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布鲁菌Irr蛋白的生物信息学分析、表达纯化以及ELISA方法的初步建立_百

IT圈 admin 2024-05-20 52浏览 0评论

2024年5月20日发(作者：佘子爱)

中国动物传染病学报

2023,31(4):57-66Chinese Journal of Animal Infectious Diseases

·研究论文·

布鲁菌Irr蛋白的生物信息学分析、表达纯化以及

ELISA方法的初步建立

孙天浩

，张倩

2,3

，曹旭东

，李楠

，程科建

，张江伟

，王震

1,2

，陈创夫

1,2

（1.石河子大学动物科技学院，石河子832000；2.西部地区高发人兽共患传染性疾病防治协同创新中心，

石河子832000；3.新疆农垦科学院，石河子832000）

摘要：

为建立一种检测布鲁菌抗体的间接ELISA检测方法，本研究对Irr蛋白进行生物信息学分析、原核表达，用纯化的重组蛋

白Irr作为包被抗原，建立了一种检测布鲁菌抗体的间接 ELISA方法。结果显示，重组蛋白Irr包被量为0.25

g，5％脱脂奶粉封

闭2 h，一抗稀释浓度1∶500孵育2 h，二抗稀释浓度1∶5000孵育2 h，显色15 min时建立的间接ELISA方法条件最优，该方法的

450

临界值为0.55，与凝集实验的符合率达到96.7%，同时具有较好的特异性和重复性。以上结果表明，本研究基于Irr蛋白建

立了操作简单、特异性高、重复性好的血清学间接ELISA检测方法，为布鲁菌病的诊断和流行病学调查提供了技术支持。

关键词：

布鲁菌；Irr蛋白；原核表达；生物信息学；间接ELISA方法

中图分类号：

S852.61

文献标志码：

文章编号：

1674-6422（2023）04-0057-10

Bioinformatics Analysis, Expression and Puriﬁ cation of

Brucella

Irr Protein and

Preliminary Establishment of ELISA Method

SUN Tianhao

, ZHANG Qian

2,3

, CAO Xudong

, LI Nan

, CHENG Kejian

, ZHANG Jiangwei

WANG Zhen

1,2

, CHEN Chuangfu

1,2

(1. College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Xinjiang 832000, China; 2. Co-Innovation Center for Zoonotic Infectious

Diseases in the western region, Shihezi University, Xinjiang 832000, China; 3. Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science,

Xinjiang 832000, China)

Abstract: In order to establish an indirect ELISA method for detecting Brucella antibodies, this study performed bioinformatics analysis

and prokaryotic expression of Irr protein, and used purified recombinant protein Irr as the coating antigen to establish a method for

detecting Brucella Indirect ELISA method for antibodies. The results showed that the coating quantity of recombinant protein Irr was

0.25 μg, 5% skimmed milk powder was blocked for 2 h, the primary antibody dilution concentration was 1:500 and incubated for 2 h,

the secondary antibody dilution concentration was 1:5000 and incubated for 2 h, and the color development was 15 min. Optimally, the

critical value of this method is

450

0.55, and the coincidence rate with the agglutination experiment reaches 96.7%, which also has

good speciﬁ city and repeatability. In summary, this study established a serological indirect ELISA detection method based on Irr protein

with simple operation, high speciﬁ city and good reproducibility, which provided technical support for the diagnosis and epidemiological

investigation of brucellosis.

Key words:

Brucella

; Irr protein; prokaryotic expression; bioinformatics; ELISA

收稿日期：

2021-06-15

基金项目：

国家自然科学基金项目（31760020，U1803236）

作者简介：

孙天浩，男，硕士研究生，主要从事动物传染病诊断与防治研究；张倩，女，助理研究员，硕士，主要从事动物传染

病诊断与防治研究

通信作者：

王震，E-mail：******************.cn；陈创夫，E-mail：**************

中国动物传染病学报

2023年8月

布鲁菌病（Brucellosis），是由胞内生存的布

鲁菌引起的一种严重危害人和家畜健康的人兽共患

传染病，其可以引起人的波浪热，母畜流产以及公

畜睾丸炎等症状，严重阻碍畜牧业的发展和公共卫

生安全

[1]

。铁不仅是宿主生长繁殖不可或缺的基本

元素，也是绝大多数微生物必备的营养元素，影响

并调控多种胞内菌的生存和复制

[2]

。Irr是布鲁菌铁

代谢的重要转录调控因子，前期研究显示，在细胞

中铁浓度很低时，游离的Irr蛋白可以结合到一些与

铁利用相关靶基因上游的ICE BOX抑制它们的表达；

在细胞中铁浓度过高时，Irr蛋白则与血红素结合丧

失DNA结合能力，使铁利用相关基因得以表达

[3]

。

Irr蛋白是如何精确调控铁代谢并影响细菌毒力的这

种机制尚不清楚。因此，本研究通过对布鲁菌Irr蛋

白进行生物信息学分析，对其抗原表位等进行预

测，为其作为候选诊断蛋白提供理论支持，构建布

鲁菌Irr蛋白原核表达载体，检测其免疫原性，以Irr

蛋白作为诊断蛋白初步建立间接ELISA方法，使我

们更深入的了解Irr蛋白，同时为Irr蛋白作为诊断靶

标奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

E. coli

BL21（DE3）表达菌购自北京

全式金生物技术有限公司；pCzn1质粒、TOP10菌株

购自南京钟鼎生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

2×

Taq

Master Mix、限制性内切酶

Nde

Ⅰ和

Xba

Ⅰ、DNA Ligation Kit、DNA marker均

购自北京康为世纪生物科技有限公司；琼脂糖凝胶

DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化

科技（北京）有限公司；IgG-HRP抗体购自北京索

莱宝科技有限公司公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3 Irr蛋白生物信息学分析

根据GenBank上公布的

流产布鲁菌2308菌株

irr

基因（登录号：AY243456）

的信息，下载基因序列及氨基酸序列，通过

TMHMM Server v.2.0软件在线分析Irr蛋白的氨基酸

序列，预测其蛋白跨膜区；应用SignalP4.1 Server

在线分析Irr蛋白的氨基酸序列，预测其信号肽；

通过ProtScale软件对Irr蛋白进行亲疏水性分析；通

过SOPMA在线软件预测Irr蛋白的二级结构；使用

SWISS-MODEL软件对Irr蛋白三级结构分析，建立

了Irr蛋白的3D模型；利用在线软件 ProtParam对Irr

蛋白进行理化性质分析；通过NCBI预测Irr蛋白的保

守结构域；使用IEDB在线软件预测分析Irr蛋白线性

B细胞抗原表位和抗原表位序列以及CD4 T细胞免疫

原性；应用ProAcePred在线软件对Irr蛋白进行乙酰

化位点预测；利用NetPhos 3.1 Server对Irr蛋白进行

磷酸化位点预测；通过NetNGIyc 1.0 Server在线软件

对Irr蛋白进行糖基化修饰位点预测；应用iDNA4mC

对Irr蛋白甲基化修饰位点进行预测，应用Cell-PLoc

2.0对Irr蛋白的亚细胞定位进行预测。

1.4 目的基因合成及验证

将

irr

基因序列送南京钟

鼎生物技术有限公司合成，利用Primer Premier 5.0

软件设计引物，使用公司合成

irr

基因序列为模

板，通过PCR扩增

irr

基因，验证基因大小是否正

确。上游引物：5'-CCATATGATGCATTCTTCACA

TACCCA-3'；下游引物：5'-CTCTAGATCAG

CGGGCCTGACGGCG-3'。所用的限制性内切酶分

别为

Nde

Ⅰ和

Xba

Ⅰ，酶切位点序列分别添加下划线

表示。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限

公司合成。

1.5 表达载体和表达菌株的构建

取验证正确的PCR

产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析并回收目的片

段，将纯化的PCR产物连接pCzn1载体，转入Top10

克隆菌株中，筛选阳性菌落。选取阳性菌落接入含

氨苄抗性的液体LB培养基中，过夜培养。用高纯度

质粒小提试剂盒提取质粒，酶切验证，选取正确的

阳性菌液保菌，送往生工生物工程（上海）股份有

限公司测序。将构建的pCzn1-irr重组质粒转入

E. coli

BL21（DE3）感受态细胞中，涂布于含氨苄抗性的

固体LB培养基中，筛选阳性菌落并进行酶切验证。

1.6 目的蛋白的表达及纯化

选取正确的阳性菌转接

至含氨苄抗性的液体LB中培养至

600

约为0.5，取

出1 mL菌液作为对照，加入IPTG诱导剂，分别取诱

导2、4、6、8 h各 1 mL菌液，进行SDS-PAGE蛋白

检测。将表达正确的蛋白采用镍柱纯化法纯化，获

取目的蛋白。

1.7 Western blot分析检测

将 SDS-PAGE凝胶上的

蛋白样品用湿式转膜仪转印到PVDF膜上，以羊布鲁

菌病阳性血清作为一抗，兔抗羊IgG-HRP为二抗，

第31卷第4期孙天浩等：布鲁菌Irr蛋白的生物信息学分析、表达纯化以及ELISA方法的初步建立

ECL显色液显色。

1.8 间接ELISA方法的初步建立

1.8.1 最适反应条件的确定采用棋盘式方法测定重

组蛋白Irr最佳包被量，一抗、二抗的最佳稀释浓

度、封闭液的选择以及一抗、二抗的孵育时间，确

定重组蛋白Irr作为诊断抗原的最佳条件。

1.8.2 临界值的确定取30份布鲁菌病的阴性血清样

品，依据最佳反应条件进行间接 ELISA 检测，根据

过计算布鲁菌病血清批内批间重复试验的变异系数

判断重复性。

1.8.6 临床样本的检测采用以上建立的间接ELISA方

法对60份羊血清进行临床样品检测，同时通过凝集

实验进行临床样本的检测，测定二者的符合率。

2 结果

2.1 目的蛋白的生物信息学分析

通过TMHMM

Server v.2.0软件在线分析预测Irr蛋白跨膜区，该

蛋白无跨膜螺旋结构（图1A）。应用SignalP4.1

Server在线分析预测其信号肽，该蛋白无信号肽（图

1B）。通过ProtScale软件对Irr蛋白进行亲疏水性分

析，该蛋白为亲水性蛋白（图1C），平均亲水指数

为-0.310，第32位丝氨酸疏水性最强（最高分值为

2.633），第114位组氨酸，亲水性最强（最低分值

为-2.011）。通过SOPMA在线软件预测Irr蛋白的二

级结构，该蛋白有145个氨基酸参与形成

-螺旋，

占32.41%，延伸链占17.24%，有9个氨基酸参与形

成

-折叠，占6.21%，无规卷曲结构占44.14%（图

1D）。

1.0

0.8

0.6

C-score

S-score

Y-score

450

值计算平均值



和标准偏差SD，根据阴阳判定

临界值



+3SD确定该ELISA方法的阴阳性临界值。

1.8.3 特异性试验利用已建立的间接ELISA方法，检

测布鲁菌病阳性血清和绵羊肺腺瘤病、羊梅迪-维斯

纳病、羊巴氏杆菌病的阳性血清样品，评价该方法

的特异性。

1.8.4 敏感性试验将布鲁菌病阳性血清按照1∶50

开始依次梯度稀释，依据最佳反应条件进行间接

ELISA检测，以确定该ELISA方法的敏感性。

1.8.5 稳定性试验取7份已知布鲁菌病抗体阳性羊

血清，1份阴性血清采用同一时间段包被抗原的3

块ELISA板（批间）和不同时间段包被抗原的3块

ELISA板（批次）同时进行试验，测量

450

值，通

1.2

0.8

分

值

0.6

0.4

0.2

20 40 60 80 100 120 140

分

值

位置

0.4

0.2

0.0

0 10 20 30 40 50 60 70

位置

2.5

1.5

0.5

-0.5

-1

-1.5

-2

-2.5

Hphob./Kyte & Doolittle

20 40 60 80 100 120

分

值

20 40 60 80 100 120 140

位置

20 40 60 80 100 120

图1 Irr蛋白跨膜区（A）、信号肽（B）、亲疏水性（C）及二级结构（D）

Fig.1 Irr protein transmembrane region (A), protein signal peptide (B), hydrophilicity and hydrophobicity (C), and

secondary structure (D)

中国动物传染病学报

2023年8月

利用在线软件ProtParam对Irr蛋白进行理化性质

分析，结果表明，Irr蛋白由145个氨基酸组成，包含

18种氨基酸（图2A），分子式为C

709

1118

210

220

，

相对分子质量为16 296.31。Irr蛋白含有负电荷氨基

酸残基数为21个，正电荷氨基酸残基数为12个，该

蛋白的理论等电点为5.48。Irr蛋白在体外哺乳动物

网织红细胞中半衰期为30 h，酵母菌体内>20 h，

大肠杆菌中>10 h，不稳定指数为43.16（高于阈

值40），表明Irr蛋白为不稳定蛋白。使用SWISS-

MODEL软件对Irr蛋白三级结构分析，建立了Irr蛋

白质的3D模型，结果表明通过同源建模得到的Irr蛋

白的3D模型比较合理，其空间结构较为稳定（图

2B）。通过NCBI预测Irr蛋白的保守结构域，该蛋白

属于Fur家族（图2C），是细菌中铁吸收调节家族的

转录因子成员，对转录过程发挥阻遏作用。

比

例

（

）

D Q E G H I L K M F P S T Y V A R N

氨基酸

Query seq

Specific hits

Non-specific hits

Superfamilies

图2 Irr蛋白理化性质分析(A)、三级结构预测(B)以及保守结构域预测(C)

Fig.2 Analysis of physical and chemical properties of Irr protein (A), tertiary structure prediction (B), and prediction of

conserved domains (C)

使用IEDB在线软件预测分析蛋白线性B细胞

抗原表位及CD4 T细胞免疫原性。Irr蛋白有6个B细

胞抗原表位、3个T细胞抗原表位。应用ProAcePred

在线软件对Irr蛋白进行乙酰化位点预测，该蛋白无

乙酰化修饰位点。利用NetPhos 3.1 Server对Irr蛋白

进行磷酸化位点预测，该蛋白含有7个苏氨酸磷酸

化修饰位点、8个丝氨酸磷酸化修饰位点和0个酪氨

酸磷酸化修饰位点，包含6类蛋白质激酶结合位点

（cdc2、PKA/PKC、CKI、RSK、unsp)（图3A）。

通过NetNGIyc 1.0 Serve在线软件对蛋白进行糖基化

修饰位点预测，Irr蛋白在Asp65、Asp91、Asp104、

Asp121、Asp133这5个位点发生N-糖基化修饰（图

数

量

第31卷第4期孙天浩等：布鲁菌Irr蛋白的生物信息学分析、表达纯化以及ELISA方法的初步建立

3B）。应用iDNA4mC对Irr蛋白甲基化修饰位点进

行预测，其有45个位点可能发生甲基化修饰。应用

Cell-PLoc 2.0对Irr蛋白的亚细胞定位预测显示其定

位于胞质。

Serine

Threonine

Tyrosine

Threshold

分

值

0 20 40 60 80 100 120 140

位置

Threonine

Additional thresholds

Potential

0.75

0.5

0.25

分

值

0 20 40 60 80 100 120 140

位置

图3 Irr蛋白磷酸化位点预测（A）和糖基化修饰位点预测（B）

Fig.3 Prediction of Irr protein phosphorylation sites (A) and prediction of glycosylation modiﬁ cation sites (B)

2.2 目的基因及重组质粒的酶切验证

将PCR产物用

1.5%琼脂糖电泳进行检测，在490 bp有明显的条带

并与

irr

基因序列大小相符（图4A）。pCzn1-irr重组

质粒经限制性内切酶酶切后，经1.0%琼脂糖凝胶电

泳进行检测，与预期结果相符(图4B)，表明

irr

基因

成功插入表达载体中。

2.3 重组蛋白的表达纯化与鉴定

IPTG诱导含有重

组质粒的

E. coli

BL21（DE3）菌液，诱导后可见约

16.3 kDa的特异性条带，其分子质量与重组质粒表达

蛋白的分子质量相当。经SDS-PAGE凝胶电泳分析

得出6 h时，重组蛋白Irr的表达量最大（图5A）。将

表达正确的蛋白采用镍柱纯化法纯化，获取纯化后

的重组蛋白Irr（图5B）。

采用羊布鲁菌病阳性血清和阴性血清作为一

抗，HRP标记的兔抗羊IgG作为二抗，进行Western

blot分析，结果可见，采用羊布鲁菌病阳性血清作

为一抗孵育，在重组蛋白Irr的位置上出现明显的条

带，而作为阴性对照的

E. coli

BL21（DE3）没有出

现条带；采用羊布鲁菌病阴性血清作为一抗孵育的

E. coli

BL21（DE3）与重组蛋白Irr均未出现明显条

带（图5C）。

中国动物传染病学报

1 2 M

2023年8月

M 1 2

2000

4400

1000

750

500

250

100

490

12000

8000

6000

5000

4000

3000

2500

2000

1500

1000

750

500

250

图4

irr

基因PCR扩增结果（A）和表达载体酶切鉴定（B）

cation of expression vector by enzyme digestion (B)

Fig.4 PCR ampliﬁ cation results of

irr

gene (A) and dentiﬁ

1~2:

irr

目的基因基因; M: DNA相对分子质量标准(DL2000)

1: 酶切前的质粒; 2: 酶切后的质粒; M: DNA相对分子量标准(DL12000)

1~2: PCR production of

irr

, M: DL2000 DNA marker

1: Pre-digestion plasmid; 2: Plasmid digested by enzyme; M: DL12000 DNA marker

kDa

100

M 1 2 3 4 5

100

16.3

kDa

M 6

kDa

16.3

7 8

16.3

图5 重组蛋白Irr诱导表达（A）、重组蛋白Irr纯化（B）及重组蛋白Irr Western blot 鉴定（C）

Fig.5 The recombinant protein Irr was induced to express (A), Puriﬁ cation of Irr recombinant protein (B), and Western

blot analysis of expressed products (C)

M: 蛋白分子量标准; 1: 0 h, 2: 2 h, 3: 4 h, 4: 6 h, 5: 8 h; ; 6: 重组蛋白Irr; +: 阳性血清作为一抗孵育; -: 阴性血清作为一抗孵育; 7: 重

组蛋白Irr; 8:

E. coli

BL21 ( DE3).

M: 100 kDa protein marker; 1: 0 h, 2: 2 h, 3: 4 h,4: 6 h, 5: 8 h; 6: Irr protein; +: Positive serum was incubated as primary antibody; -: The

negative serum was incubated as a primary antibody; 7: Irr recombinant protein; 8:

E. coli

BL21(DE3)

第31卷第4期孙天浩等：布鲁菌Irr蛋白的生物信息学分析、表达纯化以及ELISA方法的初步建立

2.4 Irr蛋白间接ELISA方法的建立

2.4.1 间接ELISA方法最适反应条件的确定采用棋盘

式方法测定Irr蛋白最佳包被量、一抗、二抗的最佳

稀释浓度、封闭液的选择以及一抗、二抗、血清的

孵育时间。确定Irr蛋白作为诊断抗原的最佳优化条

件为：重组蛋白Irr的包被量为浓度为0.25

g，选择

5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗为1∶500（孵育2 h），

二抗为1∶5000（孵育2 h），显色15 min。此时P/N

为3.09。

表1 重组蛋白Irr、待检血清及二抗稀释度浓度结果

Table 1 pCzn1-irr protein, test serum and secondary antibody dilution concentration results

重组蛋白Irr抗原包被浓度

血清

Antigen coating concentration

Serum dilutions

0.25

g/孔1

g/孔2

g/孔4

g/孔

（1∶x）

0.25

g/hole1

g/hole2

g/hole4

g/hole

二抗浓度（1∶x）

Concentration of secondary antibody

1000500010 0 0

501.181.981.781.101.321.361.021.111.180.991.09

1001.562.212.211.111.401.341.021.151.301.021.15

P/N

5002.142.622.411.181.601.551.111.341.461.021.38

10002.082.102.301.391.521.471.161.441.501.121.28

表2 封闭液的选择及封闭时间的结果

封闭液

Blocking fluid

Table 2 Selection of sealing ﬂ uid and results of sealing time

封闭时间（h）阳性血清（

450

）

阴性血清（

450

）

Closed time (h)Positive serum (

450

)

Negative serum (

450

)

0.51.130.52

1.01.520.72

1.51.460.60

2.01.960.75

2.51.340.62

3.01.250.62

0.51.661.23

1.01.831.03

1.51.580.82

2.01.620.93

2.51.650.96

3.02.220.95

0.51.961.25

1.01.641.14

1.51.590.95

2.01.630.89

2.51.250.69

3.01.680.92

表3 血清孵育时间的结果

Table 3 Results of serum incubation time

血清孵育时间（h）

Serum incubation (h)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

阳性血清（

450

）

Positive serum (

450

)

0.56

1.08

1.15

1.29

1.03

1.21

阴性血清（

450

）

Negative serum (

450

)

0.36

0.43

0.40

0.42

0.38

0.52

P/N

1.56

2.51

2.87

3.07

2.71

2.32

P/N

2.17

2.11

2.43

2.61

2.16

2.01

1.35

1.78

1.93

1.74

1.72

2.34

1.57

1.44

1.67

1.83

1.81

1.83

10 000

1.11

1.19

1.38

1.31

5%脱脂奶粉

5%BSA溶液

1%明胶

中国动物传染病学报

表4 二抗孵育时间的结果

Table 4 Results of secondary antibody incubation time

二抗孵育时间（h）

Secondary antibody (h)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

阳性血清（

450

）

Positive serum (

450

)

1.65

2.06

1.95

2.54

2.46

2.59

表5 显色时间的结果

Table 5 Results of color development time

阴性血清(

450

)

Negative serum (

450

)

0.58

0.75

0.91

0.83

1.26

1.62

2023年8月

P/N

2.84

2.75

2.14

3.06

1.95

1.59

显色时间（min）

Color development (min)

阳性血清（

450

）

Positive serum (

450

)

0.82

0.84

0.99

0.97

阴性血清（

450

）

Negative serum (

450

)

0.34

0.32

0.40

0.42

0.48

P/N

2.41

2.00

3.09

2.48

2.31

2.02

2.4.2 ELISA方法临界值的确定通过对30份羊布鲁

菌病阴性血清进行ELISA检测，使用统计学软件SPSS

计算得出阴性血清样品平均值（

）=0.35和标准差

（SD）=0.10。因此，当检测样品

450

≤

0.55就可以

判定血清样品抗体为阴性；

450

≥

0.65就可以判定

血清样品抗体为阳性；当检测样品0.55<

450

<0.65，

判定为可疑，即进行复检，若

450

仍为可疑，则判

定为阳性。

2.4.3 ELISA方法特异性实验结果使用建立的ELISA

方法检测羊布鲁菌病，绵羊肺腺瘤病，羊梅迪-维斯

纳病，羊巴氏杆菌病的阳性血清，结果显示，所检

血清样品中，仅有已知布鲁菌病阳性血清显示为阳

性，其余血清抗体均为阴性（表6），表明基于重组

蛋白Irr所建 ELISA 方法有良好的特异性。

2.4.4 ELISA方法敏感性结果以Irr蛋白为抗原建

立的方法能检测到阳性血清稀释比为1∶800时，

450

为0.63，经过复检，

450

为0.62，其数值仍

在可疑区间，即判定为阳性，而阳性血清稀释比为

1∶1600时，

450

为0.51，即判定为阴性，因此以Irr

蛋白为抗原建立的方法能检测到阳性血清稀释比为

1∶800。

表6 重组蛋白Irr间接ELISA特异性的结果

Table 6 Indirect ELISA speciﬁ c results of Irr protein

血清类型

Serotyping

布鲁菌病

Brucellosis

绵羊肺腺瘤病

Sheep pulmonary

adenomatosis

0.32

羊梅迪-维斯纳病

Maedi-Visna Disease

羊巴杆菌病

Pasteurellosis

450

判定结果

1.35

0.26

0.23

2.4.5 ELISA方法稳定性结果将7份羊布鲁菌病阳性

血清和1份布鲁菌病阴性血清分别进行批内和批间重

复性试验，经SPSS软件分析，结果显示批内重复变

异系数（CV）均低于5%，平均变异系数为 1.92%

（表7），批间重复变异系数均低于10%，平均变异

系数为3.38%（表8）。表明基于Irr蛋白为抗原建立

的ELISA方法有较好的重复性。

第31卷第4期孙天浩等：布鲁菌Irr蛋白的生物信息学分析、表达纯化以及ELISA方法的初步建立

表7 重组蛋白Irr间接ELISA批间稳定性结果

样本类型

Sample type

编号

Number

阳性样本

阴性样本

Table 7 Interbatch stability of Irr protein by indirect ELISA

450

值

平均值标准差

450

valueAverageStandard deviation

123

1.58 1.521.551.55 0.02

1.67 1.661.711.68 0.02

1.91 1.931.911.92 0.01

0.83 0.780.840.82 0.03

1.17 1.161.231.19 0.03

2.31 2.332.392.34 0.03

1.43 1.451.41 1.43 0.02

0.34 0.33 0.36 0.34 0.01

表8 重组蛋白Irr间接ELISA批次稳定性结果

Table 8 Indirect ELISA batch stability of Irr protein

变异系数（%）

Coefficient of variation (%)

1.48

1.32

0.50

3.19

2.60

1.45

1.14

3.63

样本类型

Sample type

阳性样本

编号

Number

1.53

1.65

1.99

0.85

1.19

2.33

1.45

0.35阴性样本

450

值

450

value

1.49

1.77

1.93

0.82

1.21

2.38

1.58

0.37

平均值

Average

1.51

1.72

1.88

0.71

1.23

2.37

1.49

0.31

1.51

1.71

1.93

0.79

1.21

2.36

1.51

0.34

标准差

Standard deviation

0.02

0.05

0.04

0.06

0.02

0.05

0.02

变异系数（%）

Coefficient of variation (%)

1.08

2.87

2.33

7.59

1.35

0.92

3.61

7.27

2.4.6 ELISA方法临床样品的检测采用以上建立的

间接ELISA方法对60份血清进行临床样品检测，检

出阳性血清18份，阴性血清42份，用布鲁菌病凝集

实验检测60份相同的血清样本，结果显示阳性血清

20份，阴性血清40份，共同检出阳性血清18份，阴

性血清40份，两者的符合率为（40+18）/60=96.7%

（表9）。

表9 重组蛋白Irr间接ELISA临床样本结果

Table 9 Irr protein indirect ELISA results of clinical samples

血清

Serum

阳性血清

阴性血清

总数

重组蛋白Irr包被

Coated with Irr protein

凝集实验检测

Test with kits

增殖分化、凋亡、免疫防御过程中发挥着作用

[4]

。铁

调控因子Irr被报道在根瘤菌（与布鲁菌同属

-变形

菌）的铁代谢调控中发挥着关键作用

[5]

。已有研究表

明Irr是

-变形杆菌主要的铁调控因子，在布鲁菌中

Irr在亚铁血红素转运蛋白BhuA的表达过程中起着重

要作用

[6]

。除了

irr

基因，也有一些基因参与了铁的调

控，如rirA

[7]

、Fur

[8]

、RyhB

[9]

、DtxR

[10]

、Mur

[11]

等，

这一系列的铁调控因子，使布鲁菌获取可以满足其

正常的生理水平的铁离子。然而与铁代谢相关的基

因有很多，仍需要我们进一步去发现并研究其具体

的分子机制。

通过对Irr蛋白的生物信息学分析，研究发现可

能不参与胞内外信号的转导，而且该蛋白没有信号

肽，为亲水性蛋白，其亚细胞定位结果表明，该蛋

白定位于胞质中，这意味着该蛋白可能属于非分泌

蛋白，不能分泌到布鲁菌体外发挥作用。对Irr蛋白

结构、功能的可视化分析，研究发现蛋白属于Fur家

族，是细菌中铁吸收调节家族的转录因子成员，对

3 讨论

铁是多细胞生命体和几乎所有微生物必须的重

要微量元素，不仅参与氧气运输、电子转移和能源

代谢等基本代谢途径，而且在基因表达调控、细胞

中国动物传染病学报

2023年8月

转录过程发挥阻遏作用

[12]

。Wu等

[13]

最新研究发现，

磷酸化修饰对蛋白质的表达稳定性产生影响，周小

菊等

[14]

也指出，糖基化修饰的质与量的差异影响了

蛋白的表达水平、结构及功能，如蛋白的更新及降

解，因此，对蛋白修饰化的预测将有助于基因的改

造和蛋白表达条件的优化甚至酶处理等。本研究通

过对Irr蛋白的修饰化进行分析，其无乙酰化修饰位

点，5个糖基化位点，有7个苏氨酸磷酸化修饰位

点、8个丝氨酸磷酸化修饰位点以及45个甲基化修饰

位点，这为今后对Irr重组蛋白减缓蛋白降解，增加

表达量，增强免疫原性等的深入研究奠定了基础。

同时

irr

基因作为转录因子，修饰前后转录因子的转

录活性及转录因子对下游基因转录区域的结合水平

是否发生变化需要进一步深入研究探讨。

通过对Irr蛋白的B细胞、T细胞抗原表位预测和

Western blot分析结果也证明了该蛋白具有良好的反

应原性，可作为布鲁菌病血清学诊断的潜在靶标。

同时本试验以重组蛋白Irr为诊断抗原所建立的间接

ELISA法具有灵敏度高，特异性高，重复性好的特

点，可以作为布鲁菌病血清学诊断的辅助手段。

综上所述，本试验通过对Irr蛋白氨基酸进行生

物信息学分析预测，成功构建了

irr

基因的原核表达

载体并表达纯化获得了Irr蛋白，并通过Western blot

分析验证其所表达的蛋白具有良好的反应原性，

同时以Irr蛋白作为诊断抗原初步建立了间接ELISA

的方法。为Irr蛋白作为诊断靶标提供了理论支持，

也为布鲁菌病的诊断和流行病学调查提供了必要

手段。

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