2024年3月15日发(作者:厚春柏)
食品加工
FOOD PROCESSING
黄芪/淫羊藿多糖微针制备
及免疫效果分析
张学柏 兰州理工大学生命科学与工程学院,兰州 730050
作者简介:张学柏(1995-),男,硕士,主要研究方向为中药多糖复合材料的制备。
以黄芪/淫羊藿和聚乙烯吡咯烷酮为原料,蔗糖为辅料,使用真空法制备黄芪/聚乙烯吡
摘要:
咯烷酮和淫羊藿/聚乙烯吡咯烷酮微针,显微镜下观察微针的形态,通过拉力机测定其机械性能,
测定体外溶解时间,分析其免疫效果和安全性。结果表明,微针具有一定的力学性能和生物相容
性,在大鼠体内产生了免疫应答,并且细胞毒性结果表明无毒性,说明中药多糖作为佐剂用于微
针疫苗具有一定的开发潜力。
关键词:
黄芪,淫羊藿,聚乙烯吡咯烷酮,微针,疫苗
微针作为一种新型的经皮免疫技术,具有高
效、无痛、安全的特点,能打破角质层对药物的
阻滞作用,提高递送效率,可用于疫苗递送
[1-2]
。微
针可分为固体微针、涂布微针、中空微针和可溶
性微针。其中可溶性微针的制备材料具有生物相
容性的优点,当可溶性微针刺入皮肤后针体可以
溶解在组织中也不会给皮肤增加负担。可溶性微
针也存在力学性能较差等问题
[3]
空间,采用适当的干燥条件干燥使其慢慢固化,脱
模即成
[4]
。
研究采用真空法制备聚乙烯吡咯烷酮(PVP)/
黄芪多糖微针和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)/淫羊藿
多糖微针,通过对其成型性、机械强度和免疫效
果进行分析,以期制备出以中药多糖为主要材料
的微针。
。目前,可溶性
微针的制备方法有两种,一种方法是将基质溶化
与所需药物一起倒入模具中,将模具置于真空条
件下,在一定温度下持续一定时间,干燥后即可
得到载药的可降解微针,另一种方法是将药物和
基质加入溶剂中,蒸发除去部分溶剂后,浇入模
具中,高速离心,使药物和基质充分填满模具的
黄芪/淫羊藿,甘肃兰州黄河中药材市场;聚
乙烯吡咯烷酮(分析纯),合肥巴斯夫生物科技
1试验与方法
1.1试剂与仪器
98
2021/04
中国食品工业
有限公司;蔗糖(分析纯),沈阳市新化试剂
厂;吉林五星宠安士佳4联疫苗,飘扬猫咪宠物
医院;Vero细胞,赛默飞世尔科技有限公司;所
有其他化学品均为分析级,无需进一步纯化。SD
大鼠,雄性,180 g-220 g,SPF级,购自兰州大
学实验动物中心
恒温水浴锅(B-220型),上海亚荣生化仪
器厂;磁力搅拌器(ZF-7),江苏省金坛市医疗
仪器厂;光学显微镜(XSP-3CB),上海光学仪
器一厂;体式显微镜(Stemi305),北京普瑞赛
司仪器有限公司;真空干燥箱(DZF-6020),上
海一恒科学仪器有限公司;拉力机(SMT-
5000),扬州市赛思检测设备有限公司;冷冻干
燥机(FD-1A-50),北京博医康实验仪器有限公
司;酶标分析仪(DNM9206A),北京普朗新技
术有限公司。
1.2黄芪多糖/淫羊藿多糖的提取
分别称取处理的黄芪根茎和淫羊藿茎叶置于
烧杯中,在烧杯中加入80%乙醇(料液比1:10),80
℃条件下,水浴加热脱脂三次,每次3h。用四
层医用纱布将醇提液过滤掉,留下药渣,将脱脂
后的药渣放入恒温干燥箱中干燥。干燥好的药渣
继续加入圆底烧杯中,并添加蒸馏水(料液比为
1:10),在80℃下水浴提取三次,每次3h
[5]
。三
次的提取液合并在4000 r/min转速下离心10
min,除去底部沉淀后,将上清液继续合并在一
起,用旋转蒸发仪进行浓缩至一定体积,将浓缩
液放置室温,用Sevage法除蛋白,蛋白除完全后,将
浓缩液置于透析袋中进行透析,时间为3d,每
24h更换一次去离子水,透析结束后将提前冷冻好
的溶液放入冷冻干燥箱中冷冻干燥48h,最终得到
初步纯化的淫羊藿和黄芪多糖。
1.3黄芪/淫羊藿多糖微针的制备及形态观察
分别配置2%的黄芪/淫羊藿多糖溶液,25%
PVP溶液,分别以黄芪/淫羊藿多糖溶液与PVP
溶液体积比为1:1制备成混合溶液,并在混合溶液
中添加0.15 g蔗糖。使用真空法,在室温干燥的
条件下制备黄芪/淫羊藿多糖微针,然后将黄芪
多糖制备的可溶性微针命名为HQ-1,淫羊藿多
糖制备的命名为YYH-1,使用光学显微镜和体视
显微镜观察微针的形态。
1.4黄芪/淫羊藿多糖微针的机械强度测定
使用拉力机测定微针的机械强度,分别将
HQ-1,YYH-1针尖朝上放在下压头上,设置移
动速度为1 mm/min,测定不同比例下黄芪多糖微
针的最大断裂力度,选出具有最大机械强度的黄
芪多糖微针,拉力机的力与位移会被记录在电脑
上,每个样品测试三次。
1.5黄芪/淫羊藿多糖微针的免疫效果试验
1.5.1负载犬四联疫苗的两种多糖微针的制备
本次购买的疫苗是犬疫苗,需将狗的药用量
换算成大鼠的药用量。因此,采用动物的体表面
积计算法Meeh-Rubner氏公式进行换算
[6]
:
(公式1)
A:体表面积[m
2
];K:常数,K
狗
为11.2,K
大鼠
为9.1;W:体重[g]
称取适量犬四联疫苗粉末分别溶于提前制备
好的两种多糖混合液中混匀。用真空法制备微
针,由于犬四联疫苗的最适温度为2–8℃,因此
用真空法制备好微针后将微针放入4℃硅胶盒中
干燥,干燥结束后取出,即得负载犬四联疫苗的
黄芪/淫羊藿多糖微针,记为QHQ-1和QYH-
1,制备三组。
1.5.2两种多糖微针的免疫效果试验
试验采用SD雄性大鼠作为免疫效果评价的动
物模型。首先,对SD大鼠腹腔注射10%的水合
氯醛溶液(0.3 mL/100 g)进行术前麻醉、固定,并
用苦味酸进行标记。麻醉扎针时应有落空感,回
食品加工
FOOD PROCESSING
CFI
APR. 2021
99
食品加工
FOOD PROCESSING
抽时无尿液或血液
[7]
。给大鼠背部剃毛并用75%
酒精消毒,将制备好的HQ-1、YYH-1、QHQ-
1、QYH-1分别用大拇指按压1min,并用无菌纱
布及弹性绷带包扎,处理结束后将老鼠放入笼中
观察
[8]
。
将犬四联疫苗干粉溶于PBS溶液中,搅拌均
匀,对大鼠皮下注射。其中阳性对照组为皮下注,阴
性对照组为HQ-1,空白对照组为不做任何处理
的健康大鼠。初次免疫时间10d后对大鼠进行眼
眶取血,分离血清,存入-20℃冰箱中。继续重
复初次免疫的操作步骤,进行二次免疫,20d后对
大鼠进行眼眶取血,分离血清,存入-20℃冰箱中。
犬四联疫苗中包含犬瘟、细小、犬副流感、犬
腺病毒四种,本实验选用犬四联疫苗中的犬副流
感作为检测对象来检测大鼠体内的免疫效果。
1.6细胞毒性检测
分别配置淫羊藿多糖溶液,黄芪多糖溶
液,PVP溶液,蔗糖溶液(每种溶液设置低,中,高
三个浓度),分别记为Y-1、Y-2、Y-3、H-
1、H-2、H-3、Z-1、Z-2、Z-3、P-1、P-2、P-3。
非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)的复苏:Vero
细胞活化后,加入DMEM培养基,置于37℃二
氧化碳培养箱中培养
[9]
。本实验采用MTT法检测
细胞毒性
[10]
。
2结果与讨论
2.1微针的形态观察
通过在显微镜下观察制备的两种多糖微针,可
以看到微针成四棱锥型,其中每个微针的针长
为550 µm,针体底部尺寸为250×250 µm,相
邻每两个针的针尖距离为600 µm,每个微针
阵列的针体数目是225个,微针背衬部面积为
9.5×9.5mm。并且微针的形态完整均一,微针的
100
2021/04
中国食品工业
背衬部具有适当的厚度和柔软性。
2.2机械强度分析
通过拉力机来测定微针的机械强度见图1。由
力与位移的受力图可知,制备的微针具有一定的
抗压性能,随着位移的增加,所受的力也呈现上
升趋势,当微针完全破碎时,曲线会出现一个拐
点,该点的力即为微针所能承受的最大压力,随
后曲线呈直线上升。其中HQ-1的最大受力为
768 N, YYH-1能承受的最大压力为676 N,这
表明所制备的微针具有一定的机械强度,可以用
于微针疫苗。
图1 黄芪多糖微针图(a)和淫羊藿多糖微针图(b)的机械强度图
2.3免疫效果评价与分析
通过酶联免疫间接法对微针进行免疫效果的
定性检测,分别是QYH-1组,QHQ-1组,皮
下注射组,HQ-1组,健康大鼠组,试剂盒中的
阳性对照和阴性对照。结果显示HQ-1组与健
康大鼠组两次免疫后测得血清的OD值几乎没有
变化,均小于0.343,PIV-Ab呈阴性。QYH-1
组,QHQ-1组和皮下注射组初次免疫后各有一
组血清的OD值大于0.343,PIV-Ab呈阳性,且
QYH-1组和QHQ-1组测得血清的OD值略高
于皮下注射组血清的OD值。二次免疫后QYH-1
组和QHQ-1组的血清OD值均大于0.343,PIV–
Ab呈阳性,并且OD值明显高于皮下注射组。这
表明QYH-1和QHQ-1使大鼠产生了免疫应
答,并且免疫效果高于皮下注射。黄芪多糖,淫
羊藿多糖具有免疫增强作用,可能起到了佐剂的
功效,这为黄芪多糖和淫羊藿多糖作为佐剂应用
在微针疫苗中提供了可能性。
2.4细胞毒性结果分析
培养72 h后,H-1,H-2,H-3,Y-1,Y-2,Y-
3,Z-1,Z-2,Z-3,P-1,P-2,P-3对应的细胞存活
率分别为100.84±12.94%,69.94±15.87%,76.58
±11.20%,65.9±15.14%,54.66 ±8.77%,217.12
±38.15%,141.72±16.99%,126.7±20.92%,84.4
8 ±20.95%,290.5±42.87%,243.28±39.17%,1
47.32±21.86%,其中H-2,Y-1,Y-2的细胞存
活率在50%~75%的范围内。根据细胞毒性的评
级划分2级,结合细胞形态进行评价后,判为合
格,其余的微针材料溶液根据细胞毒性的评级划
分0级或1级,判为合格。根据黄芪多糖,淫羊
藿多糖,PVP,蔗糖溶液的低、中、高浓度的细
胞毒性测量结果显示,此次制备的黄芪多糖微针
和淫羊藿多糖微针的水溶性材料无细胞毒性。
结语
试验通过真空法成功制备了黄芪多糖微针和
淫羊藿多糖微针,其具有适当的机械强度和生物
相容性,可以在大鼠体内产生免疫应答。目前,市
场上没有黄芪多糖和淫羊藿多糖作为佐剂用于微
针疫苗,研究对中药多糖作为辅料兼佐剂用于微
针疫苗及对微针疫苗的开发具有启发意义。
参考文献
[1] Ye Y, Yu J, Wen D, et al. Polymeric Microneedles
for Transdermal Protein Delivery[J]. Advanced Drug Delivery
Reviews, 2018, 7 (12): 798-801.
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大分子药物的递送[J]. 生物化学与生物物理进展, 2017 (09):
36-47.
[3] 占浩慧, 黄颖聪, 马凤森. 单一或复合高分子材料用
于载药可溶性聚合物微针的制备[J]. 材料导报, 2019, 33 (10):
147-153.
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展[J]. 中国新药杂志, 2013 (2): 177-182.
[5] 闫金鑫. 天花粉多糖/黄芪多糖水凝胶的制备及性能
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[6] 章元沛主编.北京:人民卫生出版社,1996.
[7] 李明辉. 流感病毒可溶性微针疫苗制备及免疫效果研
究[D]. 宁夏医科大学, 2017.
[8] Sudheesh Kumar P T, Lakshmanan V K, Anilkumar T
V, et al. Flexible and Microporous Chitosan Hydrogel/Nano
ZnO Composite Bandages for Wound Dressing: In Vitro and In
Vivo Evaluation[J]. Acs Applied Materials & Interfaces, 2012, 4
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白的脱除[J]. 华西药学杂志, 2009, 24 (2): 155-157.
[10] 施婷婷. 新型血液过滤材料的生物相容性研究[D].
南京师范大学, 2014.
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黄芪/淫羊藿多糖微针制备
及免疫效果分析
张学柏 兰州理工大学生命科学与工程学院,兰州 730050
作者简介:张学柏(1995-),男,硕士,主要研究方向为中药多糖复合材料的制备。
以黄芪/淫羊藿和聚乙烯吡咯烷酮为原料,蔗糖为辅料,使用真空法制备黄芪/聚乙烯吡
摘要:
咯烷酮和淫羊藿/聚乙烯吡咯烷酮微针,显微镜下观察微针的形态,通过拉力机测定其机械性能,
测定体外溶解时间,分析其免疫效果和安全性。结果表明,微针具有一定的力学性能和生物相容
性,在大鼠体内产生了免疫应答,并且细胞毒性结果表明无毒性,说明中药多糖作为佐剂用于微
针疫苗具有一定的开发潜力。
关键词:
黄芪,淫羊藿,聚乙烯吡咯烷酮,微针,疫苗
微针作为一种新型的经皮免疫技术,具有高
效、无痛、安全的特点,能打破角质层对药物的
阻滞作用,提高递送效率,可用于疫苗递送
[1-2]
。微
针可分为固体微针、涂布微针、中空微针和可溶
性微针。其中可溶性微针的制备材料具有生物相
容性的优点,当可溶性微针刺入皮肤后针体可以
溶解在组织中也不会给皮肤增加负担。可溶性微
针也存在力学性能较差等问题
[3]
空间,采用适当的干燥条件干燥使其慢慢固化,脱
模即成
[4]
。
研究采用真空法制备聚乙烯吡咯烷酮(PVP)/
黄芪多糖微针和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)/淫羊藿
多糖微针,通过对其成型性、机械强度和免疫效
果进行分析,以期制备出以中药多糖为主要材料
的微针。
。目前,可溶性
微针的制备方法有两种,一种方法是将基质溶化
与所需药物一起倒入模具中,将模具置于真空条
件下,在一定温度下持续一定时间,干燥后即可
得到载药的可降解微针,另一种方法是将药物和
基质加入溶剂中,蒸发除去部分溶剂后,浇入模
具中,高速离心,使药物和基质充分填满模具的
黄芪/淫羊藿,甘肃兰州黄河中药材市场;聚
乙烯吡咯烷酮(分析纯),合肥巴斯夫生物科技
1试验与方法
1.1试剂与仪器
98
2021/04
中国食品工业
有限公司;蔗糖(分析纯),沈阳市新化试剂
厂;吉林五星宠安士佳4联疫苗,飘扬猫咪宠物
医院;Vero细胞,赛默飞世尔科技有限公司;所
有其他化学品均为分析级,无需进一步纯化。SD
大鼠,雄性,180 g-220 g,SPF级,购自兰州大
学实验动物中心
恒温水浴锅(B-220型),上海亚荣生化仪
器厂;磁力搅拌器(ZF-7),江苏省金坛市医疗
仪器厂;光学显微镜(XSP-3CB),上海光学仪
器一厂;体式显微镜(Stemi305),北京普瑞赛
司仪器有限公司;真空干燥箱(DZF-6020),上
海一恒科学仪器有限公司;拉力机(SMT-
5000),扬州市赛思检测设备有限公司;冷冻干
燥机(FD-1A-50),北京博医康实验仪器有限公
司;酶标分析仪(DNM9206A),北京普朗新技
术有限公司。
1.2黄芪多糖/淫羊藿多糖的提取
分别称取处理的黄芪根茎和淫羊藿茎叶置于
烧杯中,在烧杯中加入80%乙醇(料液比1:10),80
℃条件下,水浴加热脱脂三次,每次3h。用四
层医用纱布将醇提液过滤掉,留下药渣,将脱脂
后的药渣放入恒温干燥箱中干燥。干燥好的药渣
继续加入圆底烧杯中,并添加蒸馏水(料液比为
1:10),在80℃下水浴提取三次,每次3h
[5]
。三
次的提取液合并在4000 r/min转速下离心10
min,除去底部沉淀后,将上清液继续合并在一
起,用旋转蒸发仪进行浓缩至一定体积,将浓缩
液放置室温,用Sevage法除蛋白,蛋白除完全后,将
浓缩液置于透析袋中进行透析,时间为3d,每
24h更换一次去离子水,透析结束后将提前冷冻好
的溶液放入冷冻干燥箱中冷冻干燥48h,最终得到
初步纯化的淫羊藿和黄芪多糖。
1.3黄芪/淫羊藿多糖微针的制备及形态观察
分别配置2%的黄芪/淫羊藿多糖溶液,25%
PVP溶液,分别以黄芪/淫羊藿多糖溶液与PVP
溶液体积比为1:1制备成混合溶液,并在混合溶液
中添加0.15 g蔗糖。使用真空法,在室温干燥的
条件下制备黄芪/淫羊藿多糖微针,然后将黄芪
多糖制备的可溶性微针命名为HQ-1,淫羊藿多
糖制备的命名为YYH-1,使用光学显微镜和体视
显微镜观察微针的形态。
1.4黄芪/淫羊藿多糖微针的机械强度测定
使用拉力机测定微针的机械强度,分别将
HQ-1,YYH-1针尖朝上放在下压头上,设置移
动速度为1 mm/min,测定不同比例下黄芪多糖微
针的最大断裂力度,选出具有最大机械强度的黄
芪多糖微针,拉力机的力与位移会被记录在电脑
上,每个样品测试三次。
1.5黄芪/淫羊藿多糖微针的免疫效果试验
1.5.1负载犬四联疫苗的两种多糖微针的制备
本次购买的疫苗是犬疫苗,需将狗的药用量
换算成大鼠的药用量。因此,采用动物的体表面
积计算法Meeh-Rubner氏公式进行换算
[6]
:
(公式1)
A:体表面积[m
2
];K:常数,K
狗
为11.2,K
大鼠
为9.1;W:体重[g]
称取适量犬四联疫苗粉末分别溶于提前制备
好的两种多糖混合液中混匀。用真空法制备微
针,由于犬四联疫苗的最适温度为2–8℃,因此
用真空法制备好微针后将微针放入4℃硅胶盒中
干燥,干燥结束后取出,即得负载犬四联疫苗的
黄芪/淫羊藿多糖微针,记为QHQ-1和QYH-
1,制备三组。
1.5.2两种多糖微针的免疫效果试验
试验采用SD雄性大鼠作为免疫效果评价的动
物模型。首先,对SD大鼠腹腔注射10%的水合
氯醛溶液(0.3 mL/100 g)进行术前麻醉、固定,并
用苦味酸进行标记。麻醉扎针时应有落空感,回
食品加工
FOOD PROCESSING
CFI
APR. 2021
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食品加工
FOOD PROCESSING
抽时无尿液或血液
[7]
。给大鼠背部剃毛并用75%
酒精消毒,将制备好的HQ-1、YYH-1、QHQ-
1、QYH-1分别用大拇指按压1min,并用无菌纱
布及弹性绷带包扎,处理结束后将老鼠放入笼中
观察
[8]
。
将犬四联疫苗干粉溶于PBS溶液中,搅拌均
匀,对大鼠皮下注射。其中阳性对照组为皮下注,阴
性对照组为HQ-1,空白对照组为不做任何处理
的健康大鼠。初次免疫时间10d后对大鼠进行眼
眶取血,分离血清,存入-20℃冰箱中。继续重
复初次免疫的操作步骤,进行二次免疫,20d后对
大鼠进行眼眶取血,分离血清,存入-20℃冰箱中。
犬四联疫苗中包含犬瘟、细小、犬副流感、犬
腺病毒四种,本实验选用犬四联疫苗中的犬副流
感作为检测对象来检测大鼠体内的免疫效果。
1.6细胞毒性检测
分别配置淫羊藿多糖溶液,黄芪多糖溶
液,PVP溶液,蔗糖溶液(每种溶液设置低,中,高
三个浓度),分别记为Y-1、Y-2、Y-3、H-
1、H-2、H-3、Z-1、Z-2、Z-3、P-1、P-2、P-3。
非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)的复苏:Vero
细胞活化后,加入DMEM培养基,置于37℃二
氧化碳培养箱中培养
[9]
。本实验采用MTT法检测
细胞毒性
[10]
。
2结果与讨论
2.1微针的形态观察
通过在显微镜下观察制备的两种多糖微针,可
以看到微针成四棱锥型,其中每个微针的针长
为550 µm,针体底部尺寸为250×250 µm,相
邻每两个针的针尖距离为600 µm,每个微针
阵列的针体数目是225个,微针背衬部面积为
9.5×9.5mm。并且微针的形态完整均一,微针的
100
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背衬部具有适当的厚度和柔软性。
2.2机械强度分析
通过拉力机来测定微针的机械强度见图1。由
力与位移的受力图可知,制备的微针具有一定的
抗压性能,随着位移的增加,所受的力也呈现上
升趋势,当微针完全破碎时,曲线会出现一个拐
点,该点的力即为微针所能承受的最大压力,随
后曲线呈直线上升。其中HQ-1的最大受力为
768 N, YYH-1能承受的最大压力为676 N,这
表明所制备的微针具有一定的机械强度,可以用
于微针疫苗。
图1 黄芪多糖微针图(a)和淫羊藿多糖微针图(b)的机械强度图
2.3免疫效果评价与分析
通过酶联免疫间接法对微针进行免疫效果的
定性检测,分别是QYH-1组,QHQ-1组,皮
下注射组,HQ-1组,健康大鼠组,试剂盒中的
阳性对照和阴性对照。结果显示HQ-1组与健
康大鼠组两次免疫后测得血清的OD值几乎没有
变化,均小于0.343,PIV-Ab呈阴性。QYH-1
组,QHQ-1组和皮下注射组初次免疫后各有一
组血清的OD值大于0.343,PIV-Ab呈阳性,且
QYH-1组和QHQ-1组测得血清的OD值略高
于皮下注射组血清的OD值。二次免疫后QYH-1
组和QHQ-1组的血清OD值均大于0.343,PIV–
Ab呈阳性,并且OD值明显高于皮下注射组。这
表明QYH-1和QHQ-1使大鼠产生了免疫应
答,并且免疫效果高于皮下注射。黄芪多糖,淫
羊藿多糖具有免疫增强作用,可能起到了佐剂的
功效,这为黄芪多糖和淫羊藿多糖作为佐剂应用
在微针疫苗中提供了可能性。
2.4细胞毒性结果分析
培养72 h后,H-1,H-2,H-3,Y-1,Y-2,Y-
3,Z-1,Z-2,Z-3,P-1,P-2,P-3对应的细胞存活
率分别为100.84±12.94%,69.94±15.87%,76.58
±11.20%,65.9±15.14%,54.66 ±8.77%,217.12
±38.15%,141.72±16.99%,126.7±20.92%,84.4
8 ±20.95%,290.5±42.87%,243.28±39.17%,1
47.32±21.86%,其中H-2,Y-1,Y-2的细胞存
活率在50%~75%的范围内。根据细胞毒性的评
级划分2级,结合细胞形态进行评价后,判为合
格,其余的微针材料溶液根据细胞毒性的评级划
分0级或1级,判为合格。根据黄芪多糖,淫羊
藿多糖,PVP,蔗糖溶液的低、中、高浓度的细
胞毒性测量结果显示,此次制备的黄芪多糖微针
和淫羊藿多糖微针的水溶性材料无细胞毒性。
结语
试验通过真空法成功制备了黄芪多糖微针和
淫羊藿多糖微针,其具有适当的机械强度和生物
相容性,可以在大鼠体内产生免疫应答。目前,市
场上没有黄芪多糖和淫羊藿多糖作为佐剂用于微
针疫苗,研究对中药多糖作为辅料兼佐剂用于微
针疫苗及对微针疫苗的开发具有启发意义。
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食品加工
FOOD PROCESSING
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