2024年3月8日发(作者：辛杉)
Sieme ns Advia 系列生化仪参数详解
本详解主要针对的是市场上常见的四种西门子机型 ：ADVIA1200/1650/1800/2400
。大致
分为五个章节：简介、基本参数介绍、读点前移、前带监测、参数设置。
一、简介:
ADVIA1650是最早进入中国的拜耳生化仪 ，虽然师出日本，也是日本电子制造，但还是能
看出拜耳的设计理念在里面。后来拜耳被西门子收购，ADVIA生化也保留了下来。
ADVIA系列生化仪都是将 ISE作为标配安装，ADVIA1200生化速度是800测试每小时，
1200测试每小时， ISE400测试每小时；ADVIA1650 和升级版1800的生化速度都是
ADVIA2400的生化速度是1800测试每小时。
Advia系列的操作控制软件都大同小异 ，几乎没有什么本质上的变化 ，所以延续性较强。 加上西门子特有的流水线兼容性 ，使ADVIA系列的生命力变得异常顽强 ，在国内流水线市 场里占据相当大的份额。
在ADVIA老版本的程序中，是支持四种试剂的，也就是R1、R2、R3和R4;但在后续版本 中，四种试剂变为2种，只有R1和R2，这一点厂家并没有说明为什么 。
所有的Advia系列，都是两个试剂盘，两个试剂针，反应盘是单盘，塑料反应杯，一根样
本针。除ADVIA1200夕卜，都有一个稀释盘和稀释样本针 ，稀释样本针将原始样本加入到稀
释样本盘中，按照最高可达1:75的比例进行样本稀释，然后通过样本针将稀释后的样本转 移到反应盘中。同参考材料
样，在反应盘上也可以进行最高 1:75的样本稀释，这样二者相乘，样本
的稀释比例高达1:5625。稀释样本盘也是塑料杯，有自己单独的搅拌器、冲洗站。
ADVIA的试剂也可以进行稀释，所以节省试剂。但由于设计理念的关系，其孵育介质有孵 育油，也就是油浴。3M生产的孵育油价格较贵
外，反应杯空白比色也需要单独的活化剂
ADVIA的耗材较多，而且总成本也不少。
，而且需要半年更换。除常规的清洗剂
，加上稀释样本或试剂用的生理盐水 ，总体下来
所有的ADVIA系列都是R1+S+R2方式。反应时间可选择：3分钟、4分钟、5分钟、10 分钟、15分钟、长程反应21分钟和31分钟。
ADVIA1200没有稀释样本盘，所以样本直接被转移到反应杯上
13.5秒，R1+S后读第一点，10分钟反应读点42个，R2在19点前加入。
。加样速度4.5秒，读点
反应杯总数231个，反应体积为80-430ul，R1和R2加入体积范围在 5-300ul之间。反应 时间可选择：3分钟（最后读点14 ）、4分钟（最后读点18 ）、5分钟（最后读点21 ）、 10分钟（最后读点42 ）、15分钟（最后读点63 ）、长程反应21分钟和31分钟。
ADVIA1650和1800加样速度为3秒，读点时间是6秒，R1+S后读第一点，10分钟反应 读点98个，R2在49点前加入。参考材料
ADVIA2400加样速度为2秒，读点时间是14秒,
R1+S后读第一点，
10分钟反应读点41
反应杯总数221个，反应体积为80-300ul , R1和R2加入体积范围在15-150ul之间。
反应杯总数340个，反应体积为60-180ul，R1和
个，R2在22点前加入。
R2加入体积范围在
10-100UI 之间。
二、基本参数介绍：
主读点：/n 也就是Main Detect point的简写，m和n是主读点区的起止点 ，
0 设置（填写0就是不设置），双试剂中是指R2加入之后的一组时间点，据此计算吸光度速 率或平均值用于浓度计算； 子读点：/r。也就是subsidiary Detectpoint 的简写，p和r是子读点区的起止点 ， 0 和样本空白，在双试剂中是指 R2加入前的一组时间点。 ，一般指启动反应之前的试剂 参考材料 读点：N ,在终点法反应中，读点不小于三个，如果小于三个，系统自动前移满足三个 在速率法当中，读点不能少于六个，如果小于六个，系统自动前移满足六个 。 根据反应方法，子读点可以选择也可以不选择 。 u/d和U/D旗标：U和u表示上限，D和d表示下限，当超过小写u/d范围时，用大写U/D 显示。 空白：Biank （u/d U/D），这里指的是试剂空白的上下限 。就是以去离子水为样本的检 ，当试剂的空白吸 。试剂空白 测，主要用来监测试剂性能，是以主读点区主波长的吸光度值为基准的 光度超过u/d上下限范围，就会用U/D显示出来，提醒操作人员注意试剂问题 是可以选择是否进行监测的 。 Biank u/d的定义是，在下降速率当中，Biank u也就是空白上限为 点吸光度的 2ABS，Biankd为主读 50% ；在上升速率当中，Biank u也就是空白上限为最高主读点吸光度的 150%，Biank d为主读点吸光度的 50%。参考材料 Water Sample (Reagent Baseline) 1.8 100 Blank (u) Threshold 16 1.4 图 1 Bia nk u/U/d/D 示意图 M DET Pm M DET P n 1.2 修正点：E2。E2表示试剂和样本加入后的几个点的吸光度值 ，用来进行LIH （乳糜、黄疸、溶血等标本）或底物耗尽的监测。E2都将监测试剂空白以及样 本加试剂08 Sample + R1 Abs(E2) 的结果，也就是说E2=样本+R1的E2吸光度减去试剂空白的E2吸 光度。8/ank (d) Th^shoid 04 06 0 "T" 40 Read Point 60 读点前移： 物，而底物80 0 Point-Forwarding。在速率法中，高浓度样本往往很快消耗完反应却大量存在，速率反应很快停止。当系统监测到这种情况时，会自 动将主读点前移至发生速率反应的区域。 在使用读点前移的技术时，需要增加一个主读点.P I, l n主读点被监测到发生底物耗尽，那么自动前移读取l和m之间的读点。参考材料 图2读点前移示意图 PoEnt For^varding 图2所示中，m和n点之间出现底物耗尽现象，由于设置了 I点，所以自动将读 点移至I和m之间读取。同样，I和m以及m和n之间要多于6个读点。 如果判断底物耗尽，就要借助样本吸光度限制这个概念。 样本吸光度限制：Sampleu/d。Sample u或d只能选择一个，这是根据反应方 向的不同而设定的，下降速率反应将只有 Sample d，上升速率反应将只有 参考材料 Sample u。其要求监测R2加入之前和之后的数个读点的吸光度值，依然是主波 长的吸光度值。R2加入之前的监测点就是我们前面说的 E2, R2加入之后的监 测点是主读点区的最后两个点，叫做选择点。E2和选择点进行计算： Sample u/d=选择点的吸光度-(E2*K) 其中：E2=样本和R1的E2点吸光度值-试剂空白的E2点吸光度值 K= (R1+S) / ( R1+S+R2 )是体积系数。 当E2用于底物耗尽探测时，读点自动选取第7点，这样会避开LIH因素干扰。 判断依据，在下降速率反应中，当Sampled大于选择点吸光度时，认为是底物 耗尽；在上升速率反应中，当Sample u小于选择点吸光度时，认为是底物耗 尽。参考材料 Sample > Assay Range < 2 1.8 1.6 14 1,2 5 1 SampJe (u) Threshold Point Forwerding E2 corrected Sample (d) Threshold 0.8 0.6 0.4 P m M D ET P 0. 0 20 40 0 60 Read Point 80 1002 图3底物耗尽示意图 图3的所示中,Sample d大于主读点区m和n最后两点的吸光度值,所以判 断为底物耗尽，自动将读点前移到I和m点。 这里有一个问题，如果m点也处于底物耗尽的区域怎么办？前移的结果也会不 准确。所以ADVIA的读点前移技术并不是那么可靠，为了保证可靠，其采用了 非常复杂的计算方式，目的只有一个，规避东芝的弹性速率法。 这里简单的介绍一下弹性速率法。其原理是监测速率反应的主读点区，并根据 设置的吸光度差值进行没两个相邻读点的吸光度差 ，当实际读取的吸光度差值 小于参考材料 设定的吸光度差值时，就会判断为底物耗尽。而底物耗尽判断后自动将读 点前移至预先设置的两个点的区域，这样可以充分避开ADVIA中的如果m点也 在底物耗尽区域的可能。 读点前移不在这里做详细介绍，后面有单独的章节 反应方法：有五个选择，EPA RRA、2PA、CRA和IMA ； EPA反应方法：就是常说的终点法，可以是一点终点法，也可以是两点终点 法。一点终点法时，子读点p和r无效，填为0 ；两点终点法时，子读点p和r 要填写，而且要在R2加入之前。终点法读点要求至少三个点，不足三个点时， 系统自动前移补足。 DFT-P point Main Main detection start point 图4 EPA终点法示意图参考材料 RRA反应方法：也就是常说的速率法，可以是单速率法，也可以是双速率法。 采用单速率法时，读取主读点区的m和n的区域进行每分钟速率计算。采用双 速率法时，还要读取R2加入之前的子读点区p和r的区域进行每分钟速率计 算,然后主读点和子读点相减再进行浓度计算 。使用速率法时，系统将自动进 行E2吸光度计算。但在参数设置，可以选择是否选择E2 corre，也就是是否选 择E2修正。用DO或Not Do选择。 在速率法当中，Biank u/d必须输入，并且可以选择在R2加入前一点插入检查 点CHECK ,此检查点将于试剂空白数据进行比较，借以判断试剂是否有问 题。但此法仅在下降速率法和IMA方法中使用。如果不使用，则填写0。 当然，在速率法当中，也可以选择底物耗尽监测而增加的主读点 。 丄 D£T.P Fl 问 DET.P 1 StRf ChwkOPI—Tim# 参考材料 图5 RRA速率法示意图 2PA反应方法：也就是常说的两点速率法。也是速率法的变种，区别在于不进 行主读点间DET.P OwckD Pl —Time 的两个点的线性监测。其余与速率法完全一样。 图6 2PA两点法示意图 S+R1 CRA反应方法：官方说法为随着时间的变化反应接近恒定，曲线由最小二乘法 拟合，也有R2 〜R4 称为固定点法。大致意思是选择读点区的两个点进行吸光度值得最 小二乘法计算。是根据时间和吸光度的数值进行计算的 ，无论是速率法还是终 点法均可米用。Mam OETP 参考材料 当子读点被采用时,p=r丸）,或p丸）,r=0时，是速率法，速率计算是根据两 点间曲线的正切线；当p 说实话，真不知道这个方法是做什么项目的 ，中文没有解释，英文的解释很 少，也没发现实例。 图7 CRP固定点法示意图 IMA反应方法：也就是免疫比浊法。是采用最小二乘法计算的速率法。对于R1 参考材料 的加入量太少，无法进行E2计算时，这个方法就变得有用了参考材料 也就是说，在很多免疫比浊项目里，R1的加入量往往小于 R2的量，所以引发 了一系列的计算和判别上的困难，IMA就是为了解决这个难题的。 样本和第一试剂加入量太少，就无法进行E2的计算，没有E2就无法进行前带 监测和底物耗尽的监测，所以在IMA方法中R2之后插入监测点Check D.P.I,用 于弥补R1和S的不足。 采用IMA方法设置检查点后 ，系统自动计算 limit values值（设备默认 ------ DET.P Check O P」Main O£T,P —Time 0.003），此法对浑浊样本的处理很有成效，所以用在免疫比浊项目上。 图8 IMA免疫比浊法示意图Sub DET.P 参考材料 Reaction data Reaction process data l0r a cloudy sample 图9 IMA应用示意图 IMA的其它使用方法与速率法一样，仅限于R1+S低于反应杯最小容量的测试 项目里。如果不存在这样的项目，那么即便是免疫比浊项目，也应该采用常规 速率法或终点法。 定标方法：因数定标、线性定标和非线性定标； 在参数界面里的Calc mthd，也就是计算方式里，有ABS和STD/MSTD选择， 表示吸光度和单点定标/多点定标计算。在ADVIA的所有机型里，定标中的零浓 度点用试剂空白替代，所以在定标之前要做试剂空白，如果不做试剂空白，仪 器会认为试剂空白就是原点。注意这个差别，与奥林巴斯的不同。奥林巴斯的 试剂空白和零浓度校准点是两个概念，而在adiva里合二为一 参考材料 参数界面里的Formula，也就是公式才是选择定标方法的地方。 因数定标：如果在Calc mthd里选择ABS,那就意味着你要采用因数定标，那 么在Formula里只有一个可以选择，那就是Lin ear,因数定标只能用于线性定 标。 因数定标也就是直线方程里的 Y=KX+B中的K，所以也叫K值定标法。而B的 确定则需要试剂空白，所以因数定标法必须做试剂空白，然后结合给出的K值 进行定标曲线的绘制，然后依据这个曲线进行浓度计算。在Advia中，K值的给 出是在参数界面的 Standards setting 中的FV中。 线性定标：线性定标需要两个点才能决定一条直线 ，我们一般给出一个零浓度 点，一个带有浓度的标准点，这样仪器就会自动进行计算。而Advia中零浓度 点在试剂空白里给出了 ，所以对于两点线性定标来说，只需要在给出一个校准 点就可以了。所以在Advia的手册里，线性定标叫做一点线性。而且Advia的所 有校准点，无论是线性还是非线性，零浓度点都不计算在内，只数带有浓度的 校准点，比如5点定标，加上零浓度点其实就是6点；而6点定标，加上零浓 度点就是7点。 不过，要指出的是，Advia的试剂空白并不是强制性的，这一点与奥林巴斯不 同。不进行试剂空白检查的项目，默认试剂空白也就是零浓度点的值是通过原 点的 下面给出两张图，一张做过试剂空白的线性定标，一张是没有做过试剂空白的 线性定标。 参考材料 图10没有做试剂空白的线性定标 由于假设所有没有做过试剂空白的线性定标的零浓度点都通过原点 ，所以图中 的蓝线则是默认的校准曲线，但实际上并非如此。如果提前没有做试剂空白， 仪器也会自动做上，这样就会出现两个点，图中的两个红点就是。左下角是零 浓度点，右上角是标准店。但蓝色的定标曲线却是右上角的红点和原点的连 接，而不是与零浓度点连接。这样的结果我们都知道会有错误，因为真正计算 的是按照蓝色直线计算，而红色的我自己画上去的示意线条才是真正的计算直 线。 要解决这个问题，只有重测试剂空白重新执行定标才行 参考材料 下图是做过试剂空白的线性定标图例 图11做过试剂空白的线性定标示意图 而在statistical Data里的FV就不是因数了，而是定标点的浓度。上面两张图很参考材料 清楚的告诉我们，一点线性定标，有一个Biank试剂空白，FV为0.00,而STD 值只有一个，就是标准点的值。 Cx: Reaction ABS: FV: STD: Concentrat ion of a measure me nt sample or unit (hereinaftcF> concentration) Reaction absorbance of a measurement sampk Concentration of the standard stored in the calibration monitor Calibration curve Concentration 图12 Advia —点线性定标示意图 在线性定标中也有多点定标，例如同工酶法。在Advia中，线性多点定标多是 用来拟合一元三（二）次直线方程。对此有三种方法，由于很少使用，所以仅 仅图示，不做解释。 Operation ABS = axCx5-hbxCx2+cxCx4*d Operation /BS: Operation ^hwrbartec ot a measuremcni sample Cx： 靳 lx G d: Concenlralion of a measurement sample CoefficienJs obTained automatie^lly hy curve approximal ion in cali bmtion 参考材料 图13无变换一元三次直线方程定标参考材料 f(Cx｝二 log(Cx/FVi + 71 + (Cx/FVi)1) OperationABS=axf(Cx)' +bxf(Cxy +cxf(Cx)+d f(Cx): FVi: OpenUion ABS: a, b, d: Concentration axis conversion value 2nd concentration of the standard sample OpersUton absorbance of the measurement sample Ccwfficienis auiomaiicaliy obtained by curve approxirnaiion in cali-bration. Operation ABS Calibration curve STDS STD5 Operation ABS STD3 STD2 STD1 BLK Concentration 图14对数线性变换的一元三次线性方程定标参考材料 f(Cx) = log(Cx/FVi + 71 + (Cx/FVi)1) g(operation ABS) - tog(opcration ABS/Ai + /1 + (operation ABS/Ai)1) gfoperation ABS) = a x f(Cx)? + bx f(Cx)J +cx f(Cx) + d fifCx): Conccniration jxis conversion value 隹(optration ABS): Optraliort-^bwTbnrwv uxts vonver>inci *扣ue Cx： FVi: Operation ABS: Ai: Concent rut ion uf the msMjrtnxnt sutnpk 2nd from lhe lowest of lhe contcnlralions Opcraiinn ab$t>rban^e of the measure me nt sampk Opcrnlion ABS uf 2nd from [he In west of iht： slundurd- samp 畑 cDTKJcntrjlioiib Ctwfficienls auiomatic^lly ohtnincd by curve approxianutLon in calibralton. aF k G <1； Calibration cttfva Conceritratk>n 图15对数变换的一元三次线性方程定标 同时,Advia还提供一元二次线性方程定标。 非线性定标：Advia的非线性定标有 Logit-Log1、Logit-Log2、Logit-Log3 和 Spline样条曲线、line graph折线五种。参考材料 Operation ABS = -------------- +d 1 + (Cx/b) Operation ABS: Operation absxnbanve of the measurement ^nipk Cx; a. b* d: Conctniratinn of the measufEmEni sample Ctxjfficienix autom^ticaliy obtained by curve approximation in cali- bratitm. 图16 Logit-Log1非线性定标示意图参考材料 Operation ABS = 1 + (Cx/b) Operalion absorbance of the measurement sample： Concentration of the measurement sample Cocfficienls automatically obtained by curve approximation in calibration. Operation ABS: Cx: b, G d: 图17 Logit-Log2非线性定标示意图参考材料 Operation ABS = ------------ ——―~—— 1 + (Cx/b) v x exp(e x Cx) 图 18 Logit-Log3 非线性定标示意图 Operatton AilS: Cx: 恥 lx c. d, c: Opefation absorbance of the measuremeflt sample Concentration of the measurement sample Gx^fficienis automiilically obtained by curve upprvximalien in calibration. 参考材料 Operation ABS = ai x Cx + di Operation ABS; Operation kibMirhuiKe of the medsuremeni sample Cortceniralion of the mtasurement Simple Coefficients obtained □utofnatknlJy in cath scttipni (i - 1 to 6) of calibration Cx: a： 图19 line graph折线非定标曲线示意图参考材料 Operation ABS: Cx: a,, bj、Cj* a： Operation ABS = 3i x CxJ -t- b* x Cx* + ct x Cx + d* Ope ration absorbance of the measuremenl simple Coriccntrahon of the measurement sample Cotfficicnu obtained automittcally in each section (i = I io 6) of calibration 图20 Spline样条非定标曲线示意图 在多点定标中，由于试剂随着使用时间的推移性能会发生改变 ，其中包括颜色 的改变。所以每天开机画面中会提供简单定标 (Simplified calibration )这个选 项，原理是根据前后试剂空白修正整条定标曲线 。参考材料 STD-BI,K U2 ------------------- HFV)-MBLK UHBLK-U2XMBLK The opt ration Al IS is correcud hy the following alter UI and U2 ^rc obhirtud Openitton ABS - U2 x f(x) + VI Opcraiiun ABS: Opcraliun ub^>rbaiKC n( the riK^Mircmcnl sample Cx: VI' (.'{incrfinatiun the mea^Li^dicTil sampbe Kv^gent t^hnk fcr ccrrc^tion Pn^portiunaJ oinipontnt of currtctKin Cnncentration of lhe simplified catibminn umpk Measured tzakLilalicn absorbance of the standard sample used by simplified c#|ibraliu«j J reagent bhnk ^ifut used by th< simpEifred atlihwiidn Orcrrtlion atwnrtmnce vatue calculated by approxinulion 訓 ori^injl MBLK: ^mccnlrjtkm FV Original reagent bl&nk V2 FV： STD: HLK： 图21 Simplified calibration 简单定标示意图 参考材料 在图11中，左侧是定标细则的选项,其中，表示计算方法,有ABS （因数法）、1-Point （1点定标）和Multi-Point（多点定标）三个选项； 在Axis Conv.轴线变换中,有No Conv.（不变换）、Log.-Linear （对数线性） 和Log.-Log.（对数）三种选择； 在 Multipoi nt Formula （多点公式）中，有 Lin ear （线性定标）、quadratic （一元二次直线方程定标）、Cubic （一元三次直线方程定标）、Spline （样条 曲线）、Line Graph （折线）、Logit-Log1、Logit-Log2 和 Logit-Log3 等 8 种 方式； 在# cal Stds里，要填写包括试剂空白在内的校准点数量。 参考材料 图22多点非线性定标示意图 从图中我们看到，四个校准品的数值成梯度倍比关系，但无法做出满意的样条 曲线，是否 韓 u g b*. fcixairT C4-I 让.T * s, 需要改为对数曲线还需要观察。 图23原厂试剂多点非线性定标示意图 这是原厂的IgM定标曲线，没有做试剂空白。定标浓度并非梯度倍比稀释，但 只有这样才能保证Logit-Log3曲线的完美。好像国外很少使用样条曲线定标。 而这个项目恰恰是样条A L l-L 曲线。如果用最高浓度倍比梯度稀释，就会得到一幅漂 亮的样条曲线。 、读点前移： SL-K<3«^ 参考材料 前面说过，Advia的读点前移技术是为了应对底物耗尽的速率反应 ，采用样本 吸光度限制Sample u/d和试剂空白限制Biank u/d来进行计算和判断。要知道 是，底物耗尽有时并不是因为样本的浓度或活性太高导致的 ，试剂污染或失效 也有可能。所以读点前移技术和底物耗尽判断，从另一个方面讲，也是对试剂 性能的一个监测。 由于底物耗尽仅仅存在于速率法的反应当中，所以这里描述的均为速率法。 下面两张图就是超过Sample u/d限制后的底物耗尽图例：参考材料 hver^B or bidFsct Reaction 图24间接或相反反应超过Sample d限制的底物耗尽反应图示 hcrpasing of Oect Rsocbor 图25直接反应超过Sample u限制的底物耗尽反应图示参考材料 注意图25中27点出现的拐点，这已经是不明显的底物耗尽的表现 样本吸光度限制和试剂空白的配合使用，加上检查点checkD.P.I的介入，可以很 容易的判断试剂性能。 下图是极端情况下的试剂空白限制的图例 RBOqf'Jir BtnJi fypr 2 ! 75 - > Blank u 申 ..................................... ...... 5 0 75 * 05’ 0 25] 0 <0 25 -Q §■ 0 参考材料 ▼ Blank d 20 40 « Tme Cours# of RBOCDOI 90 100 图26试剂空白图例 通过试剂空白计算出来的Biank u/d值与样本测试时主读点区主波长吸光度值进 行比较，如果超出这个范围将会用 U/D来标示结果，以提示操作人员该结果不 可靠。 检查点check 的选择一般在R2也就是启动反应物加入之前或之后的一个 点，而E2的吸光度计算点则选择在6、7、8这三个读点上。注意这仅仅是用来 监测底物耗尽的，如果用E2来监测LIH样本，则读点应该在2、3、4、5这些 地方。 在直接反应中，也就是单试剂项目里： 当check D.P.I的主波长吸光度值大于 Blank u的值时，结果用u标示； 当check D.P.I的主波长吸光度值小于 Blank d的值时，结果用D标示； 在间接反应中，也就是双试剂项目里： 当check D.P.I的主波长吸光度值大于 Blank u的值时，结果用U标示；参考材料 当check D.P.I的主波长吸光度值小于 Biank d的值时，结果用d标示; 这就是结果里U/u/D/d ”这四种旗标的来历 F面举例说明读点前移技术的使用： Blank（⑴ and Blank {ci} Checks 0.2 0 0 W 20 30 40 50 Reed Ftoint 60 70 80 90 100 图27读点前移举例1 图27中的三个曲线：红色是试剂空白，蓝色是正常样本曲线，绿色是异常样本 曲线。 图中有两天竖线，一个E2, —个是check ,那么根据图示可以得到以下数 据： 参考材料 E2吸光度值 试剂空白修正E2（E2-试剂空白） 0.10 0.50 0.60 - 0.40 0.50 E2是要计算修正系数的，而修正系数=（R1+S）/ 试剂空白 正常样本 异常样本 那么经过体积修正过的 （R1+S+R2）。 这里假设R1是80，S是16，R2也是16，这样修正系数就是0.875。 那么经过体积修正过的正常样本 E2就是0.343，异常样本E2就是0.429。 同时我们也知道，Check 在R2之后，其正常样本为0.55，异常样本为 1.00。 那么体积修正过的 0.571 0Check -E2的值是：正常样本是 0.207,异常样本是 根据试剂空白的原则，Biank u应该是0.40，Biank d应该是0.05。 那么我们用Check 和E2的差值与Biank u值的0.40进行比较，正常样本参考材料 的差值0.207小于Biank u值的0.40,而异常样本的差值0.571大于Biank u值 2 8 的0.40,又是间接反应,所以结果报告U。 0 W 20 30 40 50 Read Rsirtt 60 70 SO 90 1 DO Blank (u) and Blank (d) Checks 2 Check D P I 图28读点前移举例2 ■» Reagent Blank T— Abnormal sariple 1 图28的例子里，红色为试剂空白，绿色为异常标本2，蓝色为异常标本1。很 明显，异常标本1是典型的底物耗尽反应，而异常标本2貌似没有问题，但R2 加入之前就过高了 。 E2吸光度值 冷—Abnormal 5^irpl« 2 试剂空白修正E2（E2-试剂空白） -0.0041 - 2.6119 2.6160 试剂空白 正常样本 参考材料 异常样本 1.7154 1.7195 经过体积修正后的E2分别是：异常样本1为2.242 ,异常样本2为1.474 ; Check D.P.I值为：异常样本1为2.4665 ,异常样本2为1.4670 ; E2和Check D.P.I的差值为：异常样本为0.224,异常样本2为-0.007 ; Biank u 值设为 0.20 , Biank d 值设置为 0.01。 异常样本1的差值0.224大于Biank u的0.20，又是间接反应，所以结果报告 U; 异常样本2的差值-0.007，小于Biank d的0.01，又是间接反应，所以结果报告 d。 这是两个利用试剂空白限制和 E2以及Check 检查点进行底物耗尽判断的例 子。在这两个例子中，试剂空白放的很宽，并不是严格按照150%和50%最高 最低计算公式计算的，但即便是这样，例子中还是判断为底物耗尽。 而在参数设置里，Biank u/d往往被设置成±9.9999，这也就意味着不进行底物 耗尽判断和试剂空白判断，那么Check D.P.I和的设置也就变得毫无意 义了。参考材料 样本吸光度限制Sample u/d在底物耗尽中的用途呢？其与试剂空白Biank u/d 可以同时，也可以单独使用，监测底物耗尽依然有一定的作用 ixf电吕和塚 or Direct Ruction 参考材料 图29样本吸光度限制Sample u/d在底物耗尽判断中的示意图参考材料 图29的上图是选择点吸光度值大于 Sample u ,下图是选择点吸光度值小于 Sampled ,所以都被判断为底物耗尽。下面举例说明计算方法： 图30 Sample u/d判断底物耗尽的例子 图中红色为试剂空白，蓝色为异常样本。试剂空白的E2为-0.004，样本的E2为 0.6127 ； 参考材料 Sample u/d=1.25-[0.6127- (-0.004)]*{[16(S)+80(R1)]/[16(S)+80(R1)+16(R2)]}=0.7215 0.250，远远小于Sample d的0.7215 （图中放宽到 0.750），所以判定为底物耗尽。（下降反应是Sample d，上升反应是Sample u ）。 ； 经过修正后的曲线就是蓝色虚线部分 ，那么主读点区的最后两个点的吸光度也 就是选择点的吸光度值只有判断底物耗尽后，就需要读点前移。而采用读点前移，还需要一个读 点。 Point Forwarding leading to Reanalysts 图31读点前移的各种可能图示 在这个图示中，主读点和之间出现底物耗尽现象，读点前 移就是读取和之间的吸光度速率。图中给出的 正好在拐点上，这种可能性太小了 。红色箭头才是更多的 可能性之 参考材料 。 当然最理想的状况是左侧的红色箭头 移也毫无意义。 ，如果是右侧的红色箭头，即便是读点前 由此可知，Advia的读点前移技术相当的复杂，并不是那么容易掌握，而且在 前移点的选择上也很令人抓狂，远不如东芝的弹性速率法简单。不过，利用这 种技术不仅可以判断试剂问题，也可以判断反应过程中的问题，还是很有帮助 的。 我们要清醒的知道，利用读点前移技术，必须进行试剂空白检测，并且计算出 Blank u/d 和Sample u/d，还要知道检查点 的设置，否则无法使用这一技术。 Check 的设置和前移点 四、前带监测：参考材料 Prozone前带监测功能是几乎所有生化仪都拥有的,Advia系列也不例外。更何 况Advia强调免疫比浊功能，所以前带监测的设置与IMA的设置在一起，同在 参数界面的一个区域里。 图32前带监测界面示意图 前带现象可能会导致实际结果偏低，这与底物耗尽类似，但在曲线上，而且截 然不同。 在前带监测选择里，前带计算公式可以选择前带公式 （用于终点法项目），也 可以选择速率公式（用于速率法项目）。无论选择什么公式，Prozone Limit前 带范围都要输入，这也是前带发生反应的实际吸光度值，超过这个值就会判定 是前带反应。 Prozo ne judge是前带的反应方向，这个方向决定是高于还是低于 ProzoneLimit值，来判断前带现象。 参考材料 如果选择速率公式，那么必须输入judge limit的值，这个值低于前带子读点的 吸光度值，将不进行前带检查。 /n和/r则为用于前带检查的主读点和子读点，这与常规参数 里的不同，也就是参数设置里的 Calculations method setting 和..p/r完全不同。而且只有选择了前带监测才有效。 下面举例如何使用前带监测：参考材料 里的/n Prozone Formula Method 0 90000 a eoooo 0 70000 o eooao 0 50000 0 4D0DD 0 30000 0 20QDQ 0 WOOD Prozone sub-DET.P 图33前带监测举例 图中的实线是正常样本，虚线是前带样本。 实线 A的主读点中间值为 51 .P m 88 -n 90= 0.750 ,子读点中间值为 - r 53 = 0.400 。主读点与子读点的吸光度差为 0.350。把这个数 值作为 Prozone Limit 值。 虚线B的主读点中间值为 88 -n 90 = 0.726 ,子读点中间值为 .P p 51 - r 53 = 0.667。主读点与子读点的吸光度差为 0.049。 Prozone judge设置为向下范围，0.049小于0.350,所以发生前带现象，因此参考材料 结果带有p标示，提醒操作人员注意。 如果是低浓度反应，可以讲前带主读点设置在启动反应之后的几个点 ，而子读 点可以设为0不用。 下图是 Advia1650的设置参数，R2加入点为49点 Calculation method set匸：Lnr Variance 10*0 参考材料 Calculacicn method netting Variance 10 * 0 * Prozone Ptrozone Prozone forrn Propone formula w Prozone form. Prosone limit Pcosone Pcozone judge Louer 1imit Prezone Judge limit |88 S-£>ET.P.p | [90 S-DET| ^53 IHA setting IHA setting Prozone toizmula 'lUTllt judge 图34前带监测的设置举例-Advia1650M-DET* F . in H —DET. Pm W-DET+P.p -'H—DET* P ・ n H-DET.P+n S-DET.P.r 参考材料 而在速率法中，前带的现象也会导致结果偏低 p r ozone React inn R a te M eih o d 图35速率法前带现象图示1 上图中曲线A是高浓度校准品，曲线B是同值的高浓度样本。校准品由于经过 处理，所以不会存在前带反应，而样本则不然，几乎无法避免。参考材料 2024年3月8日发(作者：辛杉) Sieme ns Advia 系列生化仪参数详解 本详解主要针对的是市场上常见的四种西门子机型 ：ADVIA1200/1650/1800/2400 。大致 分为五个章节：简介、基本参数介绍、读点前移、前带监测、参数设置。 一、简介: ADVIA1650是最早进入中国的拜耳生化仪 ，虽然师出日本，也是日本电子制造，但还是能 看出拜耳的设计理念在里面。后来拜耳被西门子收购，ADVIA生化也保留了下来。 ADVIA系列生化仪都是将 ISE作为标配安装，ADVIA1200生化速度是800测试每小时， 1200测试每小时， ISE400测试每小时；ADVIA1650 和升级版1800的生化速度都是 ADVIA2400的生化速度是1800测试每小时。 Advia系列的操作控制软件都大同小异 ，几乎没有什么本质上的变化 ，所以延续性较强。 加上西门子特有的流水线兼容性 ，使ADVIA系列的生命力变得异常顽强 ，在国内流水线市 场里占据相当大的份额。 在ADVIA老版本的程序中，是支持四种试剂的，也就是R1、R2、R3和R4;但在后续版本 中，四种试剂变为2种，只有R1和R2，这一点厂家并没有说明为什么 。 所有的Advia系列，都是两个试剂盘，两个试剂针，反应盘是单盘，塑料反应杯，一根样 本针。除ADVIA1200夕卜，都有一个稀释盘和稀释样本针 ，稀释样本针将原始样本加入到稀 释样本盘中，按照最高可达1:75的比例进行样本稀释，然后通过样本针将稀释后的样本转 移到反应盘中。同参考材料 样，在反应盘上也可以进行最高 1:75的样本稀释，这样二者相乘，样本 的稀释比例高达1:5625。稀释样本盘也是塑料杯，有自己单独的搅拌器、冲洗站。 ADVIA的试剂也可以进行稀释，所以节省试剂。但由于设计理念的关系，其孵育介质有孵 育油，也就是油浴。3M生产的孵育油价格较贵 外，反应杯空白比色也需要单独的活化剂 ADVIA的耗材较多，而且总成本也不少。 ，而且需要半年更换。除常规的清洗剂 ，加上稀释样本或试剂用的生理盐水 ，总体下来 所有的ADVIA系列都是R1+S+R2方式。反应时间可选择：3分钟、4分钟、5分钟、10 分钟、15分钟、长程反应21分钟和31分钟。 ADVIA1200没有稀释样本盘，所以样本直接被转移到反应杯上 13.5秒，R1+S后读第一点，10分钟反应读点42个，R2在19点前加入。 。加样速度4.5秒，读点 反应杯总数231个，反应体积为80-430ul，R1和R2加入体积范围在 5-300ul之间。反应 时间可选择：3分钟（最后读点14 ）、4分钟（最后读点18 ）、5分钟（最后读点21 ）、 10分钟（最后读点42 ）、15分钟（最后读点63 ）、长程反应21分钟和31分钟。 ADVIA1650和1800加样速度为3秒，读点时间是6秒，R1+S后读第一点，10分钟反应 读点98个，R2在49点前加入。参考材料 ADVIA2400加样速度为2秒，读点时间是14秒, R1+S后读第一点， 10分钟反应读点41 反应杯总数221个，反应体积为80-300ul , R1和R2加入体积范围在15-150ul之间。 反应杯总数340个，反应体积为60-180ul，R1和 个，R2在22点前加入。 R2加入体积范围在 10-100UI 之间。 二、基本参数介绍： 主读点：/n 也就是Main Detect point的简写，m和n是主读点区的起止点 ， 0 设置（填写0就是不设置），双试剂中是指R2加入之后的一组时间点，据此计算吸光度速 率或平均值用于浓度计算； 子读点：/r。也就是subsidiary Detectpoint 的简写，p和r是子读点区的起止点 ， 0 和样本空白，在双试剂中是指 R2加入前的一组时间点。 ，一般指启动反应之前的试剂 参考材料 读点：N ,在终点法反应中，读点不小于三个，如果小于三个，系统自动前移满足三个 在速率法当中，读点不能少于六个，如果小于六个，系统自动前移满足六个 。 根据反应方法，子读点可以选择也可以不选择 。 u/d和U/D旗标：U和u表示上限，D和d表示下限，当超过小写u/d范围时，用大写U/D 显示。 空白：Biank （u/d U/D），这里指的是试剂空白的上下限 。就是以去离子水为样本的检 ，当试剂的空白吸 。试剂空白 测，主要用来监测试剂性能，是以主读点区主波长的吸光度值为基准的 光度超过u/d上下限范围，就会用U/D显示出来，提醒操作人员注意试剂问题 是可以选择是否进行监测的 。 Biank u/d的定义是，在下降速率当中，Biank u也就是空白上限为 点吸光度的 2ABS，Biankd为主读 50% ；在上升速率当中，Biank u也就是空白上限为最高主读点吸光度的 150%，Biank d为主读点吸光度的 50%。参考材料 Water Sample (Reagent Baseline) 1.8 100 Blank (u) Threshold 16 1.4 图 1 Bia nk u/U/d/D 示意图 M DET Pm M DET P n 1.2 修正点：E2。E2表示试剂和样本加入后的几个点的吸光度值 ，用来进行LIH （乳糜、黄疸、溶血等标本）或底物耗尽的监测。E2都将监测试剂空白以及样 本加试剂08 Sample + R1 Abs(E2) 的结果，也就是说E2=样本+R1的E2吸光度减去试剂空白的E2吸 光度。8/ank (d) Th^shoid 04 06 0 "T" 40 Read Point 60 读点前移： 物，而底物80 0 Point-Forwarding。在速率法中，高浓度样本往往很快消耗完反应却大量存在，速率反应很快停止。当系统监测到这种情况时，会自 动将主读点前移至发生速率反应的区域。 在使用读点前移的技术时，需要增加一个主读点.P I, l n主读点被监测到发生底物耗尽，那么自动前移读取l和m之间的读点。参考材料 图2读点前移示意图 PoEnt For^varding 图2所示中，m和n点之间出现底物耗尽现象，由于设置了 I点，所以自动将读 点移至I和m之间读取。同样，I和m以及m和n之间要多于6个读点。 如果判断底物耗尽，就要借助样本吸光度限制这个概念。 样本吸光度限制：Sampleu/d。Sample u或d只能选择一个，这是根据反应方 向的不同而设定的，下降速率反应将只有 Sample d，上升速率反应将只有 参考材料 Sample u。其要求监测R2加入之前和之后的数个读点的吸光度值，依然是主波 长的吸光度值。R2加入之前的监测点就是我们前面说的 E2, R2加入之后的监 测点是主读点区的最后两个点，叫做选择点。E2和选择点进行计算： Sample u/d=选择点的吸光度-(E2*K) 其中：E2=样本和R1的E2点吸光度值-试剂空白的E2点吸光度值 K= (R1+S) / ( R1+S+R2 )是体积系数。 当E2用于底物耗尽探测时，读点自动选取第7点，这样会避开LIH因素干扰。 判断依据，在下降速率反应中，当Sampled大于选择点吸光度时，认为是底物 耗尽；在上升速率反应中，当Sample u小于选择点吸光度时，认为是底物耗 尽。参考材料 Sample > Assay Range < 2 1.8 1.6 14 1,2 5 1 SampJe (u) Threshold Point Forwerding E2 corrected Sample (d) Threshold 0.8 0.6 0.4 P m M D ET P 0. 0 20 40 0 60 Read Point 80 1002 图3底物耗尽示意图 图3的所示中,Sample d大于主读点区m和n最后两点的吸光度值,所以判 断为底物耗尽，自动将读点前移到I和m点。 这里有一个问题，如果m点也处于底物耗尽的区域怎么办？前移的结果也会不 准确。所以ADVIA的读点前移技术并不是那么可靠，为了保证可靠，其采用了 非常复杂的计算方式，目的只有一个，规避东芝的弹性速率法。 这里简单的介绍一下弹性速率法。其原理是监测速率反应的主读点区，并根据 设置的吸光度差值进行没两个相邻读点的吸光度差 ，当实际读取的吸光度差值 小于参考材料 设定的吸光度差值时，就会判断为底物耗尽。而底物耗尽判断后自动将读 点前移至预先设置的两个点的区域，这样可以充分避开ADVIA中的如果m点也 在底物耗尽区域的可能。 读点前移不在这里做详细介绍，后面有单独的章节 反应方法：有五个选择，EPA RRA、2PA、CRA和IMA ； EPA反应方法：就是常说的终点法，可以是一点终点法，也可以是两点终点 法。一点终点法时，子读点p和r无效，填为0 ；两点终点法时，子读点p和r 要填写，而且要在R2加入之前。终点法读点要求至少三个点，不足三个点时， 系统自动前移补足。 DFT-P point Main Main detection start point 图4 EPA终点法示意图参考材料 RRA反应方法：也就是常说的速率法，可以是单速率法，也可以是双速率法。 采用单速率法时，读取主读点区的m和n的区域进行每分钟速率计算。采用双 速率法时，还要读取R2加入之前的子读点区p和r的区域进行每分钟速率计 算,然后主读点和子读点相减再进行浓度计算 。使用速率法时，系统将自动进 行E2吸光度计算。但在参数设置，可以选择是否选择E2 corre，也就是是否选 择E2修正。用DO或Not Do选择。 在速率法当中，Biank u/d必须输入，并且可以选择在R2加入前一点插入检查 点CHECK ,此检查点将于试剂空白数据进行比较，借以判断试剂是否有问 题。但此法仅在下降速率法和IMA方法中使用。如果不使用，则填写0。 当然，在速率法当中，也可以选择底物耗尽监测而增加的主读点 。 丄 D£T.P Fl 问 DET.P 1 StRf ChwkOPI—Tim# 参考材料 图5 RRA速率法示意图 2PA反应方法：也就是常说的两点速率法。也是速率法的变种，区别在于不进 行主读点间DET.P OwckD Pl —Time 的两个点的线性监测。其余与速率法完全一样。 图6 2PA两点法示意图 S+R1 CRA反应方法：官方说法为随着时间的变化反应接近恒定，曲线由最小二乘法 拟合，也有R2 〜R4 称为固定点法。大致意思是选择读点区的两个点进行吸光度值得最 小二乘法计算。是根据时间和吸光度的数值进行计算的 ，无论是速率法还是终 点法均可米用。Mam OETP 参考材料 当子读点被采用时,p=r丸）,或p丸）,r=0时，是速率法，速率计算是根据两 点间曲线的正切线；当p 说实话，真不知道这个方法是做什么项目的 ，中文没有解释，英文的解释很 少，也没发现实例。 图7 CRP固定点法示意图 IMA反应方法：也就是免疫比浊法。是采用最小二乘法计算的速率法。对于R1 参考材料 的加入量太少，无法进行E2计算时，这个方法就变得有用了参考材料 也就是说，在很多免疫比浊项目里，R1的加入量往往小于 R2的量，所以引发 了一系列的计算和判别上的困难，IMA就是为了解决这个难题的。 样本和第一试剂加入量太少，就无法进行E2的计算，没有E2就无法进行前带 监测和底物耗尽的监测，所以在IMA方法中R2之后插入监测点Check D.P.I,用 于弥补R1和S的不足。 采用IMA方法设置检查点后 ，系统自动计算 limit values值（设备默认 ------ DET.P Check O P」Main O£T,P —Time 0.003），此法对浑浊样本的处理很有成效，所以用在免疫比浊项目上。 图8 IMA免疫比浊法示意图Sub DET.P 参考材料 Reaction data Reaction process data l0r a cloudy sample 图9 IMA应用示意图 IMA的其它使用方法与速率法一样，仅限于R1+S低于反应杯最小容量的测试 项目里。如果不存在这样的项目，那么即便是免疫比浊项目，也应该采用常规 速率法或终点法。 定标方法：因数定标、线性定标和非线性定标； 在参数界面里的Calc mthd，也就是计算方式里，有ABS和STD/MSTD选择， 表示吸光度和单点定标/多点定标计算。在ADVIA的所有机型里，定标中的零浓 度点用试剂空白替代，所以在定标之前要做试剂空白，如果不做试剂空白，仪 器会认为试剂空白就是原点。注意这个差别，与奥林巴斯的不同。奥林巴斯的 试剂空白和零浓度校准点是两个概念，而在adiva里合二为一 参考材料 参数界面里的Formula，也就是公式才是选择定标方法的地方。 因数定标：如果在Calc mthd里选择ABS,那就意味着你要采用因数定标，那 么在Formula里只有一个可以选择，那就是Lin ear,因数定标只能用于线性定 标。 因数定标也就是直线方程里的 Y=KX+B中的K，所以也叫K值定标法。而B的 确定则需要试剂空白，所以因数定标法必须做试剂空白，然后结合给出的K值 进行定标曲线的绘制，然后依据这个曲线进行浓度计算。在Advia中，K值的给 出是在参数界面的 Standards setting 中的FV中。 线性定标：线性定标需要两个点才能决定一条直线 ，我们一般给出一个零浓度 点，一个带有浓度的标准点，这样仪器就会自动进行计算。而Advia中零浓度 点在试剂空白里给出了 ，所以对于两点线性定标来说，只需要在给出一个校准 点就可以了。所以在Advia的手册里，线性定标叫做一点线性。而且Advia的所 有校准点，无论是线性还是非线性，零浓度点都不计算在内，只数带有浓度的 校准点，比如5点定标，加上零浓度点其实就是6点；而6点定标，加上零浓 度点就是7点。 不过，要指出的是，Advia的试剂空白并不是强制性的，这一点与奥林巴斯不 同。不进行试剂空白检查的项目，默认试剂空白也就是零浓度点的值是通过原 点的 下面给出两张图，一张做过试剂空白的线性定标，一张是没有做过试剂空白的 线性定标。 参考材料 图10没有做试剂空白的线性定标 由于假设所有没有做过试剂空白的线性定标的零浓度点都通过原点 ，所以图中 的蓝线则是默认的校准曲线，但实际上并非如此。如果提前没有做试剂空白， 仪器也会自动做上，这样就会出现两个点，图中的两个红点就是。左下角是零 浓度点，右上角是标准店。但蓝色的定标曲线却是右上角的红点和原点的连 接，而不是与零浓度点连接。这样的结果我们都知道会有错误，因为真正计算 的是按照蓝色直线计算，而红色的我自己画上去的示意线条才是真正的计算直 线。 要解决这个问题，只有重测试剂空白重新执行定标才行 参考材料 下图是做过试剂空白的线性定标图例 图11做过试剂空白的线性定标示意图 而在statistical Data里的FV就不是因数了，而是定标点的浓度。上面两张图很参考材料 清楚的告诉我们，一点线性定标，有一个Biank试剂空白，FV为0.00,而STD 值只有一个，就是标准点的值。 Cx: Reaction ABS: FV: STD: Concentrat ion of a measure me nt sample or unit (hereinaftcF> concentration) Reaction absorbance of a measurement sampk Concentration of the standard stored in the calibration monitor Calibration curve Concentration 图12 Advia —点线性定标示意图 在线性定标中也有多点定标，例如同工酶法。在Advia中，线性多点定标多是 用来拟合一元三（二）次直线方程。对此有三种方法，由于很少使用，所以仅 仅图示，不做解释。 Operation ABS = axCx5-hbxCx2+cxCx4*d Operation /BS: Operation ^hwrbartec ot a measuremcni sample Cx： 靳 lx G d: Concenlralion of a measurement sample CoefficienJs obTained automatie^lly hy curve approximal ion in cali bmtion 参考材料 图13无变换一元三次直线方程定标参考材料 f(Cx｝二 log(Cx/FVi + 71 + (Cx/FVi)1) OperationABS=axf(Cx)' +bxf(Cxy +cxf(Cx)+d f(Cx): FVi: OpenUion ABS: a, b, d: Concentration axis conversion value 2nd concentration of the standard sample OpersUton absorbance of the measurement sample Ccwfficienis auiomaiicaliy obtained by curve approxirnaiion in cali-bration. Operation ABS Calibration curve STDS STD5 Operation ABS STD3 STD2 STD1 BLK Concentration 图14对数线性变换的一元三次线性方程定标参考材料 f(Cx) = log(Cx/FVi + 71 + (Cx/FVi)1) g(operation ABS) - tog(opcration ABS/Ai + /1 + (operation ABS/Ai)1) gfoperation ABS) = a x f(Cx)? + bx f(Cx)J +cx f(Cx) + d fifCx): Conccniration jxis conversion value 隹(optration ABS): Optraliort-^bwTbnrwv uxts vonver>inci *扣ue Cx： FVi: Operation ABS: Ai: Concent rut ion uf the msMjrtnxnt sutnpk 2nd from lhe lowest of lhe contcnlralions Opcraiinn ab$t>rban^e of the measure me nt sampk Opcrnlion ABS uf 2nd from [he In west of iht： slundurd- samp 畑 cDTKJcntrjlioiib Ctwfficienls auiomatic^lly ohtnincd by curve approxianutLon in calibralton. aF k G <1； Calibration cttfva Conceritratk>n 图15对数变换的一元三次线性方程定标 同时,Advia还提供一元二次线性方程定标。 非线性定标：Advia的非线性定标有 Logit-Log1、Logit-Log2、Logit-Log3 和 Spline样条曲线、line graph折线五种。参考材料 Operation ABS = -------------- +d 1 + (Cx/b) Operation ABS: Operation absxnbanve of the measurement ^nipk Cx; a. b* d: Conctniratinn of the measufEmEni sample Ctxjfficienix autom^ticaliy obtained by curve approximation in cali- bratitm. 图16 Logit-Log1非线性定标示意图参考材料 Operation ABS = 1 + (Cx/b) Operalion absorbance of the measurement sample： Concentration of the measurement sample Cocfficienls automatically obtained by curve approximation in calibration. Operation ABS: Cx: b, G d: 图17 Logit-Log2非线性定标示意图参考材料 Operation ABS = ------------ ——―~—— 1 + (Cx/b) v x exp(e x Cx) 图 18 Logit-Log3 非线性定标示意图 Operatton AilS: Cx: 恥 lx c. d, c: Opefation absorbance of the measuremeflt sample Concentration of the measurement sample Gx^fficienis automiilically obtained by curve upprvximalien in calibration. 参考材料 Operation ABS = ai x Cx + di Operation ABS; Operation kibMirhuiKe of the medsuremeni sample Cortceniralion of the mtasurement Simple Coefficients obtained □utofnatknlJy in cath scttipni (i - 1 to 6) of calibration Cx: a： 图19 line graph折线非定标曲线示意图参考材料 Operation ABS: Cx: a,, bj、Cj* a： Operation ABS = 3i x CxJ -t- b* x Cx* + ct x Cx + d* Ope ration absorbance of the measuremenl simple Coriccntrahon of the measurement sample Cotfficicnu obtained automittcally in each section (i = I io 6) of calibration 图20 Spline样条非定标曲线示意图 在多点定标中，由于试剂随着使用时间的推移性能会发生改变 ，其中包括颜色 的改变。所以每天开机画面中会提供简单定标 (Simplified calibration )这个选 项，原理是根据前后试剂空白修正整条定标曲线 。参考材料 STD-BI,K U2 ------------------- HFV)-MBLK UHBLK-U2XMBLK The opt ration Al IS is correcud hy the following alter UI and U2 ^rc obhirtud Openitton ABS - U2 x f(x) + VI Opcraiiun ABS: Opcraliun ub^>rbaiKC n( the riK^Mircmcnl sample Cx: VI' (.'{incrfinatiun the mea^Li^dicTil sampbe Kv^gent t^hnk fcr ccrrc^tion Pn^portiunaJ oinipontnt of currtctKin Cnncentration of lhe simplified catibminn umpk Measured tzakLilalicn absorbance of the standard sample used by simplified c#|ibraliu«j J reagent bhnk ^ifut used by th< simpEifred atlihwiidn Orcrrtlion atwnrtmnce vatue calculated by approxinulion 訓 ori^injl MBLK: ^mccnlrjtkm FV Original reagent bl&nk V2 FV： STD: HLK： 图21 Simplified calibration 简单定标示意图 参考材料 在图11中，左侧是定标细则的选项,其中，表示计算方法,有ABS （因数法）、1-Point （1点定标）和Multi-Point（多点定标）三个选项； 在Axis Conv.轴线变换中,有No Conv.（不变换）、Log.-Linear （对数线性） 和Log.-Log.（对数）三种选择； 在 Multipoi nt Formula （多点公式）中，有 Lin ear （线性定标）、quadratic （一元二次直线方程定标）、Cubic （一元三次直线方程定标）、Spline （样条 曲线）、Line Graph （折线）、Logit-Log1、Logit-Log2 和 Logit-Log3 等 8 种 方式； 在# cal Stds里，要填写包括试剂空白在内的校准点数量。 参考材料 图22多点非线性定标示意图 从图中我们看到，四个校准品的数值成梯度倍比关系，但无法做出满意的样条 曲线，是否 韓 u g b*. fcixairT C4-I 让.T * s, 需要改为对数曲线还需要观察。 图23原厂试剂多点非线性定标示意图 这是原厂的IgM定标曲线，没有做试剂空白。定标浓度并非梯度倍比稀释，但 只有这样才能保证Logit-Log3曲线的完美。好像国外很少使用样条曲线定标。 而这个项目恰恰是样条A L l-L 曲线。如果用最高浓度倍比梯度稀释，就会得到一幅漂 亮的样条曲线。 、读点前移： SL-K<3«^ 参考材料 前面说过，Advia的读点前移技术是为了应对底物耗尽的速率反应 ，采用样本 吸光度限制Sample u/d和试剂空白限制Biank u/d来进行计算和判断。要知道 是，底物耗尽有时并不是因为样本的浓度或活性太高导致的 ，试剂污染或失效 也有可能。所以读点前移技术和底物耗尽判断，从另一个方面讲，也是对试剂 性能的一个监测。 由于底物耗尽仅仅存在于速率法的反应当中，所以这里描述的均为速率法。 下面两张图就是超过Sample u/d限制后的底物耗尽图例：参考材料 hver^B or bidFsct Reaction 图24间接或相反反应超过Sample d限制的底物耗尽反应图示 hcrpasing of Oect Rsocbor 图25直接反应超过Sample u限制的底物耗尽反应图示参考材料 注意图25中27点出现的拐点，这已经是不明显的底物耗尽的表现 样本吸光度限制和试剂空白的配合使用，加上检查点checkD.P.I的介入，可以很 容易的判断试剂性能。 下图是极端情况下的试剂空白限制的图例 RBOqf'Jir BtnJi fypr 2 ! 75 - > Blank u 申 ..................................... ...... 5 0 75 * 05’ 0 25] 0 <0 25 -Q §■ 0 参考材料 ▼ Blank d 20 40 « Tme Cours# of RBOCDOI 90 100 图26试剂空白图例 通过试剂空白计算出来的Biank u/d值与样本测试时主读点区主波长吸光度值进 行比较，如果超出这个范围将会用 U/D来标示结果，以提示操作人员该结果不 可靠。 检查点check 的选择一般在R2也就是启动反应物加入之前或之后的一个 点，而E2的吸光度计算点则选择在6、7、8这三个读点上。注意这仅仅是用来 监测底物耗尽的，如果用E2来监测LIH样本，则读点应该在2、3、4、5这些 地方。 在直接反应中，也就是单试剂项目里： 当check D.P.I的主波长吸光度值大于 Blank u的值时，结果用u标示； 当check D.P.I的主波长吸光度值小于 Blank d的值时，结果用D标示； 在间接反应中，也就是双试剂项目里： 当check D.P.I的主波长吸光度值大于 Blank u的值时，结果用U标示；参考材料 当check D.P.I的主波长吸光度值小于 Biank d的值时，结果用d标示; 这就是结果里U/u/D/d ”这四种旗标的来历 F面举例说明读点前移技术的使用： Blank（⑴ and Blank {ci} Checks 0.2 0 0 W 20 30 40 50 Reed Ftoint 60 70 80 90 100 图27读点前移举例1 图27中的三个曲线：红色是试剂空白，蓝色是正常样本曲线，绿色是异常样本 曲线。 图中有两天竖线，一个E2, —个是check ,那么根据图示可以得到以下数 据： 参考材料 E2吸光度值 试剂空白修正E2（E2-试剂空白） 0.10 0.50 0.60 - 0.40 0.50 E2是要计算修正系数的，而修正系数=（R1+S）/ 试剂空白 正常样本 异常样本 那么经过体积修正过的 （R1+S+R2）。 这里假设R1是80，S是16，R2也是16，这样修正系数就是0.875。 那么经过体积修正过的正常样本 E2就是0.343，异常样本E2就是0.429。 同时我们也知道，Check 在R2之后，其正常样本为0.55，异常样本为 1.00。 那么体积修正过的 0.571 0Check -E2的值是：正常样本是 0.207,异常样本是 根据试剂空白的原则，Biank u应该是0.40，Biank d应该是0.05。 那么我们用Check 和E2的差值与Biank u值的0.40进行比较，正常样本参考材料 的差值0.207小于Biank u值的0.40,而异常样本的差值0.571大于Biank u值 2 8 的0.40,又是间接反应,所以结果报告U。 0 W 20 30 40 50 Read Rsirtt 60 70 SO 90 1 DO Blank (u) and Blank (d) Checks 2 Check D P I 图28读点前移举例2 ■» Reagent Blank T— Abnormal sariple 1 图28的例子里，红色为试剂空白，绿色为异常标本2，蓝色为异常标本1。很 明显，异常标本1是典型的底物耗尽反应，而异常标本2貌似没有问题，但R2 加入之前就过高了 。 E2吸光度值 冷—Abnormal 5^irpl« 2 试剂空白修正E2（E2-试剂空白） -0.0041 - 2.6119 2.6160 试剂空白 正常样本 参考材料 异常样本 1.7154 1.7195 经过体积修正后的E2分别是：异常样本1为2.242 ,异常样本2为1.474 ; Check D.P.I值为：异常样本1为2.4665 ,异常样本2为1.4670 ; E2和Check D.P.I的差值为：异常样本为0.224,异常样本2为-0.007 ; Biank u 值设为 0.20 , Biank d 值设置为 0.01。 异常样本1的差值0.224大于Biank u的0.20，又是间接反应，所以结果报告 U; 异常样本2的差值-0.007，小于Biank d的0.01，又是间接反应，所以结果报告 d。 这是两个利用试剂空白限制和 E2以及Check 检查点进行底物耗尽判断的例 子。在这两个例子中，试剂空白放的很宽，并不是严格按照150%和50%最高 最低计算公式计算的，但即便是这样，例子中还是判断为底物耗尽。 而在参数设置里，Biank u/d往往被设置成±9.9999，这也就意味着不进行底物 耗尽判断和试剂空白判断，那么Check D.P.I和的设置也就变得毫无意 义了。参考材料 样本吸光度限制Sample u/d在底物耗尽中的用途呢？其与试剂空白Biank u/d 可以同时，也可以单独使用，监测底物耗尽依然有一定的作用 ixf电吕和塚 or Direct Ruction 参考材料 图29样本吸光度限制Sample u/d在底物耗尽判断中的示意图参考材料 图29的上图是选择点吸光度值大于 Sample u ,下图是选择点吸光度值小于 Sampled ,所以都被判断为底物耗尽。下面举例说明计算方法： 图30 Sample u/d判断底物耗尽的例子 图中红色为试剂空白，蓝色为异常样本。试剂空白的E2为-0.004，样本的E2为 0.6127 ； 参考材料 Sample u/d=1.25-[0.6127- (-0.004)]*{[16(S)+80(R1)]/[16(S)+80(R1)+16(R2)]}=0.7215 0.250，远远小于Sample d的0.7215 （图中放宽到 0.750），所以判定为底物耗尽。（下降反应是Sample d，上升反应是Sample u ）。 ； 经过修正后的曲线就是蓝色虚线部分 ，那么主读点区的最后两个点的吸光度也 就是选择点的吸光度值只有判断底物耗尽后，就需要读点前移。而采用读点前移，还需要一个读 点。 Point Forwarding leading to Reanalysts 图31读点前移的各种可能图示 在这个图示中，主读点和之间出现底物耗尽现象，读点前 移就是读取和之间的吸光度速率。图中给出的 正好在拐点上，这种可能性太小了 。红色箭头才是更多的 可能性之 参考材料 。 当然最理想的状况是左侧的红色箭头 移也毫无意义。 ，如果是右侧的红色箭头，即便是读点前 由此可知，Advia的读点前移技术相当的复杂，并不是那么容易掌握，而且在 前移点的选择上也很令人抓狂，远不如东芝的弹性速率法简单。不过，利用这 种技术不仅可以判断试剂问题，也可以判断反应过程中的问题，还是很有帮助 的。 我们要清醒的知道，利用读点前移技术，必须进行试剂空白检测，并且计算出 Blank u/d 和Sample u/d，还要知道检查点 的设置，否则无法使用这一技术。 Check 的设置和前移点 四、前带监测：参考材料 Prozone前带监测功能是几乎所有生化仪都拥有的,Advia系列也不例外。更何 况Advia强调免疫比浊功能，所以前带监测的设置与IMA的设置在一起，同在 参数界面的一个区域里。 图32前带监测界面示意图 前带现象可能会导致实际结果偏低，这与底物耗尽类似，但在曲线上，而且截 然不同。 在前带监测选择里，前带计算公式可以选择前带公式 （用于终点法项目），也 可以选择速率公式（用于速率法项目）。无论选择什么公式，Prozone Limit前 带范围都要输入，这也是前带发生反应的实际吸光度值，超过这个值就会判定 是前带反应。 Prozo ne judge是前带的反应方向，这个方向决定是高于还是低于 ProzoneLimit值，来判断前带现象。 参考材料 如果选择速率公式，那么必须输入judge limit的值，这个值低于前带子读点的 吸光度值，将不进行前带检查。 /n和/r则为用于前带检查的主读点和子读点，这与常规参数 里的不同，也就是参数设置里的 Calculations method setting 和..p/r完全不同。而且只有选择了前带监测才有效。 下面举例如何使用前带监测：参考材料 里的/n Prozone Formula Method 0 90000 a eoooo 0 70000 o eooao 0 50000 0 4D0DD 0 30000 0 20QDQ 0 WOOD Prozone sub-DET.P 图33前带监测举例 图中的实线是正常样本，虚线是前带样本。 实线 A的主读点中间值为 51 .P m 88 -n 90= 0.750 ,子读点中间值为 - r 53 = 0.400 。主读点与子读点的吸光度差为 0.350。把这个数 值作为 Prozone Limit 值。 虚线B的主读点中间值为 88 -n 90 = 0.726 ,子读点中间值为 .P p 51 - r 53 = 0.667。主读点与子读点的吸光度差为 0.049。 Prozone judge设置为向下范围，0.049小于0.350,所以发生前带现象，因此参考材料 结果带有p标示，提醒操作人员注意。 如果是低浓度反应，可以讲前带主读点设置在启动反应之后的几个点 ，而子读 点可以设为0不用。 下图是 Advia1650的设置参数，R2加入点为49点 Calculation method set匸：Lnr Variance 10*0 参考材料 Calculacicn method netting Variance 10 * 0 * Prozone Ptrozone Prozone forrn Propone formula w Prozone form. Prosone limit Pcosone Pcozone judge Louer 1imit Prezone Judge limit |88 S-£>ET.P.p | [90 S-DET| ^53 IHA setting IHA setting Prozone toizmula 'lUTllt judge 图34前带监测的设置举例-Advia1650M-DET* F . in H —DET. Pm W-DET+P.p -'H—DET* P ・ n H-DET.P+n S-DET.P.r 参考材料 而在速率法中，前带的现象也会导致结果偏低 p r ozone React inn R a te M eih o d 图35速率法前带现象图示1 上图中曲线A是高浓度校准品，曲线B是同值的高浓度样本。校准品由于经过 处理，所以不会存在前带反应，而样本则不然，几乎无法避免。参考材料