2024年6月11日发(作者：宾华采)

到其外表面。另一形式是体外复制型基因包，诸如连结编码RNA与翻译蛋白的核

糖体。在核糖体展示中，遗传物质通过聚合酶的酶扩增进行复制。

载有识别靶分子的结合剂的那些细胞或病毒核酸被分离和，必要时，被扩增。基因

包优选是M13噬菌体，蛋白包括M13基因III蛋白的外表面输送信号。

优选在本发明的方法中，基因包的载体或质粒在转录调控元件的严密控制下，调节

培养条件以便在颗粒表面展示少于两个拷贝融合蛋白的载体或噬菌粒颗粒的量或数

低于约20％。更优选，展示低于两个拷贝融合蛋白的载体或噬菌粒颗粒的量低于

展示一个或更多个拷贝融合蛋白的颗粒量的10％。最优选所述量低于1％。

本发明使用的表达载体优选能够表达结合多肽，可以如下产生：首先通过引入多个

编码不同结合序列的多核苷酸，合成结合多肽基因文库。可以合成合适量的多个多

核苷酸，将其以可操作的组合方式连接入载体，通过载体增殖来表达所述结合多肽

的融合蛋白。可选的还可以通过聚合酶链式反应扩增多个多核苷酸以获得足够的材

料用于表达。但是，这只在结合多肽由大的多核苷酸序列(例如长于200个碱基对，

或有时长于300碱基对)编码的情况下才是有利的。因此，优选形成多样性合成文

库，使得可以从所述多样性文库筛选至少一种能够产生具有所需预选功能和结合性

(诸如特异性)的结合多肽的表达载体。

参照下列实施例将更全面的理解上述描述。但是，这类实施例仅仅是代表实施本发

明一种或更多种实施方案的方法，不应被当作限制本发明的范围。

实施例

实施例1：构建非集中型Fcab文库(Fcab01)和进行噬菌体表面展示

IgG1 Fc片段的晶体结构公开于Brookhaven Database，登录号为，用它

帮助设计Fcab文库。

用做构建Fcab文库的基础的序列在SEQ ID No.1中给出。在该序列中，第一个氨

基酸对应于人IgG1的Glu 216(EU编号；根据IMGT数据库

(/textes/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHC

；2007年6月25日查询)，它是人IgG1铰链区(指定为人IgG1重链恒

定铰链区的(E)PKSCDKTHTCPPCP)的第一个残基。SEQ IDNo.1的倒数第二个残基

对应于人IgG1的Gly 446(EU编号；IMGT：人IgG1CH3结构域的残基号129)。

在仔细分析的结构和目测检查形成连接beta链的环的残基后，决定将残

基144，145和146(它们属于连接beta链A-B的环的一部分)以及198，199，200，

203和204(它们属于连接SEQ ID No.1的beta链E-F的环的一部分)随机化。除突

变残基之外，在SEQ ID No.1的残基号198处插入5个残基。在SEQ ID No.2中，

给出文库Fcab01的文库插入物的序列，其中所有随机化的残基位置以及5个插入

残基用字母X表示。

利用简并引物通过一系列PCR反应、之后将所获PCR产物连接来产生工程化基因。

为了促进连接，对编码SEQ ID No.1的核苷酸序列的一些密码子进行修饰，以产生

限制性酶切位点但不改变氨基酸序列(沉默突变)。为了插入克隆载体

pHEN1(Nucleic Acids Res.1991 Aug 11；19(15)：4133-7Multi-

subunit proteins on the surface of filamentous phage：

methodologies fordisplaying antibody(Fab)heavy and light boom HR，

GriffithsAD，Johnson KS，Chiswell DJ，Hudson P，Winter G.)，与pelB分泌信号

位于同一读框中，使用靠近pelB分泌信号3′末端的NcoI限制性酶切位点。对于随

机化的残基，使用密码子NNS(IUPAC编号，其中S表示核苷酸C和G)，其编码

所有20种天然存在的氨基酸，但避开了3种终止密码子中的2种。还可以使用其

它密码子诸如NNB(B表示核苷酸T、C和G)。工程化的序列在SEQ ID No.3的核

苷酸序列中给出。该序列还包括用于克隆入噬菌粒展示载体pHEN1的限制性酶切

位点，即5′端的NcoI位点和3′端的NotI位点。

用于组装突变CH3结构域的PCR引物序列在SEQ ID No.4到SEQ IDNo.9中给出。

SEQ ID No.4(PCR引物EPKSNCO)

ccatggccgagcccaaatcttgtgacaaaactc

SEQ ID No.5(PCR引物CH3LSAC)

agtcgagctcgtcacgggatgggggcaggg

SEQ ID No.6(PCR引物CH3CSAC)

gtacgagctcnnsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctgg

SEQ ID No.7(PCR引物CH3CHIN)

tgccaagcttgctgtagaggaagaaggagccg

SEQ ID No.8(PCR引物CH3RHIN)

tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsaggtggnnsnnsgggaacgtcttctcatgctccg

SEQ ID No.9(PCR引物CH3RNOT)

agttgcggccgctttacccggagacagggagag

图1显示为组装突变基因而生成的PCR片段及其所用的引物。

人单克隆抗体3D6的重链cDNA(Felgenhauer M，Kohl J，

Ruker tide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H-and L-

chainsof a human mono-clonal antibody specific to HIV-l-

c Acids Res.1990 Aug 25；18(16)：4927)被用作PCR反应的模板。分别

利用SacI和/或HindIII消化3个PCR产物，然后将其连接到一起。连接产物进一

步用NcoI和NotI消化，然后连接入先前已经用NcoI和NotI消化的表面展示噬菌

粒载体pHEN1中。然后通过电穿孔将连接产物转化入大肠杆菌。通过限制性分析

和DNA测序控制多个选出的克隆，发现其中包含按计划的插入物，包括正确插入

的随机化序列。对于下列噬菌体制备步骤，遵循标准步骤。简单来说，通过电穿孔

将连接混合物转化入大肠杆菌TG1细胞。随后，利用辅助噬菌体M13-KO7从大肠

杆菌TG1细胞挽救(rescued)噬菌体颗粒。然后采用2步法利用PEG/NaCl从培养上

清中沉淀出噬菌体颗粒，将其溶于水中，用于通过淘选法来选择，或可选的，将其

保存于-80℃。

实施例2：构建集中型Fcab文库(Fcab02)和进行噬菌体表面展示

如实施例1所述，制备Fcab文库，其中随机化文库位置是完全随机的，即它们由

密码子诸如NNS、NNB、NNK、NNN编码，或使用其它密码子。

为了清楚起见，字母诸如N、B、S或K的含义由IUPAC核苷酸模糊编码

(ambiguity code)定义，这在下表中列出：

表核苷酸模糊编码

来源：Nomenclature for incompletely specified bases in nucleic acid sequences：

recommendations 1984.A Cornish-Bowden，Nucleic Acids Res.1985 May 10；13(9)：

3021-3030。

上面列出的这些密码子被设计为使得所有20种氨基酸都由它们编码。从可能的氨

基酸中选择亚组有可能更好。实例可以参见文献(Fellouse FA，LiB，Compaan DM，

Peden AA，Hymowitz SG，

Sidhu lar recognition bya binary code.J MoI Biol.2005 May 20；348(5)：

2005 Apr 1.；Fellouse FA，Wiesmann C，

Sidhu tic antibodies from afour-amino-acid code：

a dominant role for tyrosine in antigen tl Acad Sci U S A.2004 Aug 2

4；101(34)： 2004 Aug 11.)。例如通过使用密码子KMT(其编码氨基

酸Ser、Tyr、Ala和Asp)可以构建例如只允许4种不同氨基酸类型的集中型文库。

除了NNS密码子被替换为KMT密码子之外，按照与实施例1描述的相同方式构

建出集中型Fcab文库(命名为Fcab02)。

因此，SEQ ID No.2中的字母“X”现在表示“S，Y，A和D”(Ser，Tyr，Ala和Asp)

以便描述集中型文库Fcab02。

实施例3：构建噬菌体表面展示文库，其在文库插入物(结合伴侣)和p3之间具有额

外氨基酸残基

为了研究所展示蛋白的潜在结合位点的易接近性，进行结合分析法：将噬菌体悬浮

液与抗myc mAb 9E10包被的微板(或免疫管(immunotubes))反应。清洗后，利用抗

M13酶偶联物检测结合的噬菌体。作为对照，辅助噬菌体(其不展示蛋白融合体和

myc-标签)与板反应。其它对照是噬菌体与未包被板的反应，以及噬菌体与识别噬

菌体的p3融合伴侣的抗血清的反应。

理论上，展示p3融合蛋白的噬菌体的抗myc反应型应当给出非常清楚的ELISA读

数，而针对抗myc-mAb的辅助噬菌体反应不应高于背景(未包被板)。通过结合作

为锚(anchor)的蛋白III而在M13噬菌体表面展示的CH3二聚体的结构是这样的，

每个CH3利用具有不同长度和组成的接头锚定到蛋白III。因此，CH3二聚体优选

通过两个锚来展示。

接头优化：

如果所展示分子的潜在结合位点在空间上靠近噬菌体颗粒，则位于待展示蛋白和基

因包锚定蛋白(在丝状噬菌体情况下，例如p3，p8，pX，pIX，pVII)之间的接头是

尤其重要的。在利用由CDR环形成的可变区和抗原结合位点、并将库成员展示为

p3的氨基端融合物的抗体文库中，潜在的抗原结合位点指向背离噬菌体颗粒的方

向。因此，库成员和噬菌体外壳蛋白之间的接头结构不太重要。但是改造免疫球蛋

白区的底部环和进行噬菌体展示可能是一种低效步骤，降低抗原结合克隆的产率或

甚至排斥它。改变库成员蛋白与其融合伴侣之间位于表面的接头可以解决或可能至

少减少该问题。

为了选择(在长度和柔性以及稳定性方面)最佳的接头序列，可以制备接头文库，在

其中将复制型基因包表面的锚定蛋白与因空间原因而出了名地难于选择的已知结合

蛋白融合。该文库的序列可以在长度和氨基酸含量方面不同。

在接头文库中选择最佳接头的方法取决于用途，但基本上应当是选择在某一方法学

中希望具有的所有特性的方法。针对难于选择的抗原进行的富集可以产生允许库成

员容易地接近该抗原的接头序列。在蛋白酶溶液中或其它苛刻条件下进行温育，或

者在蛋白水解条件下(例如用老龄的微生物培养物)通过宿主细胞进行频繁传代，可

以是稳定展示接头的合适选择法。

接头文库可通过任何公知的文库技术产生。合成的接头序列长度可以为10-500个

氨基酸不等。可选的，接头可以是已知具有柔性的完整蛋白。

接头优化Fcab01：

举例来说，可以使用文库Fcab01(如实施例1所述)。首先，利用NcoI和NotI限制

性酶切位点将该文库克隆入噬菌粒展示载体pHEN1。当采用这种方式克隆时，18

个氨基酸残基位于Fcab01文库插入物的C端氨基酸残基与噬菌体M13 p3的N端

氨基酸残基之间。该连接区的序列在

SEQ ID No.10SPGKAAAEQKLISEEDLNGAATVES中给出，解释如下：前4个残

基SPGK是Fcab01文库插入物的4个C端残基，然后是氨基酸序列AAA(其是由

NotI限制性酶切位点编码的氨基酸残基)，然后是序列EQKLISEEDL(其是myc表

位)，然后是NGAA，其后存在一个UAG终止密码子，该终止密码子在大肠杆菌

的琥珀抑制者菌株诸如TG1中被翻译为谷氨酰胺(Q)。SEQ IDNo.10的C端4个残

基TVES是存在于载体pHEN1中的噬菌体M13 p3的N端4个残基。

为了构建展示Fcab插入物、且Fcab(结合伴侣)与噬菌体(基因包)之间的距离增加的

噬菌体，将5个额外残基插入Fcab插入物FcabRGD4的C端，在紧接NotI克隆位

点的上游，产生克隆FcabRGD4L。FcabRGD4是一种Fcab，其在CH3结构域的

EF环中插入了能与整联蛋白结合的RGD基元，并且在ELISA中结合ανβ3-整联蛋

白。作为长度增加的接头序列，使用氨基酸序列EGGGS，其在噬菌体M13p3序列

中出现8次。所获FcabRGD4L氨基酸序列在克隆入pHEN1后表达为

SEQ ID No.11。在SEQ ID No.11中，氨基酸残基198-204代表RGD基元，氨基酸

残基237是Fcab插入物的C端残基，残基238-242代表插入的接头序列(其与未改

造的pHEN1不同)，其后是myc标签、UAG终止密码子和p3序列。

为了克隆构建体，利用PCR引物EPKSNCO(SEQ ID No.4)和

CH3rlinkactagcggccgcagagccaccaccctccttacccggagacagggagag(SEQ ID No.13)从

pHENFcabRGD4(SEQ ID No.12)扩增FcabRGD4序列，并通过NcoI和NotI限制性

酶切位点将其克隆入载体pHEN1。所获载体pHENFcabRGD4L(SEQID No.14)在核

苷酸3057-3071位处具有额外的接头序列。

将两种噬菌粒载体pHENFcabRGD4和pHENFcabRGD4L转化入大肠杆菌TG1。随

后，利用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞挽救噬菌体颗粒。然后按照2

步法利用PEG/NaCl从培养上清中沉淀出噬菌体颗粒，将其溶于水中，用于ELISA。

如下进行噬菌体ELISA：

噬菌体悬浮液与包被ανβ3-整联蛋白的微板(或免疫管)反应。清洗后，利用抗M13

酶偶联物检测结合的噬菌体。作为对照，辅助噬菌体(其不展示蛋白融合体和myc-

标签)与板反应，以及表面载有wtFcab的噬菌体颗粒与板反应。其它对照是噬菌体

与未包被板的反应，以及噬菌体与识别噬菌体的Fcab融合伴侣的抗血清的反应。

与具有pHENFcabRGD4包含的原始接头的噬菌体颗粒相比，具有源于

pHENFcabRGD4L的增长接头的噬菌体颗粒更容易与ανβ3-整联蛋白反应，从而在

ELISA中产生更强的信号。

可以进行噬菌体筛选，其中将具有wtFcab的噬菌体颗粒与少量载有FcabRGD4或

FcabRGD4L的噬菌体颗粒混合。在数轮(通常3-5轮)淘选后，优先选出展示

FcabRGD4L的噬菌体。

实施例4：Fcab文库设计

(″Fcab″是f-star Biotechnologische b.H.的注册商标)

Fcab文库的设计(在图2中显示)：抗体CH3恒定区的非CDR环中的氨基酸位置被

考虑进行随机化。环A-B、C-D和E-F是特别被考虑的，因为它们都位于结构域的

一侧。在具体位置随机化的一些设计标准在本文描述。

频繁参与抗原抗体相互作用的氨基酸在本文中被描述为包括在集中型文库中。本文

中氨基酸Ala、Asp、Ser和Tyr用于设计集中型文库。

具有受限的氨基酸应用的文库已经被证明足以产生实质上抗任何抗原的结合剂

(Sidhu&Fellhouse，NATURE CHEMICAL BIOLOGY VOLUME 2page 682ff；

Koide et al PNAS，volume 104 p6632-6637)。这类受限(或集中型)文库的优点是它

们完全可以用当前的技术手段来实现。理论上，氨基酸应用反映了配体受体结合的

天然氨基酸应用。但是，即使只利用2种氨基酸(酪氨酸和丝氨酸)的文库据报道也

得到较好的筛选结果(在抗不同结合剂的结合剂频率以及在亲和力方面)。

环的柔性：

支架蛋白可能需要一些环结构以便总体上维持天然结构。在随机化位置的一侧或双

侧构建一些序列有可能促进环中多个氨基酸位置的随机化甚至环的延长。这些序列

可以是柔性的序列，以便允许弥补这类位置中一些文库序列的任何张力。

表2：示例性的Fcab^TM文库，集中型和非集中型的

Fcab01文库在以上实施例中描述。集中型文库设计Fcab02、Fcab04和Fcab06的序

列空间被大约10e9的实际细菌文库大小覆盖。与此相反，完全随机化的文库

Fcab01、Fcab03和Fcab05事实上远远未能被充分代表。

实施例5：通过同源重组来克隆酵母展示文库

载体

使用载体pYD1(Invitrogen)作为基础载体。如下修饰载体，以便去除XhoI位点：

用XhoI切割pYD1，再用DNA聚合酶的Klenow片段处理，然后重新连接。所获

序列在pYD1dX(SEQ ID No.15)中给出。

pYD1dX在921/925位包含独特的BamHI限制性酶切位点，在963/967位包含独特

的NotI限制性酶切位点。它被这两种限制性内切酶打开。

从编码人IgG1单克隆抗体重链的cDNA通过PCR制备编码人IgG1CH1-铰链-CH2-

CH3的插入物。在该插入物中，利用标准方法引入点突变以将CH1结构域的C端

半胱氨酸残基突变为丝氨酸。利用分别将BamHI和Not限制性酶切位点连接到两

个末端的PCR引物扩增插入物。然后使用这些限制性酶切位点将插入物克隆入

pYD1dX以得到展示载体pYD1dXFc(SEQ Id No.16)。CH1结构域C端的突变密码

子(Cys到Ser)是序列pYD1dXFc中的1233-1235位。插入物的终止密码子是

1917/1919位。

该载体被用作在酵母表面展示人CH1-铰链-CH2-CH3的阳性对照，还被用做构建

载体pYD1CH12的起点(见下文)。

文库的克隆

在酵母中通过同源重组(缺口修补)进行文库的克隆，其中突变被引入CH3结构域

的结构环中。为此，制备不包含CH3结构域的受体载体：pYD1dXFc用XhoI切割

(1603/1607位)和用NotI切割(1921/1925位)，通过制备型凝胶电泳来制备大的片段，

然后用DNA聚合酶的Klenow片段处理，并重新连接。该方法重建了独特的XhoI

位点(1603/1607位)，并得到载体PYD1CH12(SEQ ID No.17)。pYD1CH12随后用

XhoI切割，并被用做酵母中用于缺口修补的受体载体。

使用Fcab文库Fcab01(SEQ ID No.18)，Fcab02(SEQ ID No.19)，

Fcab03(SEQ ID No.20)，Fcab04(SEQ ID No.21)，Fcab05(SEQ ID No.22)和

Fcab06(SEQ ID No.23)作为插入物的来源。这些文库通过标准DNA合成法制备，

在人IgG1 CH3结构域的AB环(残基359和361之间(EU编号))以及EF环(残基413

和419之间(EU编号))中包含随机化残基以及插入残基。从该合成的DNA出发，

利用PCR引物对

gapch35 caacaaggccctgcctgcccccat cgagaagaccatctccaaggccaagggccagcctcgagaaccacaggt

gtacaccctgccc(SEQ ID No.24)和

gapfcs3gagaccgaggagagggttagggataggcttaccttcgaagggccctctagactcgatcgagcggccgctcatttac

c cggagacagggagagctc ttc(SEQ ID No.25)通过PCR扩增用于酵母中缺口修补的插入

物。将100μg经XhoI切割的载体pYD1CH12和100μg插入物混合，然后根据下列

方案(其按100的系数放大以转化所需量的细胞和DNA)使用醋酸锂法转化酿酒酵

母株EBY100(Invitrogen)。简而言之，对于1μg载体DNA和1μg插入DNA的单次

转化来说，用一个酵母菌落接种10ml YPD(2％蛋白胨，2％葡萄糖(D-葡萄糖))，然

后在30℃振摇过夜。测定过夜培养物的OD600，然后用50ml YPD将所述培养物

稀释到OD600为0.4，再培养6个小时。细胞在2500rpm沉淀，将其重悬于40ml

蒸馏水中。细胞再在2500rpm沉淀，重悬于100mM LiAc中，然后在30℃温育30

分钟，将1μg载体DNA、1μg插入物和50μl变性剪切的鲑精DNA(2mg/ml)与

300μl酵母悬液混合。添加700μl 200mM醋酸锂和40％PEG-3350的溶液，将其与

酵母/DNA悬液混合，然后在30℃温育30分钟。添加88μl DMSO并混合，将混合

物在42℃温育40分钟，然后在微量离心机中离心10秒。然后去除上清，将细胞

沉淀物重悬于1ml蒸馏水中。然后将沉淀物重悬于50-100μl TE中，铺在含亮氨酸

的基本葡萄糖平板上(10g/l酵母氮碱，20g/l葡萄糖，0.1g/l亮氨酸，15g/l琼脂)。在

30℃温育平板2到4天后，出现单菌落，随后收集单菌落。

培养-诱导

将收集的酵母文库(yFcab文库)接种到10ml SD-CAA培养基(10g/l酵母氮碱，10g/l

酪蛋白氨基酸和20g/l葡萄糖，0.1g/l亮氨酸，

9.67g/lNaH₂PO₄-2H₂O和

10.19g/l Na₂HPO₄·7H₂O)，在250rpm的摇床

上28℃培养6-8小时。测定培养物的OD600，将该培养物稀释到OD600为0.2，

然后在相同条件下培养直至OD600达到1-2。离心(3000rpm/5分钟/4℃)收集细胞，

将其重悬于诱导培养基SG/R-CAA(10g/l酵母氮碱，10g/l酪蛋白氨基酸和20g/l半

乳糖，10g/l棉子糖，0.1g/l亮氨酸，9.67g/l Na₂HPO₄-

2H₂O和10.19g/l Na₂HPO₄·7H₂O)。

通过在250rpm的摇床上20℃温育2天来诱导培养物，随后进行分析和分选。

yFcab文库的质量控制。

用SD-CAA培养基诱导两天后检测yFcab文库的表达水平和表达的Fcab′s的质量。

利用多克隆抗人IgG-Fc抗血清(Sigma)检测表达水平。为此，将0.5×10e6个文库细

胞稀释于1ml染色缓冲液(SB)中，所述染色缓冲液包括含2％BSA的PBS。将细胞

沉淀，然后用包含1/2000稀释的抗人IgG-Fc-PE抗血清(Sigma)的100μl SB在冰上

染色30分钟，用SB清洗两次，随后在FACS中进行分析。总体上每个文库中所

有细胞的70％-80％在其细胞表面表达Fcabs。为了验证Fcabs的正确折叠，进行对

蛋白A的染色。再次将0.5×10e6个文库细胞稀释于1ml染色缓冲液SB中，将细

胞沉淀并用包含1μg/ml Prot-A-FITC(Fluka)的100μl SB在冰上染色30分钟，用SB

清洗两次，随后在FACS中进行分析。总体上，如上所述的yFcab文库显示≥40％

的Prot A(蛋白A)阳性细胞。为了检验Fcabs是否在细胞表面表达为二聚体，进行

对人CD64的染色。CD64的亲和力对于有效的单体结合来说太低，因此使用含二

聚体的CD64复合物。为此，将例如来自R&D Systems的1μg重组CD64(包含

HIS-标签)与1μg抗Penta HIS-alexafluor 488(来自Qiagen)在1ml SB(总体积)中混合。

通过将5×10e5个细胞与100μl复合-混合物在冰上温育30分钟检测yFcab文库与

CD64的结合，将细胞与单独的等量抗HIS-alexafluor 488(按1/200用SB稀释)温育

作为对照。温育后，细胞用冷的SB清洗两次，然后在FACS中进行分析。总体上

每个文库中所有细胞中＞50％在其细胞表面表达二聚化的Fcabs。

抗原(Her2)的生物素化

按照制造商的说明书，利用Pierce的EZ link system制备重组抗原例如

Her2(Bendermedsystems)。简而言之，将所述抗原用PBS透析，然后用PBS稀释到

1mg/ml，再与10mM硫代-LC-LC-生物素(EZ link，Pierce)(其预先溶于水中)混合。

抗原和生物素的最终比例是1∶3，将混合物在室温下温育30分钟。然后利用

Vivaspin MWCO3000(Sartorius)柱(5×8′，4000rpm)将混合物用PBS“透析”。最后通

过HPLC检测生物素化抗原(Her2)的浓度，将其等分保存于-20℃。

通过ELISA检测生物素化抗原的质量。首先按照100μl/孔将平板用溶于PBS的

10μg/ml Her2抗体(例如Herceptin)在4℃包被过夜，之后平板用清洗缓冲液

(WB)(PBS+0.05％Tween20)清洗3次，然后在室温下用封闭缓冲液(BB)(PBS+2％

BSA)封闭1小时。用WB清洗3次后，将不同浓度的Her2-生物素添加到100μl/孔

BB中置于室温下1小时，然后用WB清洗3次。最后将平板与溶于BB的

1∶25000链霉亲和素-HRP(GE healthcare)在室温下温育1小时，然后用WB清洗3

次。通过添加100μl/孔的底物TMB(Sigma)显色，在大约10分钟后通过添加100μl/

孔的30％H₂SO₄终止反应。利用ELISA读数器在450-

630nm分析结果。

实施例6：抗原特异性(Her2)Fcabs的产生

利用FACS筛选抗原特异性(Her2)Fcabs

第一轮筛选：

在FACSorting前两天，如上所述用SG/R-CAA培养基诱导包含2.5×10e8个单独

Fcab克隆的酵母文库以在其细胞表面表达Fcabs。两天后，将包含例如10倍文库

(＝2.5×10e9)的细胞量与溶于2ml SB的500nM生物素化抗原(Her2)在冰上温育30

分钟。然后将细胞用冷的SB清洗一次，随后与用SB按1∶100稀释的链霉亲和素

-PE(来自R&D systems)在冰上温育30分钟。细胞用冷的SB清洗两次，然后

稀释到终浓度1×10e9个细胞/ml。对照染色只用链霉亲和素-PE而不用抗原对

100μl 5×10e6个细胞/ml进行。在例如来自BD的FACS ARIA中分析完整文库和对

照染色。为了进行设置，使用分选对照细胞的门通条件(gate)。首先设置FSC/SSC

门(G1)来鉴定健康的酵母细胞，从G1完成FSC-宽度对FSC-面积的曲线，在新的

门(G2)中只选择非聚集细胞。随后利用FSC对FL-2(PE通道)分析G2中细胞与链

霉亲和素-PE的反应性。G3被设置为包括0.1％的(假)阳性细胞。随后，利用如上

所述的设置分析至少5×10e8个染色细胞(比文库规模大两倍，越大越好)，将G3中

的细胞分入包含2-3ml SD-CAA培养基的管中。在第一轮筛选后收集到大约

5×10e5个细胞(库1)，将其增殖1到2天，然后将细胞保存在-80℃，可以按照如上

所述诱导等分试样以表达Fcabs。再过两天后进行下一轮筛选。

第二轮筛选：

如上所述诱导第1轮筛选的库1在其表面表达Fcab。将至少5×10e6个细胞(包括多

拷贝的库1)与溶于1ml SB的500nM生物素化抗原(Her2)在冰上温育30分钟。然

后将细胞用冷的SB清洗一次，随后与用SB按1∶100稀释的链霉亲和素-PE(来自

R&D systems)以及2μg/ml蛋白A-FITC(Fluka)在冰上温育30分钟。然后细胞

用冷的SB清洗两次，然后稀释到终浓度2×10e6个细胞/ml。此外，进行对照染色，

其中如上所述将100μl 5×10e6个细胞/ml的库1与Prot A和链霉亲和素-PE的混合

物温育，但不与抗原(Her2)温育。此外，在没有链霉亲和素-PE的情况下，将100μl

表达Fcab wt非随机化Fc片段的酵母克隆的5×10e5个细胞用如上所述的Prot A-

FITC染色。在例如BD的FACS ARIA中设门进行分选来分析表达Fcab-wt的细胞。

首先设置FSC/SSC门(G1)来鉴定健康的酵母细胞，从G1完成FSC-宽度对FSC-面

积的曲线，在新的门(G2)中只选择非聚集细胞。

随后利用FSC对FL-1(FITC)分析G2中细胞的蛋白A表达。G3被设置为包括强的

Prot A阳性细胞(50-60％的亲本门，G4被设置为包括弱的Prot A阳性细胞(20-30％

的亲本细胞)。G3+G4将包括G2中所有细胞的大概70-80％。现在将在Prot A-

FITC存在条件下被链霉亲和素-PE染色的库细胞用于设置其余的分选门。首先用

库细胞检查G1和G2，在必要时进行调整。库细胞在G3中具有较少的事件，可能

在G4中也如此，提示不是所有库1中的细胞表达折叠为Fcab-wt的Fcabs。使用对

照染色的库细胞，为了G3和G4制备新的门。在曲线FSC和FL-2(PE)中设置新的

门。制备包括G3中0.1％(假)链霉亲和素阳性细胞的门(G5)，对G4中的细胞采取

相同方法得到G6。在下一步中通过FACS-ARIA选出至少5×10e6个被Her2-生物

素+链霉亲和素-PE和Prot A-FITC染色的细胞。在包含2-3ml酵母培养基的不同管

中收集G5(库2.1)和G6(库2.2)的细胞。预期两个门中都有10到1000个克隆。将

两个新库增殖1或2天，保存于-80℃。来自2.1和2.2的细胞可用于指导第3轮的

进一步分选，或在FACS中被进一步分选前它们可以(优选在将两种克隆再次混合

后)经历AB环的另一轮随机化(亲和力成熟)。

所选克隆/库的亲和力成熟

为进行亲和力成熟，向所选克隆或所选克隆的库的AB环中引入多样性。为此，利

用在第359、360和361位(EU编号)包含简并密码子的引物(引物Abmut，

gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbcaggtcagcctgacctgcctggtcaaag，

SEQ ID No.26)或可选的在第358、359、360、361和362位(EU编号)包含简并密码

子的引物(引物Abmut2LR，

gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtcaaag，

SEQ ID No.27)进行PCR。在这两种情况下用于所述PCRs的第二引物是gapfcs3。

为了产生用于在酵母中有效缺口修补的侧翼序列，所获PCR产物用引物对gapch35

和gapfsc3进一步扩增，然后通过醋酸锂将其与如上述经XhoI切割的pYD1CH12

转化酿酒酵母株EBY100。作为AB环中所述残基随机化时用的备选引物，还可以

使用引物诸如

Abmut1L(gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbcaggtcagectgacctgcct

ggtcaaag，SEQ ID No.28)或

Abmut1R(gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcct

ggtcaaag，SEQ ID No.29)。采用类似的方式，可以通过完全随机化或通过使用

spiked寡核苷酸作为引物进行随机化或通过类似的诱变技术将EF环中的残基随机

化。Abmut引物将为每个克隆产生8000个新变体(库2.3)，Abmut2LR引物导致

3×10e6个新变体(库2.4)。因此库2.3和2.4均将产生大约10e8个个体的新文库，

因为起始原料(库2.1+2.2)已经包含大约10-1000个克隆。

第三轮筛选

亲和力成熟库2.3和2.4以及必要时库2.1(优选只有Prot A阳性细胞)按上述进行诱

导，以在其细胞表面表达Fcabs，随后按照“第二轮筛选”的描述进行分选，例外的

是库2.3和2.4是更大的，因此库的染色体积等于在“第一轮筛选”中描述的文库染

色体积。在第三轮筛选中，只有Her2阳性/Prot A阳性细胞被分选出。从这些选择

过程选出的库大都包含＞20％的Her2/Prot A阳性细胞。若不然，进行组合Prot A

以及Her2的第四和第五(或甚至更多)轮筛选。

克隆分析：

制备含Her2/Prot A细胞(优选＞20％)的库的单个克隆，方法是，将所述库铺于含

SD-CAA培养基的琼脂平板上，或在平板上不产生库而直接经FACS ARIA分选出

单细胞(＝克隆)。对这些克隆进行培养，将其转移到液体培养物中，并保存于-80℃。

随后如上所述诱导克隆的等分试样以在其细胞表面表达Fcabs，并用多个参数进行

FACS筛选。这些参数可以是：在有和没有上述Prot A-FITC、CD64染色的情况下

进行筛选所用的抗原(Her2)的剂量应答范围。此外使用类似的染色方案，可以筛选

多个无关的生物素化抗原来鉴定非交叉反应性Fcabs。

可以预期，在抗原(Her2)+Prot A阳性细胞的数轮筛选后，这些克隆中有较大百分

比例当用500nM抗原(Her2)染色时显示＞25％的抗原(Her2)阳性，当用

2μg/ml Prot A-FITC染色时显示＞70％的Prot A阳性。在大多数情况下，这些克隆

还显示＞50％的CD64结合。因此模拟在酵母中表达的非随机化Fc片段(Fcab wt)

的Prot A和CD64水平。

如上述选出的具有上述特征的克隆现可以制备为可溶性分子。这可以通过将

Fcab DNA瞬时转染或稳定转染入新的宿主细胞来实现。为此，使用标准方法从单

个酵母克隆分离DNA。通过PCR扩增编码完整CH3结构域或只是CH3结构域的

已在文库中被随机化的部分的相关DNA，将其转移入包含Fcab缺失部分

(missing part)+合适启动子和多种筛选标记物诸如G418之一(允许从未转染细胞群

体中筛选出转染细胞)的新表达载体。然后将所述新载体例如瞬时转染新的宿主细

胞诸如HEK293或CHO。回收宿主细胞，然后培养若干天。培养上清包含可溶性

的Fcab，其可经或不经例如Prot A纯化就用于进一步检测。还可以通过标准方法

制备稳定细胞系。

表2.筛选的Her2克隆的序列：参照 No.1的编号

实施例7：对4D5 Fab的酵母展示

为了在酵母中展示Fab片段，如下改造酵母展示载体

pYD1(Invitrogen)(SEQ ID No.72)：

在581/586位通过定点诱变引入Nhel限制性酶切位点以获得改造的载体

pYDINhe(SEQ ID No.73)。该载体用NheI和PmeI限制性消化得到3个片段。最大

的片段是剩余的载体主链，向其中插入合成的寡核苷酸接头得到载体

pYD1lnk(SEQ ID No.74)。然后通过PCR从载体pYD1扩增包括MATα转录终止区

的盒，将其通过BamHI和Pstl限制性消化和连接克隆入pYD1lnk。所获载体是

pYD1mata(SEQ ID No.75)。通过PCR从pYD1扩增包含GAL1启动子、编码Aga2

的基因以及具有NotI和SfiI克隆位点的合成接头的盒，将其通过EcoRI和PacI限

制性消化克隆入pYD1mata得到载体pYD1gal(SEQ ID No.76)。

作为在酵母中展示的Fab的实例，合成分别编码抗体4D5(Herceptin)的VH-CH1和

VL-CL的基因：序列4D5H(SEQ ID No.77)和4D5L(SEQ IDNo.78)。

4D5H侧翼为SfiI和NotI限制性酶切位点，将其克隆入载体pYD1gal得到载体

pYD4D5hc(SEQ ID No.79)。在该载体中，将4D5H的N端融合到Aga2的C端，并

在4D5H的C端连接六聚组氨酸标签，后面是终止密码子。4D5的VH-CH1氨基

酸序列在4D5hp(SEQ ID No.80)中给出。

4D5L侧翼为NcoI和Ascl限制性酶切位点，将其克隆入载体pYD4D5hc得到载体

pYD4D5hl(SEQ ID No.81)。4D5L在其前面有一个Aga2分泌信号，并在CL结构域

的C端半胱氨酸残基后载有一个终止密码子。4D5的VL-CL氨基酸序列在

4D51p(SEQ ID No.82)中给出。

为了展示4D5Fab，将载体pYD4D5hl转化入酵母菌株EBY100(Invitrogen)，在不含

色氨酸的基本培养基上筛选转化体，然后按照标准步骤(Invitrogen)通过在包含半乳

糖的培养基上生长来诱导重组蛋白的表达。

实施例8：构建文库，其在4D5 Fab CL结构域的结构环中有随机化残基

作为酵母展示文库构建的第一步，利用限制性内切酶BsiWI和AscI从展示载体

pYD4D5hl中切割出野生型CL(C kappa)结构域。制备侧翼为BsiWI和AscI位点(在

pYD4D5hl的情况下)的编码人C kappa结构域的合成基因，其中在AB和EF环中

分别引入随机突变和插入。在该具体实施例中，在人C kappa结构域的16和17位

氨基酸之间插入3，4或5个NNB密码子，将第92，93，94，95，97，98和99位

残基用NNB密码子取代(IMGT编号，参见图2)。NNB密码子包含位置1和2处的

全部4个核苷酸以及位置3处的C、G和T。因此NNB编码全部20种天然编码的

氨基酸。

文库按照标准方法进行制备和筛选。

使用CDR靶Her2neu和4D5表位作为支架配体。筛选文库成员用于产生本发明的

细胞毒模块抗体，它们在CL结构域中加入了结合位点，所述位点特异性结合效应

分子如Fcgamma受体或半衰期已延长的蛋白如血清白蛋白。对所获Fab进行以下

测试：(i)以Kd＜10^-8M和IC50＜10^-8M进行Her2neu结

合，和(ii)用CDC和/或ADCC分析效应功能，和可选的确定白蛋白结合。

序列表

<110>F-星生物技术研究与开发有限公司(f-star Biotechnologische Forschungs-

und

b.H.)

<120>展示结合剂

<130>FS9.1

<160>82

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>232

<212>PRT

<213>人

<400>1

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210>2

<211>237

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>包含随机氨基酸修饰的人IgG

<220>

<221>misc_feature

<222>(144)..(146)

<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(198)..(205)

<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(208)..(209)

<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸

<400>2

Olu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Oly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Xaa

130 135 140

Xaa Xaa Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Trp Xaa

195 200 205

Xaa Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

210 215 220

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210>3

<211>728

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于克隆修饰的IgG的DNA序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(438)..(439)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(441)..(442)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(444)..(445)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(600)..(601)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(603)..(604)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(606)..(607)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(609)..(610)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(612)..(613)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(615)..(616)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(618)..(619)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(621)..(622)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(630)..(631)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(633)..(634)

<223>n是a，c，g，或t

<400>3

ccatggccga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60

aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120

tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg 180

tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240

aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300

ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg 360

agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc ctcgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420

catcccgtga cgagctcnns nnsnnscaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480

atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540

ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag cttaccgtgn 600

nsnnsnnsnn snnsnnsnns nnsaggtggn nsnnsgggaa cgtcttctca tgctccgtga 660

tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag 720

cggccgca 728

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物EPKSNCO

<400>4

ccatggccga gcccaaatct tgtgacaaaa ctc 33

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物CH3LSAC

<400>5

agtcgagctc gtcacgggat gggggcaggg 30

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物CH3CSAC

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(12)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(18)

<223>n是a，c，g，或t

<400>6

gtacgagctc nnsnnsnnsc aagtcagcct gacctgcctg g 41

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物CH3CHIN

<400>7

tgccaagctt gctgtagagg aagaaggagc cg 32

<210>8

<211>59

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物CH3RHIN

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(18)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(24)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(33)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(35)..(36)

<223>n是a，c，g，或t

<400>8

tgccaagctt accgtgnnsn nsnnsaggtg gnnsnnsggg aacgtcttct catgctccg 59

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物CH3RNOT

<400>9

agttgcggcc gctttacccg gagacaggga gag 33

<210>10

<211>25

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>连接区

<400>10

Ser Pro Gly Lys Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp

1 5 10 15

Leu Asn Gly Ala Ala Thr Val Glu Ser

20 25

<210>11

<211>662

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>FcabRGD4L的氨基酸序列

<400>11

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Olu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Gly Cys Arg Gly Asp Cys Leu Ser Arg Trp Gln

195 200 205

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

210 215 220

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn

245 250 255

Gly Ala Ala Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn

260 265 270

Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala

275 280 285

Asn Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr

290 295 300

Gly Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala

305 310 315 320

Ile Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly

325 330 335

Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr

340 345 350

Pro Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro

355 360 365

Pro Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu

370 375 380

Ser Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn

385 390 395 400

Arg Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr

405 410 415

Asp Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala

420 425 430

Met Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His

435 440 445

Ser Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser

450 455 460

Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly

465 470 475 480

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser

485 490 495

Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser

500 505 510

Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met

515 520 525

Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys

530 535 540

Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile

545 550 555 560

Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe

565 570 575

Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser

580 585 590

Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser

595 600 605

Val Glu Cys Arg Pro Tyr Val Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe

610 615 620

Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe

625 630 635 640

Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn

645 650 655

Ile Leu His Lys Glu Ser

660

<210>12

<211>5200

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>载体pHENFcabRGD4

<400>12

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt aagcttgcat gcaaattcta tttcaaggag acagtcataa 2280

tgaaatacct attgcctacg gcagccgctg gattgttatt actcgcggcc cagccggcca 2340

tggccgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac 2400

tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct 2460

cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 2520

agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 2580

agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 2640

tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 2700

aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat 2760

cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc 2820

ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca 2880

cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctt accgtgggtt 2940

gccgcggtga ttgtctgagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc 3000

atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaagcgg 3060

ccgcagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatgg ggccgcatag actgttgaaa 3120

gttgtttagc aaaacctcat acagaaaatt catttactaa cgtctggaaa gacgacaaaa 3180

ctttagatcg ttacgctaac tatgagggct gtctgtggaa tgctacaggc gttgtggttt 3240

gtactggtga cgaaactcag tgttacggta catgggttcc tattgggctt gctatccctg 3300

aaaatgaggg tggtggctct gagggtggcg gttctgaggg tggcggttct gagggtggcg 3360

gtactaaacc tcctgagtac ggtgatacac ctattccggg ctatacttat atcaaccctc 3420

tcgacggcac ttatccgcct ggtactgagc aaaaccccgc taatcctaat ccttctcttg 3480

aggagtctca gcctcttaat actttcatgt ttcagaataa taggttccga aataggcagg 3540

gtgcattaac tgtttatacg ggcactgtta ctcaaggcac tgaccccgtt aaaacttatt 3600

accagtacac tcctgtatca tcaaaagcca tgtatgacgc ttactggaac ggtaaattca 3660

gagactgcgc tttccattct ggctttaatg aggatccatt cgtttgtgaa tatcaaggcc 3720

aatcgtctga cctgcctcaa cctcctgtca atgctggcgg cggctctggt ggtggttctg 3780

gtggcggctc tgagggtggc ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc ggctctgagg 3840

gtggcggttc cggtggcggc tccggttccg gtgattttga ttatgaaaaa atggcaaacg 3900

ctaataaggg ggctatgacc gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct gacgctaaag 3960

gcaaacttga ttctgtcgct actgattacg gtgctgctat cgatggtttc attggtgacg 4020

tttccggcct tgctaatggt aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct aattcccaaa 4080

tggctcaagt cggtgacggt gataattcac ctttaatgaa taatttccgt caatatttac 4140

cttctttgcc tcagtcggtt gaatgtcgcc cttatgtctt tggcgctggt aaaccatatg 4200

aattttctat tgattgtgac aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg tttcttttat 4260

atgttgccac ctttatgtat gtattttcga cgtttgctaa catactgcat aaggagtctt 4320

aataagaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 4380

caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 4440

cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg 4500

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca cgtcaaagca accatagtac 4560

gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 4620

acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 4680

ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 4740

gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca 4800

tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 4860

ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg gctattcttt tgatttataa 4920

gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 4980

gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca attttatggt gcactctcag tacaatctgc 5040

tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga 5100

cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc 5160

atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 5200

<210>13

<211>48

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>CH3r连接

<400>13

actagcggcc gcagagccac caccctcctt acccggagac agggagag 48

<210>14

<211>5215

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>载体pHENFcabRGD4L

<400>14

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt aagcttgcat gcaaattcta tttcaaggag acagtcataa 2280

tgaaatacct attgcctacg gcagccgctg gattgttatt actcgcggcc cagccggcca 2340

tggccgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac 2400

tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct 2460

cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 2520

agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 2580

agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 2640

tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 2700

aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat 2760

cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc 2820

ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca 2880

cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctt accgtgggtt 2940

gccgcggtga ttgtctgagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc 3000

atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaggagg 3060

gtggtggctc tgcggccgca gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatggggccg 3120

catagactgt tgaaagttgt ttagcaaaac ctcatacaga aaattcattt actaacgtct 3180

ggaaagacga caaaacttta gatcgttacg ctaactatga gggctgtctg tggaatgcta 3240

caggcgttgt ggtttgtact ggtgacgaaa ctcagtgtta cggtacatgg gttcctattg 3300

ggcttgctat ccctgaaaat gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct gagggtggcg 3360

gttctgaggg tggcggtact aaacctcctg agtacggtga tacacctatt ccgggctata 3420

cttatatcaa ccctctcgac ggcacttatc cgcctggtac tgagcaaaac cccgctaatc 3480

ctaatccttc tcttgaggag tctcagcctc ttaatacttt catgtttcag aataataggt 3540

tccgaaatag gcagggtgca ttaactgttt atacgggcac tgttactcaa ggcactgacc 3600

ccgttaaaac ttattaccag tacactcctg tatcatcaaa agccatgtat gacgcttact 3660

ggaacggtaa attcagagac tgcgctttcc attctggctt taatgaggat ccattcgttt 3720

gtgaatatca aggccaatcg tctgacctgc ctcaacctcc tgtcaatgct ggcggcggct 3780

ctggtggtgg ttctggtggc ggctctgagg gtggcggctc tgagggtggc ggttctgagg 3840

gtggcggctc tgagggtggc ggttccggtg gcggctccgg ttccggtgat tttgattatg 3900

aaaaaatggc aaacgctaat aagggggcta tgaccgaaaa tgccgatgaa aacgcgctac 3960

agtctgacgc taaaggcaaa cttgattctg tcgctactga ttacggtgct gctatcgatg 4020

gtttcattgg tgacgtttcc ggccttgcta atggtaatgg tgctactggt gattttgctg 4080

gctctaattc ccaaatggct caagtcggtg acggtgataa ttcaccttta atgaataatt 4140

tccgtcaata tttaccttct ttgcctcagt cggttgaatg tcgcccttat gtctttggcg 4200

ctggtaaacc atatgaattt tctattgatt gtgacaaaat aaacttattc cgtggtgtct 4260

ttgcgtttct tttatatgtt gccaccttta tgtatgtatt ttcgacgttt gctaacatac 4320

tgcataagga gtcttaataa gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 4380

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 4440

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 4500

tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcacgtca 4560

aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 4620

cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 4680

tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 4740

gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt 4800

tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 4860

ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcgggctat 4920

tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 4980

taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact 5040

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 5100

gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 5160

gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcga 5215

<210>15

<211>5013

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>载体pYD1dX

<400>15

acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60

cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120

acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180

ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240

ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300

taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360

ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420

ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480

gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540

tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa 600

ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga 660

ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa 720

cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca 780

cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 840

ctggtggtgg tggttctgct agcatgactg gtggacagca aatgggtcgg gatctgtacg 900

acgatgacga taaggtacca ggatccagtg tggtggaatt ctgcagatat ccagcacagt 960

ggcggccgct cgatcgagtc tagagggccc ttcgaaggta agcctatccc taaccctctc 1020

ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accattgagt ttaaacccgc 1080

tgatctgata acaacagtgt agatgtaaca aaatcgactt tgttcccact gtacttttag 1140

ctcgtacaaa atacaatata cttttcattt ctccgtaaac aacatgtttt cccatgtaat 1200

atccttttct atttttcgtt ccgttaccaa ctttacacat actttatata gctattcact 1260

tctatacact aaaaaactaa gacaatttta attttgctgc ctgccatatt tcaatttgtt 1320

ataaattcct ataatttatc ctattagtag ctaaaaaaag atgaatgtga atcgaatcct 1380

aagagaattg ggcaagtgca caaacaatac ttaaataaat actactcagt aataacctat 1440

ttcttagcat ttttgacgaa atttgctatt ttgttagagt cttttacacc atttgtctcc 1500

acacctccgc ttacatcaac accaataacg ccatttaatc taagcgcatc accaacattt 1560

tctggcgtca gtccaccagc taacataaaa tgtaagctct cggggctctc ttgccttcca 1620

acccagtcag aaatcgagtt ccaatccaaa agttcacctg tcccacctgc ttctgaatca 1680

aacaaggBaa taaacgaatg aggtttctgt gaagctgcac tgagtagtat gttgcagtct 1740

tttggaaata cgagtctttt aataactggc aaaccgagga actcttggta ttcttgccac 1800

gactcatctc cgtgcagttg gacgatatca atgccgtaat cattgaccag agccaaaaca 1860

tcctccttag gttgattacg aaacacgcca accaagtatt tcggagtgcc tgaactattt 1920

ttatatgctt ttacaagact tgaaattttc cttgcaataa ccgggtcaat tgttctcttt 1980

ctattgggca cacatataat acccagcaag tcagcatcgg aatctagagc acattctgcg 2040

gcctctgtgc tctgcaagcc gcaaactttc accaatggac cagaactacc tgtgaaatta 2100

ataacagaca tactccaagc tgcctttgtg tgcttaatca cgtatactca cgtgctcaat 2160

agtcaccaat gccctccctc ttggccctct ccttttcttt tttcgaccga atttcttgaa 2220

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 2280

cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata 2340

atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt 2400

aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa 2460

atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata 2520

gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct 2580

tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata 2640

aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact 2700

attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa 2760

atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg 2820

ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 2880

ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 2940

attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 3000

gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 3060

ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 3120

cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt 3180

gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 3240

tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 3300

gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 3360

ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 3420

tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 3480

gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 3540

caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 3600

cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 3660

atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 3720

ggcagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 3780

attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 3840

cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 3900

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3960

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 4020

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 4080

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 4140

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 4200

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 4260

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 4320

acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 4380

gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 4440

agggagcttc caggggggaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 4500

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc cgagcctatg gaaaaacgcc 4560

agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 4620

cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 4680

gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 4740

ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 4800

aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttacctcact 4860

cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc ctatgttgtg tggaattgtg 4920

agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctcggaatt 4980

aaccctcact aaagggaaca aaagctggct agt 5013

<210>16

<211>5971

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>载体pYD1dXFc

<400>16

acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60

cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120

acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180

ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240

ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300

taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360

ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420

ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480

gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540

tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa 600

ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga 660

ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa 720

cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca 780

cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 840

ctggtggtgg tggttctgct agcatgactg gtggacagca aatgggtcgg gatctgtacg 900

acgatgacga taaggtacca ggatccgcta gcaccaaggg ccccagcgtg ttccctctgg 960

cccccagctc caagagcacc tccggcggca ccgccgccct gggctgcctg gtgaaggatt 1020

acttcccaga gcccgtgacc gtgagctgga acagcggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca 1080

cctttcccgc cgtgctgcag tccagcggcc tgtactccct gagcagcgtg gtgaccgtgc 1140

ccagcagcag cctgggcacc cagacctaca tctgcaatgt gaaccacaag cccagcaata 1200

ccaaggtgga taagaaggtg gagcccaaga gcagcgacaa gacacacacg tgtcccccat 1260

gtcccgcccc tgagctgctg ggcggccctt ccgtgttcct gttccctccc aagccaaagg 1320

acaccctgat gatctcccgg acccctgagg tgacctgtgt ggtggtggac gtgagccacg 1380

aggacccaga ggtgaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga 1440

ccaagcctag agaggagcag tacaacagca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc 1500

tgcaccagga ttggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc 1560

ctgcccccat cgagaagacc atctccaagg ccaagggcca gcctcgagaa ccacaggtgt 1620

acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg 1680

tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga 1740

acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca 1800

agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc 1860

atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgag 1920

cggccgctcg atcgagtcta gagggccctt cgaaggtaag cctatcccta accctctcct 1980

cggtctcgat tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cattgagttt aaacccgctg 2040

atctgataac aacagtgtag atgtaacaaa atcgactttg ttcccactgt acttttagct 2100

cgtacaaaat acaatatact tttcatttct ccgtaaacaa catgttttcc catgtaatat 2160

ccttttctat ttttcgttcc gttaccaact ttacacatac tttatatagc tattcacttc 2220

tatacactaa aaaactaaga caattttaat tttgctgcct gccatatttc aatttgttat 2280

aaattcctat aatttatcct attagtagct aaaaaaagat gaatgtgaat cgaatcctaa 2340

gagaattggg caagtgcaca aacaatactt aaataaatac tactcagtaa taacctattt 2400

cttagcattt ttgacgaaat ttgctatttt gttagagtct tttacaccat ttgtctccac 2460

acctccgctt acatcaacac caataacgcc atttaatcta agcgcatcac caacattttc 2520

tggcgtcagt ccaccagcta acataaaatg taagctctcg gggctctctt gccttccaac 2580

ccagtcagaa atcgagttcc aatccaaaag ttcacctgtc ccacctgctt ctgaatcaaa 2640

caagggaata aacgaatgag gtttctgtga agctgcactg agtagtatgt tgcagtcttt 2700

tggaaatacg agtcttttaa taactggcaa accgaggaac tcttggtatt cttgccacga 2760

ctcatctccg tgcagttgga cgatatcaat gccgtaatca ttgaccagag ccaaaacatc 2820

ctccttaggt tgattacgaa acacgccaac caagtatttc ggagtgcctg aactattttt 2880

atatgctttt acaagacttg aaattttcct tgcaataacc gggtcaattg ttctctttct 2940

attgggcaca catataatac ccagcaagtc agcatcggaa tctagagcac attctgcggc 3000

ctctgtgctc tgcaagccgc aaactttcac caatggacca gaactacctg tgaaattaat 3060

aacagacata ctccaagctg cctttgtgtg cttaatcacg tatactcacg tgctcaatag 3120

tcaccaatgc cctccctctt ggccctctcc ttttcttttt tcgaccgaat ttcttgaaga 3180

cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 3240

taggacggat cgcttgcctg taacttacac gcgcctcgta tcttttaatg atggaataat 3300

ttgggaattt actctgtgtt tatttatttt tatgttttgt atttggattt tagaaagtaa 3360

ataaagaagg tagaagagtt acggaatgaa gaaaaaaaaa taaacaaagg tttaaaaaat 3420

ttcaacaaaa agcgtacttt acatatatat ttattagaca agaaaagcag attaaataga 3480

tatacattcg attaacgata agtaaaatgt aaaatcacag gattttcgtg tgtggtcttc 3540

tacacagaca agatgaaaca attcggcatt aatacctgag agcaggaaga gcaagataaa 3600

aggtagtatt tgttggcgat ccccctagag tcttttacat cttcggaaaa caaaaactat 3660

tttttcttta atttcttttt ttactttcta tttttaattt atatatttat attaaaaaat 3720

ttaaattata attattttta tagcacgtga tgaaaaggac ccaggtggca cttttcgggg 3780

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 3840

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 3900

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 3960

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 4020

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 4080

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga 4140

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 4200

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 4260

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 4320

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 4380

ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 4440

aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 4500

acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 4560

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 4620

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 4680

cagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 4740

taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 4800

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 4860

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 4920

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 4980

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 5040

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 5100

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 5160

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 5220

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 5280

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga 5340

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 5400

ggagcttcca ggggggaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 5460

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggccg agcctatgga aaaacgccag 5520

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 5580

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 5640

tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 5700

aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag 5760

gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt acctcactca 5820

ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcct atgttgtgtg gaattgtgag 5880

cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc tcggaattaa 5940

ccctcactaa agggaacaaa agctggctag t 5971

<210>17

<211>5657

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>pYD1CH12

<400>17

acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60

cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120

acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180

ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240

ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300

taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360

ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420

ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480

gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540

tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa 600

ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga 660

ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa 720

cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca 780

cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 840

ctggtggtgg tggttctgct agcatgactg gtggacagca aatgggtcgg gatctgtacg 900

acgatgacga taaggtacca ggatccgcta gcaccaaggg ccccagcgtg ttccctctgg 960

cccccagctc caagagcacc tccggcggca ccgccgccct gggctgcctg gtgaaggatt 1020

acttcccaga gcccgtgacc gtgagctgga acagcggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca 1080

cctttcccgc cgtgctgcag tccagcggcc tgtactccct gagcagcgtg gtgaccgtgc 1140

ccagcagcag cctgggcacc cagacctaca tctgcaatgt gaaccacaag cccagcaata 1200

ccaaggtgga taagaaggtg gagcccaaga gcagcgacaa gacacacacg tgtcccccat 1260

gtcccgcccc tgagctgctg ggcggccctt ccgtgttcct gttccctccc aagccaaagg 1320

acaccctgat gatctcccgg acccctgagg tgacctgtgt ggtggtggac gtgagccacg 1380

aggacccaga ggtgaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga 1440

ccaagcctag agaggagcag tacaacagca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc 1500

tgcaccagga ttggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc 1560

ctgcccccat cgagaagacc atctccaagg ccaagggcca gcctcgaggc cgctcgatcg 1620

agtctagagg gcccttcgaa ggtaagccta tccctaaccc tctcctcggt ctcgattcta 1680

cgcgtaccgg tcatcatcac catcaccatt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1740

gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1800

tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1860

cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1920

ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1980

tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 2040

tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2100

cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2160

caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2220

cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2280

agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2340

aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2400

ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2460

gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2520

tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2580

gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2640

taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2700

agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2760

aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2820

cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2880

gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2940

tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 3000

tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3060

agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3120

tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3180

acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3240

gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3300

ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3360

ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3420

tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3480

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3540

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3600

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3660

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3720

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3780

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3840

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 3900

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 3960

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 4020

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4080

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 4140

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 4200

gBatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 4260

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 4320

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacgggcagt caggcaacta 4380

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 4440

tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 4500

aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 4560

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 4620

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 4680

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 4740

agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4800

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4860

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4920

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4980

tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 5040

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5100

ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5160

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5220

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5280

attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5340

cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5400

ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5460

aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5520

ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5580

acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5640

aacaaaagct ggctagt 5657

<210>18

<211>738

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Fcab01

<220>

<221>misc_feature

<222>(449)..(450)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(452)..(453)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(455)..(456)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(611)..(612)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(614)..(615)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(617)..(618)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(620)..(621)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(623)..(624)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(626)..(627)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(629)..(630)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(632)..(633)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(641)..(642)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(644)..(645)

<223>n是a，c，g，或t

<400>18

ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 60

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 120

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 180

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac 240

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 300

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 360

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta 420

caccctgccc ccatcccggg atgaactgnn bnnbnnbcag gtcagcctga cctgcctggt 480

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 540

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 600

gctcaccgtg nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn bnnbaggtgg nnbnnbggga acgtcttctc 660

atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc 720

tccgggtaaa gcggccgc 738

<210>19

<211>738

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Fcab02

<400>19

ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 60

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 120

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 180

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac 240

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 300

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 360

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta 420

caccctgccc ccatcccggg atgagctgkm tkmtkmtcag gtgagcctga cctgcctggt 480

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 540

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 600

gctcaccgtg kmtkmtkmtk mtkmtkmtkm tkmtaggtgg kmtkmtggga acgtcttctc 660

atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc 720

tccgggtaaa gcggccgc 738

<210>20

<211>750

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Fcab03

<220>

<221>misc_feature

<222>(449)..(450)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(452)..(453)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(455)..(456)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(617)..(618)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(620)..(621)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(623)..(624)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(626)..(627)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(629)..(630)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(632)..(633)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(635)..(636)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_fea ture

<222>(638)..(639)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(653)..(654)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(656)..(657)

<223>n是a，c，g，或t

<400>20

ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 60

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 120

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 180

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac 240

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 300

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 360

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta 420

caccctgccc ccttcccggg atgagctgnn bnnbnnbcag gtcagcctga cctgcctggt 480

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 540

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 600

gctcaccgtg ggttctnnbn nbnnbnnbnn bnnbnnbnnb agcggcaggt ggnnbnnbgg 660

gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 720

cctctccctg tctccgggta aagcggccgc 750

<210>21

<211>750

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Fcab04

<400>21

ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 60

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 120

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 180

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac 240

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 300

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 360

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta 420

caccctgccc ccatctcggg atgagctgkm tkmtkmtcag gtcagcctga cctgcctggt 480

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 540

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 600

gctcaccgtg ggttctkmtk mtkmtkmtkm tkmtkmtkmt agcggcaggt ggkmtkmtgg 660

gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 720

cctctccctg tctccgggta aagcggccgc 750

<210>22

<211>738

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Fcab05

<220>

<221>misc_feature

<222>(449)..(450)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(452)..(453)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(455)..(456)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(611)..(612)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(614)..(615)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(617)..(618)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(620)..(621)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(623)..(624)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(626)..(627)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(629)..(630)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(632)..(633)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(641)..(642)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(644)..(645)

<223>n是a，c，g，或t

<400>22

ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 60

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 120

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 180

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt gBacggcgtg gaggtBcata atgccaagac 240

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 300

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 360

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta 420

caccctgccc ccatcccgtg atgagkmtnn bnnbnnbkmt gtcagcctga cctgcctggt 480

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 540

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 600

gctcaccgtg nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn bnnbaggtgg nnbnnbggga acgtcttctc 660

atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc 720

tccgggtaaa gcggccgc 738

2024年6月11日发(作者：宾华采)

到其外表面。另一形式是体外复制型基因包，诸如连结编码RNA与翻译蛋白的核

糖体。在核糖体展示中，遗传物质通过聚合酶的酶扩增进行复制。

载有识别靶分子的结合剂的那些细胞或病毒核酸被分离和，必要时，被扩增。基因

包优选是M13噬菌体，蛋白包括M13基因III蛋白的外表面输送信号。

优选在本发明的方法中，基因包的载体或质粒在转录调控元件的严密控制下，调节

培养条件以便在颗粒表面展示少于两个拷贝融合蛋白的载体或噬菌粒颗粒的量或数

低于约20％。更优选，展示低于两个拷贝融合蛋白的载体或噬菌粒颗粒的量低于

展示一个或更多个拷贝融合蛋白的颗粒量的10％。最优选所述量低于1％。

本发明使用的表达载体优选能够表达结合多肽，可以如下产生：首先通过引入多个

编码不同结合序列的多核苷酸，合成结合多肽基因文库。可以合成合适量的多个多

核苷酸，将其以可操作的组合方式连接入载体，通过载体增殖来表达所述结合多肽

的融合蛋白。可选的还可以通过聚合酶链式反应扩增多个多核苷酸以获得足够的材

料用于表达。但是，这只在结合多肽由大的多核苷酸序列(例如长于200个碱基对，

或有时长于300碱基对)编码的情况下才是有利的。因此，优选形成多样性合成文

库，使得可以从所述多样性文库筛选至少一种能够产生具有所需预选功能和结合性

(诸如特异性)的结合多肽的表达载体。

参照下列实施例将更全面的理解上述描述。但是，这类实施例仅仅是代表实施本发

明一种或更多种实施方案的方法，不应被当作限制本发明的范围。

实施例

实施例1：构建非集中型Fcab文库(Fcab01)和进行噬菌体表面展示

IgG1 Fc片段的晶体结构公开于Brookhaven Database，登录号为，用它

帮助设计Fcab文库。

用做构建Fcab文库的基础的序列在SEQ ID No.1中给出。在该序列中，第一个氨

基酸对应于人IgG1的Glu 216(EU编号；根据IMGT数据库

(/textes/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHC

；2007年6月25日查询)，它是人IgG1铰链区(指定为人IgG1重链恒

定铰链区的(E)PKSCDKTHTCPPCP)的第一个残基。SEQ IDNo.1的倒数第二个残基

对应于人IgG1的Gly 446(EU编号；IMGT：人IgG1CH3结构域的残基号129)。

在仔细分析的结构和目测检查形成连接beta链的环的残基后，决定将残

基144，145和146(它们属于连接beta链A-B的环的一部分)以及198，199，200，

203和204(它们属于连接SEQ ID No.1的beta链E-F的环的一部分)随机化。除突

变残基之外，在SEQ ID No.1的残基号198处插入5个残基。在SEQ ID No.2中，

给出文库Fcab01的文库插入物的序列，其中所有随机化的残基位置以及5个插入

残基用字母X表示。

利用简并引物通过一系列PCR反应、之后将所获PCR产物连接来产生工程化基因。

为了促进连接，对编码SEQ ID No.1的核苷酸序列的一些密码子进行修饰，以产生

限制性酶切位点但不改变氨基酸序列(沉默突变)。为了插入克隆载体

pHEN1(Nucleic Acids Res.1991 Aug 11；19(15)：4133-7Multi-

subunit proteins on the surface of filamentous phage：

methodologies fordisplaying antibody(Fab)heavy and light boom HR，

GriffithsAD，Johnson KS，Chiswell DJ，Hudson P，Winter G.)，与pelB分泌信号

位于同一读框中，使用靠近pelB分泌信号3′末端的NcoI限制性酶切位点。对于随

机化的残基，使用密码子NNS(IUPAC编号，其中S表示核苷酸C和G)，其编码

所有20种天然存在的氨基酸，但避开了3种终止密码子中的2种。还可以使用其

它密码子诸如NNB(B表示核苷酸T、C和G)。工程化的序列在SEQ ID No.3的核

苷酸序列中给出。该序列还包括用于克隆入噬菌粒展示载体pHEN1的限制性酶切

位点，即5′端的NcoI位点和3′端的NotI位点。

用于组装突变CH3结构域的PCR引物序列在SEQ ID No.4到SEQ IDNo.9中给出。

SEQ ID No.4(PCR引物EPKSNCO)

ccatggccgagcccaaatcttgtgacaaaactc

SEQ ID No.5(PCR引物CH3LSAC)

agtcgagctcgtcacgggatgggggcaggg

SEQ ID No.6(PCR引物CH3CSAC)

gtacgagctcnnsnnsnnscaagtcagcctgacctgcctgg

SEQ ID No.7(PCR引物CH3CHIN)

tgccaagcttgctgtagaggaagaaggagccg

SEQ ID No.8(PCR引物CH3RHIN)

tgccaagcttaccgtgnnsnnsnnsaggtggnnsnnsgggaacgtcttctcatgctccg

SEQ ID No.9(PCR引物CH3RNOT)

agttgcggccgctttacccggagacagggagag

图1显示为组装突变基因而生成的PCR片段及其所用的引物。

人单克隆抗体3D6的重链cDNA(Felgenhauer M，Kohl J，

Ruker tide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H-and L-

chainsof a human mono-clonal antibody specific to HIV-l-

c Acids Res.1990 Aug 25；18(16)：4927)被用作PCR反应的模板。分别

利用SacI和/或HindIII消化3个PCR产物，然后将其连接到一起。连接产物进一

步用NcoI和NotI消化，然后连接入先前已经用NcoI和NotI消化的表面展示噬菌

粒载体pHEN1中。然后通过电穿孔将连接产物转化入大肠杆菌。通过限制性分析

和DNA测序控制多个选出的克隆，发现其中包含按计划的插入物，包括正确插入

的随机化序列。对于下列噬菌体制备步骤，遵循标准步骤。简单来说，通过电穿孔

将连接混合物转化入大肠杆菌TG1细胞。随后，利用辅助噬菌体M13-KO7从大肠

杆菌TG1细胞挽救(rescued)噬菌体颗粒。然后采用2步法利用PEG/NaCl从培养上

清中沉淀出噬菌体颗粒，将其溶于水中，用于通过淘选法来选择，或可选的，将其

保存于-80℃。

实施例2：构建集中型Fcab文库(Fcab02)和进行噬菌体表面展示

如实施例1所述，制备Fcab文库，其中随机化文库位置是完全随机的，即它们由

密码子诸如NNS、NNB、NNK、NNN编码，或使用其它密码子。

为了清楚起见，字母诸如N、B、S或K的含义由IUPAC核苷酸模糊编码

(ambiguity code)定义，这在下表中列出：

表核苷酸模糊编码

来源：Nomenclature for incompletely specified bases in nucleic acid sequences：

recommendations 1984.A Cornish-Bowden，Nucleic Acids Res.1985 May 10；13(9)：

3021-3030。

上面列出的这些密码子被设计为使得所有20种氨基酸都由它们编码。从可能的氨

基酸中选择亚组有可能更好。实例可以参见文献(Fellouse FA，LiB，Compaan DM，

Peden AA，Hymowitz SG，

Sidhu lar recognition bya binary code.J MoI Biol.2005 May 20；348(5)：

2005 Apr 1.；Fellouse FA，Wiesmann C，

Sidhu tic antibodies from afour-amino-acid code：

a dominant role for tyrosine in antigen tl Acad Sci U S A.2004 Aug 2

4；101(34)： 2004 Aug 11.)。例如通过使用密码子KMT(其编码氨基

酸Ser、Tyr、Ala和Asp)可以构建例如只允许4种不同氨基酸类型的集中型文库。

除了NNS密码子被替换为KMT密码子之外，按照与实施例1描述的相同方式构

建出集中型Fcab文库(命名为Fcab02)。

因此，SEQ ID No.2中的字母“X”现在表示“S，Y，A和D”(Ser，Tyr，Ala和Asp)

以便描述集中型文库Fcab02。

实施例3：构建噬菌体表面展示文库，其在文库插入物(结合伴侣)和p3之间具有额

外氨基酸残基

为了研究所展示蛋白的潜在结合位点的易接近性，进行结合分析法：将噬菌体悬浮

液与抗myc mAb 9E10包被的微板(或免疫管(immunotubes))反应。清洗后，利用抗

M13酶偶联物检测结合的噬菌体。作为对照，辅助噬菌体(其不展示蛋白融合体和

myc-标签)与板反应。其它对照是噬菌体与未包被板的反应，以及噬菌体与识别噬

菌体的p3融合伴侣的抗血清的反应。

理论上，展示p3融合蛋白的噬菌体的抗myc反应型应当给出非常清楚的ELISA读

数，而针对抗myc-mAb的辅助噬菌体反应不应高于背景(未包被板)。通过结合作

为锚(anchor)的蛋白III而在M13噬菌体表面展示的CH3二聚体的结构是这样的，

每个CH3利用具有不同长度和组成的接头锚定到蛋白III。因此，CH3二聚体优选

通过两个锚来展示。

接头优化：

如果所展示分子的潜在结合位点在空间上靠近噬菌体颗粒，则位于待展示蛋白和基

因包锚定蛋白(在丝状噬菌体情况下，例如p3，p8，pX，pIX，pVII)之间的接头是

尤其重要的。在利用由CDR环形成的可变区和抗原结合位点、并将库成员展示为

p3的氨基端融合物的抗体文库中，潜在的抗原结合位点指向背离噬菌体颗粒的方

向。因此，库成员和噬菌体外壳蛋白之间的接头结构不太重要。但是改造免疫球蛋

白区的底部环和进行噬菌体展示可能是一种低效步骤，降低抗原结合克隆的产率或

甚至排斥它。改变库成员蛋白与其融合伴侣之间位于表面的接头可以解决或可能至

少减少该问题。

为了选择(在长度和柔性以及稳定性方面)最佳的接头序列，可以制备接头文库，在

其中将复制型基因包表面的锚定蛋白与因空间原因而出了名地难于选择的已知结合

蛋白融合。该文库的序列可以在长度和氨基酸含量方面不同。

在接头文库中选择最佳接头的方法取决于用途，但基本上应当是选择在某一方法学

中希望具有的所有特性的方法。针对难于选择的抗原进行的富集可以产生允许库成

员容易地接近该抗原的接头序列。在蛋白酶溶液中或其它苛刻条件下进行温育，或

者在蛋白水解条件下(例如用老龄的微生物培养物)通过宿主细胞进行频繁传代，可

以是稳定展示接头的合适选择法。

接头文库可通过任何公知的文库技术产生。合成的接头序列长度可以为10-500个

氨基酸不等。可选的，接头可以是已知具有柔性的完整蛋白。

接头优化Fcab01：

举例来说，可以使用文库Fcab01(如实施例1所述)。首先，利用NcoI和NotI限制

性酶切位点将该文库克隆入噬菌粒展示载体pHEN1。当采用这种方式克隆时，18

个氨基酸残基位于Fcab01文库插入物的C端氨基酸残基与噬菌体M13 p3的N端

氨基酸残基之间。该连接区的序列在

SEQ ID No.10SPGKAAAEQKLISEEDLNGAATVES中给出，解释如下：前4个残

基SPGK是Fcab01文库插入物的4个C端残基，然后是氨基酸序列AAA(其是由

NotI限制性酶切位点编码的氨基酸残基)，然后是序列EQKLISEEDL(其是myc表

位)，然后是NGAA，其后存在一个UAG终止密码子，该终止密码子在大肠杆菌

的琥珀抑制者菌株诸如TG1中被翻译为谷氨酰胺(Q)。SEQ IDNo.10的C端4个残

基TVES是存在于载体pHEN1中的噬菌体M13 p3的N端4个残基。

为了构建展示Fcab插入物、且Fcab(结合伴侣)与噬菌体(基因包)之间的距离增加的

噬菌体，将5个额外残基插入Fcab插入物FcabRGD4的C端，在紧接NotI克隆位

点的上游，产生克隆FcabRGD4L。FcabRGD4是一种Fcab，其在CH3结构域的

EF环中插入了能与整联蛋白结合的RGD基元，并且在ELISA中结合ανβ3-整联蛋

白。作为长度增加的接头序列，使用氨基酸序列EGGGS，其在噬菌体M13p3序列

中出现8次。所获FcabRGD4L氨基酸序列在克隆入pHEN1后表达为

SEQ ID No.11。在SEQ ID No.11中，氨基酸残基198-204代表RGD基元，氨基酸

残基237是Fcab插入物的C端残基，残基238-242代表插入的接头序列(其与未改

造的pHEN1不同)，其后是myc标签、UAG终止密码子和p3序列。

为了克隆构建体，利用PCR引物EPKSNCO(SEQ ID No.4)和

CH3rlinkactagcggccgcagagccaccaccctccttacccggagacagggagag(SEQ ID No.13)从

pHENFcabRGD4(SEQ ID No.12)扩增FcabRGD4序列，并通过NcoI和NotI限制性

酶切位点将其克隆入载体pHEN1。所获载体pHENFcabRGD4L(SEQID No.14)在核

苷酸3057-3071位处具有额外的接头序列。

将两种噬菌粒载体pHENFcabRGD4和pHENFcabRGD4L转化入大肠杆菌TG1。随

后，利用辅助噬菌体M13-KO7从大肠杆菌TG1细胞挽救噬菌体颗粒。然后按照2

步法利用PEG/NaCl从培养上清中沉淀出噬菌体颗粒，将其溶于水中，用于ELISA。

如下进行噬菌体ELISA：

噬菌体悬浮液与包被ανβ3-整联蛋白的微板(或免疫管)反应。清洗后，利用抗M13

酶偶联物检测结合的噬菌体。作为对照，辅助噬菌体(其不展示蛋白融合体和myc-

标签)与板反应，以及表面载有wtFcab的噬菌体颗粒与板反应。其它对照是噬菌体

与未包被板的反应，以及噬菌体与识别噬菌体的Fcab融合伴侣的抗血清的反应。

与具有pHENFcabRGD4包含的原始接头的噬菌体颗粒相比，具有源于

pHENFcabRGD4L的增长接头的噬菌体颗粒更容易与ανβ3-整联蛋白反应，从而在

ELISA中产生更强的信号。

可以进行噬菌体筛选，其中将具有wtFcab的噬菌体颗粒与少量载有FcabRGD4或

FcabRGD4L的噬菌体颗粒混合。在数轮(通常3-5轮)淘选后，优先选出展示

FcabRGD4L的噬菌体。

实施例4：Fcab文库设计

(″Fcab″是f-star Biotechnologische b.H.的注册商标)

Fcab文库的设计(在图2中显示)：抗体CH3恒定区的非CDR环中的氨基酸位置被

考虑进行随机化。环A-B、C-D和E-F是特别被考虑的，因为它们都位于结构域的

一侧。在具体位置随机化的一些设计标准在本文描述。

频繁参与抗原抗体相互作用的氨基酸在本文中被描述为包括在集中型文库中。本文

中氨基酸Ala、Asp、Ser和Tyr用于设计集中型文库。

具有受限的氨基酸应用的文库已经被证明足以产生实质上抗任何抗原的结合剂

(Sidhu&Fellhouse，NATURE CHEMICAL BIOLOGY VOLUME 2page 682ff；

Koide et al PNAS，volume 104 p6632-6637)。这类受限(或集中型)文库的优点是它

们完全可以用当前的技术手段来实现。理论上，氨基酸应用反映了配体受体结合的

天然氨基酸应用。但是，即使只利用2种氨基酸(酪氨酸和丝氨酸)的文库据报道也

得到较好的筛选结果(在抗不同结合剂的结合剂频率以及在亲和力方面)。

环的柔性：

支架蛋白可能需要一些环结构以便总体上维持天然结构。在随机化位置的一侧或双

侧构建一些序列有可能促进环中多个氨基酸位置的随机化甚至环的延长。这些序列

可以是柔性的序列，以便允许弥补这类位置中一些文库序列的任何张力。

表2：示例性的Fcab^TM文库，集中型和非集中型的

Fcab01文库在以上实施例中描述。集中型文库设计Fcab02、Fcab04和Fcab06的序

列空间被大约10e9的实际细菌文库大小覆盖。与此相反，完全随机化的文库

Fcab01、Fcab03和Fcab05事实上远远未能被充分代表。

实施例5：通过同源重组来克隆酵母展示文库

载体

使用载体pYD1(Invitrogen)作为基础载体。如下修饰载体，以便去除XhoI位点：

用XhoI切割pYD1，再用DNA聚合酶的Klenow片段处理，然后重新连接。所获

序列在pYD1dX(SEQ ID No.15)中给出。

pYD1dX在921/925位包含独特的BamHI限制性酶切位点，在963/967位包含独特

的NotI限制性酶切位点。它被这两种限制性内切酶打开。

从编码人IgG1单克隆抗体重链的cDNA通过PCR制备编码人IgG1CH1-铰链-CH2-

CH3的插入物。在该插入物中，利用标准方法引入点突变以将CH1结构域的C端

半胱氨酸残基突变为丝氨酸。利用分别将BamHI和Not限制性酶切位点连接到两

个末端的PCR引物扩增插入物。然后使用这些限制性酶切位点将插入物克隆入

pYD1dX以得到展示载体pYD1dXFc(SEQ Id No.16)。CH1结构域C端的突变密码

子(Cys到Ser)是序列pYD1dXFc中的1233-1235位。插入物的终止密码子是

1917/1919位。

该载体被用作在酵母表面展示人CH1-铰链-CH2-CH3的阳性对照，还被用做构建

载体pYD1CH12的起点(见下文)。

文库的克隆

在酵母中通过同源重组(缺口修补)进行文库的克隆，其中突变被引入CH3结构域

的结构环中。为此，制备不包含CH3结构域的受体载体：pYD1dXFc用XhoI切割

(1603/1607位)和用NotI切割(1921/1925位)，通过制备型凝胶电泳来制备大的片段，

然后用DNA聚合酶的Klenow片段处理，并重新连接。该方法重建了独特的XhoI

位点(1603/1607位)，并得到载体PYD1CH12(SEQ ID No.17)。pYD1CH12随后用

XhoI切割，并被用做酵母中用于缺口修补的受体载体。

使用Fcab文库Fcab01(SEQ ID No.18)，Fcab02(SEQ ID No.19)，

Fcab03(SEQ ID No.20)，Fcab04(SEQ ID No.21)，Fcab05(SEQ ID No.22)和

Fcab06(SEQ ID No.23)作为插入物的来源。这些文库通过标准DNA合成法制备，

在人IgG1 CH3结构域的AB环(残基359和361之间(EU编号))以及EF环(残基413

和419之间(EU编号))中包含随机化残基以及插入残基。从该合成的DNA出发，

利用PCR引物对

gapch35 caacaaggccctgcctgcccccat cgagaagaccatctccaaggccaagggccagcctcgagaaccacaggt

gtacaccctgccc(SEQ ID No.24)和

gapfcs3gagaccgaggagagggttagggataggcttaccttcgaagggccctctagactcgatcgagcggccgctcatttac

c cggagacagggagagctc ttc(SEQ ID No.25)通过PCR扩增用于酵母中缺口修补的插入

物。将100μg经XhoI切割的载体pYD1CH12和100μg插入物混合，然后根据下列

方案(其按100的系数放大以转化所需量的细胞和DNA)使用醋酸锂法转化酿酒酵

母株EBY100(Invitrogen)。简而言之，对于1μg载体DNA和1μg插入DNA的单次

转化来说，用一个酵母菌落接种10ml YPD(2％蛋白胨，2％葡萄糖(D-葡萄糖))，然

后在30℃振摇过夜。测定过夜培养物的OD600，然后用50ml YPD将所述培养物

稀释到OD600为0.4，再培养6个小时。细胞在2500rpm沉淀，将其重悬于40ml

蒸馏水中。细胞再在2500rpm沉淀，重悬于100mM LiAc中，然后在30℃温育30

分钟，将1μg载体DNA、1μg插入物和50μl变性剪切的鲑精DNA(2mg/ml)与

300μl酵母悬液混合。添加700μl 200mM醋酸锂和40％PEG-3350的溶液，将其与

酵母/DNA悬液混合，然后在30℃温育30分钟。添加88μl DMSO并混合，将混合

物在42℃温育40分钟，然后在微量离心机中离心10秒。然后去除上清，将细胞

沉淀物重悬于1ml蒸馏水中。然后将沉淀物重悬于50-100μl TE中，铺在含亮氨酸

的基本葡萄糖平板上(10g/l酵母氮碱，20g/l葡萄糖，0.1g/l亮氨酸，15g/l琼脂)。在

30℃温育平板2到4天后，出现单菌落，随后收集单菌落。

培养-诱导

将收集的酵母文库(yFcab文库)接种到10ml SD-CAA培养基(10g/l酵母氮碱，10g/l

酪蛋白氨基酸和20g/l葡萄糖，0.1g/l亮氨酸，

9.67g/lNaH₂PO₄-2H₂O和

10.19g/l Na₂HPO₄·7H₂O)，在250rpm的摇床

上28℃培养6-8小时。测定培养物的OD600，将该培养物稀释到OD600为0.2，

然后在相同条件下培养直至OD600达到1-2。离心(3000rpm/5分钟/4℃)收集细胞，

将其重悬于诱导培养基SG/R-CAA(10g/l酵母氮碱，10g/l酪蛋白氨基酸和20g/l半

乳糖，10g/l棉子糖，0.1g/l亮氨酸，9.67g/l Na₂HPO₄-

2H₂O和10.19g/l Na₂HPO₄·7H₂O)。

通过在250rpm的摇床上20℃温育2天来诱导培养物，随后进行分析和分选。

yFcab文库的质量控制。

用SD-CAA培养基诱导两天后检测yFcab文库的表达水平和表达的Fcab′s的质量。

利用多克隆抗人IgG-Fc抗血清(Sigma)检测表达水平。为此，将0.5×10e6个文库细

胞稀释于1ml染色缓冲液(SB)中，所述染色缓冲液包括含2％BSA的PBS。将细胞

沉淀，然后用包含1/2000稀释的抗人IgG-Fc-PE抗血清(Sigma)的100μl SB在冰上

染色30分钟，用SB清洗两次，随后在FACS中进行分析。总体上每个文库中所

有细胞的70％-80％在其细胞表面表达Fcabs。为了验证Fcabs的正确折叠，进行对

蛋白A的染色。再次将0.5×10e6个文库细胞稀释于1ml染色缓冲液SB中，将细

胞沉淀并用包含1μg/ml Prot-A-FITC(Fluka)的100μl SB在冰上染色30分钟，用SB

清洗两次，随后在FACS中进行分析。总体上，如上所述的yFcab文库显示≥40％

的Prot A(蛋白A)阳性细胞。为了检验Fcabs是否在细胞表面表达为二聚体，进行

对人CD64的染色。CD64的亲和力对于有效的单体结合来说太低，因此使用含二

聚体的CD64复合物。为此，将例如来自R&D Systems的1μg重组CD64(包含

HIS-标签)与1μg抗Penta HIS-alexafluor 488(来自Qiagen)在1ml SB(总体积)中混合。

通过将5×10e5个细胞与100μl复合-混合物在冰上温育30分钟检测yFcab文库与

CD64的结合，将细胞与单独的等量抗HIS-alexafluor 488(按1/200用SB稀释)温育

作为对照。温育后，细胞用冷的SB清洗两次，然后在FACS中进行分析。总体上

每个文库中所有细胞中＞50％在其细胞表面表达二聚化的Fcabs。

抗原(Her2)的生物素化

按照制造商的说明书，利用Pierce的EZ link system制备重组抗原例如

Her2(Bendermedsystems)。简而言之，将所述抗原用PBS透析，然后用PBS稀释到

1mg/ml，再与10mM硫代-LC-LC-生物素(EZ link，Pierce)(其预先溶于水中)混合。

抗原和生物素的最终比例是1∶3，将混合物在室温下温育30分钟。然后利用

Vivaspin MWCO3000(Sartorius)柱(5×8′，4000rpm)将混合物用PBS“透析”。最后通

过HPLC检测生物素化抗原(Her2)的浓度，将其等分保存于-20℃。

通过ELISA检测生物素化抗原的质量。首先按照100μl/孔将平板用溶于PBS的

10μg/ml Her2抗体(例如Herceptin)在4℃包被过夜，之后平板用清洗缓冲液

(WB)(PBS+0.05％Tween20)清洗3次，然后在室温下用封闭缓冲液(BB)(PBS+2％

BSA)封闭1小时。用WB清洗3次后，将不同浓度的Her2-生物素添加到100μl/孔

BB中置于室温下1小时，然后用WB清洗3次。最后将平板与溶于BB的

1∶25000链霉亲和素-HRP(GE healthcare)在室温下温育1小时，然后用WB清洗3

次。通过添加100μl/孔的底物TMB(Sigma)显色，在大约10分钟后通过添加100μl/

孔的30％H₂SO₄终止反应。利用ELISA读数器在450-

630nm分析结果。

实施例6：抗原特异性(Her2)Fcabs的产生

利用FACS筛选抗原特异性(Her2)Fcabs

第一轮筛选：

在FACSorting前两天，如上所述用SG/R-CAA培养基诱导包含2.5×10e8个单独

Fcab克隆的酵母文库以在其细胞表面表达Fcabs。两天后，将包含例如10倍文库

(＝2.5×10e9)的细胞量与溶于2ml SB的500nM生物素化抗原(Her2)在冰上温育30

分钟。然后将细胞用冷的SB清洗一次，随后与用SB按1∶100稀释的链霉亲和素

-PE(来自R&D systems)在冰上温育30分钟。细胞用冷的SB清洗两次，然后

稀释到终浓度1×10e9个细胞/ml。对照染色只用链霉亲和素-PE而不用抗原对

100μl 5×10e6个细胞/ml进行。在例如来自BD的FACS ARIA中分析完整文库和对

照染色。为了进行设置，使用分选对照细胞的门通条件(gate)。首先设置FSC/SSC

门(G1)来鉴定健康的酵母细胞，从G1完成FSC-宽度对FSC-面积的曲线，在新的

门(G2)中只选择非聚集细胞。随后利用FSC对FL-2(PE通道)分析G2中细胞与链

霉亲和素-PE的反应性。G3被设置为包括0.1％的(假)阳性细胞。随后，利用如上

所述的设置分析至少5×10e8个染色细胞(比文库规模大两倍，越大越好)，将G3中

的细胞分入包含2-3ml SD-CAA培养基的管中。在第一轮筛选后收集到大约

5×10e5个细胞(库1)，将其增殖1到2天，然后将细胞保存在-80℃，可以按照如上

所述诱导等分试样以表达Fcabs。再过两天后进行下一轮筛选。

第二轮筛选：

如上所述诱导第1轮筛选的库1在其表面表达Fcab。将至少5×10e6个细胞(包括多

拷贝的库1)与溶于1ml SB的500nM生物素化抗原(Her2)在冰上温育30分钟。然

后将细胞用冷的SB清洗一次，随后与用SB按1∶100稀释的链霉亲和素-PE(来自

R&D systems)以及2μg/ml蛋白A-FITC(Fluka)在冰上温育30分钟。然后细胞

用冷的SB清洗两次，然后稀释到终浓度2×10e6个细胞/ml。此外，进行对照染色，

其中如上所述将100μl 5×10e6个细胞/ml的库1与Prot A和链霉亲和素-PE的混合

物温育，但不与抗原(Her2)温育。此外，在没有链霉亲和素-PE的情况下，将100μl

表达Fcab wt非随机化Fc片段的酵母克隆的5×10e5个细胞用如上所述的Prot A-

FITC染色。在例如BD的FACS ARIA中设门进行分选来分析表达Fcab-wt的细胞。

首先设置FSC/SSC门(G1)来鉴定健康的酵母细胞，从G1完成FSC-宽度对FSC-面

积的曲线，在新的门(G2)中只选择非聚集细胞。

随后利用FSC对FL-1(FITC)分析G2中细胞的蛋白A表达。G3被设置为包括强的

Prot A阳性细胞(50-60％的亲本门，G4被设置为包括弱的Prot A阳性细胞(20-30％

的亲本细胞)。G3+G4将包括G2中所有细胞的大概70-80％。现在将在Prot A-

FITC存在条件下被链霉亲和素-PE染色的库细胞用于设置其余的分选门。首先用

库细胞检查G1和G2，在必要时进行调整。库细胞在G3中具有较少的事件，可能

在G4中也如此，提示不是所有库1中的细胞表达折叠为Fcab-wt的Fcabs。使用对

照染色的库细胞，为了G3和G4制备新的门。在曲线FSC和FL-2(PE)中设置新的

门。制备包括G3中0.1％(假)链霉亲和素阳性细胞的门(G5)，对G4中的细胞采取

相同方法得到G6。在下一步中通过FACS-ARIA选出至少5×10e6个被Her2-生物

素+链霉亲和素-PE和Prot A-FITC染色的细胞。在包含2-3ml酵母培养基的不同管

中收集G5(库2.1)和G6(库2.2)的细胞。预期两个门中都有10到1000个克隆。将

两个新库增殖1或2天，保存于-80℃。来自2.1和2.2的细胞可用于指导第3轮的

进一步分选，或在FACS中被进一步分选前它们可以(优选在将两种克隆再次混合

后)经历AB环的另一轮随机化(亲和力成熟)。

所选克隆/库的亲和力成熟

为进行亲和力成熟，向所选克隆或所选克隆的库的AB环中引入多样性。为此，利

用在第359、360和361位(EU编号)包含简并密码子的引物(引物Abmut，

gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbcaggtcagcctgacctgcctggtcaaag，

SEQ ID No.26)或可选的在第358、359、360、361和362位(EU编号)包含简并密码

子的引物(引物Abmut2LR，

gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcctggtcaaag，

SEQ ID No.27)进行PCR。在这两种情况下用于所述PCRs的第二引物是gapfcs3。

为了产生用于在酵母中有效缺口修补的侧翼序列，所获PCR产物用引物对gapch35

和gapfsc3进一步扩增，然后通过醋酸锂将其与如上述经XhoI切割的pYD1CH12

转化酿酒酵母株EBY100。作为AB环中所述残基随机化时用的备选引物，还可以

使用引物诸如

Abmut1L(gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagnnbnnbnnbnnbcaggtcagectgacctgcct

ggtcaaag，SEQ ID No.28)或

Abmut1R(gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgnnbnnbnnbnnbgtcagcctgacctgcct

ggtcaaag，SEQ ID No.29)。采用类似的方式，可以通过完全随机化或通过使用

spiked寡核苷酸作为引物进行随机化或通过类似的诱变技术将EF环中的残基随机

化。Abmut引物将为每个克隆产生8000个新变体(库2.3)，Abmut2LR引物导致

3×10e6个新变体(库2.4)。因此库2.3和2.4均将产生大约10e8个个体的新文库，

因为起始原料(库2.1+2.2)已经包含大约10-1000个克隆。

第三轮筛选

亲和力成熟库2.3和2.4以及必要时库2.1(优选只有Prot A阳性细胞)按上述进行诱

导，以在其细胞表面表达Fcabs，随后按照“第二轮筛选”的描述进行分选，例外的

是库2.3和2.4是更大的，因此库的染色体积等于在“第一轮筛选”中描述的文库染

色体积。在第三轮筛选中，只有Her2阳性/Prot A阳性细胞被分选出。从这些选择

过程选出的库大都包含＞20％的Her2/Prot A阳性细胞。若不然，进行组合Prot A

以及Her2的第四和第五(或甚至更多)轮筛选。

克隆分析：

制备含Her2/Prot A细胞(优选＞20％)的库的单个克隆，方法是，将所述库铺于含

SD-CAA培养基的琼脂平板上，或在平板上不产生库而直接经FACS ARIA分选出

单细胞(＝克隆)。对这些克隆进行培养，将其转移到液体培养物中，并保存于-80℃。

随后如上所述诱导克隆的等分试样以在其细胞表面表达Fcabs，并用多个参数进行

FACS筛选。这些参数可以是：在有和没有上述Prot A-FITC、CD64染色的情况下

进行筛选所用的抗原(Her2)的剂量应答范围。此外使用类似的染色方案，可以筛选

多个无关的生物素化抗原来鉴定非交叉反应性Fcabs。

可以预期，在抗原(Her2)+Prot A阳性细胞的数轮筛选后，这些克隆中有较大百分

比例当用500nM抗原(Her2)染色时显示＞25％的抗原(Her2)阳性，当用

2μg/ml Prot A-FITC染色时显示＞70％的Prot A阳性。在大多数情况下，这些克隆

还显示＞50％的CD64结合。因此模拟在酵母中表达的非随机化Fc片段(Fcab wt)

的Prot A和CD64水平。

如上述选出的具有上述特征的克隆现可以制备为可溶性分子。这可以通过将

Fcab DNA瞬时转染或稳定转染入新的宿主细胞来实现。为此，使用标准方法从单

个酵母克隆分离DNA。通过PCR扩增编码完整CH3结构域或只是CH3结构域的

已在文库中被随机化的部分的相关DNA，将其转移入包含Fcab缺失部分

(missing part)+合适启动子和多种筛选标记物诸如G418之一(允许从未转染细胞群

体中筛选出转染细胞)的新表达载体。然后将所述新载体例如瞬时转染新的宿主细

胞诸如HEK293或CHO。回收宿主细胞，然后培养若干天。培养上清包含可溶性

的Fcab，其可经或不经例如Prot A纯化就用于进一步检测。还可以通过标准方法

制备稳定细胞系。

表2.筛选的Her2克隆的序列：参照 No.1的编号

实施例7：对4D5 Fab的酵母展示

为了在酵母中展示Fab片段，如下改造酵母展示载体

pYD1(Invitrogen)(SEQ ID No.72)：

在581/586位通过定点诱变引入Nhel限制性酶切位点以获得改造的载体

pYDINhe(SEQ ID No.73)。该载体用NheI和PmeI限制性消化得到3个片段。最大

的片段是剩余的载体主链，向其中插入合成的寡核苷酸接头得到载体

pYD1lnk(SEQ ID No.74)。然后通过PCR从载体pYD1扩增包括MATα转录终止区

的盒，将其通过BamHI和Pstl限制性消化和连接克隆入pYD1lnk。所获载体是

pYD1mata(SEQ ID No.75)。通过PCR从pYD1扩增包含GAL1启动子、编码Aga2

的基因以及具有NotI和SfiI克隆位点的合成接头的盒，将其通过EcoRI和PacI限

制性消化克隆入pYD1mata得到载体pYD1gal(SEQ ID No.76)。

作为在酵母中展示的Fab的实例，合成分别编码抗体4D5(Herceptin)的VH-CH1和

VL-CL的基因：序列4D5H(SEQ ID No.77)和4D5L(SEQ IDNo.78)。

4D5H侧翼为SfiI和NotI限制性酶切位点，将其克隆入载体pYD1gal得到载体

pYD4D5hc(SEQ ID No.79)。在该载体中，将4D5H的N端融合到Aga2的C端，并

在4D5H的C端连接六聚组氨酸标签，后面是终止密码子。4D5的VH-CH1氨基

酸序列在4D5hp(SEQ ID No.80)中给出。

4D5L侧翼为NcoI和Ascl限制性酶切位点，将其克隆入载体pYD4D5hc得到载体

pYD4D5hl(SEQ ID No.81)。4D5L在其前面有一个Aga2分泌信号，并在CL结构域

的C端半胱氨酸残基后载有一个终止密码子。4D5的VL-CL氨基酸序列在

4D51p(SEQ ID No.82)中给出。

为了展示4D5Fab，将载体pYD4D5hl转化入酵母菌株EBY100(Invitrogen)，在不含

色氨酸的基本培养基上筛选转化体，然后按照标准步骤(Invitrogen)通过在包含半乳

糖的培养基上生长来诱导重组蛋白的表达。

实施例8：构建文库，其在4D5 Fab CL结构域的结构环中有随机化残基

作为酵母展示文库构建的第一步，利用限制性内切酶BsiWI和AscI从展示载体

pYD4D5hl中切割出野生型CL(C kappa)结构域。制备侧翼为BsiWI和AscI位点(在

pYD4D5hl的情况下)的编码人C kappa结构域的合成基因，其中在AB和EF环中

分别引入随机突变和插入。在该具体实施例中，在人C kappa结构域的16和17位

氨基酸之间插入3，4或5个NNB密码子，将第92，93，94，95，97，98和99位

残基用NNB密码子取代(IMGT编号，参见图2)。NNB密码子包含位置1和2处的

全部4个核苷酸以及位置3处的C、G和T。因此NNB编码全部20种天然编码的

氨基酸。

文库按照标准方法进行制备和筛选。

使用CDR靶Her2neu和4D5表位作为支架配体。筛选文库成员用于产生本发明的

细胞毒模块抗体，它们在CL结构域中加入了结合位点，所述位点特异性结合效应

分子如Fcgamma受体或半衰期已延长的蛋白如血清白蛋白。对所获Fab进行以下

测试：(i)以Kd＜10^-8M和IC50＜10^-8M进行Her2neu结

合，和(ii)用CDC和/或ADCC分析效应功能，和可选的确定白蛋白结合。

序列表

<110>F-星生物技术研究与开发有限公司(f-star Biotechnologische Forschungs-

und

b.H.)

<120>展示结合剂

<130>FS9.1

<160>82

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>232

<212>PRT

<213>人

<400>1

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210>2

<211>237

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>包含随机氨基酸修饰的人IgG

<220>

<221>misc_feature

<222>(144)..(146)

<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(198)..(205)

<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(208)..(209)

<223>Xaa可以是任一种天然存在的氨基酸

<400>2

Olu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Oly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Xaa

130 135 140

Xaa Xaa Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Trp Xaa

195 200 205

Xaa Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

210 215 220

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210>3

<211>728

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于克隆修饰的IgG的DNA序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(438)..(439)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(441)..(442)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(444)..(445)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(600)..(601)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(603)..(604)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(606)..(607)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(609)..(610)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(612)..(613)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(615)..(616)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(618)..(619)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(621)..(622)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(630)..(631)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(633)..(634)

<223>n是a，c，g，或t

<400>3

ccatggccga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60

aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120

tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg 180

tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240

aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300

ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg 360

agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc ctcgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420

catcccgtga cgagctcnns nnsnnscaag tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480

atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540

ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag cttaccgtgn 600

nsnnsnnsnn snnsnnsnns nnsaggtggn nsnnsgggaa cgtcttctca tgctccgtga 660

tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag 720

cggccgca 728

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物EPKSNCO

<400>4

ccatggccga gcccaaatct tgtgacaaaa ctc 33

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物CH3LSAC

<400>5

agtcgagctc gtcacgggat gggggcaggg 30

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物CH3CSAC

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(12)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(15)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(18)

<223>n是a，c，g，或t

<400>6

gtacgagctc nnsnnsnnsc aagtcagcct gacctgcctg g 41

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物CH3CHIN

<400>7

tgccaagctt gctgtagagg aagaaggagc cg 32

<210>8

<211>59

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物CH3RHIN

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(18)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(24)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(32)..(33)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(35)..(36)

<223>n是a，c，g，或t

<400>8

tgccaagctt accgtgnnsn nsnnsaggtg gnnsnnsggg aacgtcttct catgctccg 59

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物CH3RNOT

<400>9

agttgcggcc gctttacccg gagacaggga gag 33

<210>10

<211>25

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>连接区

<400>10

Ser Pro Gly Lys Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp

1 5 10 15

Leu Asn Gly Ala Ala Thr Val Glu Ser

20 25

<210>11

<211>662

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>FcabRGD4L的氨基酸序列

<400>11

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Olu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Gly Cys Arg Gly Asp Cys Leu Ser Arg Trp Gln

195 200 205

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

210 215 220

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn

245 250 255

Gly Ala Ala Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn

260 265 270

Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala

275 280 285

Asn Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr

290 295 300

Gly Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala

305 310 315 320

Ile Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly

325 330 335

Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr

340 345 350

Pro Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro

355 360 365

Pro Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu

370 375 380

Ser Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn

385 390 395 400

Arg Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr

405 410 415

Asp Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala

420 425 430

Met Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His

435 440 445

Ser Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser

450 455 460

Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly

465 470 475 480

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser

485 490 495

Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser

500 505 510

Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met

515 520 525

Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys

530 535 540

Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile

545 550 555 560

Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe

565 570 575

Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser

580 585 590

Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser

595 600 605

Val Glu Cys Arg Pro Tyr Val Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe

610 615 620

Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe

625 630 635 640

Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn

645 650 655

Ile Leu His Lys Glu Ser

660

<210>12

<211>5200

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>载体pHENFcabRGD4

<400>12

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt aagcttgcat gcaaattcta tttcaaggag acagtcataa 2280

tgaaatacct attgcctacg gcagccgctg gattgttatt actcgcggcc cagccggcca 2340

tggccgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac 2400

tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct 2460

cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 2520

agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 2580

agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 2640

tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 2700

aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat 2760

cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc 2820

ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca 2880

cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctt accgtgggtt 2940

gccgcggtga ttgtctgagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc 3000

atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaagcgg 3060

ccgcagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatgg ggccgcatag actgttgaaa 3120

gttgtttagc aaaacctcat acagaaaatt catttactaa cgtctggaaa gacgacaaaa 3180

ctttagatcg ttacgctaac tatgagggct gtctgtggaa tgctacaggc gttgtggttt 3240

gtactggtga cgaaactcag tgttacggta catgggttcc tattgggctt gctatccctg 3300

aaaatgaggg tggtggctct gagggtggcg gttctgaggg tggcggttct gagggtggcg 3360

gtactaaacc tcctgagtac ggtgatacac ctattccggg ctatacttat atcaaccctc 3420

tcgacggcac ttatccgcct ggtactgagc aaaaccccgc taatcctaat ccttctcttg 3480

aggagtctca gcctcttaat actttcatgt ttcagaataa taggttccga aataggcagg 3540

gtgcattaac tgtttatacg ggcactgtta ctcaaggcac tgaccccgtt aaaacttatt 3600

accagtacac tcctgtatca tcaaaagcca tgtatgacgc ttactggaac ggtaaattca 3660

gagactgcgc tttccattct ggctttaatg aggatccatt cgtttgtgaa tatcaaggcc 3720

aatcgtctga cctgcctcaa cctcctgtca atgctggcgg cggctctggt ggtggttctg 3780

gtggcggctc tgagggtggc ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc ggctctgagg 3840

gtggcggttc cggtggcggc tccggttccg gtgattttga ttatgaaaaa atggcaaacg 3900

ctaataaggg ggctatgacc gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct gacgctaaag 3960

gcaaacttga ttctgtcgct actgattacg gtgctgctat cgatggtttc attggtgacg 4020

tttccggcct tgctaatggt aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct aattcccaaa 4080

tggctcaagt cggtgacggt gataattcac ctttaatgaa taatttccgt caatatttac 4140

cttctttgcc tcagtcggtt gaatgtcgcc cttatgtctt tggcgctggt aaaccatatg 4200

aattttctat tgattgtgac aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg tttcttttat 4260

atgttgccac ctttatgtat gtattttcga cgtttgctaa catactgcat aaggagtctt 4320

aataagaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 4380

caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 4440

cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg 4500

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca cgtcaaagca accatagtac 4560

gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 4620

acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 4680

ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 4740

gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca 4800

tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 4860

ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg gctattcttt tgatttataa 4920

gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 4980

gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca attttatggt gcactctcag tacaatctgc 5040

tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga 5100

cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc 5160

atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 5200

<210>13

<211>48

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>CH3r连接

<400>13

actagcggcc gcagagccac caccctcctt acccggagac agggagag 48

<210>14

<211>5215

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>载体pHENFcabRGD4L

<400>14

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt aagcttgcat gcaaattcta tttcaaggag acagtcataa 2280

tgaaatacct attgcctacg gcagccgctg gattgttatt actcgcggcc cagccggcca 2340

tggccgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac 2400

tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct 2460

cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 2520

agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 2580

agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 2640

tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 2700

aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat 2760

cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc 2820

ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca 2880

cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctt accgtgggtt 2940

gccgcggtga ttgtctgagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc 3000

atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaggagg 3060

gtggtggctc tgcggccgca gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatggggccg 3120

catagactgt tgaaagttgt ttagcaaaac ctcatacaga aaattcattt actaacgtct 3180

ggaaagacga caaaacttta gatcgttacg ctaactatga gggctgtctg tggaatgcta 3240

caggcgttgt ggtttgtact ggtgacgaaa ctcagtgtta cggtacatgg gttcctattg 3300

ggcttgctat ccctgaaaat gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct gagggtggcg 3360

gttctgaggg tggcggtact aaacctcctg agtacggtga tacacctatt ccgggctata 3420

cttatatcaa ccctctcgac ggcacttatc cgcctggtac tgagcaaaac cccgctaatc 3480

ctaatccttc tcttgaggag tctcagcctc ttaatacttt catgtttcag aataataggt 3540

tccgaaatag gcagggtgca ttaactgttt atacgggcac tgttactcaa ggcactgacc 3600

ccgttaaaac ttattaccag tacactcctg tatcatcaaa agccatgtat gacgcttact 3660

ggaacggtaa attcagagac tgcgctttcc attctggctt taatgaggat ccattcgttt 3720

gtgaatatca aggccaatcg tctgacctgc ctcaacctcc tgtcaatgct ggcggcggct 3780

ctggtggtgg ttctggtggc ggctctgagg gtggcggctc tgagggtggc ggttctgagg 3840

gtggcggctc tgagggtggc ggttccggtg gcggctccgg ttccggtgat tttgattatg 3900

aaaaaatggc aaacgctaat aagggggcta tgaccgaaaa tgccgatgaa aacgcgctac 3960

agtctgacgc taaaggcaaa cttgattctg tcgctactga ttacggtgct gctatcgatg 4020

gtttcattgg tgacgtttcc ggccttgcta atggtaatgg tgctactggt gattttgctg 4080

gctctaattc ccaaatggct caagtcggtg acggtgataa ttcaccttta atgaataatt 4140

tccgtcaata tttaccttct ttgcctcagt cggttgaatg tcgcccttat gtctttggcg 4200

ctggtaaacc atatgaattt tctattgatt gtgacaaaat aaacttattc cgtggtgtct 4260

ttgcgtttct tttatatgtt gccaccttta tgtatgtatt ttcgacgttt gctaacatac 4320

tgcataagga gtcttaataa gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 4380

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 4440

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 4500

tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcacgtca 4560

aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 4620

cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 4680

tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 4740

gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt 4800

tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 4860

ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcgggctat 4920

tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 4980

taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact 5040

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 5100

gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 5160

gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcga 5215

<210>15

<211>5013

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>载体pYD1dX

<400>15

acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60

cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120

acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180

ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240

ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300

taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360

ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420

ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480

gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540

tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa 600

ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga 660

ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa 720

cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca 780

cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 840

ctggtggtgg tggttctgct agcatgactg gtggacagca aatgggtcgg gatctgtacg 900

acgatgacga taaggtacca ggatccagtg tggtggaatt ctgcagatat ccagcacagt 960

ggcggccgct cgatcgagtc tagagggccc ttcgaaggta agcctatccc taaccctctc 1020

ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accattgagt ttaaacccgc 1080

tgatctgata acaacagtgt agatgtaaca aaatcgactt tgttcccact gtacttttag 1140

ctcgtacaaa atacaatata cttttcattt ctccgtaaac aacatgtttt cccatgtaat 1200

atccttttct atttttcgtt ccgttaccaa ctttacacat actttatata gctattcact 1260

tctatacact aaaaaactaa gacaatttta attttgctgc ctgccatatt tcaatttgtt 1320

ataaattcct ataatttatc ctattagtag ctaaaaaaag atgaatgtga atcgaatcct 1380

aagagaattg ggcaagtgca caaacaatac ttaaataaat actactcagt aataacctat 1440

ttcttagcat ttttgacgaa atttgctatt ttgttagagt cttttacacc atttgtctcc 1500

acacctccgc ttacatcaac accaataacg ccatttaatc taagcgcatc accaacattt 1560

tctggcgtca gtccaccagc taacataaaa tgtaagctct cggggctctc ttgccttcca 1620

acccagtcag aaatcgagtt ccaatccaaa agttcacctg tcccacctgc ttctgaatca 1680

aacaaggBaa taaacgaatg aggtttctgt gaagctgcac tgagtagtat gttgcagtct 1740

tttggaaata cgagtctttt aataactggc aaaccgagga actcttggta ttcttgccac 1800

gactcatctc cgtgcagttg gacgatatca atgccgtaat cattgaccag agccaaaaca 1860

tcctccttag gttgattacg aaacacgcca accaagtatt tcggagtgcc tgaactattt 1920

ttatatgctt ttacaagact tgaaattttc cttgcaataa ccgggtcaat tgttctcttt 1980

ctattgggca cacatataat acccagcaag tcagcatcgg aatctagagc acattctgcg 2040

gcctctgtgc tctgcaagcc gcaaactttc accaatggac cagaactacc tgtgaaatta 2100

ataacagaca tactccaagc tgcctttgtg tgcttaatca cgtatactca cgtgctcaat 2160

agtcaccaat gccctccctc ttggccctct ccttttcttt tttcgaccga atttcttgaa 2220

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 2280

cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata 2340

atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt 2400

aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa 2460

atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata 2520

gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct 2580

tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata 2640

aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact 2700

attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa 2760

atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg 2820

ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 2880

ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 2940

attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 3000

gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 3060

ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 3120

cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt 3180

gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 3240

tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 3300

gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 3360

ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 3420

tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 3480

gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 3540

caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 3600

cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 3660

atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 3720

ggcagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 3780

attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 3840

cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 3900

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3960

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 4020

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 4080

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 4140

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 4200

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 4260

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 4320

acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 4380

gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 4440

agggagcttc caggggggaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 4500

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc cgagcctatg gaaaaacgcc 4560

agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 4620

cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 4680

gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 4740

ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 4800

aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttacctcact 4860

cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc ctatgttgtg tggaattgtg 4920

agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctcggaatt 4980

aaccctcact aaagggaaca aaagctggct agt 5013

<210>16

<211>5971

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>载体pYD1dXFc

<400>16

acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60

cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120

acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180

ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240

ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300

taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360

ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420

ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480

gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540

tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa 600

ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga 660

ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa 720

cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca 780

cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 840

ctggtggtgg tggttctgct agcatgactg gtggacagca aatgggtcgg gatctgtacg 900

acgatgacga taaggtacca ggatccgcta gcaccaaggg ccccagcgtg ttccctctgg 960

cccccagctc caagagcacc tccggcggca ccgccgccct gggctgcctg gtgaaggatt 1020

acttcccaga gcccgtgacc gtgagctgga acagcggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca 1080

cctttcccgc cgtgctgcag tccagcggcc tgtactccct gagcagcgtg gtgaccgtgc 1140

ccagcagcag cctgggcacc cagacctaca tctgcaatgt gaaccacaag cccagcaata 1200

ccaaggtgga taagaaggtg gagcccaaga gcagcgacaa gacacacacg tgtcccccat 1260

gtcccgcccc tgagctgctg ggcggccctt ccgtgttcct gttccctccc aagccaaagg 1320

acaccctgat gatctcccgg acccctgagg tgacctgtgt ggtggtggac gtgagccacg 1380

aggacccaga ggtgaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga 1440

ccaagcctag agaggagcag tacaacagca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc 1500

tgcaccagga ttggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc 1560

ctgcccccat cgagaagacc atctccaagg ccaagggcca gcctcgagaa ccacaggtgt 1620

acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg 1680

tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga 1740

acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca 1800

agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc 1860

atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgag 1920

cggccgctcg atcgagtcta gagggccctt cgaaggtaag cctatcccta accctctcct 1980

cggtctcgat tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cattgagttt aaacccgctg 2040

atctgataac aacagtgtag atgtaacaaa atcgactttg ttcccactgt acttttagct 2100

cgtacaaaat acaatatact tttcatttct ccgtaaacaa catgttttcc catgtaatat 2160

ccttttctat ttttcgttcc gttaccaact ttacacatac tttatatagc tattcacttc 2220

tatacactaa aaaactaaga caattttaat tttgctgcct gccatatttc aatttgttat 2280

aaattcctat aatttatcct attagtagct aaaaaaagat gaatgtgaat cgaatcctaa 2340

gagaattggg caagtgcaca aacaatactt aaataaatac tactcagtaa taacctattt 2400

cttagcattt ttgacgaaat ttgctatttt gttagagtct tttacaccat ttgtctccac 2460

acctccgctt acatcaacac caataacgcc atttaatcta agcgcatcac caacattttc 2520

tggcgtcagt ccaccagcta acataaaatg taagctctcg gggctctctt gccttccaac 2580

ccagtcagaa atcgagttcc aatccaaaag ttcacctgtc ccacctgctt ctgaatcaaa 2640

caagggaata aacgaatgag gtttctgtga agctgcactg agtagtatgt tgcagtcttt 2700

tggaaatacg agtcttttaa taactggcaa accgaggaac tcttggtatt cttgccacga 2760

ctcatctccg tgcagttgga cgatatcaat gccgtaatca ttgaccagag ccaaaacatc 2820

ctccttaggt tgattacgaa acacgccaac caagtatttc ggagtgcctg aactattttt 2880

atatgctttt acaagacttg aaattttcct tgcaataacc gggtcaattg ttctctttct 2940

attgggcaca catataatac ccagcaagtc agcatcggaa tctagagcac attctgcggc 3000

ctctgtgctc tgcaagccgc aaactttcac caatggacca gaactacctg tgaaattaat 3060

aacagacata ctccaagctg cctttgtgtg cttaatcacg tatactcacg tgctcaatag 3120

tcaccaatgc cctccctctt ggccctctcc ttttcttttt tcgaccgaat ttcttgaaga 3180

cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 3240

taggacggat cgcttgcctg taacttacac gcgcctcgta tcttttaatg atggaataat 3300

ttgggaattt actctgtgtt tatttatttt tatgttttgt atttggattt tagaaagtaa 3360

ataaagaagg tagaagagtt acggaatgaa gaaaaaaaaa taaacaaagg tttaaaaaat 3420

ttcaacaaaa agcgtacttt acatatatat ttattagaca agaaaagcag attaaataga 3480

tatacattcg attaacgata agtaaaatgt aaaatcacag gattttcgtg tgtggtcttc 3540

tacacagaca agatgaaaca attcggcatt aatacctgag agcaggaaga gcaagataaa 3600

aggtagtatt tgttggcgat ccccctagag tcttttacat cttcggaaaa caaaaactat 3660

tttttcttta atttcttttt ttactttcta tttttaattt atatatttat attaaaaaat 3720

ttaaattata attattttta tagcacgtga tgaaaaggac ccaggtggca cttttcgggg 3780

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 3840

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 3900

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 3960

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 4020

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 4080

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga 4140

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 4200

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 4260

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 4320

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 4380

ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 4440

aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 4500

acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 4560

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 4620

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 4680

cagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 4740

taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 4800

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 4860

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 4920

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 4980

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 5040

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 5100

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 5160

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 5220

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 5280

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga 5340

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 5400

ggagcttcca ggggggaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 5460

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggccg agcctatgga aaaacgccag 5520

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 5580

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 5640

tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 5700

aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag 5760

gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt acctcactca 5820

ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcct atgttgtgtg gaattgtgag 5880

cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc tcggaattaa 5940

ccctcactaa agggaacaaa agctggctag t 5971

<210>17

<211>5657

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>pYD1CH12

<400>17

acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60

cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120

acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180

ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240

ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300

taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360

ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420

ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480

gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540

tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa 600

ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga 660

ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa 720

cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca 780

cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 840

ctggtggtgg tggttctgct agcatgactg gtggacagca aatgggtcgg gatctgtacg 900

acgatgacga taaggtacca ggatccgcta gcaccaaggg ccccagcgtg ttccctctgg 960

cccccagctc caagagcacc tccggcggca ccgccgccct gggctgcctg gtgaaggatt 1020

acttcccaga gcccgtgacc gtgagctgga acagcggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca 1080

cctttcccgc cgtgctgcag tccagcggcc tgtactccct gagcagcgtg gtgaccgtgc 1140

ccagcagcag cctgggcacc cagacctaca tctgcaatgt gaaccacaag cccagcaata 1200

ccaaggtgga taagaaggtg gagcccaaga gcagcgacaa gacacacacg tgtcccccat 1260

gtcccgcccc tgagctgctg ggcggccctt ccgtgttcct gttccctccc aagccaaagg 1320

acaccctgat gatctcccgg acccctgagg tgacctgtgt ggtggtggac gtgagccacg 1380

aggacccaga ggtgaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga 1440

ccaagcctag agaggagcag tacaacagca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc 1500

tgcaccagga ttggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc 1560

ctgcccccat cgagaagacc atctccaagg ccaagggcca gcctcgaggc cgctcgatcg 1620

agtctagagg gcccttcgaa ggtaagccta tccctaaccc tctcctcggt ctcgattcta 1680

cgcgtaccgg tcatcatcac catcaccatt gagtttaaac ccgctgatct gataacaaca 1740

gtgtagatgt aacaaaatcg actttgttcc cactgtactt ttagctcgta caaaatacaa 1800

tatacttttc atttctccgt aaacaacatg ttttcccatg taatatcctt ttctattttt 1860

cgttccgtta ccaactttac acatacttta tatagctatt cacttctata cactaaaaaa 1920

ctaagacaat tttaattttg ctgcctgcca tatttcaatt tgttataaat tcctataatt 1980

tatcctatta gtagctaaaa aaagatgaat gtgaatcgaa tcctaagaga attgggcaag 2040

tgcacaaaca atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga 2100

cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat 2160

caacaccaat aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac 2220

cagctaacat aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg 2280

agttccaatc caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg 2340

aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc 2400

ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccgtgca 2460

gttggacgat atcaatgccg taatcattga ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat 2520

tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag tgcctgaact atttttatat gcttttacaa 2580

gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt caattgttct ctttctattg ggcacacata 2640

taatacccag caagtcagca tcggaatcta gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca 2700

agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac tacctgtgaa attaataaca gacatactcc 2760

aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc 2820

cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga ccgaatttct tgaagacgaa agggcctcgt 2880

gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg acggatcgct 2940

tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg gaatttactc 3000

tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa agaaggtaga 3060

agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca acaaaaagcg 3120

tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata cattcgatta 3180

acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca cagacaagat 3240

gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt agtatttgtt 3300

ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt tctttaattt 3360

ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa attataatta 3420

tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 3480

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 3540

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 3600

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 3660

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 3720

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 3780

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc 3840

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 3900

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 3960

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 4020

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4080

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 4140

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 4200

gBatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 4260

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 4320

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacgggcagt caggcaacta 4380

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 4440

tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 4500

aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 4560

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 4620

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 4680

gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 4740

agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4800

tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4860

ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4920

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4980

tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 5040

acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 5100

ggaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 5160

ttttgtgatg ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 5220

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5280

attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa 5340

cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc 5400

ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 5460

aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 5520

ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5580

acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aattaaccct cactaaaggg 5640

aacaaaagct ggctagt 5657

<210>18

<211>738

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Fcab01

<220>

<221>misc_feature

<222>(449)..(450)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(452)..(453)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(455)..(456)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(611)..(612)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(614)..(615)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(617)..(618)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(620)..(621)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(623)..(624)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(626)..(627)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(629)..(630)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(632)..(633)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(641)..(642)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(644)..(645)

<223>n是a，c，g，或t

<400>18

ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 60

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 120

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 180

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac 240

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 300

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 360

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta 420

caccctgccc ccatcccggg atgaactgnn bnnbnnbcag gtcagcctga cctgcctggt 480

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 540

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 600

gctcaccgtg nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn bnnbaggtgg nnbnnbggga acgtcttctc 660

atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc 720

tccgggtaaa gcggccgc 738

<210>19

<211>738

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Fcab02

<400>19

ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 60

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 120

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 180

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac 240

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 300

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 360

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta 420

caccctgccc ccatcccggg atgagctgkm tkmtkmtcag gtgagcctga cctgcctggt 480

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 540

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 600

gctcaccgtg kmtkmtkmtk mtkmtkmtkm tkmtaggtgg kmtkmtggga acgtcttctc 660

atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc 720

tccgggtaaa gcggccgc 738

<210>20

<211>750

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Fcab03

<220>

<221>misc_feature

<222>(449)..(450)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(452)..(453)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(455)..(456)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(617)..(618)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(620)..(621)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(623)..(624)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(626)..(627)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(629)..(630)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(632)..(633)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(635)..(636)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_fea ture

<222>(638)..(639)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(653)..(654)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(656)..(657)

<223>n是a，c，g，或t

<400>20

ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 60

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 120

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 180

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac 240

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 300

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 360

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta 420

caccctgccc ccttcccggg atgagctgnn bnnbnnbcag gtcagcctga cctgcctggt 480

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 540

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 600

gctcaccgtg ggttctnnbn nbnnbnnbnn bnnbnnbnnb agcggcaggt ggnnbnnbgg 660

gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 720

cctctccctg tctccgggta aagcggccgc 750

<210>21

<211>750

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Fcab04

<400>21

ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 60

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 120

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 180

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac 240

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 300

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 360

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta 420

caccctgccc ccatctcggg atgagctgkm tkmtkmtcag gtcagcctga cctgcctggt 480

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 540

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 600

gctcaccgtg ggttctkmtk mtkmtkmtkm tkmtkmtkmt agcggcaggt ggkmtkmtgg 660

gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 720

cctctccctg tctccgggta aagcggccgc 750

<210>22

<211>738

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>Fcab05

<220>

<221>misc_feature

<222>(449)..(450)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(452)..(453)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(455)..(456)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(611)..(612)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(614)..(615)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(617)..(618)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(620)..(621)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(623)..(624)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(626)..(627)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(629)..(630)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(632)..(633)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(641)..(642)

<223>n是a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(644)..(645)

<223>n是a，c，g，或t

<400>22

ggcccagccg gccatggccg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 60

cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 120

caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 180

agaccctgag gtcaagttca actggtacgt gBacggcgtg gaggtBcata atgccaagac 240

aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 300

gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 360

agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cctcgagaac cacaggtgta 420

caccctgccc ccatcccgtg atgagkmtnn bnnbnnbkmt gtcagcctga cctgcctggt 480

caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 540

caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 600

gctcaccgtg nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn bnnbaggtgg nnbnnbggga acgtcttctc 660

atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc 720

tccgggtaaa gcggccgc 738