2024年10月7日发(作者：翠和正)
肝脏病杂志２０１１年１Ｏ月第１４卷第５ ，Ｑｃｔ． ．、， ： ．
・
３２７・
著・
乙型肝炎病毒ｒｔＮ２３８Ｈ变异与阿德福韦酯
耐药的相关性研究 出
朱华钟彦伟许智慧 刘佳慧 刘 妍 苏何玲徐东平
【摘要】 目的 阐明乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）多聚酶／逆转录酶区ｒｔＮ２３８Ｈ变异对临床产生阿德福韦（ＡＤＶ）
耐药的影响。方法分析了１７８９例慢性乙型肝炎患者ｒｔＮ２３８Ｈ变异的发生频率及其与ＡＤＶ用药的关系；从典型
病例患者血清中克隆获得ＨＢＶ ｒｔＮ２３８Ｈ变异株并通过回复定点突变获得对应的野生株，分别构建ｐＴｒｉＥｘ—ＨＢＶ１．１
重组表达载体，瞬时转染ＨｅｐＧ２细胞。给予转染细胞不同浓度ＡＤＶ处理，用ＤＮａｓｅ消化游离ＤＮＡ后，对上清中成
熟病毒颗粒中的ＨＢＶ ＤＮＡ进行裂解定量以评价病毒的复制力。结果在１７８９例乙型肝炎患者中ｒｔＮ２３８Ｈ变异
为１８１例（１０．１％），其中ＨＢＶ Ｂ基因型感染为１５１例（８３．４％），Ｃ基因型感染为３０例（１６．６％）；ＡＤＶ经治和未治患
者分别为１３０例（７１．８．％）和５１例（２８．２％），其中对ＡＤＶ治疗产生临床应答（含部分应答）的占８２．３％（１０７／１３０），无
应答或出现病毒学反跳的占１７．７％（２３／１３０），但与野生株相比，ｔｒＮ２３８Ｈ变异株对ＡＤＶ的敏感性和病毒复制力无明
显的改变。结论ｒｔＮ２３８Ｈ是ＨＢＶ自然发生的多态性变异，对ＡＤＶ敏感性和复制力无直接的影响。
【关键词】慢性乙型肝炎；乙型肝炎病毒；变异；耐药性；阿德福韦
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－５０６９．２０１ １．０５．００３
Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｔＮ２３８Ｈ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｄｅｆｏｖｉｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ
ＺＨＵ Ｈｕａ，ＺＨＯＮＧ Ｙａｎｗｅｉ， Ｕ Ｚｈｉｈｕｉ，ｅｔ ｏ２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｌｉｎ Ｍｅｄｉｃ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，
Ｇｕａｎｇｘｉ Ｚｈｕａｎｇ Ａ ｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｔＮ２３８Ｈ ｖａｒｉａｎｔ ｏｎ ａｄｅｆｏｖｉｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｒｔＮ２３８Ｈ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ａｄｅｆｏｖｉｒ（ＡＤＶ）ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ １ ７８９
ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ．Ｔｈｅ ｒｔＮ２３８Ｎ ｖａｒｉａｎｔ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｃａｓｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｗｉｌｄ—．ｔｙｐｅ
ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ ｗａｓ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．ｐＴｒｉＥｘ—ＨＢＶ１．１ ｖｅｔｏｒｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ Ｎ２３８Ｈ ｖａｒｉａｎｔ ｏｒ
ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｒｉａｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＶ．Ａｆｔｅｒ ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ ｕｎｃｏａｔｅｄ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ＤＮａｓｅ，ＨＢＶ ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒ—
ｎａｔａｎｔ ｗａｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｏｎｅ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｅｉｇｈｔｙ ｏｎｅ（１ ０．１％）ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ａｓ ｈａｖｉｎｇ ｒｔＮ２３８Ｈ，ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅｍ，１５１（８３．４％）ｗｅｒｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｂ，ａｎｄ ３０（１６．６％）ｗｅｒｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ；１３０
ＡＤＶ—ｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ（７１．８．％）ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｒｔＮ２３８Ｈ ｖａｒｉａｎｔ ｔｈａｎ ５１ ＡＤＶ－ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ（２８．２％）：
Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ，ｒｔＮ２３８Ｈ ｈａｄ ｓｉｍｉｌａｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＡＤＶ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｔＮ２３８Ｈ ｉｓ ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ——ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｉｒｅｃｔ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ＡＤＶ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｕｓ；ｒＶａｒｉａｎｔ；Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；Ａｄｅｆｏｖｉｒ
研究表明，应用阿德福韦酯（ＡＤＶ）１年、２年、３
０％、３％、１１％、１８％和２９％ｌｌ＿。目前，明确的ＡＤＶ经典
耐药变异有ｒｔＮ２３６Ｔ和ｒｔＡ１８１Ｖ，这两种变异单独或
联合出现后可引起ＨＢＶ对ＡＤＶ的敏感性下降２～２０
年、４年和５年的相关耐药突变累积发生率分别为
基金项目：同家“十一五”传染病重大专项课题（２００８ＺＸ１０００２一
Ｏ１１）；北京市自然科学基金课题（７０９１００６）
作者单位：５４１００４广西壮族自治区桂林市桂林医学院生物技
术学院（朱华，苏何玲）；北京解放军第３０２医院肝衰竭诊疗研究中心
病毒性肝炎研究室（钟彦伟，许智慧，刘佳慧，刘妍，徐东平）
第一作者：朱华女，３２岁，医学硕士，讲师。主要从事乙型肝炎重
症化机制研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｕｂａｏｂａｏ１２１３＠１２６．ＣＯＦｌｌ
倍，引起病毒学和生化学反跳＿２叫。还有一些与ＡＤＶ
耐药相关变异的报道，但未被公认，被称为提议（ｐｒｏ—
ｐｏｓｅｄ）、次要（ｍｉｎｏｒ）或争议（ｄｅｂａｔｉｎｇ）变异，包括
ｒｔＶ８４Ｍ、ｒｔｌ８１Ｔ、ｒｔＶ２１４Ａ、ｒｔＱ２１５Ｓ、ｒｔＬ２１７Ｒ、ｒｔＩ２３３Ｖ和
通讯作者：徐东平，Ｅ—ｍａｉｈｘｕｄｏｎｇｐｉｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ
ｒｔＮ２３８Ｄ／Ｔ等【５ ｌ。如果对ＡＤＶ的敏感性下降仅３倍
・
３２８・ 月干旦 杂志２０１１年１ｏ月第１４卷第５期ＪＣｌｉｎ Ｈｅｐａｔｏ１，Ｏ ｃｔ＿２０１１．Ｖ０１．１５ Ｎｏ．５
（其他３种药物均在５０倍以上）即可引起临床耐药，
使表型耐药分析结果不易判断 。我们在对ＨＢＶ感染
患者的检测中发现，在ｒｔＮ２３８位点上ｒｔＮ２３８Ｈ变异较
ｒｔＮ２３８Ｄ／Ｔ更为常见，且在ＡＤＶ经治患者中的检出率
高于ＡＤＶ未治患者。本文对ＨＢＶ ｒｔＮ２３８Ｈ进行了进
一
学Ｚｏｕｌｉｍ教授惠赠，ＨＢＶ载量荧光定量试剂盒为上
海复兴医学科技发展有限公司产品。提取含有ＨＢＶＴ
基因的质粒，用Ｘｈｏ Ｉ和Ｎｃｏ Ｉ双酶切目的基因片段
及ｐＴｒｉＥｘ—ＨＢＶ１．１表达载体，电泳后回收目的基因片
段（１２５０ｂｐ）及ｐＴｒｉＥｘ—ＨＢＶ１．１表达载体片段，连接后
步分析研究，以明确该变异是否与ＡＤＶ耐药有关。
对象与方法
一
转化大肠杆菌，随机挑取克隆进行测序，确定ＨＢＶ表
达载体构建成功。将ＡＤＶ溶于ＤＭＳＯ，配制成浓缩液
（１Ｏｍｍｏｌ／Ｌ），临用前稀释成所需浓度。将ＨｅｐＧ２细胞
接种于２４孑Ｌ板（１０万／孔），１８小时后每孔转染０２２５Ｉｘｇ
质粒，５小时后，细胞用１×ＰＢＳ洗３遍，加入含不同浓
、
研究对象２００５年～２０１０年期间解放军第
３０２医院收住的慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者
１７８９例，均接受了ＨＢＶ ＤＮＡ序列测定。另于２００５年
１２月收住慢性乙型肝炎患者（男，３３岁）１例，取血进
行ＨＢＶ表型耐药分析，患者ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ和抗
一
ＨＢｃ阳性，ＨＢＶ ＤＮＡ阳性，给予ＡＤＶ（美国葛兰素
公司）治疗，病情逐渐好转，纳差症状消失，谷丙转氨
酶（ＡＬＴ）和谷草转氨酶（ＡＳＴ）恢复正常，ＨＢＶ ＤＮＡ转
为阴性。２００７年８月患者自行停用ＡＤＶ，２０天后再次
出现乏力纳差表现，血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗一ＨＢｅ和
抗一ＨＢｃ阳性，总胆红素／直接胆红素（Ｔ／ＤＢＩＬ）
２１．３／７．２１ｘｍｏｌ／Ｌ，ＡＩＪｒｒ ５５７Ｕ／Ｌ、ＡＳＴ １８８Ｕ／Ｌ，ＨＢＶ ＤＮＡ
７．２９５ｘ１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ。于２００７年１０月再次人院，给予
ＡＤＶ治疗，病情未见好转，ＨＢＶ ＤＮＡ仍为４．４０×
１ ０３ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ，ＨＢＶ ＤＮＡ序列测定检出ｒｔＮ２３８Ｈ变异，
未检出ｒｔＡ１８１Ｖ、ｎＮ２３６Ｔ或其它经典耐药变异，前
Ｃ／ＢＣＰ区有Ａ１７６２Ｔ＋Ｇ１７６４Ａ双联变异，无Ｇ１８９６Ａ变
异；其ＨＢＶ基因型分型为Ｃ型。
二、ＨＢＶ ＤＮＡ序列测定ＨＢＶ基因扩增的单管
巢式ＰＣＲ方法为我室建立，扩增测序的两个基因片
段（ｎｔ ５４ １３７８、ｎｔ １５８３ ２２２７）分别包括了ＨＢＶ逆转
录酶区和前ｃ／基本核心启动子区。根据测序结果进
行ＨＢＶ基因变异分析和基因分型 ｏｌ。
三、ＨＢＶ基因定点突变提取血清ＨＢＶ ＤＮＡ，
经巢式ＰＣＲ扩增后克隆到ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ载体中（美国
Ｐｒｏｍｅｇａ公司），根据需要合成定点变异引物，将
ｒｔＮ２３８Ｈ回复突变为野生序列。采用的定点试剂为美
国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司产品，引物序列和定点突
变操作按照我室以前发表的文献方法进行【ｌｌ１。随机挑
选３～５个克隆测序，获得该患者ＨＢＶ野生株（ｗｔ）。
四、病毒表型耐药与体外复制力检测取ＨｅｐＧ２
细胞购于美国模式培养物集存库（ＡＴＣＣ），经ＤＭＥＭ
（含１０％ＦＢＳ，青霉素１００Ｕ／ｍｌ，链霉素ｌＯＩｘｇ／ｍ１）培养；
转染试剂ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ购于
Ｒｏｃｈｅ公司，ｐＴｒｉＥｘ—ＨＢＶ１．１表达载体由法国里昂大
度的培养液培养（ＡＤＶ的浓度为０，０．０３３、０．１、０．３３、１．００
和３．３３Ｉｘｍｏｌ／Ｌ），隔天换液一次。换液后２天，收集细
胞培养上清，用ＤＮａｓｅ消化游离ＤＮＡ后，加入终浓度
为５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ ７５℃１５ｍｉｎ灭活ＤＮａｓｅ，裂解释放
Ｄａｎｅ颗粒中的ＤＮＡ，进行定量检测，计算药物的半数
有效浓度（ＥＣ５０）值，变异与野生株的ＥＣ５０比值代表
对药物敏感性的改变程度，未加药孑Ｌ细胞上清ＨＢＶ
ＤＮＡ水平代表病毒的复制力水平。
结果
一
、
ｒｔＮ２３８Ｈ变异发生率情况在１７８９例慢性乙
型肝炎患者中，共在ａ２３８位点上检出各类变异２３１
例（１２．９％），其中ｒｔＮ２３８Ｈ变异１８１例（１０．１％），后者
１６例（嘴９％）与经典ＡＤＶ耐药变异（ｒｔＮ２３６Ｖ／ｒｔＡ１８１Ｖ）
共存；另检出￣Ｎ２３８Ｔ １０例（Ｏ．５６％），ｒｔＮ２３８Ｄ ３例
（０．１７％），￣Ｎ２３６Ｓ １９例（１．０６％），ｒｔＮ２３６Ｘ ８例（０Ａ５％），
ｒｔＮ２３６Ｋ ５例（０．２８％），ｒｔＮ２３６Ｑ ２例（０．１１％），ｒｔＮ２３６Ｙ、
ｒｔＮ２３６Ｌ和ｒｔＮ２３６Ａ各１例（０．０６％）。
在１８１例ｒｔＮ２３８Ｈ变异患者中，男１５３例，女２８
例，年龄３６．７＿＿－１２．９岁，ＡＬＴ １１８．０￣２０２．７Ｕ／Ｌ，ＴＢＩＬ
２５４￣４１３１．ｚｍｏｌ／Ｌ，ＨＢＶ ＤＮＡ载量为ｌｇ７．７８￣３３４ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ。
ＡＤＶ经治和未治患者分别为１３０例（７１．８．％）和５１例
（２８．２％），其中对ＡＤＶ治疗产生临床应答（含部分应
答）的占８２．３％（１０７／１３０），无应答或出现病毒学反跳
的占１７．７％（２３／１３０）。１８１例中ＨＢＶ Ｂ基因型感染为
１５１例（８３．４％），Ｃ基因型感染为３０例（１６．６％）。
二、病毒复制力与表型耐药情况将含有
ｒｔＮ２３８Ｈ变异和对应的野生型序列的ＨＢＶ表达载体
瞬时转染ＨｅｐＧ２细胞，并经ＡＤＶ处理，取转染细胞
分泌培养上清进行定量，取３次独立实验的平均值
（表１）。按照不同ＡＤＶ药物浓度计算Ｎ２３８Ｈ变异株
ＥＣ５０＝０．１０￣０．０７１ｘｍｏｌ／Ｌ，回复突变野生株ＥＣ５０＝０．０８￣
０．０４１，ｚｍｏｌ／Ｌ，变异株是野生株的１．２５倍（图１）。
肝脏病杂志２０１１年ｌ０月第１４卷第５ ＪＣｌｉｎＨｅｐａｔｏｌ，Ｏｃｔ．２０１１．Ｖｏ１．１４Ｎｏ．５
・
３２９・
表１ ｒｔＮ２３８Ｈ变异株和野生株在不同药物浓度下的复制水平
了分析。结果表明，ＨＢＶ ｒｔＮ２３８Ｈ变异的检出率为
ｌＯＯ
８０
瓣
磊６０
曩们
２０
Ｏ
０ ０．０３３ ０．１ ０．３３ １ ３．３
阿德福韦浓度（ｎ ｍｏｌ／Ｌ）
图１阿德福韦对ＨＢＶ ｒｔＮ２３８Ｈ变异株和
野生株抑制率的比较
讨论
由于在ＨＢＶ复制过程中存在逆转录过程，其多
聚酶／逆转录酶缺乏纠错能力，容易产生变异（大约
为１０＿７／核苷酸／天），但由于ＨＢＶ基因组各读码框架
间存在编码基因共用，使变异对病毒产生损害的机率
增加；变异病毒需要进人其生命周期中独特的
ｃｃｃＤＮＡ池才能相对稳定，因而ＨＢＶ变异株的产生机
率又低于ＨＣＶ、ＨＩＶ等ＲＮＡ病毒㈣。核苷（酸）类药物
长期应用，可以使对环境压力适应力强的变异病毒获
得适应性突变和选择性扩增，或使已存在于准种群中
的极少量变异株获得选择性扩增，产生的变异如果引
起病毒对药物敏感性的显著下降，被称为原发耐药变
异；如变异虽不影响药物敏感性，但可显著增强耐药
变异株的复制力，被称为复制力补偿变异。这两种类
型的变异均对临床耐药具有意义。耐药相关病毒变异
具有以下几个特征：①与应用治疗药物相关；②临床
上出现病毒学反弹和（或）病情反复；③表型耐药分析
能证明变异病毒对治疗药物的敏感性降低或引起病
毒复制力增强；④可能出现在多个病例；⑤停药后病
毒有可能恢复为野生型 ３１。
我们在对临床大样本的ＨＢＶ进行变异检测中发
现ｒｔＮ２３８Ｈ有较高的发生率，同时注意到有文献报道
该位点发生的ｒｔＮ２３８Ｄ和ｒｔＮ２３８Ｔ变异与ＡＤＶ耐药
相关。为此，我们对ｒｔＮ２３８Ｈ与ＡＤＶ耐药相关性进行
１０．１％，明显高于ｒｔＮ２３８Ｔ（０．５６％）和ｒｔＮ２３８Ｄ（０．１７％），
且ＡＤＶ经治患者中ｒｔＮ２３８Ｈ变异的检出率明显高于
ＡＤＶ未治患者。为此，我们通过表型耐药和体外复制
力分析实验进一步明确该变异是否与阿德福韦耐药
相关，但结果表明，ｒｔＮ２３８Ｈ变异株的体外复制力与野
生株接近，对ＡＤＶ的ＥＣ５０值为野生株的１．２５倍，而
文献报道引起ＡＤＶ耐药变异ＥＣ５０值至少升高２倍，
我们对经典的ｒｔＮ２３６Ｔ变异株和Ａ１８１Ｖ变异株的表
型耐药分析结果也显示它们的ＡＤＶ ＥＣ５０较野生株
上升了３～１８倍，说明ｒｔＮ２３８Ｈ变异对ＡＤＶ耐药无直
接联系。从临床应答分析，该患者虽然产生了ｒｔＮ２３８Ｈ
变异，但ＡＤＶ治疗期问患者血清ＨＢＶ病毒载量从
７．２９５×１０５ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ下降至４．４×１０。ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ，病毒未能
转阴的原因可能与ＡＤＶ抑制病毒效果相对较弱有
关。在所有检出ｒｔＮ２３８Ｈ变异的ＡＤＶ经治患者（１８１
例）中，临床取得完全或部分应答的占８２．３％，也提示
ｒｔＮ２３８Ｈ与ＡＤＶ耐药可能没有直接的关系。
本研究选择克隆了一个代表病例ＨＢＶ ｒｔＮ２３８Ｈ
变异株，同时通过回复点突变获得了与变异株背景序
列完全相同的野生株。本文采用ｐＴｆｉＥｘ—ＨＢＶ１．１和
ＨｅｐＧ２细胞系统用于瞬时表达ＨＢＶ进行病毒复制力
和表型耐药测定，该系统可以获得较高的病毒复制表
达水平，便于进行表型耐药分析口４】。我们建立了时实
荧光定量ＰＣＲ方法进行表型耐药分析，对抽米夫定
等经典耐药变异的表型耐药分析取得了良好的效果
【Ｉ５１
。
用细胞培养上清ＨＢＶ ＤＮＡ定量进行表型耐药分
析已在一些研究中应用［３，１６，１７］。我们通过对多种典型耐
药变异ＨＢＶ的表型耐药分析，表明定量检测上清病
毒与定量检测核心颗粒来评估病毒水平的结果一致
性良好（结果未列出）。
在研究中我们发现在ｒｔＮ２３８Ｈ变异，Ｂ基因型感
染的比例为８３．４％，而Ｃ基因型为１６．６％，而总样本中
Ｃ基因型感染患者占到８０％，远远高于Ｂ基因型感染
患者。国内外不少研究表明ｃ基因型感染较Ｂ基因型
感染更易发生慢性化和肝癌。我们的研究表明在我国
北方地区，ＨＢＶ Ｃ２基因型／Ｂ２基因型感染在急性肝
炎、慢性肝炎、肝硬化、慢加急性肝衰竭和肝癌患者中
的比值分别为１．７、５．７、７．５、８．０和１５．３１ ８１。但ｎＮ２３８Ｈ变
异是否对不同基因型感染的临床意义产生影响尚待进
一
步研究。总之，本研究也为分析临床检出的ＨＢＶ特
殊变异形式与耐药的相关性建立了方法学基础，通过
对大样本变异的临床资料和体外表型耐药分析证实
ｒｔＮ２３８Ｈ对ＡＤＶ敏感性和复制力无（下转第３３５页）
肝脏病杂志２０１１年１Ｏ月第１４卷 』 型丛 ： Ｑ ： ！ ：
・
３３５・
和ＩＶＣ均有下降，脾脏厚度、门静脉直径也缩小；治疗后
［６］
徐有青，工宝恩，曹海根．肝脏纤维化程度的超声二维图像诊断
患者肝功能指标均有明显改善，提示补肾健脾活血方有
研究『Ｊ１＿中华肝脏病杂志，１９９８，６（４）：２４５．
良好的抗肝纤维化和改善肝功能的作用，表明补。肾健脾
【７］
巾华肝脏病学会肝纤维化学组．肝纤维化诊断及疗效评估共
识『Ｊ１．中华肝脏病杂志，２００２，１０（５）：３２７—３２８．
活血方是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的有效药物。
［８］
闫国珍，段云友，阮骊韬，等．肝纤维化患者无创定量超声评分与
参考文献
临床评分之间天系的临床研究『ＪＩ＿中华超声影像学杂志，２００６，１５
【１］倪童天，陆伦根．慢性乙型肝炎肝纤维化Ｉ临床诊断和治疗进
【８）：５８８—５９０．
展『Ｊ１．实用肝脏病杂志，２０１０，１３（２）：１４２—１４５．
『９１武金玉，陈敏华，戴莹，等．超声对肝纤维化和肝硬化半定量诊
ｆ２】王灵台．中西医治疗慢性乙型肝炎的问题和对策『Ｊ］．中国中西
断探讨ｌＪ１．中华超声影像学杂志，２００３，１２：４７８—４８１．
医结合杂志，２００９，２７（７）：５８３—５８４．
［１ ０＿王灵台．王灵台治疗肝炎后肝硬化的临床经验ｌ Ｊ＿．中医杂志，２００９，
［３］中华医学会肝病学分会和感染病学分会．慢性乙型肝炎防治指
５０（１０）：８７４—８７６．
南『Ｊ］．实用肝脏病杂志，２００６，９（１）：８－１８．
［１ｌ】赵钢．从“灵甲胶囊”的研制思路及过程，论王灵台教授对肝纤
［４］ 中国中西医结合学会肝病专业委员会．肝纤维化中西医结合诊
维化病机学说及治疗的发展ｌＪ１＿实用肝脏病杂志，２０１０，１３（１）：
疗指南 中华肝脏病杂志，２００６，１４（１１）：８６６—８７０．
５８—６０．
［５］马芝倩，赵天慧．慢性乙型肝炎患者的超声综合评分与病理分
（收稿：２０１１—０５—２５）
级分期的相关性ｌＪ１．医学影像学杂志，２０１０，２０（１２）：１８３２—
（校对：陈从新）
１ ８３５ ・
（上接第３２９页）
直接的影响。
ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂａｓａｌ ｃｏｒｅ
参考文献
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｅｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ５０７ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ａｎｄ
ｆ１］ＰＡＰＡＴＨＥＯＤＯＲＩＤＩＩＳ ＧＶ，ＭＡＮＯＬＡＫＯＰＯＵＬＯＳ Ｓ，ＤＵＳＨＥＩＫＯ
ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ『Ｊｌｌ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ，２０１０，４７（３）：２４３－２４７．
Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ
［１１］ＪＩ Ｄ，ＬＩＵ Ｙ，Ｓ１ ＬＬ，ｅｔ ａ１．Ｖａｒｉａｂｌｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｎｍｔａｔｉｏｎａｌ
ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，
ｔｍｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ——ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｎ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｅａｐａｅ——
２００８，８（３）：１６７１—１６７８．
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ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｅ ａｎｔｉｇｅｎ—ｎｅｇａｔｉｖｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｕｒｓ ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｈｅｐ—
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ｔａｎｔ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ：Ａｎ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｄｅｆｏｖｉｒ ｉｎ
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（收稿：２０１１—０４—２０）
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（校对：陈从新）
2024年10月7日发(作者：翠和正)
肝脏病杂志２０１１年１Ｏ月第１４卷第５ ，Ｑｃｔ． ．、， ： ．
・
３２７・
著・
乙型肝炎病毒ｒｔＮ２３８Ｈ变异与阿德福韦酯
耐药的相关性研究 出
朱华钟彦伟许智慧 刘佳慧 刘 妍 苏何玲徐东平
【摘要】 目的 阐明乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）多聚酶／逆转录酶区ｒｔＮ２３８Ｈ变异对临床产生阿德福韦（ＡＤＶ）
耐药的影响。方法分析了１７８９例慢性乙型肝炎患者ｒｔＮ２３８Ｈ变异的发生频率及其与ＡＤＶ用药的关系；从典型
病例患者血清中克隆获得ＨＢＶ ｒｔＮ２３８Ｈ变异株并通过回复定点突变获得对应的野生株，分别构建ｐＴｒｉＥｘ—ＨＢＶ１．１
重组表达载体，瞬时转染ＨｅｐＧ２细胞。给予转染细胞不同浓度ＡＤＶ处理，用ＤＮａｓｅ消化游离ＤＮＡ后，对上清中成
熟病毒颗粒中的ＨＢＶ ＤＮＡ进行裂解定量以评价病毒的复制力。结果在１７８９例乙型肝炎患者中ｒｔＮ２３８Ｈ变异
为１８１例（１０．１％），其中ＨＢＶ Ｂ基因型感染为１５１例（８３．４％），Ｃ基因型感染为３０例（１６．６％）；ＡＤＶ经治和未治患
者分别为１３０例（７１．８．％）和５１例（２８．２％），其中对ＡＤＶ治疗产生临床应答（含部分应答）的占８２．３％（１０７／１３０），无
应答或出现病毒学反跳的占１７．７％（２３／１３０），但与野生株相比，ｔｒＮ２３８Ｈ变异株对ＡＤＶ的敏感性和病毒复制力无明
显的改变。结论ｒｔＮ２３８Ｈ是ＨＢＶ自然发生的多态性变异，对ＡＤＶ敏感性和复制力无直接的影响。
【关键词】慢性乙型肝炎；乙型肝炎病毒；变异；耐药性；阿德福韦
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－５０６９．２０１ １．０５．００３
Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｔＮ２３８Ｈ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｄｅｆｏｖｉｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ
ＺＨＵ Ｈｕａ，ＺＨＯＮＧ Ｙａｎｗｅｉ， Ｕ Ｚｈｉｈｕｉ，ｅｔ ｏ２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｌｉｎ Ｍｅｄｉｃ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，
Ｇｕａｎｇｘｉ Ｚｈｕａｎｇ Ａ ｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｔＮ２３８Ｈ ｖａｒｉａｎｔ ｏｎ ａｄｅｆｏｖｉｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｒｔＮ２３８Ｈ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ａｄｅｆｏｖｉｒ（ＡＤＶ）ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ １ ７８９
ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ．Ｔｈｅ ｒｔＮ２３８Ｎ ｖａｒｉａｎｔ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｃａｓｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｗｉｌｄ—．ｔｙｐｅ
ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ ｗａｓ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．ｐＴｒｉＥｘ—ＨＢＶ１．１ ｖｅｔｏｒｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ Ｎ２３８Ｈ ｖａｒｉａｎｔ ｏｒ
ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｒｉａｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＶ．Ａｆｔｅｒ ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ ｕｎｃｏａｔｅｄ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ＤＮａｓｅ，ＨＢＶ ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒ—
ｎａｔａｎｔ ｗａｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｏｎｅ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｅｉｇｈｔｙ ｏｎｅ（１ ０．１％）ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ａｓ ｈａｖｉｎｇ ｒｔＮ２３８Ｈ，ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅｍ，１５１（８３．４％）ｗｅｒｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｂ，ａｎｄ ３０（１６．６％）ｗｅｒｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ；１３０
ＡＤＶ—ｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ（７１．８．％）ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｒｔＮ２３８Ｈ ｖａｒｉａｎｔ ｔｈａｎ ５１ ＡＤＶ－ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ（２８．２％）：
Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｗｉｌｄ—ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ，ｒｔＮ２３８Ｈ ｈａｄ ｓｉｍｉｌａｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＡＤＶ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｔＮ２３８Ｈ ｉｓ ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ——ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｉｒｅｃｔ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ＡＤＶ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｕｓ；ｒＶａｒｉａｎｔ；Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；Ａｄｅｆｏｖｉｒ
研究表明，应用阿德福韦酯（ＡＤＶ）１年、２年、３
０％、３％、１１％、１８％和２９％ｌｌ＿。目前，明确的ＡＤＶ经典
耐药变异有ｒｔＮ２３６Ｔ和ｒｔＡ１８１Ｖ，这两种变异单独或
联合出现后可引起ＨＢＶ对ＡＤＶ的敏感性下降２～２０
年、４年和５年的相关耐药突变累积发生率分别为
基金项目：同家“十一五”传染病重大专项课题（２００８ＺＸ１０００２一
Ｏ１１）；北京市自然科学基金课题（７０９１００６）
作者单位：５４１００４广西壮族自治区桂林市桂林医学院生物技
术学院（朱华，苏何玲）；北京解放军第３０２医院肝衰竭诊疗研究中心
病毒性肝炎研究室（钟彦伟，许智慧，刘佳慧，刘妍，徐东平）
第一作者：朱华女，３２岁，医学硕士，讲师。主要从事乙型肝炎重
症化机制研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｕｂａｏｂａｏ１２１３＠１２６．ＣＯＦｌｌ
倍，引起病毒学和生化学反跳＿２叫。还有一些与ＡＤＶ
耐药相关变异的报道，但未被公认，被称为提议（ｐｒｏ—
ｐｏｓｅｄ）、次要（ｍｉｎｏｒ）或争议（ｄｅｂａｔｉｎｇ）变异，包括
ｒｔＶ８４Ｍ、ｒｔｌ８１Ｔ、ｒｔＶ２１４Ａ、ｒｔＱ２１５Ｓ、ｒｔＬ２１７Ｒ、ｒｔＩ２３３Ｖ和
通讯作者：徐东平，Ｅ—ｍａｉｈｘｕｄｏｎｇｐｉｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ
ｒｔＮ２３８Ｄ／Ｔ等【５ ｌ。如果对ＡＤＶ的敏感性下降仅３倍
・
３２８・ 月干旦 杂志２０１１年１ｏ月第１４卷第５期ＪＣｌｉｎ Ｈｅｐａｔｏ１，Ｏ ｃｔ＿２０１１．Ｖ０１．１５ Ｎｏ．５
（其他３种药物均在５０倍以上）即可引起临床耐药，
使表型耐药分析结果不易判断 。我们在对ＨＢＶ感染
患者的检测中发现，在ｒｔＮ２３８位点上ｒｔＮ２３８Ｈ变异较
ｒｔＮ２３８Ｄ／Ｔ更为常见，且在ＡＤＶ经治患者中的检出率
高于ＡＤＶ未治患者。本文对ＨＢＶ ｒｔＮ２３８Ｈ进行了进
一
学Ｚｏｕｌｉｍ教授惠赠，ＨＢＶ载量荧光定量试剂盒为上
海复兴医学科技发展有限公司产品。提取含有ＨＢＶＴ
基因的质粒，用Ｘｈｏ Ｉ和Ｎｃｏ Ｉ双酶切目的基因片段
及ｐＴｒｉＥｘ—ＨＢＶ１．１表达载体，电泳后回收目的基因片
段（１２５０ｂｐ）及ｐＴｒｉＥｘ—ＨＢＶ１．１表达载体片段，连接后
步分析研究，以明确该变异是否与ＡＤＶ耐药有关。
对象与方法
一
转化大肠杆菌，随机挑取克隆进行测序，确定ＨＢＶ表
达载体构建成功。将ＡＤＶ溶于ＤＭＳＯ，配制成浓缩液
（１Ｏｍｍｏｌ／Ｌ），临用前稀释成所需浓度。将ＨｅｐＧ２细胞
接种于２４孑Ｌ板（１０万／孔），１８小时后每孔转染０２２５Ｉｘｇ
质粒，５小时后，细胞用１×ＰＢＳ洗３遍，加入含不同浓
、
研究对象２００５年～２０１０年期间解放军第
３０２医院收住的慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者
１７８９例，均接受了ＨＢＶ ＤＮＡ序列测定。另于２００５年
１２月收住慢性乙型肝炎患者（男，３３岁）１例，取血进
行ＨＢＶ表型耐药分析，患者ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ和抗
一
ＨＢｃ阳性，ＨＢＶ ＤＮＡ阳性，给予ＡＤＶ（美国葛兰素
公司）治疗，病情逐渐好转，纳差症状消失，谷丙转氨
酶（ＡＬＴ）和谷草转氨酶（ＡＳＴ）恢复正常，ＨＢＶ ＤＮＡ转
为阴性。２００７年８月患者自行停用ＡＤＶ，２０天后再次
出现乏力纳差表现，血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗一ＨＢｅ和
抗一ＨＢｃ阳性，总胆红素／直接胆红素（Ｔ／ＤＢＩＬ）
２１．３／７．２１ｘｍｏｌ／Ｌ，ＡＩＪｒｒ ５５７Ｕ／Ｌ、ＡＳＴ １８８Ｕ／Ｌ，ＨＢＶ ＤＮＡ
７．２９５ｘ１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ。于２００７年１０月再次人院，给予
ＡＤＶ治疗，病情未见好转，ＨＢＶ ＤＮＡ仍为４．４０×
１ ０３ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ，ＨＢＶ ＤＮＡ序列测定检出ｒｔＮ２３８Ｈ变异，
未检出ｒｔＡ１８１Ｖ、ｎＮ２３６Ｔ或其它经典耐药变异，前
Ｃ／ＢＣＰ区有Ａ１７６２Ｔ＋Ｇ１７６４Ａ双联变异，无Ｇ１８９６Ａ变
异；其ＨＢＶ基因型分型为Ｃ型。
二、ＨＢＶ ＤＮＡ序列测定ＨＢＶ基因扩增的单管
巢式ＰＣＲ方法为我室建立，扩增测序的两个基因片
段（ｎｔ ５４ １３７８、ｎｔ １５８３ ２２２７）分别包括了ＨＢＶ逆转
录酶区和前ｃ／基本核心启动子区。根据测序结果进
行ＨＢＶ基因变异分析和基因分型 ｏｌ。
三、ＨＢＶ基因定点突变提取血清ＨＢＶ ＤＮＡ，
经巢式ＰＣＲ扩增后克隆到ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ载体中（美国
Ｐｒｏｍｅｇａ公司），根据需要合成定点变异引物，将
ｒｔＮ２３８Ｈ回复突变为野生序列。采用的定点试剂为美
国Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司产品，引物序列和定点突
变操作按照我室以前发表的文献方法进行【ｌｌ１。随机挑
选３～５个克隆测序，获得该患者ＨＢＶ野生株（ｗｔ）。
四、病毒表型耐药与体外复制力检测取ＨｅｐＧ２
细胞购于美国模式培养物集存库（ＡＴＣＣ），经ＤＭＥＭ
（含１０％ＦＢＳ，青霉素１００Ｕ／ｍｌ，链霉素ｌＯＩｘｇ／ｍ１）培养；
转染试剂ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ购于
Ｒｏｃｈｅ公司，ｐＴｒｉＥｘ—ＨＢＶ１．１表达载体由法国里昂大
度的培养液培养（ＡＤＶ的浓度为０，０．０３３、０．１、０．３３、１．００
和３．３３Ｉｘｍｏｌ／Ｌ），隔天换液一次。换液后２天，收集细
胞培养上清，用ＤＮａｓｅ消化游离ＤＮＡ后，加入终浓度
为５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ ７５℃１５ｍｉｎ灭活ＤＮａｓｅ，裂解释放
Ｄａｎｅ颗粒中的ＤＮＡ，进行定量检测，计算药物的半数
有效浓度（ＥＣ５０）值，变异与野生株的ＥＣ５０比值代表
对药物敏感性的改变程度，未加药孑Ｌ细胞上清ＨＢＶ
ＤＮＡ水平代表病毒的复制力水平。
结果
一
、
ｒｔＮ２３８Ｈ变异发生率情况在１７８９例慢性乙
型肝炎患者中，共在ａ２３８位点上检出各类变异２３１
例（１２．９％），其中ｒｔＮ２３８Ｈ变异１８１例（１０．１％），后者
１６例（嘴９％）与经典ＡＤＶ耐药变异（ｒｔＮ２３６Ｖ／ｒｔＡ１８１Ｖ）
共存；另检出￣Ｎ２３８Ｔ １０例（Ｏ．５６％），ｒｔＮ２３８Ｄ ３例
（０．１７％），￣Ｎ２３６Ｓ １９例（１．０６％），ｒｔＮ２３６Ｘ ８例（０Ａ５％），
ｒｔＮ２３６Ｋ ５例（０．２８％），ｒｔＮ２３６Ｑ ２例（０．１１％），ｒｔＮ２３６Ｙ、
ｒｔＮ２３６Ｌ和ｒｔＮ２３６Ａ各１例（０．０６％）。
在１８１例ｒｔＮ２３８Ｈ变异患者中，男１５３例，女２８
例，年龄３６．７＿＿－１２．９岁，ＡＬＴ １１８．０￣２０２．７Ｕ／Ｌ，ＴＢＩＬ
２５４￣４１３１．ｚｍｏｌ／Ｌ，ＨＢＶ ＤＮＡ载量为ｌｇ７．７８￣３３４ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ。
ＡＤＶ经治和未治患者分别为１３０例（７１．８．％）和５１例
（２８．２％），其中对ＡＤＶ治疗产生临床应答（含部分应
答）的占８２．３％（１０７／１３０），无应答或出现病毒学反跳
的占１７．７％（２３／１３０）。１８１例中ＨＢＶ Ｂ基因型感染为
１５１例（８３．４％），Ｃ基因型感染为３０例（１６．６％）。
二、病毒复制力与表型耐药情况将含有
ｒｔＮ２３８Ｈ变异和对应的野生型序列的ＨＢＶ表达载体
瞬时转染ＨｅｐＧ２细胞，并经ＡＤＶ处理，取转染细胞
分泌培养上清进行定量，取３次独立实验的平均值
（表１）。按照不同ＡＤＶ药物浓度计算Ｎ２３８Ｈ变异株
ＥＣ５０＝０．１０￣０．０７１ｘｍｏｌ／Ｌ，回复突变野生株ＥＣ５０＝０．０８￣
０．０４１，ｚｍｏｌ／Ｌ，变异株是野生株的１．２５倍（图１）。
肝脏病杂志２０１１年ｌ０月第１４卷第５ ＪＣｌｉｎＨｅｐａｔｏｌ，Ｏｃｔ．２０１１．Ｖｏ１．１４Ｎｏ．５
・
３２９・
表１ ｒｔＮ２３８Ｈ变异株和野生株在不同药物浓度下的复制水平
了分析。结果表明，ＨＢＶ ｒｔＮ２３８Ｈ变异的检出率为
ｌＯＯ
８０
瓣
磊６０
曩们
２０
Ｏ
０ ０．０３３ ０．１ ０．３３ １ ３．３
阿德福韦浓度（ｎ ｍｏｌ／Ｌ）
图１阿德福韦对ＨＢＶ ｒｔＮ２３８Ｈ变异株和
野生株抑制率的比较
讨论
由于在ＨＢＶ复制过程中存在逆转录过程，其多
聚酶／逆转录酶缺乏纠错能力，容易产生变异（大约
为１０＿７／核苷酸／天），但由于ＨＢＶ基因组各读码框架
间存在编码基因共用，使变异对病毒产生损害的机率
增加；变异病毒需要进人其生命周期中独特的
ｃｃｃＤＮＡ池才能相对稳定，因而ＨＢＶ变异株的产生机
率又低于ＨＣＶ、ＨＩＶ等ＲＮＡ病毒㈣。核苷（酸）类药物
长期应用，可以使对环境压力适应力强的变异病毒获
得适应性突变和选择性扩增，或使已存在于准种群中
的极少量变异株获得选择性扩增，产生的变异如果引
起病毒对药物敏感性的显著下降，被称为原发耐药变
异；如变异虽不影响药物敏感性，但可显著增强耐药
变异株的复制力，被称为复制力补偿变异。这两种类
型的变异均对临床耐药具有意义。耐药相关病毒变异
具有以下几个特征：①与应用治疗药物相关；②临床
上出现病毒学反弹和（或）病情反复；③表型耐药分析
能证明变异病毒对治疗药物的敏感性降低或引起病
毒复制力增强；④可能出现在多个病例；⑤停药后病
毒有可能恢复为野生型 ３１。
我们在对临床大样本的ＨＢＶ进行变异检测中发
现ｒｔＮ２３８Ｈ有较高的发生率，同时注意到有文献报道
该位点发生的ｒｔＮ２３８Ｄ和ｒｔＮ２３８Ｔ变异与ＡＤＶ耐药
相关。为此，我们对ｒｔＮ２３８Ｈ与ＡＤＶ耐药相关性进行
１０．１％，明显高于ｒｔＮ２３８Ｔ（０．５６％）和ｒｔＮ２３８Ｄ（０．１７％），
且ＡＤＶ经治患者中ｒｔＮ２３８Ｈ变异的检出率明显高于
ＡＤＶ未治患者。为此，我们通过表型耐药和体外复制
力分析实验进一步明确该变异是否与阿德福韦耐药
相关，但结果表明，ｒｔＮ２３８Ｈ变异株的体外复制力与野
生株接近，对ＡＤＶ的ＥＣ５０值为野生株的１．２５倍，而
文献报道引起ＡＤＶ耐药变异ＥＣ５０值至少升高２倍，
我们对经典的ｒｔＮ２３６Ｔ变异株和Ａ１８１Ｖ变异株的表
型耐药分析结果也显示它们的ＡＤＶ ＥＣ５０较野生株
上升了３～１８倍，说明ｒｔＮ２３８Ｈ变异对ＡＤＶ耐药无直
接联系。从临床应答分析，该患者虽然产生了ｒｔＮ２３８Ｈ
变异，但ＡＤＶ治疗期问患者血清ＨＢＶ病毒载量从
７．２９５×１０５ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ下降至４．４×１０。ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ，病毒未能
转阴的原因可能与ＡＤＶ抑制病毒效果相对较弱有
关。在所有检出ｒｔＮ２３８Ｈ变异的ＡＤＶ经治患者（１８１
例）中，临床取得完全或部分应答的占８２．３％，也提示
ｒｔＮ２３８Ｈ与ＡＤＶ耐药可能没有直接的关系。
本研究选择克隆了一个代表病例ＨＢＶ ｒｔＮ２３８Ｈ
变异株，同时通过回复点突变获得了与变异株背景序
列完全相同的野生株。本文采用ｐＴｆｉＥｘ—ＨＢＶ１．１和
ＨｅｐＧ２细胞系统用于瞬时表达ＨＢＶ进行病毒复制力
和表型耐药测定，该系统可以获得较高的病毒复制表
达水平，便于进行表型耐药分析口４】。我们建立了时实
荧光定量ＰＣＲ方法进行表型耐药分析，对抽米夫定
等经典耐药变异的表型耐药分析取得了良好的效果
【Ｉ５１
。
用细胞培养上清ＨＢＶ ＤＮＡ定量进行表型耐药分
析已在一些研究中应用［３，１６，１７］。我们通过对多种典型耐
药变异ＨＢＶ的表型耐药分析，表明定量检测上清病
毒与定量检测核心颗粒来评估病毒水平的结果一致
性良好（结果未列出）。
在研究中我们发现在ｒｔＮ２３８Ｈ变异，Ｂ基因型感
染的比例为８３．４％，而Ｃ基因型为１６．６％，而总样本中
Ｃ基因型感染患者占到８０％，远远高于Ｂ基因型感染
患者。国内外不少研究表明ｃ基因型感染较Ｂ基因型
感染更易发生慢性化和肝癌。我们的研究表明在我国
北方地区，ＨＢＶ Ｃ２基因型／Ｂ２基因型感染在急性肝
炎、慢性肝炎、肝硬化、慢加急性肝衰竭和肝癌患者中
的比值分别为１．７、５．７、７．５、８．０和１５．３１ ８１。但ｎＮ２３８Ｈ变
异是否对不同基因型感染的临床意义产生影响尚待进
一
步研究。总之，本研究也为分析临床检出的ＨＢＶ特
殊变异形式与耐药的相关性建立了方法学基础，通过
对大样本变异的临床资料和体外表型耐药分析证实
ｒｔＮ２３８Ｈ对ＡＤＶ敏感性和复制力无（下转第３３５页）
肝脏病杂志２０１１年１Ｏ月第１４卷 』 型丛 ： Ｑ ： ！ ：
・
３３５・
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ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ ａｎｄ ａｄｅｆｏｖｉｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ—
ｔａｎｔ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ：Ａｎ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｄｅｆｏｖｉｒ ｉｎ
ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｄａｔｉｅｎｔｓ：ｉｎｎｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ
ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ［Ｊ］．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ，
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ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ——ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｉｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ＨＢＶ—－ｉｎｆｅｃｔｅｄ
ａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｕｒｓ［Ｊ１＿Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ，
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