2024年5月29日发(作者：铁春桃)
第
19
卷第
3
期
2003
年
9
月
病毒学报
C~INESEJOURNALOFVIROLOGY
Vol.19No.3
Se
p
t.2003
cmv-3*LTR
嵌合启动子对逆转录病毒载体
MFG
滴度及外源基因表达的影响
戴冰冰，梅文瀚，王家敏，杨蓉，钱关祥，卢健
（上海第二医科大学生物化学教研室分子生物学实验室，上海
200025
）
摘要：为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默，进一步提高逆转录病毒载体
MFG
介导的外源基因的表达水
平，同时探讨逆转录病毒
3/
端长末端重复序列（内
U3
区对病毒基因表达的影响，将逆转
lon
g
-terminalre
p
eat
，
LTR
）
录病毒载体
3/
端
LTR
内的
U3
区用
cmV
核心增强子、启动子序列替代，同时去除了
3
个与逆转录病毒载体启动子
甲基化有关的序列
NCR
、并以
e
gfp
为报告基因，构建了
MFG
利
DR
，
-e
g
f
p
和
MFG-e
g
f
p
-cmV
表达载体。结果显示：
用
cmV
启动子替代
MFG
载体
3/
端
LTR
的
U3
启动子序列，会显著降低
MFG
载体的病毒滴度及其介导的外源报
告基因的表达。提示利用
cmV
启动子替代病毒载体的
3/
端
LTR
内的
U3
区，并不是提高
M
（
molone
y
murineoMLV
逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略。结果也同时提示：在
M
leukemiVirus
）
oMLV
逆转
录病毒
3/
端
LTR
的
U3
区，可能存在与病毒
RNA
加工、成熟及稳定性有关的信号序列。
关键词：逆转录病毒载体；基因表达；嵌合启动子；长末端重复序列
中图分类号：
@782
文献标识码：
A
文章编号：（
1
）
03-0235-05
（美国）产品。
DNA
凝胶回收试剂盒购自
@
（德
IAGEN
公司
国）。
2
细胞与质粒逆转录病毒包装细胞
PA317
来自
ATCC
（
CRL
，小鼠胚胎成纤维细胞
NI~
来自
ATCC-2187
）
-3T3
，
（
CRL
。质粒
p
UC18
购自
T
；
-1658
）
akara
（日本）
p
cDNA3
、
逆转录病毒载体
MFG
为匹滋堡大
p
SV2neu
为本科室保存；
学
PDRobbins
教授惠赠。
首先
3MFG3*LTR
区的改造为便于
MFG3/LTR
的改造，
通过酶切补平再连接，将
p
UC18
克隆载体多克隆位点处的
限制性内切酶
Xba
"
识别位点突变，形成
p
UC18X
-
。将
MFG3/LTR
及部分载体骨架通过
Bam
~I
与
Eco
RI
克隆至
-
形成
-
p
UC18X
，
p
UC18XLTR
。利用
PCR
以
p
cDNA3
载体
为模板，扩增出
cmV
核心启动子及增强子元件
cmV
。上游引
逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默，是在
以逆转录病毒为转移载体的基因治疗中所遇到的主
要问题。目前认为，其主要原因是病毒载体
LTR
区
［
1
，
2
］
的启动子甲基化。因此改造病毒载体
LTR
，包
括去除与甲基化有关的元件如
U3
区的
DRs
（
direct
、及
5/
端的
re
p
eats
）
NCR
（
ne
g
atiVecontrolre
g
ion
）
（等，在一定程度上降低了逆
PBS
p
rimerbindin
g
site
）
［
3-5
］
转录病毒载体介导的外源基因的沉默。在本
研究中，将
MoMLV
来源的逆转录病毒载体
MFG3/
端
LTR
中的
U3
启动子增强子序列，用真核细胞强
启动子
cmV
核心元件替代，观察含有嵌合
3/
端
LTR
的逆转录病毒载体的滴度，及其介导外源报告基因
探讨逆转录病毒载体
3/
端
LTR
e
gfp
表达的情况，
中的
U3
区与病毒基因表达的关系。
物：
g
at
g
cta
g
ccc
g
c
g
ttacataac
，下游引物：
cca
g
a
g
ctc
g
c-
并在上下游引物中分别引入
Nhe
"
与
Sac
"ctacc
g
cccattt
g
，
内切酶识别位点。通过
Nhe
"
与
San
"
将
cmV
克隆至
-
从而形成
p
UC18XLTRU3
区相应内切酶识别位点处，
-cmV-LTR
。将改造后的
3/-cmV-LTR
重新通过
p
UC18X
形成
MFG
Eco
RI
与
Bam
~I
克隆至
MFG
载体，
-cmV
。从而
材料与方法
1
试剂
DNA
限制性内切酶购自
Boehrin
g
erMannheim
公
小牛血清、
司（德国）。
DMEM
细胞培养基、
G418
为
Gibco
（美国）。磷酸钙转染试剂盒为
Prome
g
a
公司
BRL
公司产品
收稿日期：修回日期：
2002-12-25
；
2003-03-26
基金项目：国家自然科学基金项目（编号：；上海市科
39970311
）
委重点项目（编号：
01JC14025
）
作者简介：戴冰冰（，男，山东人，博士研究生，研究方向：
1975-
）
基因治疗和基因表达调控
通讯作者：卢健，
（
021
）（
021
）
Tel
：
63846590-776443
；
Fax
：
34060742
，
；
.
j
ianlu!
将
LTR
区与逆转录病毒启动子失活有关的
3
个位点去除，
并形成具有嵌合
3/LTR
的
MFG-cmV
逆转录病毒载体。
通过
Nco
"
与
Bam
~
将
e
gfp
由
I
，
形成
MFG-e
g
f
p
克隆至
MFG
及
MFG-cmV
，
-e
g
f
p
和
p
BN
MFG-e
g
f
p
-cmV
。
5MFG-e
g
f
p
及
MFG-e
g
f
p
-cmv
在
NIH-3T3
细胞内的瞬间
4
表达在
6
孔板内接种
NI~
孔，次日分别
-3T3
细胞
5>10
5
／
取
MFG
利用脂质体
L-e
g
f
p
、
MFG-e
g
f
p
-cmV
各
6
#
i
p
ofeci-
g
，
（转染
NI~
荧光倒
namin2000
InVitro
g
ene
）
-3T3
细胞，
48h
后，
置显微镜观察及流式细胞仪检测
EGFP
平均荧光强度。
报告载体的构建
·
236
·
病毒
图
l
逆转录病毒
LTR
结构及
U3
区内的与病毒启动子
甲基化有关的序列
Fi
g
urelSchematicstructureoftheretroviralLTRand
se
C
uencesassociatedwithmeth
y
lationofretrovi-
ral
p
romoterinU3re
g
ion
g
ativecontrolre
g
ion
；
re
p
eat
；
bindin
g
site
逆转病毒包装及病毒滴度测定参见文献
［
6
］
。
MFG-e
g
f
p
及
MFG-cmV-e
g
f
p
在包装细胞
PA3l7
内表达
在
6
孔板内接种稳定表达的
PA3l7
包装细胞
5>l
5
／孔，
待细胞密度达
9 %
时，收集细胞，
FACS
检测
EGFP
的平均
荧光强度。
Northern
印迹检测
!
"#$
在包装细胞内的表达利用
TRizol
一步法抽提细胞总
RNA
，用
Boehrin
g
erMannheim
公
司（德国）
RNA
标记和检测试剂盒
NothernStarterkitI
进
行
RNA
探针的标记及检测。其中以
bam
~I
酶切后的
p
cD-
NA3-e
g
f
p
为模版，利用
S
p
6RNA
聚合酶进行体外转录标记
全长（约
7 b
p
）反义
e
gfl
RNA
探针，并以
eco
RI
酶切后的
Bluscri
p
t-mGAPD~
为模板，利用
T7RNA
聚合酶经体外转
录标记小鼠
GAPD~4 b
p
的反义
RNA
探针。探针的标记、
效率测定及
Northernblot
皆参照说明书进行。
逆转录病毒介导
!
"#$
在
NIH-3T3
细胞内的表达在
6
孔板内接种
NI~-3T3
细胞，
5>l
5
／孔，次日去掉培养基，加
入含病毒上清
2ml
（
5>l
5
CFU
），并加入
Pol
y
brene
（
Gibco
）
8
H
g
／
ml
，
4h
后去除上清加新鲜培养基
2ml
，继续培养
，
FACS
检测
EGFP
的平均荧光强度。
结果
MFG3*LTR
区的改造
通过多次亚克隆的方法，利用人巨细胞病毒核
心启动子元件代替
MFG
载体
3/LTRU3
区启动子
及增强子序列。改造后的
MFG
载体为
MFG-cmv
，
结构图见图
2
。（酶切结果略）
MFG-e
g
f
p
和
MFG-e
g
f
p
-cmV
报告载体的构建
以增强型
e
gfl
为报告基因，通过
nco
I
和
m
~I
将
e
gfl
克隆至
MFG
与
MFG-cmv
，从而形
成
MFG-e
g
f
p
和
MFG-e
g
f
p
-cmv
，载体结构图及酶切
结果见图
3
。
MFG-e
g
f
p
和
MFG-C-e
g
f
p
在
NIH-3T3
细胞内的
瞬间表达
利用脂质体
li
p
ofectiamin2
转染
NI~-3T3
细
胞，
48h
后荧光显微镜下观察到
MFG
载体及改造后
学报
l9
卷
图
2
逆转录病毒
MFG
载体
3/LTRU3
区的改造
Fi
g
ure2ModificationoftheU3re
g
ionin3/LTRofretro-
viralvectorMFG
；
B.
p
UCl8X-LTR
；
-cmv.
图
3MFG-e
g
f
p
和
MFG-e
g
f
p
-cmv
载体的结构简图及酶
切鉴定图
Fi
g
ure3SchematicstructuresofMFG-e
g
f
p
andMFG-
e
g
f
p
-cmvvectorsandtherestrictivedi
g
estion
resultofrecombinant
p
lasmid
M.A
~il
dHmarker
；
-e
g
f
p
（
nco
I+
bam
~I
）；
-
e
g
f
p
-cmv
（
nco
I+
bam
~I
）
.
的
MFG-cmv
载体都可表达
e
gfl
基因（结果略）。
但通过流式细胞仪检测发现，
MFG-cmv-e
g
f
p
的表达
比
MFG-e
g
f
p
的表达降低约
3
倍，结果见图
4
。
病毒的包装及滴度测定
以
PA3l7
细胞为包装细胞，将
MFG-e
g
f
p
与
MFG-cmv-e
g
f
p
、
p
SV2neu
载体共转染
PA3l7
细胞，
4l8
筛选约
3
周后测定细胞上清的病毒滴度
［
6
］
，结
果与
MFG-e
g
f
p
相比，
MFG-e
g
f
p
-cmv
的病毒滴度显
著降低（图
5
）。
MFG-e
g
f
p
及
MFG-e
g
f
p
-cmV
在包装细胞
PA3l7
内表达
为寻找
MFG-e
g
f
p
-cmv
病毒滴度降低的原因，
通过流式细胞仪检测
e
gfl
基因在包装细胞内稳定
表达水平，发现在包装细胞
PA3l7
内，
MFG-e
g
f
p
6
7
8
p
9
BRL
48h
l
2
4
G
5
ba
3
2024年5月29日发(作者：铁春桃)
第
19
卷第
3
期
2003
年
9
月
病毒学报
C~INESEJOURNALOFVIROLOGY
Vol.19No.3
Se
p
t.2003
cmv-3*LTR
嵌合启动子对逆转录病毒载体
MFG
滴度及外源基因表达的影响
戴冰冰，梅文瀚，王家敏，杨蓉，钱关祥，卢健
（上海第二医科大学生物化学教研室分子生物学实验室，上海
200025
）
摘要：为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默，进一步提高逆转录病毒载体
MFG
介导的外源基因的表达水
平，同时探讨逆转录病毒
3/
端长末端重复序列（内
U3
区对病毒基因表达的影响，将逆转
lon
g
-terminalre
p
eat
，
LTR
）
录病毒载体
3/
端
LTR
内的
U3
区用
cmV
核心增强子、启动子序列替代，同时去除了
3
个与逆转录病毒载体启动子
甲基化有关的序列
NCR
、并以
e
gfp
为报告基因，构建了
MFG
利
DR
，
-e
g
f
p
和
MFG-e
g
f
p
-cmV
表达载体。结果显示：
用
cmV
启动子替代
MFG
载体
3/
端
LTR
的
U3
启动子序列，会显著降低
MFG
载体的病毒滴度及其介导的外源报
告基因的表达。提示利用
cmV
启动子替代病毒载体的
3/
端
LTR
内的
U3
区，并不是提高
M
（
molone
y
murineoMLV
逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略。结果也同时提示：在
M
leukemiVirus
）
oMLV
逆转
录病毒
3/
端
LTR
的
U3
区，可能存在与病毒
RNA
加工、成熟及稳定性有关的信号序列。
关键词：逆转录病毒载体；基因表达；嵌合启动子；长末端重复序列
中图分类号：
@782
文献标识码：
A
文章编号：（
1
）
03-0235-05
（美国）产品。
DNA
凝胶回收试剂盒购自
@
（德
IAGEN
公司
国）。
2
细胞与质粒逆转录病毒包装细胞
PA317
来自
ATCC
（
CRL
，小鼠胚胎成纤维细胞
NI~
来自
ATCC-2187
）
-3T3
，
（
CRL
。质粒
p
UC18
购自
T
；
-1658
）
akara
（日本）
p
cDNA3
、
逆转录病毒载体
MFG
为匹滋堡大
p
SV2neu
为本科室保存；
学
PDRobbins
教授惠赠。
首先
3MFG3*LTR
区的改造为便于
MFG3/LTR
的改造，
通过酶切补平再连接，将
p
UC18
克隆载体多克隆位点处的
限制性内切酶
Xba
"
识别位点突变，形成
p
UC18X
-
。将
MFG3/LTR
及部分载体骨架通过
Bam
~I
与
Eco
RI
克隆至
-
形成
-
p
UC18X
，
p
UC18XLTR
。利用
PCR
以
p
cDNA3
载体
为模板，扩增出
cmV
核心启动子及增强子元件
cmV
。上游引
逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默，是在
以逆转录病毒为转移载体的基因治疗中所遇到的主
要问题。目前认为，其主要原因是病毒载体
LTR
区
［
1
，
2
］
的启动子甲基化。因此改造病毒载体
LTR
，包
括去除与甲基化有关的元件如
U3
区的
DRs
（
direct
、及
5/
端的
re
p
eats
）
NCR
（
ne
g
atiVecontrolre
g
ion
）
（等，在一定程度上降低了逆
PBS
p
rimerbindin
g
site
）
［
3-5
］
转录病毒载体介导的外源基因的沉默。在本
研究中，将
MoMLV
来源的逆转录病毒载体
MFG3/
端
LTR
中的
U3
启动子增强子序列，用真核细胞强
启动子
cmV
核心元件替代，观察含有嵌合
3/
端
LTR
的逆转录病毒载体的滴度，及其介导外源报告基因
探讨逆转录病毒载体
3/
端
LTR
e
gfp
表达的情况，
中的
U3
区与病毒基因表达的关系。
物：
g
at
g
cta
g
ccc
g
c
g
ttacataac
，下游引物：
cca
g
a
g
ctc
g
c-
并在上下游引物中分别引入
Nhe
"
与
Sac
"ctacc
g
cccattt
g
，
内切酶识别位点。通过
Nhe
"
与
San
"
将
cmV
克隆至
-
从而形成
p
UC18XLTRU3
区相应内切酶识别位点处，
-cmV-LTR
。将改造后的
3/-cmV-LTR
重新通过
p
UC18X
形成
MFG
Eco
RI
与
Bam
~I
克隆至
MFG
载体，
-cmV
。从而
材料与方法
1
试剂
DNA
限制性内切酶购自
Boehrin
g
erMannheim
公
小牛血清、
司（德国）。
DMEM
细胞培养基、
G418
为
Gibco
（美国）。磷酸钙转染试剂盒为
Prome
g
a
公司
BRL
公司产品
收稿日期：修回日期：
2002-12-25
；
2003-03-26
基金项目：国家自然科学基金项目（编号：；上海市科
39970311
）
委重点项目（编号：
01JC14025
）
作者简介：戴冰冰（，男，山东人，博士研究生，研究方向：
1975-
）
基因治疗和基因表达调控
通讯作者：卢健，
（
021
）（
021
）
Tel
：
63846590-776443
；
Fax
：
34060742
，
；
.
j
ianlu!
将
LTR
区与逆转录病毒启动子失活有关的
3
个位点去除，
并形成具有嵌合
3/LTR
的
MFG-cmV
逆转录病毒载体。
通过
Nco
"
与
Bam
~
将
e
gfp
由
I
，
形成
MFG-e
g
f
p
克隆至
MFG
及
MFG-cmV
，
-e
g
f
p
和
p
BN
MFG-e
g
f
p
-cmV
。
5MFG-e
g
f
p
及
MFG-e
g
f
p
-cmv
在
NIH-3T3
细胞内的瞬间
4
表达在
6
孔板内接种
NI~
孔，次日分别
-3T3
细胞
5>10
5
／
取
MFG
利用脂质体
L-e
g
f
p
、
MFG-e
g
f
p
-cmV
各
6
#
i
p
ofeci-
g
，
（转染
NI~
荧光倒
namin2000
InVitro
g
ene
）
-3T3
细胞，
48h
后，
置显微镜观察及流式细胞仪检测
EGFP
平均荧光强度。
报告载体的构建
·
236
·
病毒
图
l
逆转录病毒
LTR
结构及
U3
区内的与病毒启动子
甲基化有关的序列
Fi
g
urelSchematicstructureoftheretroviralLTRand
se
C
uencesassociatedwithmeth
y
lationofretrovi-
ral
p
romoterinU3re
g
ion
g
ativecontrolre
g
ion
；
re
p
eat
；
bindin
g
site
逆转病毒包装及病毒滴度测定参见文献
［
6
］
。
MFG-e
g
f
p
及
MFG-cmV-e
g
f
p
在包装细胞
PA3l7
内表达
在
6
孔板内接种稳定表达的
PA3l7
包装细胞
5>l
5
／孔，
待细胞密度达
9 %
时，收集细胞，
FACS
检测
EGFP
的平均
荧光强度。
Northern
印迹检测
!
"#$
在包装细胞内的表达利用
TRizol
一步法抽提细胞总
RNA
，用
Boehrin
g
erMannheim
公
司（德国）
RNA
标记和检测试剂盒
NothernStarterkitI
进
行
RNA
探针的标记及检测。其中以
bam
~I
酶切后的
p
cD-
NA3-e
g
f
p
为模版，利用
S
p
6RNA
聚合酶进行体外转录标记
全长（约
7 b
p
）反义
e
gfl
RNA
探针，并以
eco
RI
酶切后的
Bluscri
p
t-mGAPD~
为模板，利用
T7RNA
聚合酶经体外转
录标记小鼠
GAPD~4 b
p
的反义
RNA
探针。探针的标记、
效率测定及
Northernblot
皆参照说明书进行。
逆转录病毒介导
!
"#$
在
NIH-3T3
细胞内的表达在
6
孔板内接种
NI~-3T3
细胞，
5>l
5
／孔，次日去掉培养基，加
入含病毒上清
2ml
（
5>l
5
CFU
），并加入
Pol
y
brene
（
Gibco
）
8
H
g
／
ml
，
4h
后去除上清加新鲜培养基
2ml
，继续培养
，
FACS
检测
EGFP
的平均荧光强度。
结果
MFG3*LTR
区的改造
通过多次亚克隆的方法，利用人巨细胞病毒核
心启动子元件代替
MFG
载体
3/LTRU3
区启动子
及增强子序列。改造后的
MFG
载体为
MFG-cmv
，
结构图见图
2
。（酶切结果略）
MFG-e
g
f
p
和
MFG-e
g
f
p
-cmV
报告载体的构建
以增强型
e
gfl
为报告基因，通过
nco
I
和
m
~I
将
e
gfl
克隆至
MFG
与
MFG-cmv
，从而形
成
MFG-e
g
f
p
和
MFG-e
g
f
p
-cmv
，载体结构图及酶切
结果见图
3
。
MFG-e
g
f
p
和
MFG-C-e
g
f
p
在
NIH-3T3
细胞内的
瞬间表达
利用脂质体
li
p
ofectiamin2
转染
NI~-3T3
细
胞，
48h
后荧光显微镜下观察到
MFG
载体及改造后
学报
l9
卷
图
2
逆转录病毒
MFG
载体
3/LTRU3
区的改造
Fi
g
ure2ModificationoftheU3re
g
ionin3/LTRofretro-
viralvectorMFG
；
B.
p
UCl8X-LTR
；
-cmv.
图
3MFG-e
g
f
p
和
MFG-e
g
f
p
-cmv
载体的结构简图及酶
切鉴定图
Fi
g
ure3SchematicstructuresofMFG-e
g
f
p
andMFG-
e
g
f
p
-cmvvectorsandtherestrictivedi
g
estion
resultofrecombinant
p
lasmid
M.A
~il
dHmarker
；
-e
g
f
p
（
nco
I+
bam
~I
）；
-
e
g
f
p
-cmv
（
nco
I+
bam
~I
）
.
的
MFG-cmv
载体都可表达
e
gfl
基因（结果略）。
但通过流式细胞仪检测发现，
MFG-cmv-e
g
f
p
的表达
比
MFG-e
g
f
p
的表达降低约
3
倍，结果见图
4
。
病毒的包装及滴度测定
以
PA3l7
细胞为包装细胞，将
MFG-e
g
f
p
与
MFG-cmv-e
g
f
p
、
p
SV2neu
载体共转染
PA3l7
细胞，
4l8
筛选约
3
周后测定细胞上清的病毒滴度
［
6
］
，结
果与
MFG-e
g
f
p
相比，
MFG-e
g
f
p
-cmv
的病毒滴度显
著降低（图
5
）。
MFG-e
g
f
p
及
MFG-e
g
f
p
-cmV
在包装细胞
PA3l7
内表达
为寻找
MFG-e
g
f
p
-cmv
病毒滴度降低的原因，
通过流式细胞仪检测
e
gfl
基因在包装细胞内稳定
表达水平，发现在包装细胞
PA3l7
内，
MFG-e
g
f
p
6
7
8
p
9
BRL
48h
l
2
4
G
5
ba
3