2024年2月15日发(作者：浑盼夏)
１卷第４第１期湖北师范大学学报（自然科学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）Ｖｏｌ４１Ｎｏ１，２０２１甘油对红曲菌甘油及碳源代谢关键酶酶活的影响１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４，，，，，石 佳赵 薇鲁 瑾王文娟余 翔冯艳丽（１．特色野菜良种繁育与综合利用技术湖北省工程研究中心，３５００２；湖北黄石 ４ ２．湖北师范大学食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，３５００２；湖北黄石 ４３．湖北师范大学生命科学学院，３５００２；湖北黄石 ４４．湖北师范大学生物学国家级实验教学示范中心，３５００２）湖北黄石 ４Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）ＭＳ－１为实验菌株，摘要：以丛毛红曲菌（考察合成培养基中甘油浓度对红曲菌碳源及甘Ｈ均在３．５～７．５之间，油代谢关键酶酶活的影响。结果表明，发酵过程中各处理发酵液ｐ且呈先降后升趋，／Ｌ和４０ｇ／Ｌ的处理中甘油及碳发酵液体积呈下降趋势。在发酵的前９ｄ普遍表现为甘油浓度为１ｇ势，６０ｇ／Ｌ的处理中相关酶活，源代谢关键酶酶活高于对照及甘油浓度为１在发酵后期则普遍出现相反的现进而影响红曲菌生长及代谢产物产生。该研究结象。甘油可影响红曲菌的碳源及甘油代谢关键酶酶活，果可为深入探讨甘油影响红曲菌代谢产物产生的分子机制奠定基础。关键词：红曲菌；甘油；红曲色素；碳源代谢；关键酶Ｑ９３９．９７ 文献标志码：Ａ 文章编号：２０９６－３１４９（２０２１）０１－００１７－０９中图分类号：ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９６－３１４９．２０２１．０１．００３０ 前言Ｍｏｎａｓｃｕｓｓｐｐ．），红曲菌（又称红曲霉，是我国重要的药食同源微生物，其淀粉质原料的发酵产１，２］——红曲在我国有２０００多年的应用历史［。红曲菌在工业生活的应用主要是红曲色素（Ｍｏｎａｓ品—［３］ｐｉｇｍｅｎｔｓ，ＭＰｓ）Ｐｓｃｕｓ的应用。Ｍ在食品工业主要用于发酵豆制品、红曲米酒及干制鱼、肉制品等的着色［５］［６］，Ｐｓ保健食品、替代肉品加工中的部分亚硝酸盐等。在生产Ｍ的过程中发现，甘油可促［７～９］Ｐｓ，。进红曲菌产生Ｍ但其作用机制不明确［４］甘油可作为碳源用于微生物发酵，但不同微生物对甘油的代谢和利用也不同。已有研究表明，以ＭＰｓ（ＭｏｎａｃｏｌｉｎＫ，ＭＫ）蔗糖为主要碳源时添加甘油可促进红曲菌生长、和莫纳可林Ｋ的产生，且甘［８～１０］ＰｓＫ关键基因的表达，。甘油代谢主要涉及４油可影响红曲菌合成Ｍ和Ｍ但具体机制并不清楚Ｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＤＨ）、Ｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＧＤＨｔ）、种酶，分别是甘油脱氢酶（甘油脱水酶（二Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅｋｉｎａｓｅ，ＤＨＡＫ），３－１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌｄｅｈｙ羟基丙酮激酶（和１丙二醇氧化还原酶（１１，１２］ｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＰＤＯＲ）［。近年来，有关碳源对微生物代谢的影响也有大量报道，主要包括碳源对微生物代谢产物的影响及与碳源代谢相关基因的研究等，未见甘油影响红曲菌碳源代谢的相Ｐｓ分析了甘油对红曲菌产Ｍ的影响，还对影响红曲菌代谢产关研究。课题组在合成培养基条件下，物产生的碳源选择性进行了研究［１０］［１３，１４］［１５，１６］。然而，甘油对红曲菌碳源代谢的影响效应并不清楚。本研究从甘油代谢途径和红曲菌碳源代谢途径涉及关键酶的酶活探讨甘油对红曲菌发酵过程的ＤＨ、ＧＤＨｔ、ＤＨＡＫ和ＰＤＯＲ，ＤＨ、ＧＤＨｔ、影响。甘油代谢主要涉及４种酶，分别是Ｇ但通常仅监测ＧＰＤＯＲ的酶活。红曲菌碳源代谢涉及的酶主要是β－半乳糖苷酶和葡萄糖激酶。本研究主要在前期２０２０－０８－１８收稿日期：Ｄ２０１９２５０２），基金项目：湖北省教育厅科研计划项目重点项目（食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室开放基金（ＥＷＰＬ２０１８０７），２０１９ＣＺ０７）湖北师范大学科研创新团队项目（１９９８— ），作者简介：石 佳（女，山西晋中人，在读硕士研究生，研究方向为食品微生物．１９８１— ），Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｙａｎｌｉ＠ｈｂｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．通讯作者：冯艳丽（女，河南周口人，副教授，博士，硕士生导师，研究方向为食品发酵，
，探讨在合成培养基条件下，甘油对红曲菌甘油及碳源代谢关键酶酶活的影响，为后续开展红曲菌利用甘油及甘油影响红曲菌代谢产物产生的分子机制提供依据。研究的基础上［１０］１ 材料与方法１．１ 实验材料Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ）ＭＳ－１（ＣＣＴＣＣＭ２０１３２９５，丛毛红曲菌（中国典型培养物保藏中心）是从市售红曲ＰｓＫ且不产桔霉素的菌株。土豆等均为市售。产品中分离获得的可高产Ｍ及Ｍ１．２ 仪器设备ＦＳＨ－２型可调高速电动匀浆器，ＵＶ１９００型紫外分光光度计，金坛市江南仪器厂；日本岛津公５４２７Ｒ型台式高速离心机，ｐｐａｎｄｏｒｆ；ＨＺＱ－Ｆ１６型振荡培养箱，德国ｅ哈尔滨市东联电子技术开发司；有限公司。其余设备均为常规小型实验室设备。１．３ 试剂及溶液ＭｇＳＯ·７ＨＯ、ＫＣｌ、ＦｅＳＯ、ＮａＯＨ、ＫＨＰＯ·３ＨＯ、ＫＨＰＯ、葡萄糖、蔗糖、甘油、盐酸、乙酸钠、盐４２４２４２２４２苯并噻唑酮腙（ＭＢＴＨ）、（ＮＨ）ＳＯ、Ｆｅ（ＮＨ）（ＳＯ）、ＫＣＯ、ＫＨＣＯ、１，２－酸３－甲基－丙二醇、４２４４２４２２３３１，３－ＰＤＯ）、ＮａＨＰＯ·２ＨＯ、ＮａＨＰＯ·１２ＨＯ、ＮａＣＯ、柠檬酸钾、柠檬酸、酚试剂、丙二醇（三（羟２４２２４２２３ｒｉｓ－ＨＣｌｇＣｌ甲基）氨基甲烷Ｔ及Ｍ琼脂粉、烟酰胺腺嘌呤二核苷２均为国产分析纯试剂。谷氨酸钠、（ＮＡＤ）、ＮＡＤＰ）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（及辅酶Ｂ均为国产生物试剂。二硫苏糖醇、邻－硝酸、１２Ｄ－ＡＴＰ）６－基苯酚、邻硝基苯β－半乳吡喃糖苷、腺苷三磷酸（和葡萄糖－磷酸脱氢酶均为高级纯，６－Ｇ－６－ＰＤＨ）ＡＴＰ）ＣｍＥＩ，其中二硫苏糖醇、葡萄糖－磷酸脱氢酶（和腺苷三磷酸（生产商为Ｂ其余为国产试剂。１．４ 培养基３ＰＤＡ培养基：００ｇｍ），００ｍＬ蒸馏水煮沸３０ｍｉｎ．将２马铃薯去皮切块（约２ｃ加入１０冷却后过００ｍＬ．０ｇ０ｇＨ．滤，滤液加蒸馏水补足至１０加入２葡萄糖搅拌均匀。加入２琼脂至充分溶解，自然ｐ５００ｍＬ，１×１０Ｐａ０ｍｉｎ．分装至茄形瓶中，每瓶１灭菌２０ｇ／Ｌ，１０ｇ／Ｌ谷氨酸钠，０．０００７ｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ·７ＨＯ，１ｇ／ＬＫＨＰＯ，０．５ｇ／Ｌ发酵培养基：蔗糖６４２２４５，０．０５ｇ／ＬＦｅＳＯ，Ｈ为６．０，１×１０Ｐａ０ｍｉｎ．ＫＣｌ调节ｐ灭菌２４１．５ 孢子悬液的制备及红曲液态发酵ＤＡ斜面在２８℃培养１０ｄ，０ｍＬ无菌水。用无菌接种铲刮取孢子，接种红曲菌的Ｐ加入１将孢子６０ｃｆｕ／ｍＬ．０ｍＬ培悬液滤入装有玻璃珠的无菌锥形瓶中。调整孢子浓度为１将孢子悬液接入装有５５０ｍＬ三角瓶中，０％（ｖ／ｖ）。在３０℃、１３０ｒ／ｍｉｎ培养３ｄ后调整温度为２５℃，养基的２接种量为１５ｄ．继续培养至１１．６ 红曲菌液态发酵产物中粗酶液的制备［１０］ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ和１６０ｇ／Ｌ，结合前期研究基础，分别将发酵培养基中甘油浓度调整至１接种量及１．５孢子悬液的制备及红曲液态发酵”，，培养条件同“每隔３ｄ取样（每个处理取出３瓶进行分析）检１，３－５ｄ测甘油脱氢酶、丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶、β－半乳糖苷酶、葡萄糖激酶酶活，至第１（。设置３个平行）０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液（ｐＨ７．０，粗酶液的制备：过滤发酵液，将收集到的菌丝体保存在５含有２ｍｍｏｌ／Ｌ，，二硫苏糖醇）中，然后用组织匀浆机（每次６ｓ间歇３ｓ共进行３次）进行破碎，释放胞内酶，００ｒ／ｍｉｎ０ｍｉｎ，最后在８０条件下离心１所得上清液即为胞内酶粗提液，该粗酶液用于后续实验中酶活分析。采用过滤后的发酵液测定胞外酶的酶活。１．７ 甘油对红曲菌发酵过程中甘油代谢关键酶酶活的影响１７］１．７．１ 甘油脱氢酶酶活的测定 采用分光光度法测定甘油脱氢酶的酶活［，该反应液总体积为１．５ｍＬ，５ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ）ＳＯ、１μｍｏｌ／ＬＦｅ（ＮＨ）（ＳＯ）、０．２ｍｏｌ／Ｌ甘油、１．２ｍｍｏｌ／ＬＮＡＤ包括２４２４４２４２
．１ｍｏｌ／ＬＫＣＯｐＨ９．８）０℃，３４０以及适量保存于０中的待测液。用紫外分光光度计于３２３缓冲溶液（ｎｍ波长下，ｉｎ内的吸光度值。１个酶活单位（Ｕ）ｉｎ内消耗１测定１ｍ的定义是指在该条件下１ｍｍｏｌμ底物所需要的酶量。酶活计算公式如下：Ｕ／ｍＬ）＝（Ｖ／×Ｋ）／（ＶＬ）酶活力单位（△Ａ△ｔε×Ｔ×Ｓ×Ｋ指样品稀释倍数；Ｖ．５ｍＬ的总体积；Ｖ．０６ｍＬ的样品体积；其中，ε指摩尔吸光系Ｔ指１Ｓ指０ＮＡＤＨ在３４０ｎｍ处的毫摩尔消光系数为６．２２；Ｌｍ光径的比色杯；／ｉｎ内变化数，指１ｃ△Ａ△ｔ指１ｍ的吸光度值。Ｕ／ｍＬ）＝８．０４×／甘油脱氢酶酶活力单位（△Ａ△ｔ１．７．２ 甘油脱水酶酶活的测定 采用分光光度法检测甘油脱水酶的酶活，因甘油脱水酶的反应需依［１８］，Ｌ的反应液：ＫＣｌ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１，２赖易见光分解的辅酶Ｂ测定该酶活须在避光条件下进行。１ｍ１２．２ｍｏｌ／Ｌ、５μＭ、ｐＨ７．０）０．０３５ｍｏｌ／Ｌ和适量细胞抽提液。首先－丙二醇０辅酶Ｂ磷酸钾缓冲液（１２１７℃下保温１０ｍｉｎ，Ｌ的０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钾缓冲液（ｐＨ３．６）．５ｍＬ的０．１％在３然后加入１ｍ和０ＭＢＴＨ（２苯并噻唑酮腙）７℃下保温１５ｍｉｎ，Ｌ的蒸馏水，盐酸３－甲基－溶液，然后在３最后加入１ｍ０５ｎｍ处测定１ｍｉｎＵ）用紫外分光光度计于３内的吸光度值。１个酶活单位（的定义是指在上述条件ｉｎｍｏｌ１，３－下１ｍ内生成１μ丙二醇所需的酶量。ＢＴＨ发生显酶活力计算：甘油在甘油脱水酶的催化作用下脱水生成２－羟基丙酮，该物质可与ＭＨ７．０、３７℃的条件下，色反应，因此甘油脱水酶的酶活可以通过终点法测定。首先在ｐ底物、酶与辅０ｍｉｎ，ＢＴＨ在３０５ｎｍ处与２－共反应１接着加入柠檬酸钾缓冲液以终止反应，然后加入的Ｍ羟酶Ｂ１２ＢＴＨ显色法并不能直接用来测甘油脱水酶酶活，基丙酮发生显色反应。但是Ｍ这是因为甘油脱水酶ｉｎ，２－受甘油的影响，在３ｍ之内完全丧失酶活。由于甘油脱水酶催化１丙二醇与甘油这两种底物的ｉｎ终点法来测甘油脱水酶的酶活，反应速率呈正相关，因此可采用３个１ｍ即在加入辅酶Ｂ起始反１２ｉｎ、２ｍｉｎｉｎ内终止反应，，２－．４１，应后的１ｍ和３ｍ并测量１丙二醇与甘油的反应速率，两者比值为１ＭＢＴＨ的摩尔吸光系数为１３．２２Ｌ／ｍｍｏｌ／ｃｍ．Ｆｏｒｇｅ根据以上原因，等推导所得酶活计算公式为：Ｕ／ｍｌ）＝０．５３×Ａ甘油脱水酶活力单位（３０５１．７．３ １，３－，３－丙二醇氧化还原酶的酶丙二醇氧化还原酶酶活的测定 采用分光光度法检测１［１８，１９］，．５ｍＬ，５ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ）ＳＯ、１ｍｏｌ／ＬＦｅ（ＮＨ）活测定该酶活的反应液总体积为１包括２μ４２４４２（ＳＯ）、０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＤＯ、１．２ｍｍｏｌ／ＬＮＡＤ以及适量保存于０．１ｍｏｌ／ＬＫＣＯｐＨ９．８）中的４２２３缓冲液（０℃、３４０ｎｍ处测量１ｍｉｎＵ）待测液。用紫外分光光度计在３内的吸光度值。１个酶活单位（的定义ｉｎｍｏｌ是指在该条件下１ｍ内消耗１μ底物所需要的酶量。ＰＤＯＲ活力的计算方法：ＰＤＯＲ活力单位（Ｕ／ｍＬ）＝Ｄ×Ｖ×（／）／Ｌ×ｖ△Ａ△ｔε×Ｄ指稀释倍数；Ｖ指１．５ｍＬ的总体积；ｖ．０６ｍＬ的样品体积；ＮＡＤＨ在指０ε指摩尔吸光系数，３４０ｎｍ．２２；Ｌ．１ｃｍ光径的比色杯；／Ｄ变化值。处的毫摩尔消光系数为６指０△Ａ△ｔ指单位时间内的ＯＰＤＯＲ的作用是将还原３－３－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ，３－ＨＰＡ）ＤＯ，羟基丙醛（生成Ｐ由于３－ＨＰＡ极不稳定，ａｎｉｅｌｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ因此采用逆反应方法测量该酶活力。Ｄ等研究发现，来自菌种ＣＤＯＲ还原丙醛反应的速率是还原３－ＨＰＡ的２１％．Ｆｏｒａｇｅ等研究发现，．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ的的Ｐ来自ＫＰＤＯＲ对丙醛的还原与对ＰＤＯ的氧化反应速率比为０．８３．ＤＯ的反应速率，由此采用测定Ｐ利用转化０．８３／０．２１＝３．９５，ＤＯＲ的活力。来计算得到Ｐ因数：１，３－Ｕ／ｍＬ）＝３１．７６×丙二醇氧化还原酶酶活力单位（△Ａ／△ｔ１．８ 甘油对红曲菌发酵过程中碳源代谢关键酶酶活的影响１．８．１ β－Ｄ－ＯＮ半乳糖苷酶酶活的测定 β－半乳糖苷酶能够水解邻硝基苯β－半乳吡喃糖苷（ＰＧ），ＮＰＧ发生糖苷键断裂，ＯＮＰ）Ｄ－主要是在酶的作用下Ｏ生成黄色的邻－硝基苯酚（和β－吡喃ＮＰ的含量与其颜色深浅与呈正比，２０ｎｍ处测定ＯＮＰ半乳糖，由于Ｏ因此可用紫外分光光度计，于４
的吸光度值［２０］。Ｌ２ｍｇ／ｍＬ的ＯＮＰＧ作为底物，７℃下预热１０ｍｉｎ，首先取１ｍ在３然后在底物中加入粗酶液１ｍＬ，３７℃下保温２５ｍｉｎ，Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ的碳酸钠溶液终止酶和底物的反应，２０ｎｍ接着加入５ｍ于４［２１］Ｕ）ｉｎ释放处测定待测产物的吸光度值。１个酶活单位（的定义是指在１Ｌ的总体系内反应１ｍ１μｍｏｌＯＮＰＮＰ溶液计算所得，ＯＮＰ校正曲线如图１．所需要的酶量。标准校正曲线由已知浓度的Ｏｙ＝１．０４４２ｘ＋０．０２０１，Ｒ＝０．９９９．该方程式如下：Ｄ×Ｃ×７Ｙ＝酶活力计算公式为：Ｔ×１０Ｙ指酶活力／（Ｕ／Ｌ）；Ｄ指稀释倍数；Ｃ指ＯＮＰ的浓度／（ｍｏｌ／Ｌ）；７指反应体积／ｍＬ；Ｔ指反应时μｍｉｎ；１０指总的样品体积／ｍＬ．间／２ ＯＮＰ校准曲线图１１．８．２ 葡萄糖激酶酶活的测定 采用分光光度法检测葡萄糖激酶的酶活，１．６ｍＬ的反应体系包括：２２］０．８ｍＬ的ＡＴＰ溶液、０．８ｍＬ的ＮＡＤＰ溶液和０．８ｍＬ的氯化镁溶液［。三（羟甲基）氨基甲烷溶液、．２ｍＬ的反应体系，６μＬ的Ｇ－６－ＰＤＨ和１００μＬ的待测液，首先取３然后加入５混合为溶液①，接着．８ｍＬ的葡萄糖溶液，５℃条件下保温５ｍｉｎ，将溶液①与０分别在２最后将二者混合（总体积为４．１５６ｍＬ），４０ｎｍ处测定的吸光度值。用紫外分光光度计于３酶活力计算Ｕ／ｍＬ）＝（Ｖ／×Ｋ）／（ＶＬ）△Ａ△ｔε×酶活力单位（Ｔ×Ｓ×Ｋ指样品稀释倍数；Ｖ．１５６ｍＬ的总体积，．０７８；其中，本实验中为２Ｔ指４Ｖ．１ｍＬ的样品体积；：ＮＡＤＨ在３４０ｎｍ处的毫摩尔消光系数为６．２２；Ｌ指ε摩尔吸光系数，Ｓ指０１ｃｍ的光径比色杯；／△Ａ△ｔ指每分钟吸光度变化值。Ｕ／ｍＬ）＝６．６８×／葡萄糖激酶酶活力单位（△Ａ△ｔ２ 结果与分析２．１ 甘油对发酵液ｐＨ、体积的影响Ｈ及体积的影响，检测甘油对发酵液ｐ每３ｄ取样１次，结果如图２和图３所示。 甘油对发酵液ｐＨ的影响 图３ 甘油对发酵液体积的影响图２
４种培养基发酵液ｐＨ在３．５～７．５之间。发酵至第６ｄ０ｇ／Ｌ和由图２可知，开始，甘油浓度为４１６０ｇ／Ｌ的处理发酵液ｐＨ均低于对照和甘油浓度为１ｇ／Ｌ的发酵液ｐＨ．主要是由于红曲菌利用甘油后产生了小分子酸酸［２］［２３］。在发酵过程中，Ｈ的上升可能与ＭＰｓ发酵液ｐ本身具有碱性及极性有关。Ｈ可反应红曲菌对碳源的利用情况，通过监测发酵液的ｐ因红曲菌在利用碳源过程中可产生小分子［２］。由图３可知，随着发酵时间的延长，发酵液体积逐渐减少，且添加甘油的处理，所得发酵液体积大于对照。发酵液体积下降主要是因为发酵前期红曲菌生长代谢旺盛，对水分消耗量较大，且菌丝体中０％）。发酵过程中出现发酵液体积轻微上升可能是因为菌丝体自溶造成的含水量较高（约为８通过监测发酵液的体积，可以从侧面了解红曲菌的生长情况，也是对已有研究结果的验证。２．２ 甘油对红曲菌发酵过程中甘油代谢关键酶酶活的影响２．２．１ 甘油对红曲菌发酵过程中甘油脱氢酶酶活的影响 采用分光光度法检测发酵过程中甘油对每３ｄ取样１次，结果如图４所示。红曲菌发酵过程中甘油脱氢酶酶活的影响，［２４］。 Ａ胞外酶活 Ｂ胞内酶活 甘油对红曲菌发酵过程中甘油脱氢酶酶活的影响图４ｐ＜０．０５），由图４可知，胞外酶活显著低于胞内酶活（说明甘油脱氢酶主要存在于胞内，这与已［１８，２５］。由图４Ｂ可知，，／Ｌ和４０ｇ／Ｌ的处理胞内有的文献报道相符发酵过程的前９ｄ甘油浓度为１ｇ６０ｇ／Ｌ的处理中甘油脱氢酶酶活。发酵至第９ｄ以后甘油浓度为酶活高于对照和甘油浓度为１１６０ｇ／Ｌ／Ｌ和的处理所得甘油脱氢酶的酶活最高。推测在红曲菌生长前期，培养基中甘油浓度为１ｇ４０ｇ／Ｌ６０ｇ／Ｌ可造成培养可促进红曲菌的生长及代谢，促使甘油脱氢酶酶活增加。而甘油浓度达１［２６］基渗透压过高，造成红曲菌生长缓慢，红曲菌对甘油的利用速率也较慢，使得发酵前期甘油脱氢酶的酶活较低。随着发酵时间的延长，甘油逐渐被红曲菌利用而浓度下降，此时红曲菌加速对甘油的利用促使酶活增加。另外，由于甘油脱氢酶是甘油转化为生物量或进入氧化代谢途径的关键酶，该酶活［２７］的变化反映了红曲菌对培养基中甘油浓度变化的响应。２．２．２ 甘油对红曲菌发酵过程中１，３－丙二醇氧化还原酶酶活的影响 采用分光光度法检测甘油，３－对红曲菌发酵过程中１丙二醇氧化还原酶酶活的影响，每３ｄ取样１次，结果如图５所示。 Ａ胞外酶活 Ｂ胞内酶活 甘油对红曲菌发酵过程中１，３－图５丙二醇氧化还原酶酶活的影响
１，３－ｐ＜０．０５），由图５可知，丙二醇氧化还原酶在胞外的酶活显著低于胞内酶活（说明甘油脱［１８，２５］。由图５Ｂ可知，，氢酶主要存在于胞内，这与已有的文献报道相符在发酵前６ｄ对照和甘油浓／Ｌ的处理中１，３－０ｇ／Ｌ的处理所得酶活；，度为１ｇ丙二醇氧化还原酶酶活低于甘油浓度为４从第９ｄ／Ｌ的处理所得酶活高于甘油浓度为４０ｇ／Ｌ和１６０ｇ／Ｌ处理酶活。对照和甘油浓度为１ｇ１，３－微生物对甘油的代谢主要通过氧化和还原两条路径进行，丙二醇氧化还原酶是还原路径中，３－在发酵早期即第３ｄ红曲菌在不同浓度甘油的培养基中１丙二醇氧的关键酶。结合图５的结果，化还原酶酶活也不同。说明红曲菌通过还原路径代谢甘油时，对甘油浓度较为敏感，致使发酵前期，４０ｇ／Ｌ和１６０ｇ／Ｌ）／Ｌ甘油处理的酶活。随着发酵进程高浓度甘油（处理中胞内酶活高于对照和１ｇ的延长，高浓度甘油产生的渗透胁迫对红曲菌生长有一定的抑制，造成后续发酵过程中甘油浓度达［２６］１６０ｇ／Ｌ的处理中１，３－０ｇ／Ｌ时，丙二醇还原酶活低于其它处理。当培养基中甘油浓度为４甘油［８］，３－可促进红曲菌生长，故１丙二醇氧化还原酶的酶活在发酵的前６ｄ处于较高水平。２．２．３ 甘油对红曲菌发酵过程中甘油脱水酶酶活的影响 采用分光光度法检测甘油对红曲菌发酵过程中甘油脱水酶酶活的影响，每３ｄ取样１次，结果如图６所示。 Ａ胞外酶活 Ｂ胞内酶活 甘油对红曲菌发酵过程中甘油脱水酶酶活的影响图６由图６可知，甘油脱水酶在胞外的酶活与胞内的酶活相差不大，但胞外酶活普遍高于胞内酶活。，由图６Ａ可知，发酵过程的前６ｄ甘油脱水酶的酶活与甘油添加量呈负相关。发酵至第９ｄ及以后，甘油脱水酶的酶活与培养基中甘油浓度基本呈正相关。由图６Ｂ可知，对照所得胞内甘油脱水酶酶ｐ＞０．０５）。甘油对红曲菌胞内甘油脱水酶酶活无显著影响（活在整个发酵过程均高于其它处理组，由此推测，红曲菌在利用甘油过程中，将所产生的甘油脱水酶分泌至胞外，首先将甘油转化为３－羟３－ＨＰＡ），，３－３－ＨＰＡ可生成１，３－ＰＤＯ）。结基丙醛（后在１丙二醇氧化还原酶的作用下，丙二醇（，１，３－发酵至９ｄ以后，丙二醇氧化还原酶均较低，即甘油代谢的还原路径受阻，造成甘油脱合图５Ｂ促使甘油脱水酶酶活升高。水酶的积聚，２．３ 甘油对红曲菌发酵过程中碳源代谢关键酶酶活的影响２．３．１ 甘油对红曲菌发酵过程中葡萄糖激酶酶活的影响 采用分光光度法检测甘油对红曲菌发酵每３ｄ取样１次，结果如图７所示。过程中葡萄糖激酶酶活的影响， Ａ胞外酶活 Ｂ胞内酶活 甘油对红曲菌发酵过程中葡萄糖激酶酶活的影响图７
由图７可知，葡萄糖激酶的胞内酶活高于胞外酶活，说明葡萄糖激酶主要存在于胞内。由图７Ｂ，／Ｌ时所得葡萄糖激酶的酶活最高；２ｄ时，可知，发酵第３ｄ甘油浓度为１ｇ第６ｄ和第１甘油浓度为４０ｇ／Ｌ的处理中葡萄糖激酶的酶活最高；５ｄ第９ｄ时，对照所得葡萄糖激酶的酶活最高；第１时，甘油６０ｇ／Ｌ的处理所得葡萄糖激酶的酶活最高。浓度为１甘油代谢相关酶受到各种碳源的协同抑制，其中葡萄糖作用最强，而葡萄糖只能被葡萄糖激酶催６－磷酸。该研究所用培养基中的蔗糖必须水解成葡萄糖和果糖才能被红曲菌利用。化为葡萄糖－１ｇ／Ｌ）由此可知，低浓度甘油（可刺激红曲菌对碳源的快速利用，致使葡萄糖激酶酶活在发酵早期较随着甘油浓度的增加，葡萄糖激酶酶活达到最高的时间点延迟，说明红曲菌生长及利用碳源的速高；率受到甘油浓度的影响［８，２８］。２．３．２ 甘油对红曲菌发酵过程中β－半乳糖苷酶酶活的影响 采用分光光度法检测甘油对红曲菌发酵过程中β－半乳糖苷酶酶活的影响，每３ｄ取样１次，结果如图８所示。 Ａ胞外酶活 Ｂ胞内酶活 甘油对红曲菌发酵过程中β－图８半乳糖苷酶酶活的影响由图８可知，β－半乳糖苷酶在胞外与胞内的酶活相差不大，这与文献报道的丝状真菌产生的β［２９］－半乳糖苷酶多是胞外酶，也有胞内酶结论基本相符。β－半乳糖苷酶催化转糖基反应的效率可受动力学控制，低聚半乳糖作为其产物可作为糖苷水解酶的底物。若允许该酶反应继续进行，所有的［３０］随着发酵时间的增加，低聚半乳糖和乳糖最终可水解为半乳糖和葡萄糖等单糖。由图８Ａ可知，葡萄糖和半乳糖的转化率逐渐增加［３１］，故β－半乳糖苷酶的酶活呈现上升的趋势。由图８Ｂ可知，，，０ｇ／Ｌ的处理所得β－发酵前３ｄ对照所得β－半乳糖苷酶的酶活最高；发酵第６ｄ甘油浓度为４半，２ｄ，０ｇ／Ｌ和１６０ｇ／Ｌ的乳糖苷酶酶活最高；发酵第９ｄ各处理酶活基本相同；发酵第１甘油浓度为４０ｇ／Ｌ时能够促进β－处理所得β－半乳糖苷酶的酶活最高。由此，甘油浓度为４半乳糖苷酶的产生。３ 小结在合成培养基中考察甘油浓度对甘油及碳源代谢关键酶酶活的影响。甘油可影响红曲菌发酵液Ｈ，Ｈ降低且处于酸性环境，的ｐ即添加甘油可使红曲菌发酵液ｐ更利于红曲菌生长。调整培养基中４０ｇ／Ｌ）１ｇ／Ｌ），）甘油至中等浓度（或低浓度（可在发酵前期（发酵过程的前９ｄ促使红曲菌分泌较多１６０ｇ／Ｌ），的甘油及碳源代谢关键酶；当培养基中甘油浓度较高（则可刺激红曲菌在发酵后期（９～１５ｄ）分泌较多甘油及碳源代谢关键酶类。该研究结果可为后续研究甘油对红曲菌生长如因甘油造成的生长迟滞期、红曲菌二次生长、红曲菌代谢产物产量及种类变化等提供理论依据。参考文献：［１］ＣｈｅｎＷ，ＨｅＹ，ＺｈｏｕＹ，ｅｔａｌ．ＥｄｉｂｌｅｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉｆｒｏｍｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓＭｏｎａｓｃｕｓ：ｅａｒｌｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ，ｍｏｄｅｒｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄｆｕｔｕｒｅｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］．ＣｏｍｐｒＲｅｖＦｏｏｄＳｃｉ，２０１５，１４（５）：５５５～５６７．［２］Ｍ］．２００３．李钟庆，郭芳．红曲菌的形态与分类学［北京：中国轻工业出版社，［３］ＣｈｅｎＷ，ＣｈｅｎＲ，ＬｉｕＱ，ｅｔａｌ．Ｏｒａｎｇｅ，ｒｅｄ，ｙｅｌｌｏｗ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａｚａｐｈｉｌｏｎｅｐｉｇｍｅｎｔｓｉｎＭｏｎａｓｃｕｓｆｕｎｇｉ［Ｊ］．ＣｈｅｍＳｃｉ，
２０１７，８（７）：４９１７～４９２５．［４］ＭａｍｕｃｏｄＨＦ，ＤｉｚｏｎＥＩ．ＰｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｂｉｏｐｉｇｍｅｎｔｓｆｒｏｍＭｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓＷｅｎｔａｓｎａｔｕｒａｌｆｏｏｄｃｏｌｏｒａｎｔｆｏｒｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎａｔｉｖｅｓａｕｓａｇｅ（Ｌｏｎｇｇａｎｉｓａ）［Ｃ］．２０１４３ｒｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１４，７１：７２～７６．［５］ＪｉｒａｓａｔｉｄＳ，ＮｏｐｈａｒａｔａｎａＭ．Ｐｒｏｄｕｃｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｗｅｅｔｆｅｒｍｅｎｔｅｄｒｉｃｅ（Ｋｈｏａ－Ｍａｋ）ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈｒｅｄｙｅａｓｔｒｉｃｅ［Ｊ］．，２０１８，１４（４）：５２１～５３４．ＩｎｔＪＡｇｒｉｃＴｅｃｈｎｏｌ［６］ＭａｐａｒｉＳＡＳ，ＴｈｒａｎｅＵ，ＭｅｙｅｒＡＳ．Ｆｕｎｇａｌｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅａｚａｐｈｉｌｏｎｅｐｉｇｍｅｎｔｓａｓｆｕｔｕｒｅｎａｔｕｒａｌｆｏｏｄｃｏｌｏｒａｎｔｓ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，２８（６）：３００～３０７．［７］ＺｈａｎｇＡ，ＳｕｎＪ，ＷａｎｇＺ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅｏｎｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｂｙＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌ，２０１５，１７５：３７４～３８１．［８］ＦｅｎｇＹＬ，ＳｈａｏＹＣ，ＺｈｏｕＹＸ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌｏｎｐｉｇｍｅｎｔｓａｎｄｍｏｎａｃｏｌｉｎＫｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｔｈｅｈｉｇｈ－ｍｏｎａｃｏｌｉｎＫ，ＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓＭＳ－１［Ｊ］．ＥｕｒＦｏｏｄＲｅｓＴｅｃｈｎｏｌ，２０１５，２４０（３）：６３５～６４３．－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｂｕｔｃｉｔｒｉｎｉｎ－ｆｒｅｅｓｔｒａｉｎ［９］ＨｕａｎｇＺＲ，ＺｈｏｕＷＢ，ＹａｎｇＸＬ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈａｎｄｇｌｙｃｅｒｏｌｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｚａｐｈｉｌｏｎｅｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓＦＡＦＵ６１８ａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｅｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄＲｅｐｉｇｍｅｎｔｓｉｎＭ，２０１８，１０６：６２６～６３５．ｓｅａｒｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ［１０］Ｊ］．２０１９，３９（０５）：２８～赵 薇，姚钰琪，王 爽，等．甘油影响红曲菌产色素的碳源选择性探究［微生物学杂志，３４．［１１］ＳｕｎＪ，ＨｅｕｖｅｌＪＶＤ，ＳｏｕｃａｉｌｌｅＰ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｈａｒｅｇｕｌｏｎａｎｄｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｆｏｒａｎａｅｒｏｂｉｃｇｌｙｃ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒｅｓｓ，２００３，１９（２）：２６３～２７２．ｅｒｏｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｂａｃｔｅｒｉａ［１２］ＺｈｅｎｇＰ，ＷｅｒｅａｔｈＫ，ＳｕｎＪ，ｅｔａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｏｆｔｈｅｄｈａｒｅｇｕｌｏｎａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ，ｇｌｙｃｅｒｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｏ１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌａｎｄｐｌａｓｍｉｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍ，２００６，４１（１０）：２１６０～２１６９．［１３］Ｊ］．范艳敏，党士坤，王文杰，等．碳源、生长素及诱导子对木豆不定根生长和次生代谢产物合成的影响［植物研２０１８，（３）：３９１～３９８．究，［１４］ＮｉｓｈａｎｔｈＫ，ＮａｍｂｉｓａｎＢ，ＲａｍｙａＲ，ｅｔａｌ．ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｂａｃｔｅｒｉｕｍａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｎｅｍａｔｏｄｅａｇａｉｎｓｔＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｅｘｐａｎｓｕｍ［Ｊ］．ＡｒｃｈＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔ，２０１３，４６（６）：７２１～７３１．［１５］ａｂＴ调控生防菌Ｓｎｅａ２５３的γ－氨基丁酸代谢途径影响杀线虫活性［Ｊ］．于冬梅．碳代谢基因ｇ微生物学通报，２０１９，４６（１２）：３２５７～３２６６．［１６］ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＴＦ９６中心碳代谢机制的研究［Ｄ］．艾正文．基于转录组学的Ｓ哈尔滨：东北农业大学２０１８．［１７］ＲａｈｍａｎＭＳ，ＸｕＣＣ，ＱｉｎＷ．ＥｘｏｔｉｃｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｎｃｒｅａｓｅｓｙｉｅｌｄｏｆ２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ＆Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，２０１８，５（１）：３．［１８］ＦｏｒａｇｅＲＧ，ＦｏｓｔｅｒＭＡ．ＧｌｙｃｅｒｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｃｏｅｎｚｙｍｅＢｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｌｙｃ１２－ｅｒｏｌａｎｄｄｉｏｌｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅｓ［Ｊ］．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８２，１４９（２）：４１３～４１９．［１９］ＹｕｎＪ，ＹａｎｇＭ，ＭａｇｏｃｈａＴＡ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌｕｓｉｎｇａｎｏｖｅｌ１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｆｒｏｍ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８，２４７：８３８～ｉｓｏｌａｔｅｄＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍａｎｄｃｏ－ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｗｈｏｌｅｃｅｌｌｓ８４３．［２０］Ｄ］．２０１２．周 宇．基因组改组选育高产β－半乳糖苷酶菌株［武汉：华中农业大学，［２１］Ｊ］．２００６，赵瑞香，王大红，牛生洋，等．超声波细胞破碎法检测嗜酸乳杆菌β－半乳糖苷酶活力的研究［食品科学，（０１）：４７～５０．［２２］Ｄ］．魏志奎．五种酸乳发酵剂糖代谢相关酶活性及发酵酸乳品质特点的比较研究［乌鲁木齐：新疆农业大学，２０１４．［２３］ＢüｈｌｅｒＲＭＭ，ＤｕｔｒａＡＣ，ＶｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏＦ，ｅｔａｌ．Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｇｍｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｕｓｉｎｇａｃｏ－ｐｒｏｄｕｃｔｏｆｂｉｏｄｉｅｓｅｌａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ［Ｊ］．ＦｏｏｄＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ（Ｃａｍｐｉｎａｓ），２０１３，３３：９～１３．［２４］Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）ＭＳ－１的鉴定及发酵特性研究［Ｄ］．２０１４．冯艳丽．丛毛红曲菌（武汉：华中农业大学，［２５］ＴａｌａｒｉｃｏＴＬ，ＡｘｅｌｓｓｏｎＬＴ，ＮｏｖｏｔｎｙＪ，ｅｔａｌ．ＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧｌｙｃｅｒｏｌａｓａＨｙｄｒｏｇｅｎＡｃｃｅｐｔｏｒｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＲｅｕｔｅｒｉ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ１，３－Ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ：ＮＡＤ＋Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ＆ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，５６（４）：９４３～９４８．
［２６］ＦｅｎｇＹ，ＣｈｅｎＷ，ＣｈｅｎＦ．ＡＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓＭＳ－１ｓｔｒａｉｎｗｉｔｈｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄｍｏｎａｃｏｌｉｎＫｂｕｔｎｏｃｉｔｒｉｎｉｎ［Ｊ］．ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，２５（４）：１１１５～１１２２．［２７］ＬｉＣ，ＬｅｓｎｉｋＫＬ，ＬｉｕＨ．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆＷａｓｔｅＧｌｙｃｅｒｏｌｆｒｏｍＢｉｏｄｉｅｓｅｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｏＶａｌｕｅ－ＡｄｄｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］．Ｅｎｅｒｇｉｅｓ，２０１３，６（９）：４７３９～４７６８．［２８］ＳｅｎｏＥＴ，ＣｈａｔｅｒＫＦ．ＧｌｙｃｅｒｏｌＣａｔａｂｏｌｉｃＥｎｚｙｍｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎＷｉｌｄ－ｔｙｐｅａｎｄＭｕｔａｎｔＳｔｒａｉｎｓｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＣｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３（２）［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３，１２９（５）：１４０３～１４１３．［２９］Ｄ］．２０１３．黎 丽．斜卧青霉β－半乳糖苷酶的分离纯化及分子构造研究［济南：齐鲁工业大学，［３０］Ｄ］．陈真真．β－半乳糖苷酶菌株筛选、酶的分离纯化和性质及酶法合成低聚半乳糖的研究［无锡：江南大学，２０１３．［３１］Ｊ］．２００６，许牡丹，杨伟东，柯 蕾，等．米曲霉β－半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工艺研究［食品工业科技，（０１）：１８３～１８５＋１８９．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌｏｎｋｅｙｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｍｅｔａｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４ＳＨＩＪｉａ，ＺＨＡＯＷｅｉ，ＬＵＪｉｎ，１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４ＷＡＮＧＷｅｎｊｕａｎ，ＹＵＸｉａｎｇ，ＦＥＮＧＹａｎｌｉ（１．ＨｕｂｅｉＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃＷｉｌｄＶｅｇｅｔａｂｌｅＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ４３５００２，Ｃｈｉｎａ；２．ＨｕｂｅｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｄｉｂｌｅＷｉｌｄＰｌａｎｔｓＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＨｕｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ４３５００２，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨｕｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ４３５００２，Ｃｈｉｎａ；４．ＮａｔｉｏｎａｌＤｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＨｕｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ４３５００２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｎｋｅｙｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｍｅｔａｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｉｎｓｙｎｔｈｅｔｉｃｍｅｄｉｕｍｗｈｅｎＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓＭＳ－１ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｒａｉｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐＨｖａｌｕｅｓｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｗｅｒｅｂｅｔｗｅｅｎ３．５ａｎｄ７．５ａｎｄａｌｌｐＨｖａｌｕｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｉｒｓｔａｎｄｔｈｅｎｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ａｌｌｏｆｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｖｏｌｕｍｅｓｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓｆｏｒｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｃａｒｂｏｎｍｅｔａｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｗｉｔｈ１ｇ／Ｌａｎｄ４０ｇ／Ｌｇｌｙｃｅｒｏｌｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｗｉｔｈ０ｇ／Ｌａｎｄ１６０ｇ／Ｌｇｌｙｃｅｒｏｌｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔ９ｄａｙｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｈｉｌｅｔｈｅｓｉｔｕａｔｉｏｎｗａｓａｌｗａｙｓｏｐｐｏｓｉｔｅｄｕｒｉｎｇｔｈｅｌａｔｅｒｓｔａｇｅｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ．ＴｈｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｍｅｔａｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｃａｎｂｅａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｇｌｃｅｒＭｏｎａｓｃｕｓｓｐｐ．ＴｈｅｐｒｅｓｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｃａｎｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｍｏｏｌａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｄｓｏｆｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｂｙＭｏｎａｓｃｕｓｓｐｐ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｏｎａｓｃｕｓｓｐｐ；ｇｌｙｃｅｒｏｌ；Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｇｍｅｎｔｓ；ｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓ
2024年2月15日发(作者：浑盼夏)
１卷第４第１期湖北师范大学学报（自然科学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）Ｖｏｌ４１Ｎｏ１，２０２１甘油对红曲菌甘油及碳源代谢关键酶酶活的影响１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４，，，，，石 佳赵 薇鲁 瑾王文娟余 翔冯艳丽（１．特色野菜良种繁育与综合利用技术湖北省工程研究中心，３５００２；湖北黄石 ４ ２．湖北师范大学食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，３５００２；湖北黄石 ４３．湖北师范大学生命科学学院，３５００２；湖北黄石 ４４．湖北师范大学生物学国家级实验教学示范中心，３５００２）湖北黄石 ４Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）ＭＳ－１为实验菌株，摘要：以丛毛红曲菌（考察合成培养基中甘油浓度对红曲菌碳源及甘Ｈ均在３．５～７．５之间，油代谢关键酶酶活的影响。结果表明，发酵过程中各处理发酵液ｐ且呈先降后升趋，／Ｌ和４０ｇ／Ｌ的处理中甘油及碳发酵液体积呈下降趋势。在发酵的前９ｄ普遍表现为甘油浓度为１ｇ势，６０ｇ／Ｌ的处理中相关酶活，源代谢关键酶酶活高于对照及甘油浓度为１在发酵后期则普遍出现相反的现进而影响红曲菌生长及代谢产物产生。该研究结象。甘油可影响红曲菌的碳源及甘油代谢关键酶酶活，果可为深入探讨甘油影响红曲菌代谢产物产生的分子机制奠定基础。关键词：红曲菌；甘油；红曲色素；碳源代谢；关键酶Ｑ９３９．９７ 文献标志码：Ａ 文章编号：２０９６－３１４９（２０２１）０１－００１７－０９中图分类号：ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９６－３１４９．２０２１．０１．００３０ 前言Ｍｏｎａｓｃｕｓｓｐｐ．），红曲菌（又称红曲霉，是我国重要的药食同源微生物，其淀粉质原料的发酵产１，２］——红曲在我国有２０００多年的应用历史［。红曲菌在工业生活的应用主要是红曲色素（Ｍｏｎａｓ品—［３］ｐｉｇｍｅｎｔｓ，ＭＰｓ）Ｐｓｃｕｓ的应用。Ｍ在食品工业主要用于发酵豆制品、红曲米酒及干制鱼、肉制品等的着色［５］［６］，Ｐｓ保健食品、替代肉品加工中的部分亚硝酸盐等。在生产Ｍ的过程中发现，甘油可促［７～９］Ｐｓ，。进红曲菌产生Ｍ但其作用机制不明确［４］甘油可作为碳源用于微生物发酵，但不同微生物对甘油的代谢和利用也不同。已有研究表明，以ＭＰｓ（ＭｏｎａｃｏｌｉｎＫ，ＭＫ）蔗糖为主要碳源时添加甘油可促进红曲菌生长、和莫纳可林Ｋ的产生，且甘［８～１０］ＰｓＫ关键基因的表达，。甘油代谢主要涉及４油可影响红曲菌合成Ｍ和Ｍ但具体机制并不清楚Ｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＤＨ）、Ｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＧＤＨｔ）、种酶，分别是甘油脱氢酶（甘油脱水酶（二Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅｋｉｎａｓｅ，ＤＨＡＫ），３－１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌｄｅｈｙ羟基丙酮激酶（和１丙二醇氧化还原酶（１１，１２］ｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＰＤＯＲ）［。近年来，有关碳源对微生物代谢的影响也有大量报道，主要包括碳源对微生物代谢产物的影响及与碳源代谢相关基因的研究等，未见甘油影响红曲菌碳源代谢的相Ｐｓ分析了甘油对红曲菌产Ｍ的影响，还对影响红曲菌代谢产关研究。课题组在合成培养基条件下，物产生的碳源选择性进行了研究［１０］［１３，１４］［１５，１６］。然而，甘油对红曲菌碳源代谢的影响效应并不清楚。本研究从甘油代谢途径和红曲菌碳源代谢途径涉及关键酶的酶活探讨甘油对红曲菌发酵过程的ＤＨ、ＧＤＨｔ、ＤＨＡＫ和ＰＤＯＲ，ＤＨ、ＧＤＨｔ、影响。甘油代谢主要涉及４种酶，分别是Ｇ但通常仅监测ＧＰＤＯＲ的酶活。红曲菌碳源代谢涉及的酶主要是β－半乳糖苷酶和葡萄糖激酶。本研究主要在前期２０２０－０８－１８收稿日期：Ｄ２０１９２５０２），基金项目：湖北省教育厅科研计划项目重点项目（食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室开放基金（ＥＷＰＬ２０１８０７），２０１９ＣＺ０７）湖北师范大学科研创新团队项目（１９９８— ），作者简介：石 佳（女，山西晋中人，在读硕士研究生，研究方向为食品微生物．１９８１— ），Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｙａｎｌｉ＠ｈｂｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．通讯作者：冯艳丽（女，河南周口人，副教授，博士，硕士生导师，研究方向为食品发酵，
，探讨在合成培养基条件下，甘油对红曲菌甘油及碳源代谢关键酶酶活的影响，为后续开展红曲菌利用甘油及甘油影响红曲菌代谢产物产生的分子机制提供依据。研究的基础上［１０］１ 材料与方法１．１ 实验材料Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ）ＭＳ－１（ＣＣＴＣＣＭ２０１３２９５，丛毛红曲菌（中国典型培养物保藏中心）是从市售红曲ＰｓＫ且不产桔霉素的菌株。土豆等均为市售。产品中分离获得的可高产Ｍ及Ｍ１．２ 仪器设备ＦＳＨ－２型可调高速电动匀浆器，ＵＶ１９００型紫外分光光度计，金坛市江南仪器厂；日本岛津公５４２７Ｒ型台式高速离心机，ｐｐａｎｄｏｒｆ；ＨＺＱ－Ｆ１６型振荡培养箱，德国ｅ哈尔滨市东联电子技术开发司；有限公司。其余设备均为常规小型实验室设备。１．３ 试剂及溶液ＭｇＳＯ·７ＨＯ、ＫＣｌ、ＦｅＳＯ、ＮａＯＨ、ＫＨＰＯ·３ＨＯ、ＫＨＰＯ、葡萄糖、蔗糖、甘油、盐酸、乙酸钠、盐４２４２４２２４２苯并噻唑酮腙（ＭＢＴＨ）、（ＮＨ）ＳＯ、Ｆｅ（ＮＨ）（ＳＯ）、ＫＣＯ、ＫＨＣＯ、１，２－酸３－甲基－丙二醇、４２４４２４２２３３１，３－ＰＤＯ）、ＮａＨＰＯ·２ＨＯ、ＮａＨＰＯ·１２ＨＯ、ＮａＣＯ、柠檬酸钾、柠檬酸、酚试剂、丙二醇（三（羟２４２２４２２３ｒｉｓ－ＨＣｌｇＣｌ甲基）氨基甲烷Ｔ及Ｍ琼脂粉、烟酰胺腺嘌呤二核苷２均为国产分析纯试剂。谷氨酸钠、（ＮＡＤ）、ＮＡＤＰ）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（及辅酶Ｂ均为国产生物试剂。二硫苏糖醇、邻－硝酸、１２Ｄ－ＡＴＰ）６－基苯酚、邻硝基苯β－半乳吡喃糖苷、腺苷三磷酸（和葡萄糖－磷酸脱氢酶均为高级纯，６－Ｇ－６－ＰＤＨ）ＡＴＰ）ＣｍＥＩ，其中二硫苏糖醇、葡萄糖－磷酸脱氢酶（和腺苷三磷酸（生产商为Ｂ其余为国产试剂。１．４ 培养基３ＰＤＡ培养基：００ｇｍ），００ｍＬ蒸馏水煮沸３０ｍｉｎ．将２马铃薯去皮切块（约２ｃ加入１０冷却后过００ｍＬ．０ｇ０ｇＨ．滤，滤液加蒸馏水补足至１０加入２葡萄糖搅拌均匀。加入２琼脂至充分溶解，自然ｐ５００ｍＬ，１×１０Ｐａ０ｍｉｎ．分装至茄形瓶中，每瓶１灭菌２０ｇ／Ｌ，１０ｇ／Ｌ谷氨酸钠，０．０００７ｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ·７ＨＯ，１ｇ／ＬＫＨＰＯ，０．５ｇ／Ｌ发酵培养基：蔗糖６４２２４５，０．０５ｇ／ＬＦｅＳＯ，Ｈ为６．０，１×１０Ｐａ０ｍｉｎ．ＫＣｌ调节ｐ灭菌２４１．５ 孢子悬液的制备及红曲液态发酵ＤＡ斜面在２８℃培养１０ｄ，０ｍＬ无菌水。用无菌接种铲刮取孢子，接种红曲菌的Ｐ加入１将孢子６０ｃｆｕ／ｍＬ．０ｍＬ培悬液滤入装有玻璃珠的无菌锥形瓶中。调整孢子浓度为１将孢子悬液接入装有５５０ｍＬ三角瓶中，０％（ｖ／ｖ）。在３０℃、１３０ｒ／ｍｉｎ培养３ｄ后调整温度为２５℃，养基的２接种量为１５ｄ．继续培养至１１．６ 红曲菌液态发酵产物中粗酶液的制备［１０］ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ和１６０ｇ／Ｌ，结合前期研究基础，分别将发酵培养基中甘油浓度调整至１接种量及１．５孢子悬液的制备及红曲液态发酵”，，培养条件同“每隔３ｄ取样（每个处理取出３瓶进行分析）检１，３－５ｄ测甘油脱氢酶、丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶、β－半乳糖苷酶、葡萄糖激酶酶活，至第１（。设置３个平行）０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液（ｐＨ７．０，粗酶液的制备：过滤发酵液，将收集到的菌丝体保存在５含有２ｍｍｏｌ／Ｌ，，二硫苏糖醇）中，然后用组织匀浆机（每次６ｓ间歇３ｓ共进行３次）进行破碎，释放胞内酶，００ｒ／ｍｉｎ０ｍｉｎ，最后在８０条件下离心１所得上清液即为胞内酶粗提液，该粗酶液用于后续实验中酶活分析。采用过滤后的发酵液测定胞外酶的酶活。１．７ 甘油对红曲菌发酵过程中甘油代谢关键酶酶活的影响１７］１．７．１ 甘油脱氢酶酶活的测定 采用分光光度法测定甘油脱氢酶的酶活［，该反应液总体积为１．５ｍＬ，５ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ）ＳＯ、１μｍｏｌ／ＬＦｅ（ＮＨ）（ＳＯ）、０．２ｍｏｌ／Ｌ甘油、１．２ｍｍｏｌ／ＬＮＡＤ包括２４２４４２４２
．１ｍｏｌ／ＬＫＣＯｐＨ９．８）０℃，３４０以及适量保存于０中的待测液。用紫外分光光度计于３２３缓冲溶液（ｎｍ波长下，ｉｎ内的吸光度值。１个酶活单位（Ｕ）ｉｎ内消耗１测定１ｍ的定义是指在该条件下１ｍｍｏｌμ底物所需要的酶量。酶活计算公式如下：Ｕ／ｍＬ）＝（Ｖ／×Ｋ）／（ＶＬ）酶活力单位（△Ａ△ｔε×Ｔ×Ｓ×Ｋ指样品稀释倍数；Ｖ．５ｍＬ的总体积；Ｖ．０６ｍＬ的样品体积；其中，ε指摩尔吸光系Ｔ指１Ｓ指０ＮＡＤＨ在３４０ｎｍ处的毫摩尔消光系数为６．２２；Ｌｍ光径的比色杯；／ｉｎ内变化数，指１ｃ△Ａ△ｔ指１ｍ的吸光度值。Ｕ／ｍＬ）＝８．０４×／甘油脱氢酶酶活力单位（△Ａ△ｔ１．７．２ 甘油脱水酶酶活的测定 采用分光光度法检测甘油脱水酶的酶活，因甘油脱水酶的反应需依［１８］，Ｌ的反应液：ＫＣｌ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１，２赖易见光分解的辅酶Ｂ测定该酶活须在避光条件下进行。１ｍ１２．２ｍｏｌ／Ｌ、５μＭ、ｐＨ７．０）０．０３５ｍｏｌ／Ｌ和适量细胞抽提液。首先－丙二醇０辅酶Ｂ磷酸钾缓冲液（１２１７℃下保温１０ｍｉｎ，Ｌ的０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钾缓冲液（ｐＨ３．６）．５ｍＬ的０．１％在３然后加入１ｍ和０ＭＢＴＨ（２苯并噻唑酮腙）７℃下保温１５ｍｉｎ，Ｌ的蒸馏水，盐酸３－甲基－溶液，然后在３最后加入１ｍ０５ｎｍ处测定１ｍｉｎＵ）用紫外分光光度计于３内的吸光度值。１个酶活单位（的定义是指在上述条件ｉｎｍｏｌ１，３－下１ｍ内生成１μ丙二醇所需的酶量。ＢＴＨ发生显酶活力计算：甘油在甘油脱水酶的催化作用下脱水生成２－羟基丙酮，该物质可与ＭＨ７．０、３７℃的条件下，色反应，因此甘油脱水酶的酶活可以通过终点法测定。首先在ｐ底物、酶与辅０ｍｉｎ，ＢＴＨ在３０５ｎｍ处与２－共反应１接着加入柠檬酸钾缓冲液以终止反应，然后加入的Ｍ羟酶Ｂ１２ＢＴＨ显色法并不能直接用来测甘油脱水酶酶活，基丙酮发生显色反应。但是Ｍ这是因为甘油脱水酶ｉｎ，２－受甘油的影响，在３ｍ之内完全丧失酶活。由于甘油脱水酶催化１丙二醇与甘油这两种底物的ｉｎ终点法来测甘油脱水酶的酶活，反应速率呈正相关，因此可采用３个１ｍ即在加入辅酶Ｂ起始反１２ｉｎ、２ｍｉｎｉｎ内终止反应，，２－．４１，应后的１ｍ和３ｍ并测量１丙二醇与甘油的反应速率，两者比值为１ＭＢＴＨ的摩尔吸光系数为１３．２２Ｌ／ｍｍｏｌ／ｃｍ．Ｆｏｒｇｅ根据以上原因，等推导所得酶活计算公式为：Ｕ／ｍｌ）＝０．５３×Ａ甘油脱水酶活力单位（３０５１．７．３ １，３－，３－丙二醇氧化还原酶的酶丙二醇氧化还原酶酶活的测定 采用分光光度法检测１［１８，１９］，．５ｍＬ，５ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ）ＳＯ、１ｍｏｌ／ＬＦｅ（ＮＨ）活测定该酶活的反应液总体积为１包括２μ４２４４２（ＳＯ）、０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＤＯ、１．２ｍｍｏｌ／ＬＮＡＤ以及适量保存于０．１ｍｏｌ／ＬＫＣＯｐＨ９．８）中的４２２３缓冲液（０℃、３４０ｎｍ处测量１ｍｉｎＵ）待测液。用紫外分光光度计在３内的吸光度值。１个酶活单位（的定义ｉｎｍｏｌ是指在该条件下１ｍ内消耗１μ底物所需要的酶量。ＰＤＯＲ活力的计算方法：ＰＤＯＲ活力单位（Ｕ／ｍＬ）＝Ｄ×Ｖ×（／）／Ｌ×ｖ△Ａ△ｔε×Ｄ指稀释倍数；Ｖ指１．５ｍＬ的总体积；ｖ．０６ｍＬ的样品体积；ＮＡＤＨ在指０ε指摩尔吸光系数，３４０ｎｍ．２２；Ｌ．１ｃｍ光径的比色杯；／Ｄ变化值。处的毫摩尔消光系数为６指０△Ａ△ｔ指单位时间内的ＯＰＤＯＲ的作用是将还原３－３－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ，３－ＨＰＡ）ＤＯ，羟基丙醛（生成Ｐ由于３－ＨＰＡ极不稳定，ａｎｉｅｌｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ因此采用逆反应方法测量该酶活力。Ｄ等研究发现，来自菌种ＣＤＯＲ还原丙醛反应的速率是还原３－ＨＰＡ的２１％．Ｆｏｒａｇｅ等研究发现，．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ的的Ｐ来自ＫＰＤＯＲ对丙醛的还原与对ＰＤＯ的氧化反应速率比为０．８３．ＤＯ的反应速率，由此采用测定Ｐ利用转化０．８３／０．２１＝３．９５，ＤＯＲ的活力。来计算得到Ｐ因数：１，３－Ｕ／ｍＬ）＝３１．７６×丙二醇氧化还原酶酶活力单位（△Ａ／△ｔ１．８ 甘油对红曲菌发酵过程中碳源代谢关键酶酶活的影响１．８．１ β－Ｄ－ＯＮ半乳糖苷酶酶活的测定 β－半乳糖苷酶能够水解邻硝基苯β－半乳吡喃糖苷（ＰＧ），ＮＰＧ发生糖苷键断裂，ＯＮＰ）Ｄ－主要是在酶的作用下Ｏ生成黄色的邻－硝基苯酚（和β－吡喃ＮＰ的含量与其颜色深浅与呈正比，２０ｎｍ处测定ＯＮＰ半乳糖，由于Ｏ因此可用紫外分光光度计，于４
的吸光度值［２０］。Ｌ２ｍｇ／ｍＬ的ＯＮＰＧ作为底物，７℃下预热１０ｍｉｎ，首先取１ｍ在３然后在底物中加入粗酶液１ｍＬ，３７℃下保温２５ｍｉｎ，Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ的碳酸钠溶液终止酶和底物的反应，２０ｎｍ接着加入５ｍ于４［２１］Ｕ）ｉｎ释放处测定待测产物的吸光度值。１个酶活单位（的定义是指在１Ｌ的总体系内反应１ｍ１μｍｏｌＯＮＰＮＰ溶液计算所得，ＯＮＰ校正曲线如图１．所需要的酶量。标准校正曲线由已知浓度的Ｏｙ＝１．０４４２ｘ＋０．０２０１，Ｒ＝０．９９９．该方程式如下：Ｄ×Ｃ×７Ｙ＝酶活力计算公式为：Ｔ×１０Ｙ指酶活力／（Ｕ／Ｌ）；Ｄ指稀释倍数；Ｃ指ＯＮＰ的浓度／（ｍｏｌ／Ｌ）；７指反应体积／ｍＬ；Ｔ指反应时μｍｉｎ；１０指总的样品体积／ｍＬ．间／２ ＯＮＰ校准曲线图１１．８．２ 葡萄糖激酶酶活的测定 采用分光光度法检测葡萄糖激酶的酶活，１．６ｍＬ的反应体系包括：２２］０．８ｍＬ的ＡＴＰ溶液、０．８ｍＬ的ＮＡＤＰ溶液和０．８ｍＬ的氯化镁溶液［。三（羟甲基）氨基甲烷溶液、．２ｍＬ的反应体系，６μＬ的Ｇ－６－ＰＤＨ和１００μＬ的待测液，首先取３然后加入５混合为溶液①，接着．８ｍＬ的葡萄糖溶液，５℃条件下保温５ｍｉｎ，将溶液①与０分别在２最后将二者混合（总体积为４．１５６ｍＬ），４０ｎｍ处测定的吸光度值。用紫外分光光度计于３酶活力计算Ｕ／ｍＬ）＝（Ｖ／×Ｋ）／（ＶＬ）△Ａ△ｔε×酶活力单位（Ｔ×Ｓ×Ｋ指样品稀释倍数；Ｖ．１５６ｍＬ的总体积，．０７８；其中，本实验中为２Ｔ指４Ｖ．１ｍＬ的样品体积；：ＮＡＤＨ在３４０ｎｍ处的毫摩尔消光系数为６．２２；Ｌ指ε摩尔吸光系数，Ｓ指０１ｃｍ的光径比色杯；／△Ａ△ｔ指每分钟吸光度变化值。Ｕ／ｍＬ）＝６．６８×／葡萄糖激酶酶活力单位（△Ａ△ｔ２ 结果与分析２．１ 甘油对发酵液ｐＨ、体积的影响Ｈ及体积的影响，检测甘油对发酵液ｐ每３ｄ取样１次，结果如图２和图３所示。 甘油对发酵液ｐＨ的影响 图３ 甘油对发酵液体积的影响图２
４种培养基发酵液ｐＨ在３．５～７．５之间。发酵至第６ｄ０ｇ／Ｌ和由图２可知，开始，甘油浓度为４１６０ｇ／Ｌ的处理发酵液ｐＨ均低于对照和甘油浓度为１ｇ／Ｌ的发酵液ｐＨ．主要是由于红曲菌利用甘油后产生了小分子酸酸［２］［２３］。在发酵过程中，Ｈ的上升可能与ＭＰｓ发酵液ｐ本身具有碱性及极性有关。Ｈ可反应红曲菌对碳源的利用情况，通过监测发酵液的ｐ因红曲菌在利用碳源过程中可产生小分子［２］。由图３可知，随着发酵时间的延长，发酵液体积逐渐减少，且添加甘油的处理，所得发酵液体积大于对照。发酵液体积下降主要是因为发酵前期红曲菌生长代谢旺盛，对水分消耗量较大，且菌丝体中０％）。发酵过程中出现发酵液体积轻微上升可能是因为菌丝体自溶造成的含水量较高（约为８通过监测发酵液的体积，可以从侧面了解红曲菌的生长情况，也是对已有研究结果的验证。２．２ 甘油对红曲菌发酵过程中甘油代谢关键酶酶活的影响２．２．１ 甘油对红曲菌发酵过程中甘油脱氢酶酶活的影响 采用分光光度法检测发酵过程中甘油对每３ｄ取样１次，结果如图４所示。红曲菌发酵过程中甘油脱氢酶酶活的影响，［２４］。 Ａ胞外酶活 Ｂ胞内酶活 甘油对红曲菌发酵过程中甘油脱氢酶酶活的影响图４ｐ＜０．０５），由图４可知，胞外酶活显著低于胞内酶活（说明甘油脱氢酶主要存在于胞内，这与已［１８，２５］。由图４Ｂ可知，，／Ｌ和４０ｇ／Ｌ的处理胞内有的文献报道相符发酵过程的前９ｄ甘油浓度为１ｇ６０ｇ／Ｌ的处理中甘油脱氢酶酶活。发酵至第９ｄ以后甘油浓度为酶活高于对照和甘油浓度为１１６０ｇ／Ｌ／Ｌ和的处理所得甘油脱氢酶的酶活最高。推测在红曲菌生长前期，培养基中甘油浓度为１ｇ４０ｇ／Ｌ６０ｇ／Ｌ可造成培养可促进红曲菌的生长及代谢，促使甘油脱氢酶酶活增加。而甘油浓度达１［２６］基渗透压过高，造成红曲菌生长缓慢，红曲菌对甘油的利用速率也较慢，使得发酵前期甘油脱氢酶的酶活较低。随着发酵时间的延长，甘油逐渐被红曲菌利用而浓度下降，此时红曲菌加速对甘油的利用促使酶活增加。另外，由于甘油脱氢酶是甘油转化为生物量或进入氧化代谢途径的关键酶，该酶活［２７］的变化反映了红曲菌对培养基中甘油浓度变化的响应。２．２．２ 甘油对红曲菌发酵过程中１，３－丙二醇氧化还原酶酶活的影响 采用分光光度法检测甘油，３－对红曲菌发酵过程中１丙二醇氧化还原酶酶活的影响，每３ｄ取样１次，结果如图５所示。 Ａ胞外酶活 Ｂ胞内酶活 甘油对红曲菌发酵过程中１，３－图５丙二醇氧化还原酶酶活的影响
１，３－ｐ＜０．０５），由图５可知，丙二醇氧化还原酶在胞外的酶活显著低于胞内酶活（说明甘油脱［１８，２５］。由图５Ｂ可知，，氢酶主要存在于胞内，这与已有的文献报道相符在发酵前６ｄ对照和甘油浓／Ｌ的处理中１，３－０ｇ／Ｌ的处理所得酶活；，度为１ｇ丙二醇氧化还原酶酶活低于甘油浓度为４从第９ｄ／Ｌ的处理所得酶活高于甘油浓度为４０ｇ／Ｌ和１６０ｇ／Ｌ处理酶活。对照和甘油浓度为１ｇ１，３－微生物对甘油的代谢主要通过氧化和还原两条路径进行，丙二醇氧化还原酶是还原路径中，３－在发酵早期即第３ｄ红曲菌在不同浓度甘油的培养基中１丙二醇氧的关键酶。结合图５的结果，化还原酶酶活也不同。说明红曲菌通过还原路径代谢甘油时，对甘油浓度较为敏感，致使发酵前期，４０ｇ／Ｌ和１６０ｇ／Ｌ）／Ｌ甘油处理的酶活。随着发酵进程高浓度甘油（处理中胞内酶活高于对照和１ｇ的延长，高浓度甘油产生的渗透胁迫对红曲菌生长有一定的抑制，造成后续发酵过程中甘油浓度达［２６］１６０ｇ／Ｌ的处理中１，３－０ｇ／Ｌ时，丙二醇还原酶活低于其它处理。当培养基中甘油浓度为４甘油［８］，３－可促进红曲菌生长，故１丙二醇氧化还原酶的酶活在发酵的前６ｄ处于较高水平。２．２．３ 甘油对红曲菌发酵过程中甘油脱水酶酶活的影响 采用分光光度法检测甘油对红曲菌发酵过程中甘油脱水酶酶活的影响，每３ｄ取样１次，结果如图６所示。 Ａ胞外酶活 Ｂ胞内酶活 甘油对红曲菌发酵过程中甘油脱水酶酶活的影响图６由图６可知，甘油脱水酶在胞外的酶活与胞内的酶活相差不大，但胞外酶活普遍高于胞内酶活。，由图６Ａ可知，发酵过程的前６ｄ甘油脱水酶的酶活与甘油添加量呈负相关。发酵至第９ｄ及以后，甘油脱水酶的酶活与培养基中甘油浓度基本呈正相关。由图６Ｂ可知，对照所得胞内甘油脱水酶酶ｐ＞０．０５）。甘油对红曲菌胞内甘油脱水酶酶活无显著影响（活在整个发酵过程均高于其它处理组，由此推测，红曲菌在利用甘油过程中，将所产生的甘油脱水酶分泌至胞外，首先将甘油转化为３－羟３－ＨＰＡ），，３－３－ＨＰＡ可生成１，３－ＰＤＯ）。结基丙醛（后在１丙二醇氧化还原酶的作用下，丙二醇（，１，３－发酵至９ｄ以后，丙二醇氧化还原酶均较低，即甘油代谢的还原路径受阻，造成甘油脱合图５Ｂ促使甘油脱水酶酶活升高。水酶的积聚，２．３ 甘油对红曲菌发酵过程中碳源代谢关键酶酶活的影响２．３．１ 甘油对红曲菌发酵过程中葡萄糖激酶酶活的影响 采用分光光度法检测甘油对红曲菌发酵每３ｄ取样１次，结果如图７所示。过程中葡萄糖激酶酶活的影响， Ａ胞外酶活 Ｂ胞内酶活 甘油对红曲菌发酵过程中葡萄糖激酶酶活的影响图７
由图７可知，葡萄糖激酶的胞内酶活高于胞外酶活，说明葡萄糖激酶主要存在于胞内。由图７Ｂ，／Ｌ时所得葡萄糖激酶的酶活最高；２ｄ时，可知，发酵第３ｄ甘油浓度为１ｇ第６ｄ和第１甘油浓度为４０ｇ／Ｌ的处理中葡萄糖激酶的酶活最高；５ｄ第９ｄ时，对照所得葡萄糖激酶的酶活最高；第１时，甘油６０ｇ／Ｌ的处理所得葡萄糖激酶的酶活最高。浓度为１甘油代谢相关酶受到各种碳源的协同抑制，其中葡萄糖作用最强，而葡萄糖只能被葡萄糖激酶催６－磷酸。该研究所用培养基中的蔗糖必须水解成葡萄糖和果糖才能被红曲菌利用。化为葡萄糖－１ｇ／Ｌ）由此可知，低浓度甘油（可刺激红曲菌对碳源的快速利用，致使葡萄糖激酶酶活在发酵早期较随着甘油浓度的增加，葡萄糖激酶酶活达到最高的时间点延迟，说明红曲菌生长及利用碳源的速高；率受到甘油浓度的影响［８，２８］。２．３．２ 甘油对红曲菌发酵过程中β－半乳糖苷酶酶活的影响 采用分光光度法检测甘油对红曲菌发酵过程中β－半乳糖苷酶酶活的影响，每３ｄ取样１次，结果如图８所示。 Ａ胞外酶活 Ｂ胞内酶活 甘油对红曲菌发酵过程中β－图８半乳糖苷酶酶活的影响由图８可知，β－半乳糖苷酶在胞外与胞内的酶活相差不大，这与文献报道的丝状真菌产生的β［２９］－半乳糖苷酶多是胞外酶，也有胞内酶结论基本相符。β－半乳糖苷酶催化转糖基反应的效率可受动力学控制，低聚半乳糖作为其产物可作为糖苷水解酶的底物。若允许该酶反应继续进行，所有的［３０］随着发酵时间的增加，低聚半乳糖和乳糖最终可水解为半乳糖和葡萄糖等单糖。由图８Ａ可知，葡萄糖和半乳糖的转化率逐渐增加［３１］，故β－半乳糖苷酶的酶活呈现上升的趋势。由图８Ｂ可知，，，０ｇ／Ｌ的处理所得β－发酵前３ｄ对照所得β－半乳糖苷酶的酶活最高；发酵第６ｄ甘油浓度为４半，２ｄ，０ｇ／Ｌ和１６０ｇ／Ｌ的乳糖苷酶酶活最高；发酵第９ｄ各处理酶活基本相同；发酵第１甘油浓度为４０ｇ／Ｌ时能够促进β－处理所得β－半乳糖苷酶的酶活最高。由此，甘油浓度为４半乳糖苷酶的产生。３ 小结在合成培养基中考察甘油浓度对甘油及碳源代谢关键酶酶活的影响。甘油可影响红曲菌发酵液Ｈ，Ｈ降低且处于酸性环境，的ｐ即添加甘油可使红曲菌发酵液ｐ更利于红曲菌生长。调整培养基中４０ｇ／Ｌ）１ｇ／Ｌ），）甘油至中等浓度（或低浓度（可在发酵前期（发酵过程的前９ｄ促使红曲菌分泌较多１６０ｇ／Ｌ），的甘油及碳源代谢关键酶；当培养基中甘油浓度较高（则可刺激红曲菌在发酵后期（９～１５ｄ）分泌较多甘油及碳源代谢关键酶类。该研究结果可为后续研究甘油对红曲菌生长如因甘油造成的生长迟滞期、红曲菌二次生长、红曲菌代谢产物产量及种类变化等提供理论依据。参考文献：［１］ＣｈｅｎＷ，ＨｅＹ，ＺｈｏｕＹ，ｅｔａｌ．ＥｄｉｂｌｅｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉｆｒｏｍｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓＭｏｎａｓｃｕｓ：ｅａｒｌｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ，ｍｏｄｅｒｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄｆｕｔｕｒｅｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］．ＣｏｍｐｒＲｅｖＦｏｏｄＳｃｉ，２０１５，１４（５）：５５５～５６７．［２］Ｍ］．２００３．李钟庆，郭芳．红曲菌的形态与分类学［北京：中国轻工业出版社，［３］ＣｈｅｎＷ，ＣｈｅｎＲ，ＬｉｕＱ，ｅｔａｌ．Ｏｒａｎｇｅ，ｒｅｄ，ｙｅｌｌｏｗ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆａｚａｐｈｉｌｏｎｅｐｉｇｍｅｎｔｓｉｎＭｏｎａｓｃｕｓｆｕｎｇｉ［Ｊ］．ＣｈｅｍＳｃｉ，
２０１７，８（７）：４９１７～４９２５．［４］ＭａｍｕｃｏｄＨＦ，ＤｉｚｏｎＥＩ．ＰｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｂｉｏｐｉｇｍｅｎｔｓｆｒｏｍＭｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓＷｅｎｔａｓｎａｔｕｒａｌｆｏｏｄｃｏｌｏｒａｎｔｆｏｒｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎａｔｉｖｅｓａｕｓａｇｅ（Ｌｏｎｇｇａｎｉｓａ）［Ｃ］．２０１４３ｒｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１４，７１：７２～７６．［５］ＪｉｒａｓａｔｉｄＳ，ＮｏｐｈａｒａｔａｎａＭ．Ｐｒｏｄｕｃｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｗｅｅｔｆｅｒｍｅｎｔｅｄｒｉｃｅ（Ｋｈｏａ－Ｍａｋ）ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈｒｅｄｙｅａｓｔｒｉｃｅ［Ｊ］．，２０１８，１４（４）：５２１～５３４．ＩｎｔＪＡｇｒｉｃＴｅｃｈｎｏｌ［６］ＭａｐａｒｉＳＡＳ，ＴｈｒａｎｅＵ，ＭｅｙｅｒＡＳ．Ｆｕｎｇａｌｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅａｚａｐｈｉｌｏｎｅｐｉｇｍｅｎｔｓａｓｆｕｔｕｒｅｎａｔｕｒａｌｆｏｏｄｃｏｌｏｒａｎｔｓ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，２８（６）：３００～３０７．［７］ＺｈａｎｇＡ，ＳｕｎＪ，ＷａｎｇＺ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅｏｎｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｆｒｏｍｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｂｙＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌ，２０１５，１７５：３７４～３８１．［８］ＦｅｎｇＹＬ，ＳｈａｏＹＣ，ＺｈｏｕＹＸ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌｏｎｐｉｇｍｅｎｔｓａｎｄｍｏｎａｃｏｌｉｎＫｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｔｈｅｈｉｇｈ－ｍｏｎａｃｏｌｉｎＫ，ＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓＭＳ－１［Ｊ］．ＥｕｒＦｏｏｄＲｅｓＴｅｃｈｎｏｌ，２０１５，２４０（３）：６３５～６４３．－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｂｕｔｃｉｔｒｉｎｉｎ－ｆｒｅｅｓｔｒａｉｎ［９］ＨｕａｎｇＺＲ，ＺｈｏｕＷＢ，ＹａｎｇＸＬ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｏｌｕｂｌｅｓｔａｒｃｈａｎｄｇｌｙｃｅｒｏｌｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｚａｐｈｉｌｏｎｅｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓＦＡＦＵ６１８ａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｅｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄＲｅｐｉｇｍｅｎｔｓｉｎＭ，２０１８，１０６：６２６～６３５．ｓｅａｒｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ［１０］Ｊ］．２０１９，３９（０５）：２８～赵 薇，姚钰琪，王 爽，等．甘油影响红曲菌产色素的碳源选择性探究［微生物学杂志，３４．［１１］ＳｕｎＪ，ＨｅｕｖｅｌＪＶＤ，ＳｏｕｃａｉｌｌｅＰ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｈａｒｅｇｕｌｏｎａｎｄｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｆｏｒａｎａｅｒｏｂｉｃｇｌｙｃ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒｅｓｓ，２００３，１９（２）：２６３～２７２．ｅｒｏｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｂａｃｔｅｒｉａ［１２］ＺｈｅｎｇＰ，ＷｅｒｅａｔｈＫ，ＳｕｎＪ，ｅｔａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｏｆｔｈｅｄｈａｒｅｇｕｌｏｎａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ，ｇｌｙｃｅｒｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｏ１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌａｎｄｐｌａｓｍｉｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍ，２００６，４１（１０）：２１６０～２１６９．［１３］Ｊ］．范艳敏，党士坤，王文杰，等．碳源、生长素及诱导子对木豆不定根生长和次生代谢产物合成的影响［植物研２０１８，（３）：３９１～３９８．究，［１４］ＮｉｓｈａｎｔｈＫ，ＮａｍｂｉｓａｎＢ，ＲａｍｙａＲ，ｅｔａｌ．ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｂａｃｔｅｒｉｕｍａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｎｅｍａｔｏｄｅａｇａｉｎｓｔＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｅｘｐａｎｓｕｍ［Ｊ］．ＡｒｃｈＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔ，２０１３，４６（６）：７２１～７３１．［１５］ａｂＴ调控生防菌Ｓｎｅａ２５３的γ－氨基丁酸代谢途径影响杀线虫活性［Ｊ］．于冬梅．碳代谢基因ｇ微生物学通报，２０１９，４６（１２）：３２５７～３２６６．［１６］ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＴＦ９６中心碳代谢机制的研究［Ｄ］．艾正文．基于转录组学的Ｓ哈尔滨：东北农业大学２０１８．［１７］ＲａｈｍａｎＭＳ，ＸｕＣＣ，ＱｉｎＷ．ＥｘｏｔｉｃｇｌｙｃｅｒｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｎｃｒｅａｓｅｓｙｉｅｌｄｏｆ２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ＆Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，２０１８，５（１）：３．［１８］ＦｏｒａｇｅＲＧ，ＦｏｓｔｅｒＭＡ．ＧｌｙｃｅｒｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｃｏｅｎｚｙｍｅＢｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｌｙｃ１２－ｅｒｏｌａｎｄｄｉｏｌｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅｓ［Ｊ］．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８２，１４９（２）：４１３～４１９．［１９］ＹｕｎＪ，ＹａｎｇＭ，ＭａｇｏｃｈａＴＡ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌｕｓｉｎｇａｎｏｖｅｌ１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｆｒｏｍ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８，２４７：８３８～ｉｓｏｌａｔｅｄＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍａｎｄｃｏ－ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｗｈｏｌｅｃｅｌｌｓ８４３．［２０］Ｄ］．２０１２．周 宇．基因组改组选育高产β－半乳糖苷酶菌株［武汉：华中农业大学，［２１］Ｊ］．２００６，赵瑞香，王大红，牛生洋，等．超声波细胞破碎法检测嗜酸乳杆菌β－半乳糖苷酶活力的研究［食品科学，（０１）：４７～５０．［２２］Ｄ］．魏志奎．五种酸乳发酵剂糖代谢相关酶活性及发酵酸乳品质特点的比较研究［乌鲁木齐：新疆农业大学，２０１４．［２３］ＢüｈｌｅｒＲＭＭ，ＤｕｔｒａＡＣ，ＶｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏＦ，ｅｔａｌ．Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｇｍｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｕｓｉｎｇａｃｏ－ｐｒｏｄｕｃｔｏｆｂｉｏｄｉｅｓｅｌａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅ［Ｊ］．ＦｏｏｄＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ（Ｃａｍｐｉｎａｓ），２０１３，３３：９～１３．［２４］Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓ）ＭＳ－１的鉴定及发酵特性研究［Ｄ］．２０１４．冯艳丽．丛毛红曲菌（武汉：华中农业大学，［２５］ＴａｌａｒｉｃｏＴＬ，ＡｘｅｌｓｓｏｎＬＴ，ＮｏｖｏｔｎｙＪ，ｅｔａｌ．ＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＧｌｙｃｅｒｏｌａｓａＨｙｄｒｏｇｅｎＡｃｃｅｐｔｏｒｂｙＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＲｅｕｔｅｒｉ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ１，３－Ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ：ＮＡＤ＋Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ＆ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，５６（４）：９４３～９４８．
［２６］ＦｅｎｇＹ，ＣｈｅｎＷ，ＣｈｅｎＦ．ＡＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓＭＳ－１ｓｔｒａｉｎｗｉｔｈｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄｍｏｎａｃｏｌｉｎＫｂｕｔｎｏｃｉｔｒｉｎｉｎ［Ｊ］．ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，２５（４）：１１１５～１１２２．［２７］ＬｉＣ，ＬｅｓｎｉｋＫＬ，ＬｉｕＨ．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆＷａｓｔｅＧｌｙｃｅｒｏｌｆｒｏｍＢｉｏｄｉｅｓｅｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｏＶａｌｕｅ－ＡｄｄｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］．Ｅｎｅｒｇｉｅｓ，２０１３，６（９）：４７３９～４７６８．［２８］ＳｅｎｏＥＴ，ＣｈａｔｅｒＫＦ．ＧｌｙｃｅｒｏｌＣａｔａｂｏｌｉｃＥｎｚｙｍｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎＷｉｌｄ－ｔｙｐｅａｎｄＭｕｔａｎｔＳｔｒａｉｎｓｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＣｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３（２）［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３，１２９（５）：１４０３～１４１３．［２９］Ｄ］．２０１３．黎 丽．斜卧青霉β－半乳糖苷酶的分离纯化及分子构造研究［济南：齐鲁工业大学，［３０］Ｄ］．陈真真．β－半乳糖苷酶菌株筛选、酶的分离纯化和性质及酶法合成低聚半乳糖的研究［无锡：江南大学，２０１３．［３１］Ｊ］．２００６，许牡丹，杨伟东，柯 蕾，等．米曲霉β－半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工艺研究［食品工业科技，（０１）：１８３～１８５＋１８９．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌｏｎｋｅｙｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｍｅｔａｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４ＳＨＩＪｉａ，ＺＨＡＯＷｅｉ，ＬＵＪｉｎ，１，２，３，４１，２，３，４１，２，３，４ＷＡＮＧＷｅｎｊｕａｎ，ＹＵＸｉａｎｇ，ＦＥＮＧＹａｎｌｉ（１．ＨｕｂｅｉＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃＷｉｌｄＶｅｇｅｔａｂｌｅＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ４３５００２，Ｃｈｉｎａ；２．ＨｕｂｅｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｄｉｂｌｅＷｉｌｄＰｌａｎｔｓＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＨｕｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ４３５００２，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨｕｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ４３５００２，Ｃｈｉｎａ；４．ＮａｔｉｏｎａｌＤｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＨｕｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｎｇｓｈｉ４３５００２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｎｋｅｙｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｍｅｔａｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｉｎｓｙｎｔｈｅｔｉｃｍｅｄｉｕｍｗｈｅｎＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｌｏｓｕｓＭＳ－１ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｒａｉｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐＨｖａｌｕｅｓｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｗｅｒｅｂｅｔｗｅｅｎ３．５ａｎｄ７．５ａｎｄａｌｌｐＨｖａｌｕｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｉｒｓｔａｎｄｔｈｅｎｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ａｌｌｏｆｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｖｏｌｕｍｅｓｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓｆｏｒｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｃａｒｂｏｎｍｅｔａｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｗｉｔｈ１ｇ／Ｌａｎｄ４０ｇ／Ｌｇｌｙｃｅｒｏｌｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｗｉｔｈ０ｇ／Ｌａｎｄ１６０ｇ／Ｌｇｌｙｃｅｒｏｌｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔ９ｄａｙｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｈｉｌｅｔｈｅｓｉｔｕａｔｉｏｎｗａｓａｌｗａｙｓｏｐｐｏｓｉｔｅｄｕｒｉｎｇｔｈｅｌａｔｅｒｓｔａｇｅｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ．ＴｈｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｎｄｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｍｅｔａｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｃａｎｂｅａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｇｌｃｅｒＭｏｎａｓｃｕｓｓｐｐ．ＴｈｅｐｒｅｓｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｃａｎｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｍｏｏｌａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｄｓｏｆｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｂｙＭｏｎａｓｃｕｓｓｐｐ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｏｎａｓｃｕｓｓｐｐ；ｇｌｙｃｅｒｏｌ；Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｇｍｅｎｔｓ；ｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓ