2024年8月21日发(作者：性绮玉)
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第１２期 ２９
鸭ＩＬ一２ ｍＲＮＡ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ
检测方法的建立
于学武 ，郑世民 ，葛宝伟。，刘超男 ，高雪丽
（１。东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨１５００３０；２．辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳１１０１６４）
中图分类号：￥８５２．４ 文献标识码：Ｂ 文章编号：０５２９—６００５（２０１１）１２～００２９—０３
鸭是一种与人类关系十分密切的水禽，对其相
ｐＭＤ１８－Ｔ载体均购自大连ＴａＫａＲａ公司。
关基因表达水平的定量分析，为进一步了解各基因
１．２主要试剂和仪器 禽源反转录酶（ＡＭＶ）、
功能及其与生产、抗病能力的关系具有十分重戛的
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｒＴａｑ ＤＮＡ
应用价值。细胞因子与某些疾病的发生发展密切相
聚合酶、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ－２ ０００、Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ
关，故对细胞因子及其受体的检测越来越受到重视。
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑｍ均为大
实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉ－ 连ＴａＫａＲａ公司产品；Ｔｒｉｚｏｌ为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产
ｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ＲＴ—ＦＱ－ＰＣＲ）技术是ＲＮＡ定量领域 品；Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５、ＴＩＡＮ ｐｒｅｐ Ｍｉｎｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ均
的创新，该技术为组织或细胞中ｍＲＮＡ检测提供了
为北京天根生物有限公司产品；ＡＢＩ ７５００荧光ＰＣＲ
一
种敏感性和准确性均很高、重复性好的试验方法， 仪、ＢＩＯ—ＲＡＤ ＰＴＣ＿２００ ＰＣＲ仪、ＵＶＰ ＧＤＳ一８００凝
减少了普通ＰＣＲ反应中易产生污染等弊端，并可进 胶成像系统等均为美国相应公司产品。
行高通量操作。该技术已成为目前检测细胞因子的
１．３ 引物设计及合成 根据ＧｅｎＢａｎｋ上鸭ＩＬ－２
标准方法之一＿ｌ ｊ。
和Ｊ３一ａｃｔｉｎ基因核苷酸序列，利用Ｏｌｉｇｏ６．０及Ｐｒｉｍ—
１材料与方法
ｅｒ５．０软件，在保守区分别设计１对特异引物，其序
１．１试验动物、菌种和质粒金定鸭购自哈尔滨市
列见表１。引物由上海英骏生物技术有限公司合
某孵化场，于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
成。
ＳＰＦ实验动物中心饲养；ＪＭ１０９感受态菌和
表１引物序列及其扩增片段
１．４ ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成采用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
ｃＤＮＡ ６ ｔｔＬ，用灭菌ｄｄＨ２Ｏ补至５Ｏ Ｌ。ＩＬ一２与ｐ—
公司Ｔｒｉｚｏｌ试剂一步法提取鸭脾脏总ＲＮＡ，溶于
ａｅｔｉｎ扩增反应条件为：９４℃预变性２ ｍｉｎ；然后
１５ Ｌ ＤＥＰＣ水中，１．５ 琼脂糖凝胶电泳后观察， ９４℃变性４５ Ｓ，５６／５７℃退火４５ Ｓ，７２℃延伸４５ Ｓ，共
并于紫外分光光度仪下测定ＯＤ 。、ＯＤ ，计算其
３０个循环；７２℃终延伸５ ｍｉｎ。
比值，鉴定ＲＮＡ样品质量。反转录反应体系及条 １．６ 阳性标准品的制备分别回收ＩＬ一２及［３－ａｃｔｉｎ
件按反转录酶说明书进行，所得反应液用于常规 扩增产物，经纯化后连接入ｐＭＤ－１８Ｔ载体，转化至
ＰＣＲ和Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ，或一２Ｏ℃保存备用。
ＪＭｌＯ９感受态菌，提取经ＰＣＲ鉴定和序列测定分析
１．５ 目的片段扩增 反应体系为：１０×Ｂｕｆｆｅｒ １０ 验证均为阳性克隆菌株的质粒，１Ｏ倍梯度稀释阳性
Ｌ，ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）８ Ｌ，ｒＴ ｇ（５Ｕ／
质粒，一２Ｏ℃保存备用。
ｇＬ）Ｏ．２５／，Ｌ，上下游引物（１Ｏ￣ｔｍｏｌ／Ｌ）各０．５ Ｌ， １．７ 反应条件的优化应用梯度ＰＣＲ仪选择不同
Ｔ 值（５０℃～６５℃），确定最佳Ｔ 值；在Ｔ 值确定
收稿日期：２０１１－０１—２４
条件下，对引物浓度进行优化。
基金项目：黑龙江省自然科学基金（ｃ２００８４１）
作者简介：于学武（１９８２～），男，兽医师，博士生，从事畜禽疫病免
１．８ 标准曲线绘制 取ＩＬ一２及１３－ａｃｔｉｎ １０倍系列
疫病理研究工作，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕｘｕｅｗｕｌ＠１６３．ｃｏｒｎ
稀释的重组阳性质粒为模板，反应体系为ＳＹＢＲ
通讯作者：郑世民，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｅｎｇｓｈｉｍｉｎｂＬ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（２×）１０“Ｌ、上下游引物（１０
３０ 中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第１２期
ｍｏｌ／Ｌ）各０．３ Ｌ，ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（５０×）０．４
Ｌ，模板１．０ Ｌ，灭菌ｄｄＨ２Ｏ补至２Ｏ Ｌ。反应程
序为：９５℃预变性１５ Ｓ，９５℃变性５ ｓ，６０℃退火／延
伸３４ Ｓ，４０个循环，在每个退火步骤之后采集荧光
信号，并设阴性对照。反应结束后确认扩增曲线、熔
解曲线及制作标准曲线，采用自动分析软件进行数
据分析。
１．９特异性、灵敏度及重复性检验 分别将ＩＬ一２
及８一ａｃｔｉｎ ｃＤＮＡ进行１０。至１Ｏ 稀释，进行灵敏度
试验。上述每个稀释度设３个重复，每次试验以相
应熔解曲线判断扩增产物的特异性。
２ 结果
２．１ 总ＲＮＡ质量鉴定 总ＲＮＡ经１．５ ９／６普通琼
脂糖凝胶电泳后，显示清晰的２８Ｓ、１８Ｓ条带（图１），
核酸蛋白紫外分析仪检测ＲＮＡ ＯＤ。 。／ｏｒ）。。。值介
于１．８～２．０之间，提示总ＲＮＡ质量较好。
２８Ｓ
ｌ８Ｓ
图１总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳图
１：双蒸水；２：总ＲＮＡ
２．２ ＩＬ一２及８一ａｃｔｉｎ扩增 ＩＬ＿２及』３一ａｃｔｉｎ扩增产
物于１．５ 琼脂糖凝胶上电泳后观察，发现分别于
２００ ｂｐ、１３０ ｂｐ位置各呈现一条特异性条带，与预期
设计片段大小相一致（图２、３）；测定的鸭ＩＬ一２和』３一
ａｃｔｉｎ序列分别与ＧｅｎＢａｎｋ中鸭ＩＬ一２及Ｂ—ａｃｔｉｎ基
因序列比较，核苷酸同源性分别为９８．１ 、９９．２ 。
ｂｐ
２ ０００
１ ０００
７５０
５００
２５０
２００ ｂｐ
１００
图２ ＩＬ－２基因扩增结果
Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：ＩＬ－２扩增产物
２．３ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ的优化条件 退火温度及引
物浓度优化结果表明，０．１５／ｌｍｏｌ／Ｌ引物终浓度及
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
６Ｏ℃退火具有最低的Ｃｔ值及相对高的荧光强度，且
无二聚体形成。
ｂｐ
２ ０００
９２８
５００
２５０
１００
图３￣ａｃｔｉｎ基因扩增结果
●
Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：￣－ａｃｔｉｎ扩增产物
２．４标准曲线绘制 由扩增曲线可知１Ｏ。和１０
稀释度的扩增曲线不理想，标准曲线的线性关系也
不好，相关系数（Ｒｚ）分别为０．９７７ ４６８和０．９８６ ８５６。
因此，将上述２个稀释度质粒弃掉，
ｌ ｌ １ ｌ Ｏ ０ Ｏ Ｏ
结果其相关系数
０
（Ｒ ）分别变为０．９９６ ５９４和０．９９５ ２５７，斜率（ｋ）分
∞∞知加∞∞∞们∞０加
别为一３。１７５ ３７７和～３．１６２ ８８５。扩增曲线随即变
得较为理想，图４、５、６、７。
星
占
图４ Ｉ￣ａｃｔｉｎ基因扩增曲线
循环数
图５ ＩＬ－２基因扩增曲线
２．５特异性分析每次反应结束后／？－ａｃｔｉｎ及ＩＬ一２
基因相应熔解曲线均在８１℃左右处形成单一峰值
（图８、９），阴性对照曲线较为平直，表明引物特异性
好，扩增产物单一，经电泳证实为特异性产物。
ｏ＾Ｉ Ａ１．１占
Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ ０
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第１２期
掩 Ｍ
３ｌ
ｍ∞∞ 乏！∞
Ｉ
Ｉ 卜
Ｉ
ｔ
●
图６￣－ａｃｔｉｎ基因标准曲线
－
ｌ
●
图７ ＩＬ－－２基因标准曲线
｛
；１
｝
ｌ
， ｒ
；
６Ｏ ６５ ７Ｏ ７５ ８Ｏ ８５ ９Ｏ ９５
温度（℃）
图８￣ａｃｔｉｎ基因熔解曲线
焉
＞
｝ ，
ａ
５
髓 矍 §
』
漫 －．．－．－－－．
ｆ
温度（℃）
图９ ＩＬ－２基因熔解曲线
２．６灵敏度及重复性ｃＤＮＡ在１０。至１Ｏ 稀释
范围内，Ｊ３一ａｃｔｉｎ及ＩＬ一２扩增曲线的重复性好（图
１０、１１），变异系数（ＣＶ）分别在３．５８ ～６．１２％和
１．６４％～３．５５％之间；在此稀释范围内，由公式（ＯＤ
值×５０×ｌＯ一。×６．０２×１０捣／（６６Ｏ×ｂｐ数）一拷贝／
ｍＬ）计算可知，其检测灵敏度分别达１１６拷贝／“Ｌ
和１５８拷贝 Ｌ。
２．４Ｏ
２．００
ｌ ６０
１ ２０
专Ｏ，８Ｏ
０．４０
Ｏ
—
Ｏ ４０
１ ５ １０ １５ ２０ ２Ｓ ３Ｏ ３５ ４Ｏ
循环数
图１０ ｐ－ａｃｔｉｎ基因灵敏度及重复性扩增曲线
蛊
ｏ
循环数
图１１ ＩＬ一２基因灵敏度及重复性扩增曲线
３讨论与结语
细胞因子与动物机体免疫应答关系十分密切，
ＩＬ－２作为细胞免疫的主要细胞因子，在动物机体免
疫应答过程中发挥重要作用，包括Ｔ细胞激活和分
化、Ｂ细胞生长发育以及自然杀伤细胞的活化。水
禽的ＩＬ一２研究较其他动物相对滞后，王金勇等［３ 利
用同源克隆法，首次获得目前最长的鸭ＩＬ一２基因组
ＤＮＡ序列，并对鸭ＩＬ一２进行了生物信息学分析。
研究表明，慢性感染、自身免疫性疾病、移植排斥与
组织细胞中促炎、抗炎细胞因子变化密切相关，探究
上述免疫过程，对相关细胞因子表达的定量尤为重
要，而常常用于分析的组织或细胞量较少，难以在蛋
白质水平进行定量。尽管转录后调节和翻译后修饰
在某些目的基因意义重大，许多文献报道，ＲＴ—ＦＱ－
ＰＣＲ定量细胞因子ｍＲＮＡ水平与ＥＬＩＳＡ测定的
细胞因子蛋白质水平有良好的相关性［２，４－５］。目前
ＲＴ－一ＦＱ－－Ｐ．ＣＲ技术已得到广泛应用，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
适用于扩增各种目的基因，无需设计探针、使用方
便、成本低廉，但其对引物设计要求较高。
本试验建立了ＩＬ一２ ｔｕＲＮＡ表达双标准曲线
Ｒ．Ｔ－一ＦＱ－ＰＣＲ检测方法，该方法既可对ＩＬ一２ ｔｕＲＮＡ
表达进行绝对定量，也可利用内参基因８一ａｃｔｉｎ进行
３２ 中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第１２期
圈养金丝猴鞭形毛首线虫的消长观察
王荣琼 ，刘永张。，赵永琳 。，邹丰才
（１．云南农业职业技术学院，云南昆明６５０２１２；２．昆明动物园，云南昆明６５００２１；
３．泸西县畜牧兽医局动物卫生监督所，云南泸西６５２４００；４．云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明６５０２０１）
中图分类号：￥８５２．７３ Ｊ‘１ 文献标识码：Ｂ 文章编号：０５２９—６００５（２０１１）１２ ００３２—０２
金丝猴鞭形毛首线虫（鞭虫）（Ｔ．ｔｒｉｃｈｕｒｕｓ）病
鞭形毛首线虫虫卵数，了解鞭形毛首线虫在金丝猴
体内的消长规律，从而对金丝猴鞭形毛首线虫病进
行有效控制，达到保护金丝猴的目的。
１材料及方法
是一种全球分布，能感染多种动物的寄生虫病，全年
均可发生。金丝猴对鞭形毛首线虫极为易感，发病
后对动物的健康影响极大，而且虫体在动物盲肠中
很难驱净。临床主要表现为精神沉郁，体温升高，食
欲减少，稀便，腹泻，排血色水样粪便，并附有黏液，
贫血消瘦，严重的可致死 ｊ。
１．１ 材料 １２只金丝猴猴子由昆明动物园驯养，
展出于固定的笼舍内，滇金丝猴８只，川金丝猴４
只，年龄最大的９岁，最小的属幼龄猴。分别采集各
编号金丝猴的新鲜粪便，编号装入洁净的器皿内，于
１２ ｈ内进行检查。
本次对昆明动物园圈养金丝猴粪便进行定期检
查，通过近７个月的观察、计算，从金丝猴粪便中的
收稿日期：２Ｏ１１—０１—１３
１．２方法
作者简介：王荣琼（１９７８一），女，讲师，硕士，主要从事寄生虫方面
的教学及小动物的临床工作，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｒｑ２００９＠ｙａｈｏｏ．ＣＯＮ．ｃｎ
通讯作者：刘永张，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｙｚｈ２４６８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
试验开始前使用虫力黑进行药物投服
（虫力黑是由伊维菌素、阿苯哒唑等药组成的复方制
剂驱虫药），２４ ｈ后取粪样观察，自２００９年９月１０
日开始持续至２０１０年４月１１日共７个月时间，共
采集粪样８次。其中２ ０ ０ ９年９月１ ０日和２ ０ ０ ９年
相对定量检测，研究ｔｕＲＮＡ在处理样品和未处理样
参考文献：
［１］Ａｒｇａｗ Ｔ，Ｒｉｔｚｈａｕｐｔ Ａ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ Ａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅａｌ
ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔｉａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅｅｎ ｄｏｇｅ
品目的基因之间的表达差异。根据Ｃｔ值及相应标
准曲线计算出ＩＬ一２、Ｊ３一ａｃｔｉｎ初始拷贝数，然后进行
数据归一化处理（标准化ｍＲＮＡ表达量一目标基
ｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２，１０６（１）：９７—１０６．
［２］Ｂｌａｓｃｈｋｅ Ｖ，Ｒｅｉｃｈ Ｋ，Ｂｌａｓｅｈｋｅ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ
ｓｍａｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ：ｖａｉｌ—
因／内参基因），校正模板在核酸数量上的差异，消除
了样品采集、核酸提取及反转录操作中误差对定量
样品结果的影响［６］。同时，由于该方法检测目的基
因和内参基因斜率（ｋ）分别为一３．１７５ ３７７和
ｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０００，２４６（１－２）：７９—９０．
［３］ 王金勇．鸭白细胞介素２配体与受体ａｌｐｈａ的研究［Ｄ］．杭州：
浙江大学，２００６．
３．１６２ ８８５，具有相似的线性范围，表明扩增效率
很接近，因此，在以后研究ＩＬ一２ ｍＲＮＡ表达差异
Ｅ４］Ｈｅｉｎ Ｊ，Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒ Ｕ，Ｂｅｉｎ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕ—
ｒｉｎｅ ＩＦＮ一７ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ
时，可省去制作标准品及标准曲线步骤，利用比较
Ｃｔ值法即可得到ＩＬ一２ ｍＲＮＡ表达变化结果ｌ＿７ ］。
熔解曲线分析表明，该方法扩增的产物具有特异性，
ｋｉｎｅｔｉｃ ＲＴ—ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｄｙｅ［Ｊ］．Ｓｅａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕ—
ｎｏｌ，２００１，５４（３）：２８５—２９１．
［５］Ｍｉｃｈａｅｌ Ｗ Ｙ，Ｃｈａｎ Ｅａｇｌｅ Ｓ Ｈ Ｃｈｕｌ，Ｋａ—Ｆａｉ Ｔｏ，ｅｔ ａ１．Ｑｕａｎ—
ｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＯＣＳ－１，ａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ
ｇｅｎｅ，ｂｙ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｙｌａ—
ｔｉｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｇａｓ—
未见引物二聚体和其他非特异性产物生成；对各稀
释度ＩＬ一２ ｃＤＮＡ进行检测表明，该方法灵敏度高
（可达１５８拷贝／ＴＬ），可对细胞或组织中的ＩＬ一２
ｍＲＮＡ表达进行直接检测，无需通过其他刺激诱
ｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００４，２６
（１６）：１２８９—１２９３．
［６］Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ Ａ，Ｏｖｅｒｂｅｒｇｈ Ｌ，Ｖａｌｅｋｘ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅ—
ａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｆｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ
导；重复性试验结果表明，该方法重复性好。
综上所述，本研究建立的方法，对鸭ＩＬ一２ ｍＲ—
ＮＡ进行定量检测具有快速、灵敏、特异性强等优
点，为进一步在ｔｕＲＮＡ水平对鸭细胞因子进行定量
分析奠定了基础。
ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２５（４）：３８６—４０１．
［７］Ｄｕｓｓａｕｌｔ Ａ Ａ，Ｐｏｕｌｉｏｔ Ｍ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ
ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｐｒｏｃｅｄ
Ｏｎｌｉｎｅ，２００６，８（１）：１－１０．
ｒ８］Ｐｆａｆｆｌ Ｍ Ｗ．Ａ ｎｅｗ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａ—
ｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ［Ｊ］．Ｎｕｅｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００１，２９
（９）：ｅ４５．
2024年8月21日发(作者：性绮玉)
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第１２期 ２９
鸭ＩＬ一２ ｍＲＮＡ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ
检测方法的建立
于学武 ，郑世民 ，葛宝伟。，刘超男 ，高雪丽
（１。东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨１５００３０；２．辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳１１０１６４）
中图分类号：￥８５２．４ 文献标识码：Ｂ 文章编号：０５２９—６００５（２０１１）１２～００２９—０３
鸭是一种与人类关系十分密切的水禽，对其相
ｐＭＤ１８－Ｔ载体均购自大连ＴａＫａＲａ公司。
关基因表达水平的定量分析，为进一步了解各基因
１．２主要试剂和仪器 禽源反转录酶（ＡＭＶ）、
功能及其与生产、抗病能力的关系具有十分重戛的
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｒＴａｑ ＤＮＡ
应用价值。细胞因子与某些疾病的发生发展密切相
聚合酶、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ－２ ０００、Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ
关，故对细胞因子及其受体的检测越来越受到重视。
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑｍ均为大
实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉ－ 连ＴａＫａＲａ公司产品；Ｔｒｉｚｏｌ为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产
ｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ＲＴ—ＦＱ－ＰＣＲ）技术是ＲＮＡ定量领域 品；Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５、ＴＩＡＮ ｐｒｅｐ Ｍｉｎｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ均
的创新，该技术为组织或细胞中ｍＲＮＡ检测提供了
为北京天根生物有限公司产品；ＡＢＩ ７５００荧光ＰＣＲ
一
种敏感性和准确性均很高、重复性好的试验方法， 仪、ＢＩＯ—ＲＡＤ ＰＴＣ＿２００ ＰＣＲ仪、ＵＶＰ ＧＤＳ一８００凝
减少了普通ＰＣＲ反应中易产生污染等弊端，并可进 胶成像系统等均为美国相应公司产品。
行高通量操作。该技术已成为目前检测细胞因子的
１．３ 引物设计及合成 根据ＧｅｎＢａｎｋ上鸭ＩＬ－２
标准方法之一＿ｌ ｊ。
和Ｊ３一ａｃｔｉｎ基因核苷酸序列，利用Ｏｌｉｇｏ６．０及Ｐｒｉｍ—
１材料与方法
ｅｒ５．０软件，在保守区分别设计１对特异引物，其序
１．１试验动物、菌种和质粒金定鸭购自哈尔滨市
列见表１。引物由上海英骏生物技术有限公司合
某孵化场，于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
成。
ＳＰＦ实验动物中心饲养；ＪＭ１０９感受态菌和
表１引物序列及其扩增片段
１．４ ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成采用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
ｃＤＮＡ ６ ｔｔＬ，用灭菌ｄｄＨ２Ｏ补至５Ｏ Ｌ。ＩＬ一２与ｐ—
公司Ｔｒｉｚｏｌ试剂一步法提取鸭脾脏总ＲＮＡ，溶于
ａｅｔｉｎ扩增反应条件为：９４℃预变性２ ｍｉｎ；然后
１５ Ｌ ＤＥＰＣ水中，１．５ 琼脂糖凝胶电泳后观察， ９４℃变性４５ Ｓ，５６／５７℃退火４５ Ｓ，７２℃延伸４５ Ｓ，共
并于紫外分光光度仪下测定ＯＤ 。、ＯＤ ，计算其
３０个循环；７２℃终延伸５ ｍｉｎ。
比值，鉴定ＲＮＡ样品质量。反转录反应体系及条 １．６ 阳性标准品的制备分别回收ＩＬ一２及［３－ａｃｔｉｎ
件按反转录酶说明书进行，所得反应液用于常规 扩增产物，经纯化后连接入ｐＭＤ－１８Ｔ载体，转化至
ＰＣＲ和Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ，或一２Ｏ℃保存备用。
ＪＭｌＯ９感受态菌，提取经ＰＣＲ鉴定和序列测定分析
１．５ 目的片段扩增 反应体系为：１０×Ｂｕｆｆｅｒ １０ 验证均为阳性克隆菌株的质粒，１Ｏ倍梯度稀释阳性
Ｌ，ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）８ Ｌ，ｒＴ ｇ（５Ｕ／
质粒，一２Ｏ℃保存备用。
ｇＬ）Ｏ．２５／，Ｌ，上下游引物（１Ｏ￣ｔｍｏｌ／Ｌ）各０．５ Ｌ， １．７ 反应条件的优化应用梯度ＰＣＲ仪选择不同
Ｔ 值（５０℃～６５℃），确定最佳Ｔ 值；在Ｔ 值确定
收稿日期：２０１１－０１—２４
条件下，对引物浓度进行优化。
基金项目：黑龙江省自然科学基金（ｃ２００８４１）
作者简介：于学武（１９８２～），男，兽医师，博士生，从事畜禽疫病免
１．８ 标准曲线绘制 取ＩＬ一２及１３－ａｃｔｉｎ １０倍系列
疫病理研究工作，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕｘｕｅｗｕｌ＠１６３．ｃｏｒｎ
稀释的重组阳性质粒为模板，反应体系为ＳＹＢＲ
通讯作者：郑世民，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｅｎｇｓｈｉｍｉｎｂＬ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（２×）１０“Ｌ、上下游引物（１０
３０ 中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第１２期
ｍｏｌ／Ｌ）各０．３ Ｌ，ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（５０×）０．４
Ｌ，模板１．０ Ｌ，灭菌ｄｄＨ２Ｏ补至２Ｏ Ｌ。反应程
序为：９５℃预变性１５ Ｓ，９５℃变性５ ｓ，６０℃退火／延
伸３４ Ｓ，４０个循环，在每个退火步骤之后采集荧光
信号，并设阴性对照。反应结束后确认扩增曲线、熔
解曲线及制作标准曲线，采用自动分析软件进行数
据分析。
１．９特异性、灵敏度及重复性检验 分别将ＩＬ一２
及８一ａｃｔｉｎ ｃＤＮＡ进行１０。至１Ｏ 稀释，进行灵敏度
试验。上述每个稀释度设３个重复，每次试验以相
应熔解曲线判断扩增产物的特异性。
２ 结果
２．１ 总ＲＮＡ质量鉴定 总ＲＮＡ经１．５ ９／６普通琼
脂糖凝胶电泳后，显示清晰的２８Ｓ、１８Ｓ条带（图１），
核酸蛋白紫外分析仪检测ＲＮＡ ＯＤ。 。／ｏｒ）。。。值介
于１．８～２．０之间，提示总ＲＮＡ质量较好。
２８Ｓ
ｌ８Ｓ
图１总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳图
１：双蒸水；２：总ＲＮＡ
２．２ ＩＬ一２及８一ａｃｔｉｎ扩增 ＩＬ＿２及』３一ａｃｔｉｎ扩增产
物于１．５ 琼脂糖凝胶上电泳后观察，发现分别于
２００ ｂｐ、１３０ ｂｐ位置各呈现一条特异性条带，与预期
设计片段大小相一致（图２、３）；测定的鸭ＩＬ一２和』３一
ａｃｔｉｎ序列分别与ＧｅｎＢａｎｋ中鸭ＩＬ一２及Ｂ—ａｃｔｉｎ基
因序列比较，核苷酸同源性分别为９８．１ 、９９．２ 。
ｂｐ
２ ０００
１ ０００
７５０
５００
２５０
２００ ｂｐ
１００
图２ ＩＬ－２基因扩增结果
Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：ＩＬ－２扩增产物
２．３ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ的优化条件 退火温度及引
物浓度优化结果表明，０．１５／ｌｍｏｌ／Ｌ引物终浓度及
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
６Ｏ℃退火具有最低的Ｃｔ值及相对高的荧光强度，且
无二聚体形成。
ｂｐ
２ ０００
９２８
５００
２５０
１００
图３￣ａｃｔｉｎ基因扩增结果
●
Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：￣－ａｃｔｉｎ扩增产物
２．４标准曲线绘制 由扩增曲线可知１Ｏ。和１０
稀释度的扩增曲线不理想，标准曲线的线性关系也
不好，相关系数（Ｒｚ）分别为０．９７７ ４６８和０．９８６ ８５６。
因此，将上述２个稀释度质粒弃掉，
ｌ ｌ １ ｌ Ｏ ０ Ｏ Ｏ
结果其相关系数
０
（Ｒ ）分别变为０．９９６ ５９４和０．９９５ ２５７，斜率（ｋ）分
∞∞知加∞∞∞们∞０加
别为一３。１７５ ３７７和～３．１６２ ８８５。扩增曲线随即变
得较为理想，图４、５、６、７。
星
占
图４ Ｉ￣ａｃｔｉｎ基因扩增曲线
循环数
图５ ＩＬ－２基因扩增曲线
２．５特异性分析每次反应结束后／？－ａｃｔｉｎ及ＩＬ一２
基因相应熔解曲线均在８１℃左右处形成单一峰值
（图８、９），阴性对照曲线较为平直，表明引物特异性
好，扩增产物单一，经电泳证实为特异性产物。
ｏ＾Ｉ Ａ１．１占
Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ ０
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第１２期
掩 Ｍ
３ｌ
ｍ∞∞ 乏！∞
Ｉ
Ｉ 卜
Ｉ
ｔ
●
图６￣－ａｃｔｉｎ基因标准曲线
－
ｌ
●
图７ ＩＬ－－２基因标准曲线
｛
；１
｝
ｌ
， ｒ
；
６Ｏ ６５ ７Ｏ ７５ ８Ｏ ８５ ９Ｏ ９５
温度（℃）
图８￣ａｃｔｉｎ基因熔解曲线
焉
＞
｝ ，
ａ
５
髓 矍 §
』
漫 －．．－．－－－．
ｆ
温度（℃）
图９ ＩＬ－２基因熔解曲线
２．６灵敏度及重复性ｃＤＮＡ在１０。至１Ｏ 稀释
范围内，Ｊ３一ａｃｔｉｎ及ＩＬ一２扩增曲线的重复性好（图
１０、１１），变异系数（ＣＶ）分别在３．５８ ～６．１２％和
１．６４％～３．５５％之间；在此稀释范围内，由公式（ＯＤ
值×５０×ｌＯ一。×６．０２×１０捣／（６６Ｏ×ｂｐ数）一拷贝／
ｍＬ）计算可知，其检测灵敏度分别达１１６拷贝／“Ｌ
和１５８拷贝 Ｌ。
２．４Ｏ
２．００
ｌ ６０
１ ２０
专Ｏ，８Ｏ
０．４０
Ｏ
—
Ｏ ４０
１ ５ １０ １５ ２０ ２Ｓ ３Ｏ ３５ ４Ｏ
循环数
图１０ ｐ－ａｃｔｉｎ基因灵敏度及重复性扩增曲线
蛊
ｏ
循环数
图１１ ＩＬ一２基因灵敏度及重复性扩增曲线
３讨论与结语
细胞因子与动物机体免疫应答关系十分密切，
ＩＬ－２作为细胞免疫的主要细胞因子，在动物机体免
疫应答过程中发挥重要作用，包括Ｔ细胞激活和分
化、Ｂ细胞生长发育以及自然杀伤细胞的活化。水
禽的ＩＬ一２研究较其他动物相对滞后，王金勇等［３ 利
用同源克隆法，首次获得目前最长的鸭ＩＬ一２基因组
ＤＮＡ序列，并对鸭ＩＬ一２进行了生物信息学分析。
研究表明，慢性感染、自身免疫性疾病、移植排斥与
组织细胞中促炎、抗炎细胞因子变化密切相关，探究
上述免疫过程，对相关细胞因子表达的定量尤为重
要，而常常用于分析的组织或细胞量较少，难以在蛋
白质水平进行定量。尽管转录后调节和翻译后修饰
在某些目的基因意义重大，许多文献报道，ＲＴ—ＦＱ－
ＰＣＲ定量细胞因子ｍＲＮＡ水平与ＥＬＩＳＡ测定的
细胞因子蛋白质水平有良好的相关性［２，４－５］。目前
ＲＴ－一ＦＱ－－Ｐ．ＣＲ技术已得到广泛应用，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
适用于扩增各种目的基因，无需设计探针、使用方
便、成本低廉，但其对引物设计要求较高。
本试验建立了ＩＬ一２ ｔｕＲＮＡ表达双标准曲线
Ｒ．Ｔ－一ＦＱ－ＰＣＲ检测方法，该方法既可对ＩＬ一２ ｔｕＲＮＡ
表达进行绝对定量，也可利用内参基因８一ａｃｔｉｎ进行
３２ 中国兽医杂志２０１１年（第４７卷）第１２期
圈养金丝猴鞭形毛首线虫的消长观察
王荣琼 ，刘永张。，赵永琳 。，邹丰才
（１．云南农业职业技术学院，云南昆明６５０２１２；２．昆明动物园，云南昆明６５００２１；
３．泸西县畜牧兽医局动物卫生监督所，云南泸西６５２４００；４．云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明６５０２０１）
中图分类号：￥８５２．７３ Ｊ‘１ 文献标识码：Ｂ 文章编号：０５２９—６００５（２０１１）１２ ００３２—０２
金丝猴鞭形毛首线虫（鞭虫）（Ｔ．ｔｒｉｃｈｕｒｕｓ）病
鞭形毛首线虫虫卵数，了解鞭形毛首线虫在金丝猴
体内的消长规律，从而对金丝猴鞭形毛首线虫病进
行有效控制，达到保护金丝猴的目的。
１材料及方法
是一种全球分布，能感染多种动物的寄生虫病，全年
均可发生。金丝猴对鞭形毛首线虫极为易感，发病
后对动物的健康影响极大，而且虫体在动物盲肠中
很难驱净。临床主要表现为精神沉郁，体温升高，食
欲减少，稀便，腹泻，排血色水样粪便，并附有黏液，
贫血消瘦，严重的可致死 ｊ。
１．１ 材料 １２只金丝猴猴子由昆明动物园驯养，
展出于固定的笼舍内，滇金丝猴８只，川金丝猴４
只，年龄最大的９岁，最小的属幼龄猴。分别采集各
编号金丝猴的新鲜粪便，编号装入洁净的器皿内，于
１２ ｈ内进行检查。
本次对昆明动物园圈养金丝猴粪便进行定期检
查，通过近７个月的观察、计算，从金丝猴粪便中的
收稿日期：２Ｏ１１—０１—１３
１．２方法
作者简介：王荣琼（１９７８一），女，讲师，硕士，主要从事寄生虫方面
的教学及小动物的临床工作，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｒｑ２００９＠ｙａｈｏｏ．ＣＯＮ．ｃｎ
通讯作者：刘永张，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｙｚｈ２４６８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
试验开始前使用虫力黑进行药物投服
（虫力黑是由伊维菌素、阿苯哒唑等药组成的复方制
剂驱虫药），２４ ｈ后取粪样观察，自２００９年９月１０
日开始持续至２０１０年４月１１日共７个月时间，共
采集粪样８次。其中２ ０ ０ ９年９月１ ０日和２ ０ ０ ９年
相对定量检测，研究ｔｕＲＮＡ在处理样品和未处理样
参考文献：
［１］Ａｒｇａｗ Ｔ，Ｒｉｔｚｈａｕｐｔ Ａ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ Ａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅａｌ
ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔｉａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅｅｎ ｄｏｇｅ
品目的基因之间的表达差异。根据Ｃｔ值及相应标
准曲线计算出ＩＬ一２、Ｊ３一ａｃｔｉｎ初始拷贝数，然后进行
数据归一化处理（标准化ｍＲＮＡ表达量一目标基
ｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２，１０６（１）：９７—１０６．
［２］Ｂｌａｓｃｈｋｅ Ｖ，Ｒｅｉｃｈ Ｋ，Ｂｌａｓｅｈｋｅ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ
ｓｍａｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ：ｖａｉｌ—
因／内参基因），校正模板在核酸数量上的差异，消除
了样品采集、核酸提取及反转录操作中误差对定量
样品结果的影响［６］。同时，由于该方法检测目的基
因和内参基因斜率（ｋ）分别为一３．１７５ ３７７和
ｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０００，２４６（１－２）：７９—９０．
［３］ 王金勇．鸭白细胞介素２配体与受体ａｌｐｈａ的研究［Ｄ］．杭州：
浙江大学，２００６．
３．１６２ ８８５，具有相似的线性范围，表明扩增效率
很接近，因此，在以后研究ＩＬ一２ ｍＲＮＡ表达差异
Ｅ４］Ｈｅｉｎ Ｊ，Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒ Ｕ，Ｂｅｉｎ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕ—
ｒｉｎｅ ＩＦＮ一７ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ
时，可省去制作标准品及标准曲线步骤，利用比较
Ｃｔ值法即可得到ＩＬ一２ ｍＲＮＡ表达变化结果ｌ＿７ ］。
熔解曲线分析表明，该方法扩增的产物具有特异性，
ｋｉｎｅｔｉｃ ＲＴ—ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｄｙｅ［Ｊ］．Ｓｅａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕ—
ｎｏｌ，２００１，５４（３）：２８５—２９１．
［５］Ｍｉｃｈａｅｌ Ｗ Ｙ，Ｃｈａｎ Ｅａｇｌｅ Ｓ Ｈ Ｃｈｕｌ，Ｋａ—Ｆａｉ Ｔｏ，ｅｔ ａ１．Ｑｕａｎ—
ｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＯＣＳ－１，ａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ
ｇｅｎｅ，ｂｙ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｙｌａ—
ｔｉｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｇａｓ—
未见引物二聚体和其他非特异性产物生成；对各稀
释度ＩＬ一２ ｃＤＮＡ进行检测表明，该方法灵敏度高
（可达１５８拷贝／ＴＬ），可对细胞或组织中的ＩＬ一２
ｍＲＮＡ表达进行直接检测，无需通过其他刺激诱
ｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００４，２６
（１６）：１２８９—１２９３．
［６］Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ Ａ，Ｏｖｅｒｂｅｒｇｈ Ｌ，Ｖａｌｅｋｘ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅ—
ａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｆｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ
导；重复性试验结果表明，该方法重复性好。
综上所述，本研究建立的方法，对鸭ＩＬ一２ ｍＲ—
ＮＡ进行定量检测具有快速、灵敏、特异性强等优
点，为进一步在ｔｕＲＮＡ水平对鸭细胞因子进行定量
分析奠定了基础。
ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２５（４）：３８６—４０１．
［７］Ｄｕｓｓａｕｌｔ Ａ Ａ，Ｐｏｕｌｉｏｔ Ｍ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ
ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｐｒｏｃｅｄ
Ｏｎｌｉｎｅ，２００６，８（１）：１－１０．
ｒ８］Ｐｆａｆｆｌ Ｍ Ｗ．Ａ ｎｅｗ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａ—
ｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ［Ｊ］．Ｎｕｅｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００１，２９
（９）：ｅ４５．