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜
烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—Ｉ ＡｃＦ）分离蛋
白，应用电转移将电泳分离后的蛋白转移至硝酸纤维
一
素滤膜上，滤膜经５％脱脂奶粉 ｊ二室温封闭后，依次与
抗及辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的二抗孵育，以电
０．００１）。与对照组比较，试验组细胞条件培养液中第
５、７、９天ｌＬ—ｌ Ａ、ｌＩ 、Ｉ１ 一８ ｍＲＮＡ均显著升高（Ｐ＜
０．０５，Ｐ＜Ｏ．Ｏ０１），第７、９犬ＶＥＧＦ—Ａ、ＩＦＮ一 ｍＲＮＡ均
显著升高（Ｐ＜Ｏ。０５）。见表３、表４
对照组 试验组
化学发光法（ＥＣＩ ）显色
１．６ ＲＴ—ＰＣＲ ＲＮｅａｓ）试剂盒（Ｑｉａｇｅｎ）提取细胞总
ＲＮＡ，逆转录试剂盒（Ｒｏｃｈｅ）台成ｅＤＮＡ，ＲＴ—ｌ ＣＲ采用
Ｒｏｃｈｅ公司ＬｉｇｈｔＣｙ（’ｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｌｍ ＳＹＢＲ
ＧＩ ｎ Ｉ Ｓｙｓｔｅｍ，将ＧＡＰＤＩ｛没为内参。引物见表１
表１ Ｒｅａｌ·ｔｉｍｅ ＰＣＲ引物列表
基因
Ｒａｔ）１
１１．一１ｎ
ＩＩ ４３
１１ ｛
Ｎ一
七游５ ３
Ｆ游５．ｕ３
ＧＧＧＴＧ（ ＡＴ【：ＡＴＣＡ＿ｒＣＡＣＡＣＡＴＡＧ Ｆ
ＧＣＣＡＣＣＣＧＧ（ Ａ【 几 ｒＧＡ
ＡＴＣＡＣＴＡＣＣｌｒＣ ～ＣＣＧ（ ｌｒＧＣ ｒ ＿ｒＧＣＧＴＡＴＣ ｌ ＣＡ（ ＣＣＡ Ｉ℃ＴＣＣ
ＡＴＧＣＡＡ＿ｒＡ１、【：ＣＡＣＣＣ【 ＴＧＡＣ ＧＡＧＧｑ’Ｇ（：ｔ ＣＡＴＧＣＴＡＣＡ ｒ门’
ｒＩ、ＧＧｔ：ＣＴ ＡＡ Ｉ’Ｉ Ｉ’ｒＣＣＴＡ
ＡＧＣＧ Ｉ 、Ｇ（：（：Ａ（ ＡＴＧＣＡＡ ｒＡＣ
ＣＣ
＿ｒＣＣＣＡＴＧ（：（： Ｕｌ、（ ＴＧＴ（；１Ｔｌ’ｒＡ
ＡＡＧＣＡＣ【：ＡＧｔ ＣＡＴＧＡＡＡｒｒＣ＿ｒ
ＶＥＧＦ－Ａ ＣＣＡＣＧＧｔ：（：＿ｒ（，ＧＡＧ ＦＧ ＦＧＴ
ｔ ＧＣＡＴＡＡ ｌｌＣ ｌ’ＧＣＡＴＧＧＴＧＡＴ（
（ ＡＰＤＩ１
（ Ａ【 ＴＣＡＡＣ（；（；ＡＴ ｌｖＩ” （ ＴＣ【 ．ｒ １Ｔｒ‘ ＡＴ 几 ｌ、（；（ Ａ（：ＣＧＡＴＣ ＦＣＧ
图１ 两组ＳＧＣ７９０１细胞第５天ＳＡ－３－Ｇａｌ染色（ｘ４００）
１．７酶联免疫吸附法（Ｅ１ ＩＳＡ）检测 收集不同细胞
对照纽 试验组
ｐ５３
条件培养液，根据Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ试剂合
（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）说明 检测Ｉ１ ～１Ａ、ＩＩ 一６、Ｉ１ 一８、ＶＥＧｌ￣’、
ＩＦＮ一 表达，结果表示为与阴性对照组检测值的比值。
１．８转染前期实验构建的Ｒａｐｌ ｓｉＲＮＡ和阴性对照
ｓｉＲＮＡ载体 采用１Ａｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ…２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）分
别瞬时转染ＳＧＣ７９０ｌ细胞（分别命名为ＳＧＣ７９０１一
ＲａｐＩ ＫＤ和ＳＧＣ７９０１一ＮＣ），ＳＧＣ７９０１ Ｒａｐｌ ＫＤ分别用
空白培养液及５ ｐｍｕ）ｌ／Ｉ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ处理１、５、７、９ ｄ（分
别为Ｒａｐｌ ＫＤ对照组及Ｒａｐｌ ＫＤ试验组），ＳＧＣ７９０１一
ＮＣ分别用空白培养液及５ ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ处理１、
５、７、９ ｄ（分别为ＮＣ对照组及ＮＣ试验组）。４组检测
指标及方法同对照组及实验组。
１．９统计学方法
２ 结 果
图２两组培养第５天ｐ５３及ＰＩ６ “ 表达
对照组 试验组
０ １ ５ ７ ９ ０ １ ５ ７ ９ （ｄ）
ＲａｐＩ
ＩＬ—ｌＡ
ＩＬ一６
ＩＬ一８
ＶＥＧＦ—Ａ
ＩＦＮ—Ｙ
Ｔ—ｔｕｂｕｌｉｎ
使用ＳＰＳＳ２１．０软件进行ｔ检验。
２．１两组细胞增殖情况及Ｒａｐｌ、ＳＡＳＰ卡甘关因子表达
比较试验组第３天后细胞停止生长，见表２。与对
照组比较，试验组第５天细胞ＳＡ一 Ｇａｌ染色增加，ｐ５３
图３两组Ｒａｐｌ和ＳＡＳＰ相关因子蛋白表达
表２两组ＳＧＣ７９０１细胞增殖情况比较（ｘ：ｅ．ｓ，细胞相对密度，Ｈ＝３）
组别
对照组
第０天
１．ｏ（）±（）．７４
１．【ＭＪ±０ Ｏ５
第１天
ｌ ｌ４±Ｏ．Ｏ３
１．８９±Ｏ．Ｏ８
第２天
１．９３±０．２０
１．４７士（）ｌ１
第３天
３．５ｌ土Ｏ．２４
１ ６０￣０．１０Ｉ）
第４天
５．３３±０．２２
．
第５火
６ ２５±０ ｌ９
１．６０±０ ２０
第６人
６．８０＿＋０．２６
Ｉ ４９±ｔＩ １３
第７天
６．８０±０ ０８
５２ｉｌＩ１．２３Ｉ】
试验组
６０±０ ０９
与对照组比较：１）Ｐ＜Ｏ．０５
ｌ９Ｉ４·
目老年学杂志２０Ｉ８年４门第３８卷
表３两组Ｒａｐｌ和ＳＡＳＰ相关因子ｍＲＮＡ表达比较（ ＋ｊ，，ｌ＝３）
与对照组比较：１）Ｐ＜０．０５，２）Ｐ＜０．００１；下表同
表４两组细胞条件培养液中ＳＡＳＰ相关因子表达比较（ ＋ｊ，，ｌ＝３）
２．２ ４组细胞增殖情况及Ｒａｐｌ ｍＲＮＡ、ｐ５３、ｐ１６州
表达比较ＲａｐＩ ＫＤ对照组、Ｒａｐｌ ＫＤ试验组、ＮＣ对
ＮＣ试验组比较，Ｒａｐｌ ＫＤ试验组细胞条件培养液中第
５、７、９天ＩＬ一１ Ａ、ＩＬ一６、ＩＬ一８ ＶＥＧＦ—Ａ、ＩＦＮ一 ｍＲＮＡ均显
照组及ＮＣ试验组Ｒａｐｌ ｍＲＮＡ表达相对密度分别为
０．４３±０．０４、０．６４±０．０５、１．１７±０．０２、４．１３±０．１９，Ｒａｐｌ
著升高（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．００１）。见图７、表６。
ＲａｐＩ ＫＤ对照组 Ｒａｐｌ ＫＤ试验纽
ＫＤ对照组与ＮＣ对照组、Ｒａｐｌ ＫＤ试验组与ＮＣ试验
组比较Ｒａｐｌ ｍＲＮＡ表达相对密度均显著降低（Ｐ＜
０．０５），见图４。Ｒａｐｌ ＫＤ试验组及ＮＣ试验组第３天
后细胞均停止生长，见表５。ＮＣ试验组与ＮＣ对照组
比较、Ｒａｐｌ ＫＤ试验组与Ｒａｐｌ ＫＤ对照组比较，第５
天细胞ＳＡ．Ｂ．Ｇａｌ染色增加，ｐ５３及ｐ１６Ⅲ 蛋白表达显
著升高，见图５、图６。
ＲａｐＩ
ＮＣ对照组 ＮＣ试验组
＂ｔ－ｔｕｂｕｌｉｎ
１：Ｒａｐｌ ＫＤ对照组，２：Ｒａｐｌ ＫＤ试验组，３：ＮＣ对照组，４：ＮＣ试验组
图４ ４组Ｒａｐｌ蛋白表达
２．３ Ｒａｐｌ敲除抑制ＳＡＳＰ表达与ＮＣ试验组比较，
Ｒａｐｌ ＫＤ试验组第５天ＩＬ一１ Ａ、ＩＬ一６、ＩＬ一８、ＶＥＧＦ—Ａ、
ＩＦＮ一＾ｙ ｍＲＮＡ均显著降低（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．００１）。与
图５ ４组细胞第５天ＳＡ· Ｇａｌ染色（ｘ４００）
表５ ４组细胞增殖情况比较（ｉ ，细胞相对密度。ｎ＝３ Ｊ
表６ ＮＣ试验组及Ｒａｐｌ ＫＤ试验组细胞条件培养液中ＳＡＳＰ相关因子表达比较（ｉ＋ｊ。ｎ＝３】
ｐ５３
上皮一间质转化（ＥＭＴ）和增加肿瘤细胞侵袭力促进肿
瘤转移…］。
Ｒａｐｌ是具有多种端粒和端粒外功能的调控蛋白，
与衰老和肿瘤发展密切相关。在乳腺癌和肝癌中发现
ＲａｐＩ表达升高，抑制细胞凋亡，增加肿瘤侵袭性 。
Ｒａｐｌ结合于染色体的某些非端粒位点，调节细胞黏附
因子、肿瘤及代谢等相关基因转录。Ｒａｐｌ通过转录调
控和ＮＦ．ＫＢ信号通路调节炎性因子表达，抑制Ｒａｐｌ
降低间充质干细胞肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）一 、ＩＬ一６和单
核细胞趋化蛋白一１的分泌，提高细胞存活及在心肌梗
ｐ１６ “
Ｔ—ｔｕｂｕｌｉｎ
１ ２ ３ ４
Ｒａｐｌ ＫＩ）对照组．２：ＩｌａＩ ｌ ＫＤ试验Ⅲ，３：ＮＣ刈照绀，４：ＮＣ试验组
图６ ４组ｐ５６、ｐ１６ 蛋白表达
ＲａｐＩ ＫＤ试验 ＮＣ试验组
０ ｌ ５ ７ ９ （ｄ）
Ｒａｐ１
ＩＬ ｌＡ
ＩＬ．６
ＩＬ培
ＶＥＧＦ—Ａ
ＩＦＮ—Ｔ
死中的治疗效果；Ｒａｐｌ促进ＮＬＲＰ３炎性小体，导致移
植肝脏损伤 １３）；Ｒａｐｌ促进巨噬细胞分泌炎性因子，促
进动脉粥样硬化发展¨ 。研究显示，胞质Ｒａｐ１和胞
核ＮＦ—ＫＢ ｐ６５在胃癌组织中的表达呈显著正相关，可
能与ＮＦ．ＫＢ信号转导通路共同参与胃癌的发生发展
有关¨ ；Ｒａｐｌ调控ＴＲＦ２在化疗药物诱导的ＤＮＡ损
Ｔ－ｔｕｂｕｌｉｎ
伤修复中的作用，参与胃癌耐药的发生 。而ＤＮＡ损
伤反应和ＮＦ．ＫＢ信号通路都是ＳＡＳＰ调控因子 ，本
研究进一步证实，Ｒａｐｌ调控化疗药物诱导的胃癌细胞
ＳＡＳＰ。在低剂量ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ诱导的胃癌细胞衰老过程
中伴随Ｒａｐｌ表达升高，Ｒａｐｌ表达升高出现于ｅｔｏｐｏ—
ｓｉｄｅ处理的早期阶段，并在衰老细胞中持续存在；Ｒａｐｌ
图７ Ｒａｐｌ ＫＤ试验组及ＮＣ试验组Ｒａｐｌ和
ＳＡＳＰ相关因子蛋白表达
３讨论
ＴＩＳ在肿瘤治疗中发挥着复杂的“双刃剑”式作
片ｊ，一方面细胞处于生长停滞状态，抑制细胞增殖，并
敲除不影响ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ诱导的细胞衰老，但抑制并延迟
ＳＡＳＰ表达。因此，Ｒａｐｌ可能通过调控ＴＩＳ促进胃癌
发展及耐药，抑制Ｒａｐｌ将为胃癌治疗提供新的靶点。
４参考文献
１ Ｋａｎｇ Ｃ，Ｘｕ Ｑ，Ｍａｒｔｉｎ ＴＤ，ｅｌ ａ１． ｆｈｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｉｌ＇．４￣＂ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｎ—
通过ＳＡＳＰ相关因子促进免疫清除 ；另一方面，证据
证实：ＴＩＳ诱发局部和全身性炎症，促进化疗药物引起
的短期和Ｋ期副作用，包括骨髓抑制、心脏损伤、肿瘤
复发、衰竭等 ”：此外，ＴＩＳ促进肿瘤耐药，通过诱导
·
ｌ９１６·
中国老年学杂志２０１８年４月第３８卷
ｌｆａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｏｆ ＧＡＴＡ４［Ｊ］
．
ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｌａｐｓｅ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ，
２０１７；７（２）：１６５－７６．
１１
Ｔａｔｏ·Ｃ０ｓｔａ Ｊ，Ｃａｓｉｍｉｏ Ｓ，Ｐａｃｈｅｃｏ Ｔ，ｒｅｔ ａ１．Ｔｈｅｒａｐｙ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅ－
ｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ··ｔｏ··ｍｅｓｃｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ－
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（编辑王一涵）
中风回语颗粒对脑缺血再灌注损伤小鼠的影响及机制
俞￣－ＪＡＬ韩冬李娜李晓华石晓征阚 默修凡懿王健
（长春中医药大学，吉林
［摘要］ 目的
长春１３０１１７）
观察中风回语颗粒对脑缺血再灌注损伤小鼠的影响并探讨其作用机制。方法 １２０只小鼠随机分为假手
术组、模型组、中风回语颗粒低剂量组（１．２ ｇ／ｋｇ）、中风回语颗粒中剂量组（２．４ ｇ／ｋｇ）、中风回语颗粒高剂量组（４．８ ｇ／ｋｇ）及盐酸美
金刚组（３ ｍｅ，／ｋｇ），每组２０只，各组均连续给药７ ｄ。末次给药３０ ｍｉｎ后，除假手术组，其余各组小鼠均制备脑缺血再灌注损伤模
型，假手术组只进行手术，不实施缺血再灌注损伤。各组小鼠进行神经行为学评分，并且测定脑组织超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、谷胱
甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ—Ｐｘ）、一氧化氮（ＮＯ）合酶（ＮＯＳ）、Ｔ—ＡＴＰａｓｅ、Ｎａ Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ“．Ｍ ＋－ＡＴＰａｓｅ的活性和丙二醛（ＭＤＡ）、ＮＯ
的含量。结果与模型组比较，中风回语颗粒中、高剂量组可以显著降低小鼠神经功能评分、降低脑组织ＭＤＡ、ＮＯ含量及ＮＯＳ活
性，升高ＳＯＤ、ＧＳＨ—Ｐｘ、Ｔ－ＡＴＰａｓｅ、Ｎａ －Ｋ￣－ＡＴＰａｓｅ及ｃａ“－Ｍ －ＡＴＰａｓｅ活性（均Ｐ＜０．０５）。结论中风回语颗粒对缺血再灌注引起
的小鼠脑组织损伤具有保护作用，其机制可能与提高脑组织抗氧化活性及改善能量耗竭状态有关。
［关键词］ 中风回语颗粒；缺血再灌注损伤；抗氧化
［中图分类号］Ｒ２Ｂ５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００５－９２０２（２０１８）０８．１９１６－０３；ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－９２０２．２０１８．０８．０５２
脑血管疾病为临床常见病，以缺血性脑血管病最
为普遍，在治疗过程中首先应该恢复缺血区的血流供
基金项目：科技部重大新药创制（２Ｏ１０ｚｘｏ９ｌ０２－２０５）；吉林省“大学生创
新创业训练计划”（２０１７１０１９９１ １６）；吉林省卫生计生青年科
技骨干培养计划项目（２０１６Ｑ０５０）；吉林省中医药科技项目
（２０１７００２）；长春中医药大学“百青计划”（２０１７）
１长春中医药大学附属医院
应，但是，同时又会造成脑缺血再灌注损伤¨ｌ２Ｊ。中风
回语颗粒是临床经验方，作为院内制剂应用多年，由石
昌蒲、郁金、黄连、冰片、川芍等１０味中药组成，具有化
痰宣窍，清热化癖，透脑清神等功效，用于缺血性脑卒
中的治疗 Ｊ。本研究观察中风回语颗粒对缺血再灌
注引起脑组织损伤的影响及机制。
１材料与方法
１．１动物成年昆明种小鼠，雄性，体重２２～２６ ｇ，清
通信作者：王健（１９７０－），男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事
脑病学研究。
第一作者：俞之胤（１９８２．），男，助教，主要从事脑病学研究。
洁级，由吉林大学实验动物中心提供，合格证号ＳＣＸＫ—