2024年5月28日发(作者：接傲雪)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.8
(22)申请日 2011.09.23
(71)申请人 华中农业大学;武汉科前动物生物制品有限责任公司
地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
(72)发明人 何启盖 徐丽丽 库旭钢 李燕 李娜娜 张坤 陈焕春 郭爱珍 徐高原
(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所
代理人 张红兵
(51)
C12N1/21
C12N15/50
C12N15/63
A61K39/295
A61P31/04
A61P31/14
C12R1/42
A61K39/112
A61K39/215
(10)申请公布号 CN 103013895 A
(43)申请公布日 2013.04.03
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门
氏菌基因工程活疫苗及制备与应用
(57)摘要
本发明属于动物细菌基因工程技术
领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达
猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组的
猪霍乱沙门氏菌菌株C501-COE和C501-
SD的构建、疫苗制备及应用。本发明得到
一种不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病
毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌
C501-COE和C501-SD，其保藏号分别为
CCTCC NO：M2011296；CCTCC NO：
M2011297，这两株重组菌株缺失了猪霍乱
沙门氏菌生长所必需的asd基因，并含有
能够在该菌株中表达asd基因和猪流行性
腹泻病毒COE基因片段、SD基因片段的
质粒。还公开了利用该重组菌制备猪霍乱
沙门氏菌和猪流行性腹泻疫苗的方法及应
用。本发明的疫苗可以刺激猪产生抵抗猪
霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒的保护
性免疫反应，有效防止猪霍乱沙门氏菌和
猪流行性腹泻病毒的感染。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD，其特征在于，所述的猪霍乱
沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)C501-COE和C501-SD保藏在中国典型培养物保
藏中心，其保藏号分别为CCTCC NO：M2011296和CCTCC NO：M2011297，所
述的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD分别含有表达猪流行性腹泻病毒保护
性抗原基因COE和SD，它们的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2和4所示。
2.一种重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD的制备方法，它包括下列步骤：
1)分别构建重组质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD，用如下所示的两个引物对从患
猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea)的病猪粪便病料中分别扩增猪流行性腹
泻病毒COE基因和SD基因，所述的COE基因和SD基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示：
所用引物对的DNA序列分别如下所示：
COE正向引物：GATGAATTCATGCATGAACAGCCAATTTC(5′→3′)，
COE反向引物：GGGAAGCTTGATAGTATACTTGGTACACACATCC(5′→3′)；
SD正向引物：GACGAATTCATGACAGACGTTTCTTTTATGACTC(5′→3′)，
SD反向引物：GGGGTCGACAATACTCATACTAAAGTTGGTGGG(5′→3′)；
分别将其亚克隆至原核表达载体pET-32a上，构建重组质粒pET-32a-COE和pET-
32a-SD，其中重组质粒pET-32a-COE包含如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸
序列；所述的重组质粒pET-32a-SD包含如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序
列；
2)分别构建重组质粒pYA-COE和pYA-SD，将构建正确的原核表达质粒pET-32a-
COE和pET-32a-SD分别进行双酶切，并与经过相同双酶切的穿梭质粒pYA3493
进行连接，转化asd基因缺失的大肠杆菌x6097，筛选阳性克隆；
3)分别构建重组猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD，将重组质粒pYA-COE和
pYA-SD电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株中，分别得到保藏编号为
CCTCC NO：M2011296和CCTCC NO：M2011297的猪霍乱沙门氏菌C501-COE
和C501-SD。
3.一种能够原核表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段COE，该片段的核
苷酸序列如下所示：
CATGAACAGC CAATTTCTTT TGTTACTTTG CCATCATTCA ATGATCATTC
TTTTGTTAAT ATTACTGTCT CTGCGGCTTT TGGTGGTCAT AGTGGTGCCA
ACCTCATTGC ATCTGACACT ACTATCAATG GGTTTAGTTC TTTCTGTGTT
GACACTAGAC AATTTACCAT TACACTGTTT TATAACGTTA CAAACAGTTA
TGGTTATGTG TCTAAGTCAC AGGATAGTAA TTGCCCTTTC ACCTTGCAAT
CTGTTAATGA TTACCTGTCT TTTAGCAAAT TTTGTGTTTC AACCAGCCTT
TTGGCTGGTG CTTGTACCAT AGATCTTTTT GGTTACCCTG AGTTCGGTAG
TGGTGTTAAG TTTACGTCCC TTTATTTTCA ATTCACAAAG GGTGAGTTGA
TTACTGGCAC GCCTAAACCA CTTCAAGGTG TCACGGACGT TTCTTTTATG
ACTCTGGATG TGTGTACCA AGTATACTATC
一种能够原核表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段SD，该片段的核苷
酸序列如下所示：
ACAGACGTTT CTTTTATGAC TCTGGATGTG TGTACCAAGT ATACTATCTAT
GGCTTTAAAG GTGAGGGTAT TATTACCCTT ACAAATTCTA GCTTTTTGGC
AGGTGTTTAT TATACATCTG ATTCTGGACA GTTGTTAGCC TTTAAGAATG
TCACTAGTGG TGCTGTTTAT TCTGTTACGC CATGTTCTTT TTCAGAGCAG
GCTGCATATG TTGATGATGA TATAGTGGGT GTTATTTCTA GTTTGTCTAA
CTCCACTTTT AACAATACCA GGGAGTTGCC TGGTTTCTTC TACCATTCTA
ATGATGGCTC CAATTGTACA GAGCCTGTGT TGGTGTATAG TAACATAGGT
GTCTGTAAAT CTGGCAGTAT TGGCTATGTC CCACTTCAGG ATGGCCAAG
TCAAGATTGC ACCCATGGTT ACTGGGAATA TTAGTATTCC CACCAACTTT
AGTATGAGTA TT。
4.一种猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻二价基因工程疫苗，其特征包括，该疫苗含
有权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD，按照体积比，猪霍乱
沙门氏菌C501-COE和C501-SD的菌液与明胶保护剂比例为2∶1。
5.权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻二
价基因工程疫苗中的应用。
说 明 书
技术领域
本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及两种不含抗性标记的分别表达猪
流行性腹泻病毒保 护性抗原基因-COE基因和SD基因的重组的猪霍乱沙
门氏菌活疫苗菌株的构建及应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonellu)是一种胞内寄生的革兰氏阴性肠道杆菌，具有侵袭性，最常
见的沙门氏菌属 有鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等。
人体和动物的胃肠道沙门氏菌对人和动物均有较强的致病力，可引起
疾病，沙门氏菌在外界环境中的生存能力较强，在利用基因工程的方法致弱以后，
仍
最初预防沙门氏菌的疫苗是全菌灭活苗，但该疫苗只能激发机体的体液免疫，且易
引起副作用，另外， 还存在着需免疫多次和无交叉保护的缺点，因而
染的方式，给
具有较强的侵袭力。
不能广泛应用。此后，研究学者模拟沙门氏菌肠道自然感
动物口服减毒的沙门氏菌(如肠炎沙门氏菌Ty21a的口服弱毒苗)，结果发现，可诱
导机体 产生更好的体液免疫和细胞免疫，因此受到很多研究学者的普
遍重视(Gernianier R et al.，1975)。
由于肠炎伤寒沙门氏菌Ty21a致弱的遗传背景不清晰，各国研究学者，尝试运用
基因工程的方法，研 究遗传背景清晰的伤寒弱毒基因缺失疫苗株，用
1988)、于口服免疫研究，例如，aro基因缺失株(Dougan G et al.，
cya/crp缺失株(Alper M D et al.，1978)、Dam和phoP/phoQ缺失株(Galan J E et al.，
1989)、
asd基因缺失株(徐引弟等，2006)等。
弱毒沙门氏菌除本身可以作为疫苗以外，也可被用作载体来表达外源抗原基因，近
年来，以弱毒沙门 氏菌为载体表达肿瘤、病毒、细菌和寄生虫等的外源抗
从而为研制新型基因原，研制多价基因工程疫苗成为该领域的研究热点，
工程疫苗开辟了新的途径(Zhao Z et al.，2008)。
近年来，弱毒沙门氏菌为载体的基因工程疫苗成为研究的热点，其优越性主要表现
在(徐引弟博士论
(1)抗原递呈的有效性，尤其是口服或滴鼻免疫时，效果更佳(Dietrich et al.，1998)；
(2)可产生特异性细胞毒性T细胞杀伤反应(CTL效应)；
(3)可以激发黏膜和系统免疫反应。以弱毒沙门氏菌为载体的疫苗经口服或滴鼻的
方式免疫后，可以 直接将外源抗原运载至机体的黏膜相关淋巴组织
al.，2006)；
文，2006)：
(MALT)，从而激发机体的黏膜和系统免疫反应(Spreng et
(4)具有免疫佐剂作用。沙门氏菌的LPS是一种内在佐剂，此外，有研究表明，沙
门氏菌内部有一个 非甲基化的CpG DNA序列，具有较强的免疫刺激活性，
被认为是具有应用潜
可以促进机体内部Th型为主的免疫应答，因而，
力的免疫增强剂和免疫佐剂(Paglia et al.，1998)；
(5)免疫具有持续性。减毒沙门氏菌载体所携带的质粒不易丢失，且可长期稳定地
存在于机体淋巴组
体的免疫应答反应；
(6)联合免疫作用。减毒沙门氏菌本身所携带的抗原与质粒表达的外源抗原起到了
联合免疫的作用， 同时，还可以将2个或2个以上的外源抗原基因插入到
织内，从而不需反复多次地加强免疫也可长期地激发机
表达质粒中，免疫宿主后可针对不同的外源抗原产
从而达到一次免疫防治多种疾病的疗效；
生相应的免疫反应，
(7)所表达的抗原蛋白不需提纯。以减毒沙门氏菌为载体的疫苗，只需过夜培养即
可直接免疫，从而 省去了诱导剂诱导与纯化蛋白的步骤，制备过程简单、
作成本； 省时，且易于储存运输，因此，可显著降低疫苗制
(8)接种方式简便，易于操作，适于群体免疫，且安全性好。
猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株是在含醋酸铊的培养基中，连续传代500次致弱的菌
株，其具有良好免 疫原性，实践也证明了C500株具有良好的免疫原性，
低、安全性好的特点。且能激活全身、局部和粘膜免疫系统，具有副作用
其中，最常用的是沙门氏菌Asd-平衡致死系统(Galan J E，et al.1990)。华中
农业大学农业微生物学国家重点实验室徐引弟博士构建了C500株的asd基
证实Δasd C500缺失株的免疫原性，与
应用于
因缺失株Δasd C500，经实验
C500菌株相比，毒力更低，安全性更好(徐引弟等，2006)，且已
重组活疫苗的制备，如申请人所在农业微生物国家重点实验室构建了猪传染性胃肠
炎的重组沙门氏 菌活疫苗，经临床验证，该疫苗具有较好的免疫预防效
2)。 果，且已申请了中国发明专利(专利申请号为
猪流行性腹泻(PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起，一种高度接触性的急性传染
病，猪感染PEDV 以后，常引起仔猪的急性肠炎及致命性水泻直至脱水死
脱水；PEDV感染猪，亡，其临床特征主要表现在仔猪呕吐、严重腹泻和
剖检病理变化主要表现为猪的空肠和回肠部分的肠绒毛的萎缩和脱落(Pensaert and
Yeo，2006)。PED对猪的危害很大，各种年龄的猪均可发病，但对哺乳仔
仔猪死亡率达95％以上(Timoney J F et al.，
猪的危害最为严重，20日龄以内
1988)，给养猪业带来重大经济损失。
目前，PED在世界范围内广泛流行。在欧洲各国，PED较以前的流行程度已明显
降低，但是在亚洲猪 场中PEDV的感染率非常高，尤其是在韩国、
极为相日本和中国等，从致病机理和临床症状上来看，PEDV与TGEV
似，且由于其感染率明显高于TGEV和猪轮状病毒(PoRV)，给养猪业造成了巨大
的损失(Cavanagh
PEDV属于冠状病毒科、冠状病毒属。PED首次发现并报道是在1971年的英国
(Oldham，1972)。自此 以后，该病在欧洲和亚洲大规模发生报道
了PED的发
D et al.，1997)。
(Puranaveja et al.，2009)，自1976年开始，我国相继报道
生，现在PED已成为世界范围内流行的重要的猪病毒性腹泻病之一。1978年，引
起该病的病原 体-PEDV，在英国和比利时首次得到鉴定(Chasey et al.，
的第五次报告被列为冠状病1978)，且在1991年国际病毒分类委员会(ICTV)
毒属的可能成员，直到1995年的第六次报告才被列为冠状病毒属的正式成员。
PEDV粒子形态特征与冠状病毒科其它成员的很相似(Chasey et al.，1978)，纤突糖
蛋白(S蛋白)、 膜糖蛋白(M蛋白)和包膜糖蛋白(E蛋白)分布于病毒粒
内部，PEDV的核衣壳结构
子的表面；核衣壳蛋白(N蛋白)位于病毒粒子
是由N蛋白与基因组RNA相互作用而形成的，这使得PEDV与传染性胃肠炎病毒
在形态学上很难区别(Pensaert et al.，1986)。目前为止，研究发现PEDV只
et al.，1981)。 存在一个血清型(Witte
PEDV S蛋白在介导感染宿主产生中和抗体的过程中发挥重要作用，近年来，国内
外研究人员先后对 PEDV S基因进行了的研究。2002年Chang等据
个抗原表位区TGEV S基因的中和表位序列，推测出了PEDV S基因的一
(499～638aa)，并命名为COE，经试验证实，该基因具有较好的免疫原性，且也已
作为靶基 因，应用到转基因植物疫苗和基因工程疫苗的制备之中
是以体液免疫为主的病毒，(Nguyen et al.，2009；葛俊伟等，2010)。PEDV
因而，B细胞抗原表位在抗PEDV感染中具有重要的意义，Sun等人(2008)通
过实验鉴定得知S1亚基的S1D(636-789aa)区中
能为PEDV的两个B所包含的S1D5(744-759aa)和S1D6(756-771aa)，可
细胞表位(Sun D B et al.，2008)，另外S1D区还包括了一个免疫原性较好的高亲和
国内外常用的预防PED发生的方法是，将PEDV感染猪的粪便或发病仔猪的肠内
容物，人工感染妊娠 母猪，刺激产生母源抗体，仔猪吮乳后，获得保
力表位序列S1P3(697-742aa)。
护，降低死亡率和缩短PED流行时间。
与大多数病毒性疾病相同，对PED的防控，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，
PED商业化的疫苗主 要是灭活苗和弱毒苗两种，两种疫苗在使用后，
推测其原因为虽然在一定程度上可以预防PED的发生，但效果不理想。
PEDV主要经肠道感染猪，局部肠黏膜免疫系统在抗PEDV感染的免疫过程中发挥
了重要的作 用(Pospischil A et al.，2002)，因而刺激肠道黏膜产生的特异性
疫苗关键的问题。然而，现有的商sIgA，成为防制本病发生和研制PED
业化灭活苗和弱毒苗在免疫后，只能诱导体液免疫应答，不能激活黏膜
免疫系统，即使有较高的血清抗体滴度，仍不能阻止病原经黏膜入侵体内，
已有PED转基因植物疫苗和基因工程活
此，开
因而免疫效果不佳。目前，虽
疫苗的相关研究，但只是处于实验研究阶段，还未实现商业化，因
发更加安全、高效、廉价的新型疫苗是世界养猪业的迫切需要。
鉴于减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有运送效率高，免疫方法简单，免疫效果较好，
能同时激发全身免 疫和局部粘膜免疫等优点，有着良好的应用前景。重组
前所采用的携带抗性沙门氏菌疫苗的传统构建方法存在很多缺陷，如以
基因的表达质粒，因其所存在的生物安全问题，而不被人们所接受。本研究所使用
的 猪霍乱沙门氏菌C500asd质粒-载体平衡致死系统具有无抗性标记的
达量高、外源基因表达稳定和不需优点，此外，还具有免疫原性好、表
纯化等优点，因而，将其开发为表达猪流行性腹泻病毒主要抗原基因的
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，其第一个目的是获得表达猪流行性腹
泻病毒保护性抗原
氏菌株。
本发明的第二个目的是利用上述的重组菌获得一种猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻
病毒二价基因工
本发明的第三个目的是上述重组菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒二价
基因工程疫苗中
本发明通过以下技术方案实现：
申请人通过基因工程的方法，获得了表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因-COE
基因和SD基因的 重组的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)-C501-
22日送交位于湖北省武汉
的应用。
程疫苗。
蛋白基因-COE基因和SD蛋白基因的重组猪霍乱沙门
重组活疫苗具有广阔的应用前景。
COE和C501-SD，该两菌株已于2011年8月
市武汉大学内的中国典型微生物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号分别为
CCTCC
两个重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD的制备方法，主要包括下列步
骤：
1)原核表达质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD的构建：从患猪流行性腹泻病
(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病猪粪便病料中，扩增猪流行性腹泻
NO：M2011296；CCTCC NO：M2011297。
病毒COE基因和SD基因，并分别将其亚克隆至原
构建原核表达质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD；
核表达载体pET-32a，
2)重组质粒pYA-COE和pYA-SD的构建：将构建正确的原核表达质粒进行双酶切，
并与经过相同双酶 切的穿梭质粒pYA3493进
行连接，转化Asd-的大肠杆菌x6097，筛选阳性克隆；
3)重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD的构建：将重组质粒pYA-COE和
pYA-SD电转化至猪 霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株中，得到保藏编号
的重组的猪霍分别为CCTCC NO：M2011296；CCTCC NO：M2011297
乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD。
申请人获得两种猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段COE基因、SD基因，
它们的核苷酸序列如 序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示
(其制备方法见实施例所示)。
申请人利用所述的重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE菌液、重组的猪霍乱沙门氏菌
C501-SD菌液与明 胶保护剂按照适当体积比(见实施例)成功制备一种防治
疫苗。 猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻的二价基因工程
上述的不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌
株缺失了沙门氏 菌株基因组中必需的细胞壁形成相关基因asd基因(需
的培养基上才能正常要含asd基因的质粒存在于菌体内或外源添加DAP
生长、繁殖)，同时这两株重组菌株分别含有外源质粒pYA-COE和pYA-SD(均含
有 asd基因)，这两株重组菌株均保留了亲本菌株C500作为猪霍乱沙门
pYA-COE和pYA-SD均能在该菌氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。质粒
株中表达asd基因，且两者能分别表达猪流行性腹泻病毒S蛋白中的COE抗
原位点和SD抗原位点基因。其中，asd基因表达产物提供沙门氏菌株必需
的细胞壁形成相关成份。COE抗 原位点和SD抗原位点基因表达产物提供
良好的针对猪流行性腹泻病毒的免疫原性。
本发明的不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏
菌株C501-COE和 C501-SD，这两株基因工程菌株均衍生于在中国已经使
C500。所述的本发用了50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株
明的重组猪霍乱沙门氏菌株C501-COE和C501-SD，缺失了C500菌株基因组中的
asd基 因，同时添加了含有猪流行性腹泻病毒S蛋白中的COE抗原位点和
pYA-SD。由于需要pYA-COE和SD抗原位点基因的质粒pYA-COE和
pYA-SD的存在重组菌株才能存活，因此大大提高了质粒pYA-COE和pYA-SD
(也就是COE抗原位点和SD抗原位点基因)在重组菌株中的稳定性。COE
重组菌株中的稳定表达，使之具有针对猪
抗原位点和SD抗原位点基因在
传染性胃肠炎病毒很好的免疫保护力。
本发明的基本构建方法是：利用本申请人所在的农业微生物国家重点实验室构建好
的asd基因缺失的 猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500ΔcrpΔasd缺失株(徐引
腹泻病毒COE和SD基因弟等，2006)构建含有能够原核表达猪流行性
的质粒pYA-COE和pYA-SD。将重组质粒分别电转入C500asd基因缺失株中，这
样 重组质粒与C500asd基因缺失株形成互补，而满足生长需要，进而稳
性标记的能表达猪流行性腹泻病毒定共存，形成了我们发明的不含抗
保护性抗原的重组菌株C501-COE和C501-SD。通过大量的生物学实验数
据证明本发明制备的重组菌株可用于制备针对猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹
泻的二价基因工程疫苗。
本发明的主要优点是：
1、本发明的重组菌株表达的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中的A、D抗原位点和N
蛋白中的N321抗原位 点是猪传染性胃肠炎病毒重要的免疫原性
基因片段，本发明的重组菌株表达的猪流行性腹泻病毒保护性抗 原基因
-COE基因和SD基因是猪流行性腹泻病毒重要的免疫原性基因片段，均具有良好
的免疫保护性。由 于猪传染性胃肠炎病毒和猪、流行性腹泻病毒危害日益
猪流行性腹泻疫苗严重，而目前市场上各种商品化猪传染性胃肠炎和
(主要是佐剂灭活苗和弱毒苗)免疫效果普遍较差。因此，用该基因工程菌株制成的
疫
2、本发明的重组菌株衍生于在中国已经使用了50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌
弱毒疫苗株C500， 完全保留了C500针对猪霍乱沙门氏菌的免疫效力。而
安全性。
苗具有广阔的市场应用前景。
且，该重组菌株毒力比C500稍弱，具有更好的生物
3、本发明的重组菌株可以同时提供针对猪霍乱沙门氏菌、传染性胃肠炎病毒和猪
流行性腹泻三种病
4、本发明所研制的疫苗，与现有的灭活苗和弱毒苗相比，具有制备过程简单、省
时，且易于储存运
5、本发明的重组菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。
更详细的技术方案见实施例所述。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因COE的
核苷酸片段。
序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因SD的核
苷酸片段。
输的特点，显著降低了疫苗的制作成本。
原的保护力。
图1：本发明制备的能够原核表达的猪流行性腹泻保护性抗原基因片段构建流程图。
图2：本发明制备的能够原核表达的COE基因和SD基因的序列比对图。其中，图
2A：能够原核表达 的COE基因与其它毒株相应序列的比对；图2B：能够
原核表达的SD基因与其它毒株相应序列的比对。
图3：本发明制备重组沙门氏菌所用穿梭质粒pYA3493的图谱。
图4：本发明制备重组质粒pYA-COE和pYA-SD的PCR鉴定图片。其中：
图4A：pYA-COE PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1-2：pYA-
COE；3：阳性对照；4：
阴性对照；
图4B：pYA-SD PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1-2：pYA-SD；
3：阳性对照；4：阴
图5：本发明制备重组质粒pYA-COE和pYA-SD的酶切鉴定结果电泳图。其中，
M1：DNA Marker(DL2000)；M2：DNA marker(DL15000)；1：
3：pYA-
性对照。
pYA3493/EcoR I；2：pYA-COE/EcoRI+HindIII；
SD/EcoRI+Sal I。
图6：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD的构建流程图。
图7：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD的PCR鉴定图。其中，
图7A：重组菌C501-COE PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1-2：
C501-COE；3：阳性
对照；
4：阴性对照；
图7B：重组菌C501-SD PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1-2：
C501-SD；3：阳性对
4：阴性对照。
图8：本发明制备的重组菌株C501-COE和C501-SD中沙门氏菌invA基因的扩增
图片。其中，
M：DNA Marker(DL2000)；1：阳性对照；2：C501-COE中invA基因扩增；3：
501-SD中invA基因扩增。
图9：利用Western blotting方法检测本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD
中蛋白的分泌表达。
图9A：含有COE蛋白在重组菌C501-COE中的分泌表达。其中，M：
Prestained Protein Ladder；
图9B：含有SD蛋白在重组菌C501-SD中的分泌表达。其中，M：
Prestained Protein Ladder。
图10：利用间接免疫荧光实验检测本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD中
表达蛋白在细菌中的 定位。其中，图10A：C501-COE；图10B：
其中：
照；
C501-SD；图10C：C501-pYA。
图11：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD的生长曲线图。
图12：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD的遗传稳定性实验结果。其中：
图12A：重组菌C501-COE的遗传稳定性鉴定结果。其中，M：
DNA Marker(DL2000)；1-6：分别为重组 菌C501-COE传代50次、40次、
30次、20次、10次和第1代的PCR鉴定结果；
图12B：重组菌C501-SD的遗传稳定性鉴定结果。其中，M：
DNA Marker(DL2000)；1-6：分别为重组
30次、40次和50次后的PCR鉴定结果。
图13：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD在免疫BalB/C小鼠后针对外源
抗原的的黏膜sIgA
图13A：重组菌C501-COE免疫小鼠后的抗COE蛋白的黏膜sIgA抗体水平；
图13B：重组菌C501-SD免疫小鼠后的抗SD蛋白的黏膜sIgA抗体水平。
图14：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD在免疫BalB/C小鼠后针对外源
抗原的血清IgG抗
图14A：重组菌C501-COE免疫小鼠后的抗COE蛋白的血清IgG抗体水平；
图14B：重组菌C501-SD免疫小鼠后的抗SD蛋白的血清IgG抗体水平。
图15：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD在免疫BalB/C小鼠后针沙门氏
菌的抗体水平。其
中：
体水平。其中：
抗体水平。其中：
菌C501-SD第1代及传代20次、
图15A：重组菌C501-COE和C501-SD免疫小鼠后的抗沙门氏菌的血清IgG抗体
水平；
图15B：重组菌C501-COE和C501-SD免疫小鼠后的抗沙门氏菌的黏膜sIgA抗体
水平。
图16：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD在小鼠体内诱导的IFN-γmRNA
上的差异水平比较。
图16A：重组菌C501-COE诱导的IFN-γmRNA水平与空质粒对照菌的对照结果；
图16B：重组菌C501-SD诱导的IFN-γmRNA水平与空质粒对照菌的对照结果。
图17：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD在小鼠体内诱导的IFN-γ蛋白
表达水平的差异比
图17A：重组菌C501-COE诱导的IFN-γ蛋白表达水平与空质粒对照菌的对照结果；
图17B：重组菌C501-SD诱导的IFN-γ蛋白表达水平与空质粒对照菌的对照结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。
实施例1：制备能够原核表达的猪流行性腹泻保护性抗原COE和SD蛋白的基因片
较。其中：
其中；
段
(1)制备原核表达质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD所需的引物设计，其序列如表1
所述。
表1制备原核表达质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD所需的引物序列
表1中引物的下划线部分为酶切位点。
(2)制备能够原核表达的COE和SD片段
利用张坤报道的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重
RT-PCR检测方法(张 坤，2010)，检测送检的临床病料。从猪流行性
BioFlux公司
腹泻病毒感染的阳性粪便病料中，提取基因组RNA(采用
的总RNA提取试剂盒，按照该公司提供的试剂盒说明书操作)，然后进行反转录。
以反转录所 得到的cDNA为模板，分别以表1所示的EP1/HP2和
切位点的SDE1/SDS2为引物，PCR扩增带有EcoR I、HindIII酶
PEDV COE基因和带有ECOR I、Sal I酶切位点的SD基因片段，扩增体系如下所
述：
COE基因片断和SD基因片段的PCR扩增条件：95℃预变性4min后，进行如下循
环：94℃变性40s，
72℃10min。
58.1℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环，最后
扩增完成后，取PCR产物8μL，加入1μL10×Loading Buffer，用0.8％琼脂糖凝胶
进行电泳，EB染 色，观察电泳结果。电泳后用BioFlux公司胶回收试剂
作)。将纯化后的盒进行目的基因的纯化(按照该试剂盒的说明书操
COE基因片段与原核表达载体pET-32a分别进行EcoR I和HindIII双酶切后跑胶回
收，利 用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)；
pET-32a分别进行EcoR I和Sal I将纯化后的SD基因片段与原核表达载体
双酶切后跑胶回收，利用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌表达宿主菌
BL21(DE3)。经PCR、双酶切和测序鉴定，最终得到能够原核表达的猪流行
够原核表达的基因片段的制备流程如图1
性腹泻COE和SD基因片段。能
所示。测序结果与其它毒株序列的比对结果如图2所示。
实施例2：重组质粒pYA-COE和pYA-SD的构建与鉴定
将带有EcoR I、HindIII酶切位点的重组质粒pET-32a-COE和带有ECOR I、Sal I
酶切位点的 pET-32a-SD进行双酶切回收，然后与同样经过双酶切回收的
接，连接产物转化asd基因穿梭质粒pYA3493(质粒构建图谱见图3)连
缺失的大肠杆菌x6097(来源：美国华盛顿大学 Curtiss III教授惠赠)，
筛选阳性克隆，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定，得到构建正确的重组质
图5所示)。其中，PCR扩增体系及扩增粒pYA-COE和pYA-SD(如图4和
条件如实施例1，(2)所述。
实施例3：表达猪流行性腹泻病毒COE和SD融合蛋白的重组沙门氏菌菌株C501-
COE和C501-SD的构建与
(1)鉴定重组的沙门氏菌C501-COE和C501-SD所需的引物的设计，其DNA序列如
表2所示：
鉴定
表2鉴定重组的沙门氏菌C501-COE和C501-SD所需的引物的DNA序列
(2)重组的沙门氏菌C501-COE和C501-SD的构建与鉴定方法
将鉴定正确的重组质粒pYA-COE和pYA-SD(来源见实施例2)分别电转化至asd缺
失的C500-感受态 细胞中，电转仪(Bio-Rad GenePulserII)参数设置为：电
间4ms，构建流程图见图6。压2.2Kv，电容25μF，脉冲电阻200Ω和时
在DAP阴性平板上，挑取单菌落于TSB液体培养基中培养8-10h，吸取1mL
菌液制备模板，分别以表1所示的EP1/HP2和SDE1/SDS2为引物，进行目
再使用沙门氏菌特异基因invA基因
行沙门
的片段的扩增(如图7所示)；
(GenBank：M90846.1)的特异性引物pi1/pi2(见表2)对重组菌进
氏菌特异性鉴定(如图8所示)；最后以表2所示的引物pY1为上游测序引物进行测
序鉴定。结果 表明含有pYA-COE和pYA-SD质粒的重组的猪霍乱沙
氏菌菌株门氏菌构建正确，申请人分别将其命名为猪霍乱沙门
(Salmonella choleraesuis)C501-COE和C501-SD，并送交中国典型培养物保藏中心
(CCTCC)
实施例4：表达猪流行性腹泻病毒COE和SD融合蛋白的重组沙门氏菌菌株C501-
COE和C501-SD的生物学
(1)重组菌C501-COE和C501-SD的表达特性分析
分别挑取重组菌C501-COE和C501-SD的单菌落于TSB液体培养基中，37℃，
200r/min培养12h，4 ℃放置12h，按1∶100的体积比接种于TSB液
磅高压
特性
用于专利程序的保藏。
体培养基(配方：3％TSB粉末(30g)溶于ddH2O中，15
灭菌15min后于室温保存。)中，37℃，200r/min，培养6-8h，8000rpm离心10min，
分别收集 菌体和上清，上清液经0.22μm滤膜过滤，取900μl上清，并
菌的终浓度均达到10％，加入100％的三氯乙酸100μl，使上述重组
冰浴30min后，12000r/min，离心30min，弃上清；加入1mL预冷的无水乙醇
洗涤沉淀，12000r/min，离心10min，如此重复洗涤2次。将所得到的蛋白
阳性血清(由中国农业科学院哈尔滨兽医
鉴定
用猪源抗猪流行性腹泻病毒
研究所惠赠，见遗传资源表所述)作一抗，进行Western blotting
(如图9所示)，结果显示本发明的重组菌能够分泌表达融合蛋白，且融合蛋白能够
与猪的猪流行性
此外，经间接免疫荧光实验对融合蛋白在细菌中的定位进行了鉴定，鉴定方法参考
汪淼的硕士论文 (汪淼.2006。)，实验结果显示，重组菌所表达的融合蛋
腹泻病毒阳性血清抗体发生特异性反应。
白定位于细菌的表面(如图10所示)。
(2)重组菌C501-COE和C501-SD的生长特性分析
将重组菌C501-COE、C501-SD在TSB中37℃培养过夜后，进行连续10倍稀释，
选取3个合适的稀释 梯度，每个稀释度取100μL均匀涂布在TSA平板上，
取平均值，并计算出每个梯度各做3个重复，37℃，培养过夜，计数，
原液的CFU(菌落形成单位)。转接使其终浓度为106CFU/mL，37℃，
200r/min振 荡培养，每间隔1h取样，测OD600值，绘制生长曲线。相同
质粒对照菌株C501-pYA的的方法绘制亲本株猪沙门氏菌C500及空载体
生长曲线，然后比较其生长特性的差异。从重组菌的生长曲线(如图11所示)
可以看出，重组菌C501-COE、重组菌C501-SD、空载体质粒对照菌株
与亲本
C501-pYA在培养过程中，生长状态
菌株猪沙门氏菌C500基本相似，只是生长速度稍慢于亲本猪沙门氏菌。
(3)重组菌C501-COE和C501-SD的表型鉴定
分别将重组菌C501-COE、C501-SD、空质粒对照菌株C501-pYA和亲本菌株C500
划线接种于TSA平板， 然后挑取单菌落，分别转接阿拉伯糖、甘露糖、
蔗糖等碳源生硫化氢、乳糖、木糖、尿素、葡萄糖、鼠李糖、卫茅醇、
化鉴定管，37℃，温育24h，进行重组菌的表型判定。生化鉴定结果表明，重组菌
C501-COE、 C501-SD和C501-pYA与亲本菌C500生化特性相同，都不能
蔗糖，但是能利用甘露糖、
利用蔗糖、阿拉伯糖、尿素、乳糖、卫茅醇和
木糖、葡萄糖、和鼠李糖作为唯一碳源。
(4)重组菌C501-COE和C501-SD的遗传稳定性
将重组菌C501-COE和C501-SD在用TSA固体培养基(配方：4％TSA粉末(40g)溶
于ddH2O中，15 磅高压灭菌15min后于室温保存。)制备的平板上划线
振荡培养12h，然后培养，挑取单菌落至液体培养基中，37℃，200r/min，
按1∶100的体积比转接到新鲜的TSB液体培养基中，培养12h，如此连续重复转
接 培养50次，以第1、10、20、30、40和50代的培养物为模板，分别
进行PCR扩增，PCR扩增用表1所述的引物EP1/HP2和SDE1/SDS2
体系及扩增条件如实施例1，(2)所述，检测重组质粒pYA-COE和pYA-SD在
Δasd C500 中的遗传稳定性。鉴定结果证明，均可以从各代重组菌培养物
带(如图12所示)。 中扩增出480bp和462bp的特异性DNA条
实施例5：以Balb/C小鼠为动物模型分析重组菌的免疫原性
1.小鼠免疫实验设计
70只BALB/c小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心，见遗传资源表所述)随机分为7
小组，每组10只， 分别为口服重组菌C501-COE、肌注重组菌C501-COE、
组菌C501-pYA、肌口服重组菌C501-SD、肌注重组菌C501-SD、口服重
注重组菌C501-pYA和TSB对照组，于首免后两周和二免后两周(首免后4周)断尾
采 血和收集肠内容物，间接ELISA方法检测抗体水平(IgA和IgG抗体)，
具体操作步骤如下所述：
1.1免疫小鼠血清IgG抗体水平ELISA检测：
按照文献《疫苗关键技术详解》原著第二版(A.罗宾逊等，2006)，将原核表达蛋白
(COE蛋白和 SD蛋白)按0.5μg/孔的浓度包被酶标板，100μl/孔，4℃，包被
过夜，洗涤液洗涤3次，3min/次；
(2)加入封闭液进行封闭，150μl/孔，37℃，封闭2h，取出洗涤3次，3min/次；
(3)将待检血清从1∶2或1∶10开始进行倍比稀释，加入酶标板，100μl/孔，37℃，
反应1h，取出
(4)加入1∶6000倍稀释的羊抗鼠HRP-IgG，100μl/孔，37℃，反应1h，洗涤5-6次，
3min/次；
(5)加入四甲基联苯胺底物(A+B)100μl，室温避光反应10-15min，再加入50μl 0.25％
HF终止
(6)选择OD630nm≥0.2的反应孔，作为阳性，取待检血清的最高稀释倍
数的倒数，换算成抗体的滴度。
1.2免疫小鼠肠分泌性IgA抗体水平检测：
分别于免疫后21d，28d随机取2-3只小鼠，颈椎脱臼处死，刮取肠道表面粘液于
1.5ml离心管中，
用pH 7.4PBS作10倍稀释，混匀后-20℃保存备用。
反应，用酶标仪测定OD630nm；
洗涤3次，3min/次；
肠道sIgA抗体ELISA检测方法同实施例5，1.1所述。其中，间接ELISA检测方
法所用的核心试剂的成
包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液(25mmol/L)；
Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，
ddH2O定容至至1L；
PBS缓冲液：140mmol NaCl(8.18g)，2.7mmol KCl(0.20g)，
10mmol Na2HPO4(3.58g)，1.8
mmol KH2PO4(0.245g)，溶于
分及制备步骤如下所示：
800mL ddH2O中，用5mol/L的NaOH调至pH7.4后，
ddH2O定容至至1L；
洗涤液：在PBS缓冲液中加入0.05％的Tween-20；
封闭液：1L洗涤液中加入0.50g牛血清蛋白(BSA)；
底物缓冲液：pH5.0的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液25.7mL，0.1mol/L的柠檬酸液
24.3mL，0.2mol/L的
TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL的无水乙醇中；
底物液(TMB)：将TMB母液与底物缓冲液按按1∶20的比例混合均匀后，每毫升
底物液中加入30％的
终止液：0.25％HF。
免疫前，需对重组菌进行活菌计数。口服组免疫前4h，BALB/c小鼠需停水停料，
H2O2 0.2μL；
Na2HPO4 25.7mL，ddH2O 50mL；
在免疫前20min 口服50μl 10％NaHCO3中和胃酸，然后用
鼠免疫剂量约12号BALB/c小鼠灌胃针口服免疫200μl，使每只BALB/c小
为1.5×108个活菌量(剂量参照：中华人民共和国兽用生物制品质量标
准，2001版)；肌 肉注射组每只BALB/c小鼠免疫剂量与口服免疫组下相
同；TSB空白对照组免疫接种200μl。
免疫后2周，每组随机选取5只进行加强免疫。分别于首次免疫前、首次免疫后2
周、加强免疫后2 周进行小鼠尾静脉负压采血，收集血清，将5只
平均抗体水平。BALB/c小鼠血清等量混合，采用间接ELISA法检测各组
2.免疫BALB/c小鼠的抗猪流行性腹泻病毒保护性抗原蛋白抗体水平的检测
分别采集免疫前、首免后2周和二免后2周的BALB/c小鼠血清利用间接ELISA
方法检测血清IgG抗体； 分别于免疫后21d，28d随机取2-3只BALB/c
中，用
小鼠，颈椎脱臼处死，刮取肠道表面粘液于1.5ml离心管
pH 7.4PBS稀释，利用间接ELISA方法检测黏膜sIgA抗体。按照文献《疫苗关键
技术详解》原著 第二版(A.罗宾逊等，2006)，将原核表达蛋白(COE蛋
将待检血清或肠黏膜内容物
白和SD蛋白)按0.5μg/孔的浓度包被酶标板，
从1∶2或1∶10开始进行倍比稀释，分别加入到相应反应孔内进行检测。
检测结果如下：①sIgA产生情况，重组菌C501-COE和C501-SD口服免疫组sIgA
抗体滴度分别为1∶1280 和1∶2048，而肌肉注射组的sIgA抗体滴度分
生情况，重组别为1∶640和1∶1024(如图13所示)；②血清IgG抗体产
菌C501-COE和C501-SD肌肉注射组中的IgG抗体滴度分别为1∶4096和1∶2560，
而口服免疫
所示)
组所产生的IgG抗体滴度分别为1∶2048和1∶1280(如图14
(3)免疫BALB/c小鼠沙门氏菌抗体水平ELISA检测
沙门氏菌ELISA抗原的制备：挑取沙门氏菌单菌落于5mL TSB液体培养基中，
37℃，活化过夜，用 体积比为1∶100转接至100mL TSB液体培养基，
收集菌体，用pH 7.437℃，200r/min，培养8h，8000r/min，离心10min，
的PBS洗涤2次，然后，用pH 7.4的PBS以体积比为1∶10倍浓缩重悬，冰上超
声 破碎至清亮(UP 200S超声波处理器-德国her公司制造，功
24KHz，超声波破碎时间：30s/次，
光度计
率：200W、振幅：60％、操作频率：
间隔时间：1min/次)，12000r/min，离心20min，弃沉淀。用分光
测定上清蛋白浓度，分装500μl/管，于-20℃保存备用。按照文献《疫苗关键技术
详解》原著第二 版(A.罗宾逊等，2006)，将制备的沙门氏菌蛋白按
免疫BALB/c小鼠血
0.5μg/孔的浓度包被酶联板，间接ELISA方法检测
清中的IgG抗体和肠黏膜中的特异性IgA抗体水平。
检测结果显示，重组菌株C501-COE和C501-SD免疫组BALB/c小鼠均诱导产生
了与空载体对照菌株 C501-pYA免疫组BALB/c小鼠相似水平的沙门
氏菌血清IgG抗体和肠道sIgA抗体(如图15所示)
(4)细胞免疫检测
具体方法按文献(肖少波，2004)进行：
制备小鼠脾淋巴细胞，并调整细胞浓度为2×106/mL，加入到24孔细
胞培养板中，1mL/孔，以纯化 的目的蛋白作体外刺激原，并使蛋白终浓
度为10μg/mL。将24孔细胞培养板放于37℃，5％CO2细胞培养
箱中培养，20h后，各选择一个细胞孔，提取细胞总RNA，通过相对荧光
达水平上的差异。剩余细胞孔，在72h后，定量的方法测定IFN-γmRNA表
收集细胞上清，利用双夹心ELISA方法(采用R&D公司小鼠IFN-
γ检测试剂盒进行检测，具体操作步骤参照该试剂盒的说明书)，检测IFN-γ
蛋白表达水平上的差异。
利用SYBR Green Real-time PCR的方法，检测BALB/c小鼠免疫脾细胞中IFN-γ的
mRNA相对于β -actin的mRNA的表达量，并进行了相对定量分析，结
小鼠脾细胞中IFN-果显示，重组菌C501-COE和C501-SD免疫组BALB/c
γmRNA的相对表达量高于空载体质粒C501-pYA免疫组，且肌肉注射组的IFN-
γmRNA
采用双夹心ELISA方法(采用R&D公司小鼠IFN-γ检测试剂盒进行检测，具
体操作步骤参照该试剂 盒的说明书)检测各免疫组脾细胞分泌的IFN-γ
免疫组
的相对表达量要高于口服免疫组(如图16所示)。
水平，结果表明，本发明的重组菌C501-COE和C501-SD
BALB/c小鼠脾细胞中IFN-γ蛋白表达水平明显高于高于空载体质粒C501-pYA免
疫组，且重组菌
图17所示)
此外，沙门氏菌空质粒对照组C501-pYA所诱导的IFN-γ无论是在mRNA水平还
是在蛋白水平上都比 TSB对照组的要高一些，这可能与沙门氏菌本
反应。
肌肉注射组IFN-γ抗体水平要略高于口服免疫组。(如
身可充当佐剂有关，因而可刺激机体产生比较强的细胞免疫
实施例6：利用重组的沙门氏菌C501-COE和C501-SD制备二价基因工程疫苗
将重组菌C501-COE和C501-SD在TSA固体培养基上划线培养，挑取单菌落于
TSB液体培养基中培养， 培养至活菌浓度达到
2.5×1010CFU/mL。将菌液低速离心集菌，按沙门氏菌C501-COE和
C501-SD的菌液： 明胶保护剂(体积：体积)为2∶1的比例加入明胶保护
剂(保护剂配制方法：每100mL ddH2O中加入蔗糖 40g，
明胶8g；充分溶解后于121℃高压灭菌30min，保存备用)，于灭菌冻干瓶中按
2.0mL/瓶分装，置-50 ℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，用
确保没有杂菌
生理盐水或PBS(pH7.4)溶解并进行活菌计数(CFU)，并且
污染，置于-20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。
实施例7：重组疫苗菌株的初步临床保护效果观察
(1)重组疫苗菌株对新生仔猪的安全性试验
从一规模化养猪场随机抽取2窝健康1日龄仔猪(品种为长白猪)，以
3×109CFU的免疫剂量，口服
免疫本发明制备的冻干减毒
沙门氏菌疫苗，跟踪观察7天，发现免疫前后仔猪体温无变化，且仔猪能够正
(2)本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗对仔猪的免疫保护试验
选择两个PEDV感染的规模化猪场，以3×109CFU的免疫剂量，口服
免疫本发明制备的冻干减毒沙门 氏菌疫苗，跟踪观察1周，记录各猪场免
表3和表4)。
常吸吮母乳，由此说明本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗是安全的。
疫后的仔猪(品种为长白猪)发病率和成活率，评价免疫效果(见
表3猪场A应用本发明制备的猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活
疫苗的免疫效果
表4猪场B应用本发明制备的猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活
疫苗的免疫效果
由表3和表4的临床试验统计数据可知，本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗不仅
安全性较好，且具 有较好的预防效果。新生仔猪免疫重组疫苗后，A场腹
下降到8％～
泻率由100％下降到18％～30％，B场死亡率则由80％
20％，结果显示了该重组疫苗具有较好的免疫预防效果。
参考文献
1.A.罗宾逊等.疫苗关键技术详解.原著第二版.(李琦涵，刘龙丁，车艳春等译).北京：
化学工业出版
2.葛俊伟，汪淼，李一经等.表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌
免疫小鼠诱导的免疫
3.汪淼.表达猪流行性腹泻病毒中和抗原区重组乳酸乳球菌系统的构建东北农业大学
硕士毕业论文.[硕
4.徐引弟，郭爱珍，刘维红等.猪霍乱沙门氏菌C500株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载
体系统的构建及鉴
5.徐引弟.猪霍乱沙门氏菌C500株crp-、asd-缺失株平衡致
死系统的构建及应用.[博士学位论文].武
汉：华中农业大学图书馆，2006.
定[J].生物工程学报，2006，22(3)：366-372.
士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，2006.
应答[J].中国兽医科学，2010，40(07)：708-712.
社，2006，12-14.
6.肖少波.伪狂犬病毒gC基因“自杀性”DNA疫苗及VP22蛋白转导的免疫增强效应
研究.[博士学位论
7.张坤，何启盖.猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重
RT-PCR检测方法的建
1001-1005.
M D，
Ames B ort of antibiotics and metabolite analogs by systems under cyclic
AMP control：
立及临床应用[J].畜牧兽医学报，2010，41(8)：
文].武汉：华中农业大学图书馆，2004.
positive selection of Salmonella typhimurium cya and crp mutants[J].J Bacteriol，
gh D，Brian D A，Briton P，et rales：
a new order comprising Coronaviridae and
142(3)：629-633.
D，Cartwright S -
like particles associated with porcine epidemic diarrhea.
25(2)：255-256.
H.，Schifferli D.M，
et ed immune responses to vira lepitopes by combining macrophage-
Res Vet Sci，1978，
Arteriviridae[J].Arch Virol，1997，
1978，133(1)：149-157.
inducible expression with multimeric display on a Salmonella e，2001，
ch G，Bubert A，Gentschev I，et ry of antigen-
encoding plasmid DNA into the
19(20-22)：3009-3018.
cytosol of macrophages by attenuated suicide Listeria monocytogenes[J].Nat Biot
16(2)：181-185. echnol，1998，
G，Chatfield S，Pickard D，Bester J，
O’Callaghan D and Maskell uction and
characterization of vaccine strains of Salmonella harboring mutations in two diffe
genes[J].J Infect Dis，1988，158(6)：1329-1335. rent aro
J E and Curtiss III nce and vaccine potential of phoP mutants of Salmo
nella
J E，Nakayama K，
Curtiss R g and characterization of the asd gene of Salmonella
typhimurium：
typhimurium[J].Microb Pathogen，1989，6：433-443.
use in stable maintenance of recombinant plasmids in Salmonella vaccine strains[J].
nier R，
Furer ion and characterization of GalE mutant Ty 21a of Salmonellu
typhi：a candidate strain fora live，oral typhoid vaccine[J].J Infect Dis，1975，
Gene，1990，94：29-35.
131：553-558.
X H，Young S K，Sang C J，et tion of a Heat-
labile Enterotoxin B Subunit-porcine
P，Medina E，Arioli I，et transfer in dendritic cells，
induced by oral DNA vaccination with Salmonella typhimurium，
Epidemic Diarrhea Virus-
neutralizing Epitope Fusion Protein in Transgenic Lettuce(Lactuca
sativa)[J].BIOTECHNOLO BIOPROC E，2009，14：731-737.
results in protective immunity against a murine
1998，92(9)：3172-3176.
fibrosarcoma[J].Blood，
rt M e Epidemic esofSwine[J].Iowa State University P
ress，
rt M B，Yeo S e epidemic ：Straw B E，Zim-merman J J，
D’Allaire S，Taylor D J.(eds.)，Diseases of -Blackwell，
1986，402-406.
Ames，2006，9：367-372.
chil A，Stuedli A，Kiupel M，
et on porcine epidemic diarrhea[J].J Swine
10(2)：81-85.
S，Dietrich G，Weidinger al design of Salmonella-
based vaccination
D B，Feng L，Shi H Y，Chen J F，et of two novel B cell epitopes on
porcine epidemic diarrhea virus spike protein[J].Veterinary Microbiology，2008，
strategies[J].Methods，2006，38：133-143.
Health Prod，2002，
131：73-81.
y J F，GillesPie J H，Seott F W，
et iology and Infectious Diease of Domestie
Comstock Publishing Associates，1988，897-898.
Z，Xue Y，Wu B，
et aneous vaccination with attenuated Salmonella enterica
serovar Choleraesuis C500 expressing recombinant filamentous hemagglutinin an
d pertactin
：
antigens protects mice against fatal infections with both ca serovar Choler
Bordetella bronchiseptica[J].Infect Immun，2008，76(5)：2157-aesuis and
2163
2024年5月28日发(作者：接傲雪)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.8
(22)申请日 2011.09.23
(71)申请人 华中农业大学;武汉科前动物生物制品有限责任公司
地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
(72)发明人 何启盖 徐丽丽 库旭钢 李燕 李娜娜 张坤 陈焕春 郭爱珍 徐高原
(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所
代理人 张红兵
(51)
C12N1/21
C12N15/50
C12N15/63
A61K39/295
A61P31/04
A61P31/14
C12R1/42
A61K39/112
A61K39/215
(10)申请公布号 CN 103013895 A
(43)申请公布日 2013.04.03
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门
氏菌基因工程活疫苗及制备与应用
(57)摘要
本发明属于动物细菌基因工程技术
领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达
猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组的
猪霍乱沙门氏菌菌株C501-COE和C501-
SD的构建、疫苗制备及应用。本发明得到
一种不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病
毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌
C501-COE和C501-SD，其保藏号分别为
CCTCC NO：M2011296；CCTCC NO：
M2011297，这两株重组菌株缺失了猪霍乱
沙门氏菌生长所必需的asd基因，并含有
能够在该菌株中表达asd基因和猪流行性
腹泻病毒COE基因片段、SD基因片段的
质粒。还公开了利用该重组菌制备猪霍乱
沙门氏菌和猪流行性腹泻疫苗的方法及应
用。本发明的疫苗可以刺激猪产生抵抗猪
霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒的保护
性免疫反应，有效防止猪霍乱沙门氏菌和
猪流行性腹泻病毒的感染。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD，其特征在于，所述的猪霍乱
沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)C501-COE和C501-SD保藏在中国典型培养物保
藏中心，其保藏号分别为CCTCC NO：M2011296和CCTCC NO：M2011297，所
述的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD分别含有表达猪流行性腹泻病毒保护
性抗原基因COE和SD，它们的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2和4所示。
2.一种重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD的制备方法，它包括下列步骤：
1)分别构建重组质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD，用如下所示的两个引物对从患
猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea)的病猪粪便病料中分别扩增猪流行性腹
泻病毒COE基因和SD基因，所述的COE基因和SD基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示：
所用引物对的DNA序列分别如下所示：
COE正向引物：GATGAATTCATGCATGAACAGCCAATTTC(5′→3′)，
COE反向引物：GGGAAGCTTGATAGTATACTTGGTACACACATCC(5′→3′)；
SD正向引物：GACGAATTCATGACAGACGTTTCTTTTATGACTC(5′→3′)，
SD反向引物：GGGGTCGACAATACTCATACTAAAGTTGGTGGG(5′→3′)；
分别将其亚克隆至原核表达载体pET-32a上，构建重组质粒pET-32a-COE和pET-
32a-SD，其中重组质粒pET-32a-COE包含如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸
序列；所述的重组质粒pET-32a-SD包含如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序
列；
2)分别构建重组质粒pYA-COE和pYA-SD，将构建正确的原核表达质粒pET-32a-
COE和pET-32a-SD分别进行双酶切，并与经过相同双酶切的穿梭质粒pYA3493
进行连接，转化asd基因缺失的大肠杆菌x6097，筛选阳性克隆；
3)分别构建重组猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD，将重组质粒pYA-COE和
pYA-SD电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株中，分别得到保藏编号为
CCTCC NO：M2011296和CCTCC NO：M2011297的猪霍乱沙门氏菌C501-COE
和C501-SD。
3.一种能够原核表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段COE，该片段的核
苷酸序列如下所示：
CATGAACAGC CAATTTCTTT TGTTACTTTG CCATCATTCA ATGATCATTC
TTTTGTTAAT ATTACTGTCT CTGCGGCTTT TGGTGGTCAT AGTGGTGCCA
ACCTCATTGC ATCTGACACT ACTATCAATG GGTTTAGTTC TTTCTGTGTT
GACACTAGAC AATTTACCAT TACACTGTTT TATAACGTTA CAAACAGTTA
TGGTTATGTG TCTAAGTCAC AGGATAGTAA TTGCCCTTTC ACCTTGCAAT
CTGTTAATGA TTACCTGTCT TTTAGCAAAT TTTGTGTTTC AACCAGCCTT
TTGGCTGGTG CTTGTACCAT AGATCTTTTT GGTTACCCTG AGTTCGGTAG
TGGTGTTAAG TTTACGTCCC TTTATTTTCA ATTCACAAAG GGTGAGTTGA
TTACTGGCAC GCCTAAACCA CTTCAAGGTG TCACGGACGT TTCTTTTATG
ACTCTGGATG TGTGTACCA AGTATACTATC
一种能够原核表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段SD，该片段的核苷
酸序列如下所示：
ACAGACGTTT CTTTTATGAC TCTGGATGTG TGTACCAAGT ATACTATCTAT
GGCTTTAAAG GTGAGGGTAT TATTACCCTT ACAAATTCTA GCTTTTTGGC
AGGTGTTTAT TATACATCTG ATTCTGGACA GTTGTTAGCC TTTAAGAATG
TCACTAGTGG TGCTGTTTAT TCTGTTACGC CATGTTCTTT TTCAGAGCAG
GCTGCATATG TTGATGATGA TATAGTGGGT GTTATTTCTA GTTTGTCTAA
CTCCACTTTT AACAATACCA GGGAGTTGCC TGGTTTCTTC TACCATTCTA
ATGATGGCTC CAATTGTACA GAGCCTGTGT TGGTGTATAG TAACATAGGT
GTCTGTAAAT CTGGCAGTAT TGGCTATGTC CCACTTCAGG ATGGCCAAG
TCAAGATTGC ACCCATGGTT ACTGGGAATA TTAGTATTCC CACCAACTTT
AGTATGAGTA TT。
4.一种猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻二价基因工程疫苗，其特征包括，该疫苗含
有权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD，按照体积比，猪霍乱
沙门氏菌C501-COE和C501-SD的菌液与明胶保护剂比例为2∶1。
5.权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻二
价基因工程疫苗中的应用。
说 明 书
技术领域
本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及两种不含抗性标记的分别表达猪
流行性腹泻病毒保 护性抗原基因-COE基因和SD基因的重组的猪霍乱沙
门氏菌活疫苗菌株的构建及应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonellu)是一种胞内寄生的革兰氏阴性肠道杆菌，具有侵袭性，最常
见的沙门氏菌属 有鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等。
人体和动物的胃肠道沙门氏菌对人和动物均有较强的致病力，可引起
疾病，沙门氏菌在外界环境中的生存能力较强，在利用基因工程的方法致弱以后，
仍
最初预防沙门氏菌的疫苗是全菌灭活苗，但该疫苗只能激发机体的体液免疫，且易
引起副作用，另外， 还存在着需免疫多次和无交叉保护的缺点，因而
染的方式，给
具有较强的侵袭力。
不能广泛应用。此后，研究学者模拟沙门氏菌肠道自然感
动物口服减毒的沙门氏菌(如肠炎沙门氏菌Ty21a的口服弱毒苗)，结果发现，可诱
导机体 产生更好的体液免疫和细胞免疫，因此受到很多研究学者的普
遍重视(Gernianier R et al.，1975)。
由于肠炎伤寒沙门氏菌Ty21a致弱的遗传背景不清晰，各国研究学者，尝试运用
基因工程的方法，研 究遗传背景清晰的伤寒弱毒基因缺失疫苗株，用
1988)、于口服免疫研究，例如，aro基因缺失株(Dougan G et al.，
cya/crp缺失株(Alper M D et al.，1978)、Dam和phoP/phoQ缺失株(Galan J E et al.，
1989)、
asd基因缺失株(徐引弟等，2006)等。
弱毒沙门氏菌除本身可以作为疫苗以外，也可被用作载体来表达外源抗原基因，近
年来，以弱毒沙门 氏菌为载体表达肿瘤、病毒、细菌和寄生虫等的外源抗
从而为研制新型基因原，研制多价基因工程疫苗成为该领域的研究热点，
工程疫苗开辟了新的途径(Zhao Z et al.，2008)。
近年来，弱毒沙门氏菌为载体的基因工程疫苗成为研究的热点，其优越性主要表现
在(徐引弟博士论
(1)抗原递呈的有效性，尤其是口服或滴鼻免疫时，效果更佳(Dietrich et al.，1998)；
(2)可产生特异性细胞毒性T细胞杀伤反应(CTL效应)；
(3)可以激发黏膜和系统免疫反应。以弱毒沙门氏菌为载体的疫苗经口服或滴鼻的
方式免疫后，可以 直接将外源抗原运载至机体的黏膜相关淋巴组织
al.，2006)；
文，2006)：
(MALT)，从而激发机体的黏膜和系统免疫反应(Spreng et
(4)具有免疫佐剂作用。沙门氏菌的LPS是一种内在佐剂，此外，有研究表明，沙
门氏菌内部有一个 非甲基化的CpG DNA序列，具有较强的免疫刺激活性，
被认为是具有应用潜
可以促进机体内部Th型为主的免疫应答，因而，
力的免疫增强剂和免疫佐剂(Paglia et al.，1998)；
(5)免疫具有持续性。减毒沙门氏菌载体所携带的质粒不易丢失，且可长期稳定地
存在于机体淋巴组
体的免疫应答反应；
(6)联合免疫作用。减毒沙门氏菌本身所携带的抗原与质粒表达的外源抗原起到了
联合免疫的作用， 同时，还可以将2个或2个以上的外源抗原基因插入到
织内，从而不需反复多次地加强免疫也可长期地激发机
表达质粒中，免疫宿主后可针对不同的外源抗原产
从而达到一次免疫防治多种疾病的疗效；
生相应的免疫反应，
(7)所表达的抗原蛋白不需提纯。以减毒沙门氏菌为载体的疫苗，只需过夜培养即
可直接免疫，从而 省去了诱导剂诱导与纯化蛋白的步骤，制备过程简单、
作成本； 省时，且易于储存运输，因此，可显著降低疫苗制
(8)接种方式简便，易于操作，适于群体免疫，且安全性好。
猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株是在含醋酸铊的培养基中，连续传代500次致弱的菌
株，其具有良好免 疫原性，实践也证明了C500株具有良好的免疫原性，
低、安全性好的特点。且能激活全身、局部和粘膜免疫系统，具有副作用
其中，最常用的是沙门氏菌Asd-平衡致死系统(Galan J E，et al.1990)。华中
农业大学农业微生物学国家重点实验室徐引弟博士构建了C500株的asd基
证实Δasd C500缺失株的免疫原性，与
应用于
因缺失株Δasd C500，经实验
C500菌株相比，毒力更低，安全性更好(徐引弟等，2006)，且已
重组活疫苗的制备，如申请人所在农业微生物国家重点实验室构建了猪传染性胃肠
炎的重组沙门氏 菌活疫苗，经临床验证，该疫苗具有较好的免疫预防效
2)。 果，且已申请了中国发明专利(专利申请号为
猪流行性腹泻(PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起，一种高度接触性的急性传染
病，猪感染PEDV 以后，常引起仔猪的急性肠炎及致命性水泻直至脱水死
脱水；PEDV感染猪，亡，其临床特征主要表现在仔猪呕吐、严重腹泻和
剖检病理变化主要表现为猪的空肠和回肠部分的肠绒毛的萎缩和脱落(Pensaert and
Yeo，2006)。PED对猪的危害很大，各种年龄的猪均可发病，但对哺乳仔
仔猪死亡率达95％以上(Timoney J F et al.，
猪的危害最为严重，20日龄以内
1988)，给养猪业带来重大经济损失。
目前，PED在世界范围内广泛流行。在欧洲各国，PED较以前的流行程度已明显
降低，但是在亚洲猪 场中PEDV的感染率非常高，尤其是在韩国、
极为相日本和中国等，从致病机理和临床症状上来看，PEDV与TGEV
似，且由于其感染率明显高于TGEV和猪轮状病毒(PoRV)，给养猪业造成了巨大
的损失(Cavanagh
PEDV属于冠状病毒科、冠状病毒属。PED首次发现并报道是在1971年的英国
(Oldham，1972)。自此 以后，该病在欧洲和亚洲大规模发生报道
了PED的发
D et al.，1997)。
(Puranaveja et al.，2009)，自1976年开始，我国相继报道
生，现在PED已成为世界范围内流行的重要的猪病毒性腹泻病之一。1978年，引
起该病的病原 体-PEDV，在英国和比利时首次得到鉴定(Chasey et al.，
的第五次报告被列为冠状病1978)，且在1991年国际病毒分类委员会(ICTV)
毒属的可能成员，直到1995年的第六次报告才被列为冠状病毒属的正式成员。
PEDV粒子形态特征与冠状病毒科其它成员的很相似(Chasey et al.，1978)，纤突糖
蛋白(S蛋白)、 膜糖蛋白(M蛋白)和包膜糖蛋白(E蛋白)分布于病毒粒
内部，PEDV的核衣壳结构
子的表面；核衣壳蛋白(N蛋白)位于病毒粒子
是由N蛋白与基因组RNA相互作用而形成的，这使得PEDV与传染性胃肠炎病毒
在形态学上很难区别(Pensaert et al.，1986)。目前为止，研究发现PEDV只
et al.，1981)。 存在一个血清型(Witte
PEDV S蛋白在介导感染宿主产生中和抗体的过程中发挥重要作用，近年来，国内
外研究人员先后对 PEDV S基因进行了的研究。2002年Chang等据
个抗原表位区TGEV S基因的中和表位序列，推测出了PEDV S基因的一
(499～638aa)，并命名为COE，经试验证实，该基因具有较好的免疫原性，且也已
作为靶基 因，应用到转基因植物疫苗和基因工程疫苗的制备之中
是以体液免疫为主的病毒，(Nguyen et al.，2009；葛俊伟等，2010)。PEDV
因而，B细胞抗原表位在抗PEDV感染中具有重要的意义，Sun等人(2008)通
过实验鉴定得知S1亚基的S1D(636-789aa)区中
能为PEDV的两个B所包含的S1D5(744-759aa)和S1D6(756-771aa)，可
细胞表位(Sun D B et al.，2008)，另外S1D区还包括了一个免疫原性较好的高亲和
国内外常用的预防PED发生的方法是，将PEDV感染猪的粪便或发病仔猪的肠内
容物，人工感染妊娠 母猪，刺激产生母源抗体，仔猪吮乳后，获得保
力表位序列S1P3(697-742aa)。
护，降低死亡率和缩短PED流行时间。
与大多数病毒性疾病相同，对PED的防控，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，
PED商业化的疫苗主 要是灭活苗和弱毒苗两种，两种疫苗在使用后，
推测其原因为虽然在一定程度上可以预防PED的发生，但效果不理想。
PEDV主要经肠道感染猪，局部肠黏膜免疫系统在抗PEDV感染的免疫过程中发挥
了重要的作 用(Pospischil A et al.，2002)，因而刺激肠道黏膜产生的特异性
疫苗关键的问题。然而，现有的商sIgA，成为防制本病发生和研制PED
业化灭活苗和弱毒苗在免疫后，只能诱导体液免疫应答，不能激活黏膜
免疫系统，即使有较高的血清抗体滴度，仍不能阻止病原经黏膜入侵体内，
已有PED转基因植物疫苗和基因工程活
此，开
因而免疫效果不佳。目前，虽
疫苗的相关研究，但只是处于实验研究阶段，还未实现商业化，因
发更加安全、高效、廉价的新型疫苗是世界养猪业的迫切需要。
鉴于减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有运送效率高，免疫方法简单，免疫效果较好，
能同时激发全身免 疫和局部粘膜免疫等优点，有着良好的应用前景。重组
前所采用的携带抗性沙门氏菌疫苗的传统构建方法存在很多缺陷，如以
基因的表达质粒，因其所存在的生物安全问题，而不被人们所接受。本研究所使用
的 猪霍乱沙门氏菌C500asd质粒-载体平衡致死系统具有无抗性标记的
达量高、外源基因表达稳定和不需优点，此外，还具有免疫原性好、表
纯化等优点，因而，将其开发为表达猪流行性腹泻病毒主要抗原基因的
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，其第一个目的是获得表达猪流行性腹
泻病毒保护性抗原
氏菌株。
本发明的第二个目的是利用上述的重组菌获得一种猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻
病毒二价基因工
本发明的第三个目的是上述重组菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒二价
基因工程疫苗中
本发明通过以下技术方案实现：
申请人通过基因工程的方法，获得了表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因-COE
基因和SD基因的 重组的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)-C501-
22日送交位于湖北省武汉
的应用。
程疫苗。
蛋白基因-COE基因和SD蛋白基因的重组猪霍乱沙门
重组活疫苗具有广阔的应用前景。
COE和C501-SD，该两菌株已于2011年8月
市武汉大学内的中国典型微生物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号分别为
CCTCC
两个重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD的制备方法，主要包括下列步
骤：
1)原核表达质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD的构建：从患猪流行性腹泻病
(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病猪粪便病料中，扩增猪流行性腹泻
NO：M2011296；CCTCC NO：M2011297。
病毒COE基因和SD基因，并分别将其亚克隆至原
构建原核表达质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD；
核表达载体pET-32a，
2)重组质粒pYA-COE和pYA-SD的构建：将构建正确的原核表达质粒进行双酶切，
并与经过相同双酶 切的穿梭质粒pYA3493进
行连接，转化Asd-的大肠杆菌x6097，筛选阳性克隆；
3)重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD的构建：将重组质粒pYA-COE和
pYA-SD电转化至猪 霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株中，得到保藏编号
的重组的猪霍分别为CCTCC NO：M2011296；CCTCC NO：M2011297
乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD。
申请人获得两种猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的基因片段COE基因、SD基因，
它们的核苷酸序列如 序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示
(其制备方法见实施例所示)。
申请人利用所述的重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE菌液、重组的猪霍乱沙门氏菌
C501-SD菌液与明 胶保护剂按照适当体积比(见实施例)成功制备一种防治
疫苗。 猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹泻的二价基因工程
上述的不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌
株缺失了沙门氏 菌株基因组中必需的细胞壁形成相关基因asd基因(需
的培养基上才能正常要含asd基因的质粒存在于菌体内或外源添加DAP
生长、繁殖)，同时这两株重组菌株分别含有外源质粒pYA-COE和pYA-SD(均含
有 asd基因)，这两株重组菌株均保留了亲本菌株C500作为猪霍乱沙门
pYA-COE和pYA-SD均能在该菌氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。质粒
株中表达asd基因，且两者能分别表达猪流行性腹泻病毒S蛋白中的COE抗
原位点和SD抗原位点基因。其中，asd基因表达产物提供沙门氏菌株必需
的细胞壁形成相关成份。COE抗 原位点和SD抗原位点基因表达产物提供
良好的针对猪流行性腹泻病毒的免疫原性。
本发明的不含抗性标记的表达猪流行性腹泻病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏
菌株C501-COE和 C501-SD，这两株基因工程菌株均衍生于在中国已经使
C500。所述的本发用了50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株
明的重组猪霍乱沙门氏菌株C501-COE和C501-SD，缺失了C500菌株基因组中的
asd基 因，同时添加了含有猪流行性腹泻病毒S蛋白中的COE抗原位点和
pYA-SD。由于需要pYA-COE和SD抗原位点基因的质粒pYA-COE和
pYA-SD的存在重组菌株才能存活，因此大大提高了质粒pYA-COE和pYA-SD
(也就是COE抗原位点和SD抗原位点基因)在重组菌株中的稳定性。COE
重组菌株中的稳定表达，使之具有针对猪
抗原位点和SD抗原位点基因在
传染性胃肠炎病毒很好的免疫保护力。
本发明的基本构建方法是：利用本申请人所在的农业微生物国家重点实验室构建好
的asd基因缺失的 猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500ΔcrpΔasd缺失株(徐引
腹泻病毒COE和SD基因弟等，2006)构建含有能够原核表达猪流行性
的质粒pYA-COE和pYA-SD。将重组质粒分别电转入C500asd基因缺失株中，这
样 重组质粒与C500asd基因缺失株形成互补，而满足生长需要，进而稳
性标记的能表达猪流行性腹泻病毒定共存，形成了我们发明的不含抗
保护性抗原的重组菌株C501-COE和C501-SD。通过大量的生物学实验数
据证明本发明制备的重组菌株可用于制备针对猪霍乱沙门氏菌和猪流行性腹
泻的二价基因工程疫苗。
本发明的主要优点是：
1、本发明的重组菌株表达的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中的A、D抗原位点和N
蛋白中的N321抗原位 点是猪传染性胃肠炎病毒重要的免疫原性
基因片段，本发明的重组菌株表达的猪流行性腹泻病毒保护性抗 原基因
-COE基因和SD基因是猪流行性腹泻病毒重要的免疫原性基因片段，均具有良好
的免疫保护性。由 于猪传染性胃肠炎病毒和猪、流行性腹泻病毒危害日益
猪流行性腹泻疫苗严重，而目前市场上各种商品化猪传染性胃肠炎和
(主要是佐剂灭活苗和弱毒苗)免疫效果普遍较差。因此，用该基因工程菌株制成的
疫
2、本发明的重组菌株衍生于在中国已经使用了50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌
弱毒疫苗株C500， 完全保留了C500针对猪霍乱沙门氏菌的免疫效力。而
安全性。
苗具有广阔的市场应用前景。
且，该重组菌株毒力比C500稍弱，具有更好的生物
3、本发明的重组菌株可以同时提供针对猪霍乱沙门氏菌、传染性胃肠炎病毒和猪
流行性腹泻三种病
4、本发明所研制的疫苗，与现有的灭活苗和弱毒苗相比，具有制备过程简单、省
时，且易于储存运
5、本发明的重组菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。
更详细的技术方案见实施例所述。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因COE的
核苷酸片段。
序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因SD的核
苷酸片段。
输的特点，显著降低了疫苗的制作成本。
原的保护力。
图1：本发明制备的能够原核表达的猪流行性腹泻保护性抗原基因片段构建流程图。
图2：本发明制备的能够原核表达的COE基因和SD基因的序列比对图。其中，图
2A：能够原核表达 的COE基因与其它毒株相应序列的比对；图2B：能够
原核表达的SD基因与其它毒株相应序列的比对。
图3：本发明制备重组沙门氏菌所用穿梭质粒pYA3493的图谱。
图4：本发明制备重组质粒pYA-COE和pYA-SD的PCR鉴定图片。其中：
图4A：pYA-COE PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1-2：pYA-
COE；3：阳性对照；4：
阴性对照；
图4B：pYA-SD PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1-2：pYA-SD；
3：阳性对照；4：阴
图5：本发明制备重组质粒pYA-COE和pYA-SD的酶切鉴定结果电泳图。其中，
M1：DNA Marker(DL2000)；M2：DNA marker(DL15000)；1：
3：pYA-
性对照。
pYA3493/EcoR I；2：pYA-COE/EcoRI+HindIII；
SD/EcoRI+Sal I。
图6：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD的构建流程图。
图7：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD的PCR鉴定图。其中，
图7A：重组菌C501-COE PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1-2：
C501-COE；3：阳性
对照；
4：阴性对照；
图7B：重组菌C501-SD PCR鉴定图片。其中，M：DNA Marker(DL2000)；1-2：
C501-SD；3：阳性对
4：阴性对照。
图8：本发明制备的重组菌株C501-COE和C501-SD中沙门氏菌invA基因的扩增
图片。其中，
M：DNA Marker(DL2000)；1：阳性对照；2：C501-COE中invA基因扩增；3：
501-SD中invA基因扩增。
图9：利用Western blotting方法检测本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD
中蛋白的分泌表达。
图9A：含有COE蛋白在重组菌C501-COE中的分泌表达。其中，M：
Prestained Protein Ladder；
图9B：含有SD蛋白在重组菌C501-SD中的分泌表达。其中，M：
Prestained Protein Ladder。
图10：利用间接免疫荧光实验检测本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD中
表达蛋白在细菌中的 定位。其中，图10A：C501-COE；图10B：
其中：
照；
C501-SD；图10C：C501-pYA。
图11：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD的生长曲线图。
图12：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD的遗传稳定性实验结果。其中：
图12A：重组菌C501-COE的遗传稳定性鉴定结果。其中，M：
DNA Marker(DL2000)；1-6：分别为重组 菌C501-COE传代50次、40次、
30次、20次、10次和第1代的PCR鉴定结果；
图12B：重组菌C501-SD的遗传稳定性鉴定结果。其中，M：
DNA Marker(DL2000)；1-6：分别为重组
30次、40次和50次后的PCR鉴定结果。
图13：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD在免疫BalB/C小鼠后针对外源
抗原的的黏膜sIgA
图13A：重组菌C501-COE免疫小鼠后的抗COE蛋白的黏膜sIgA抗体水平；
图13B：重组菌C501-SD免疫小鼠后的抗SD蛋白的黏膜sIgA抗体水平。
图14：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD在免疫BalB/C小鼠后针对外源
抗原的血清IgG抗
图14A：重组菌C501-COE免疫小鼠后的抗COE蛋白的血清IgG抗体水平；
图14B：重组菌C501-SD免疫小鼠后的抗SD蛋白的血清IgG抗体水平。
图15：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD在免疫BalB/C小鼠后针沙门氏
菌的抗体水平。其
中：
体水平。其中：
抗体水平。其中：
菌C501-SD第1代及传代20次、
图15A：重组菌C501-COE和C501-SD免疫小鼠后的抗沙门氏菌的血清IgG抗体
水平；
图15B：重组菌C501-COE和C501-SD免疫小鼠后的抗沙门氏菌的黏膜sIgA抗体
水平。
图16：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD在小鼠体内诱导的IFN-γmRNA
上的差异水平比较。
图16A：重组菌C501-COE诱导的IFN-γmRNA水平与空质粒对照菌的对照结果；
图16B：重组菌C501-SD诱导的IFN-γmRNA水平与空质粒对照菌的对照结果。
图17：本发明制备的重组菌C501-COE和C501-SD在小鼠体内诱导的IFN-γ蛋白
表达水平的差异比
图17A：重组菌C501-COE诱导的IFN-γ蛋白表达水平与空质粒对照菌的对照结果；
图17B：重组菌C501-SD诱导的IFN-γ蛋白表达水平与空质粒对照菌的对照结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。
实施例1：制备能够原核表达的猪流行性腹泻保护性抗原COE和SD蛋白的基因片
较。其中：
其中；
段
(1)制备原核表达质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD所需的引物设计，其序列如表1
所述。
表1制备原核表达质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD所需的引物序列
表1中引物的下划线部分为酶切位点。
(2)制备能够原核表达的COE和SD片段
利用张坤报道的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重
RT-PCR检测方法(张 坤，2010)，检测送检的临床病料。从猪流行性
BioFlux公司
腹泻病毒感染的阳性粪便病料中，提取基因组RNA(采用
的总RNA提取试剂盒，按照该公司提供的试剂盒说明书操作)，然后进行反转录。
以反转录所 得到的cDNA为模板，分别以表1所示的EP1/HP2和
切位点的SDE1/SDS2为引物，PCR扩增带有EcoR I、HindIII酶
PEDV COE基因和带有ECOR I、Sal I酶切位点的SD基因片段，扩增体系如下所
述：
COE基因片断和SD基因片段的PCR扩增条件：95℃预变性4min后，进行如下循
环：94℃变性40s，
72℃10min。
58.1℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环，最后
扩增完成后，取PCR产物8μL，加入1μL10×Loading Buffer，用0.8％琼脂糖凝胶
进行电泳，EB染 色，观察电泳结果。电泳后用BioFlux公司胶回收试剂
作)。将纯化后的盒进行目的基因的纯化(按照该试剂盒的说明书操
COE基因片段与原核表达载体pET-32a分别进行EcoR I和HindIII双酶切后跑胶回
收，利 用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)；
pET-32a分别进行EcoR I和Sal I将纯化后的SD基因片段与原核表达载体
双酶切后跑胶回收，利用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌表达宿主菌
BL21(DE3)。经PCR、双酶切和测序鉴定，最终得到能够原核表达的猪流行
够原核表达的基因片段的制备流程如图1
性腹泻COE和SD基因片段。能
所示。测序结果与其它毒株序列的比对结果如图2所示。
实施例2：重组质粒pYA-COE和pYA-SD的构建与鉴定
将带有EcoR I、HindIII酶切位点的重组质粒pET-32a-COE和带有ECOR I、Sal I
酶切位点的 pET-32a-SD进行双酶切回收，然后与同样经过双酶切回收的
接，连接产物转化asd基因穿梭质粒pYA3493(质粒构建图谱见图3)连
缺失的大肠杆菌x6097(来源：美国华盛顿大学 Curtiss III教授惠赠)，
筛选阳性克隆，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定，得到构建正确的重组质
图5所示)。其中，PCR扩增体系及扩增粒pYA-COE和pYA-SD(如图4和
条件如实施例1，(2)所述。
实施例3：表达猪流行性腹泻病毒COE和SD融合蛋白的重组沙门氏菌菌株C501-
COE和C501-SD的构建与
(1)鉴定重组的沙门氏菌C501-COE和C501-SD所需的引物的设计，其DNA序列如
表2所示：
鉴定
表2鉴定重组的沙门氏菌C501-COE和C501-SD所需的引物的DNA序列
(2)重组的沙门氏菌C501-COE和C501-SD的构建与鉴定方法
将鉴定正确的重组质粒pYA-COE和pYA-SD(来源见实施例2)分别电转化至asd缺
失的C500-感受态 细胞中，电转仪(Bio-Rad GenePulserII)参数设置为：电
间4ms，构建流程图见图6。压2.2Kv，电容25μF，脉冲电阻200Ω和时
在DAP阴性平板上，挑取单菌落于TSB液体培养基中培养8-10h，吸取1mL
菌液制备模板，分别以表1所示的EP1/HP2和SDE1/SDS2为引物，进行目
再使用沙门氏菌特异基因invA基因
行沙门
的片段的扩增(如图7所示)；
(GenBank：M90846.1)的特异性引物pi1/pi2(见表2)对重组菌进
氏菌特异性鉴定(如图8所示)；最后以表2所示的引物pY1为上游测序引物进行测
序鉴定。结果 表明含有pYA-COE和pYA-SD质粒的重组的猪霍乱沙
氏菌菌株门氏菌构建正确，申请人分别将其命名为猪霍乱沙门
(Salmonella choleraesuis)C501-COE和C501-SD，并送交中国典型培养物保藏中心
(CCTCC)
实施例4：表达猪流行性腹泻病毒COE和SD融合蛋白的重组沙门氏菌菌株C501-
COE和C501-SD的生物学
(1)重组菌C501-COE和C501-SD的表达特性分析
分别挑取重组菌C501-COE和C501-SD的单菌落于TSB液体培养基中，37℃，
200r/min培养12h，4 ℃放置12h，按1∶100的体积比接种于TSB液
磅高压
特性
用于专利程序的保藏。
体培养基(配方：3％TSB粉末(30g)溶于ddH2O中，15
灭菌15min后于室温保存。)中，37℃，200r/min，培养6-8h，8000rpm离心10min，
分别收集 菌体和上清，上清液经0.22μm滤膜过滤，取900μl上清，并
菌的终浓度均达到10％，加入100％的三氯乙酸100μl，使上述重组
冰浴30min后，12000r/min，离心30min，弃上清；加入1mL预冷的无水乙醇
洗涤沉淀，12000r/min，离心10min，如此重复洗涤2次。将所得到的蛋白
阳性血清(由中国农业科学院哈尔滨兽医
鉴定
用猪源抗猪流行性腹泻病毒
研究所惠赠，见遗传资源表所述)作一抗，进行Western blotting
(如图9所示)，结果显示本发明的重组菌能够分泌表达融合蛋白，且融合蛋白能够
与猪的猪流行性
此外，经间接免疫荧光实验对融合蛋白在细菌中的定位进行了鉴定，鉴定方法参考
汪淼的硕士论文 (汪淼.2006。)，实验结果显示，重组菌所表达的融合蛋
腹泻病毒阳性血清抗体发生特异性反应。
白定位于细菌的表面(如图10所示)。
(2)重组菌C501-COE和C501-SD的生长特性分析
将重组菌C501-COE、C501-SD在TSB中37℃培养过夜后，进行连续10倍稀释，
选取3个合适的稀释 梯度，每个稀释度取100μL均匀涂布在TSA平板上，
取平均值，并计算出每个梯度各做3个重复，37℃，培养过夜，计数，
原液的CFU(菌落形成单位)。转接使其终浓度为106CFU/mL，37℃，
200r/min振 荡培养，每间隔1h取样，测OD600值，绘制生长曲线。相同
质粒对照菌株C501-pYA的的方法绘制亲本株猪沙门氏菌C500及空载体
生长曲线，然后比较其生长特性的差异。从重组菌的生长曲线(如图11所示)
可以看出，重组菌C501-COE、重组菌C501-SD、空载体质粒对照菌株
与亲本
C501-pYA在培养过程中，生长状态
菌株猪沙门氏菌C500基本相似，只是生长速度稍慢于亲本猪沙门氏菌。
(3)重组菌C501-COE和C501-SD的表型鉴定
分别将重组菌C501-COE、C501-SD、空质粒对照菌株C501-pYA和亲本菌株C500
划线接种于TSA平板， 然后挑取单菌落，分别转接阿拉伯糖、甘露糖、
蔗糖等碳源生硫化氢、乳糖、木糖、尿素、葡萄糖、鼠李糖、卫茅醇、
化鉴定管，37℃，温育24h，进行重组菌的表型判定。生化鉴定结果表明，重组菌
C501-COE、 C501-SD和C501-pYA与亲本菌C500生化特性相同，都不能
蔗糖，但是能利用甘露糖、
利用蔗糖、阿拉伯糖、尿素、乳糖、卫茅醇和
木糖、葡萄糖、和鼠李糖作为唯一碳源。
(4)重组菌C501-COE和C501-SD的遗传稳定性
将重组菌C501-COE和C501-SD在用TSA固体培养基(配方：4％TSA粉末(40g)溶
于ddH2O中，15 磅高压灭菌15min后于室温保存。)制备的平板上划线
振荡培养12h，然后培养，挑取单菌落至液体培养基中，37℃，200r/min，
按1∶100的体积比转接到新鲜的TSB液体培养基中，培养12h，如此连续重复转
接 培养50次，以第1、10、20、30、40和50代的培养物为模板，分别
进行PCR扩增，PCR扩增用表1所述的引物EP1/HP2和SDE1/SDS2
体系及扩增条件如实施例1，(2)所述，检测重组质粒pYA-COE和pYA-SD在
Δasd C500 中的遗传稳定性。鉴定结果证明，均可以从各代重组菌培养物
带(如图12所示)。 中扩增出480bp和462bp的特异性DNA条
实施例5：以Balb/C小鼠为动物模型分析重组菌的免疫原性
1.小鼠免疫实验设计
70只BALB/c小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心，见遗传资源表所述)随机分为7
小组，每组10只， 分别为口服重组菌C501-COE、肌注重组菌C501-COE、
组菌C501-pYA、肌口服重组菌C501-SD、肌注重组菌C501-SD、口服重
注重组菌C501-pYA和TSB对照组，于首免后两周和二免后两周(首免后4周)断尾
采 血和收集肠内容物，间接ELISA方法检测抗体水平(IgA和IgG抗体)，
具体操作步骤如下所述：
1.1免疫小鼠血清IgG抗体水平ELISA检测：
按照文献《疫苗关键技术详解》原著第二版(A.罗宾逊等，2006)，将原核表达蛋白
(COE蛋白和 SD蛋白)按0.5μg/孔的浓度包被酶标板，100μl/孔，4℃，包被
过夜，洗涤液洗涤3次，3min/次；
(2)加入封闭液进行封闭，150μl/孔，37℃，封闭2h，取出洗涤3次，3min/次；
(3)将待检血清从1∶2或1∶10开始进行倍比稀释，加入酶标板，100μl/孔，37℃，
反应1h，取出
(4)加入1∶6000倍稀释的羊抗鼠HRP-IgG，100μl/孔，37℃，反应1h，洗涤5-6次，
3min/次；
(5)加入四甲基联苯胺底物(A+B)100μl，室温避光反应10-15min，再加入50μl 0.25％
HF终止
(6)选择OD630nm≥0.2的反应孔，作为阳性，取待检血清的最高稀释倍
数的倒数，换算成抗体的滴度。
1.2免疫小鼠肠分泌性IgA抗体水平检测：
分别于免疫后21d，28d随机取2-3只小鼠，颈椎脱臼处死，刮取肠道表面粘液于
1.5ml离心管中，
用pH 7.4PBS作10倍稀释，混匀后-20℃保存备用。
反应，用酶标仪测定OD630nm；
洗涤3次，3min/次；
肠道sIgA抗体ELISA检测方法同实施例5，1.1所述。其中，间接ELISA检测方
法所用的核心试剂的成
包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液(25mmol/L)；
Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，
ddH2O定容至至1L；
PBS缓冲液：140mmol NaCl(8.18g)，2.7mmol KCl(0.20g)，
10mmol Na2HPO4(3.58g)，1.8
mmol KH2PO4(0.245g)，溶于
分及制备步骤如下所示：
800mL ddH2O中，用5mol/L的NaOH调至pH7.4后，
ddH2O定容至至1L；
洗涤液：在PBS缓冲液中加入0.05％的Tween-20；
封闭液：1L洗涤液中加入0.50g牛血清蛋白(BSA)；
底物缓冲液：pH5.0的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液25.7mL，0.1mol/L的柠檬酸液
24.3mL，0.2mol/L的
TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL的无水乙醇中；
底物液(TMB)：将TMB母液与底物缓冲液按按1∶20的比例混合均匀后，每毫升
底物液中加入30％的
终止液：0.25％HF。
免疫前，需对重组菌进行活菌计数。口服组免疫前4h，BALB/c小鼠需停水停料，
H2O2 0.2μL；
Na2HPO4 25.7mL，ddH2O 50mL；
在免疫前20min 口服50μl 10％NaHCO3中和胃酸，然后用
鼠免疫剂量约12号BALB/c小鼠灌胃针口服免疫200μl，使每只BALB/c小
为1.5×108个活菌量(剂量参照：中华人民共和国兽用生物制品质量标
准，2001版)；肌 肉注射组每只BALB/c小鼠免疫剂量与口服免疫组下相
同；TSB空白对照组免疫接种200μl。
免疫后2周，每组随机选取5只进行加强免疫。分别于首次免疫前、首次免疫后2
周、加强免疫后2 周进行小鼠尾静脉负压采血，收集血清，将5只
平均抗体水平。BALB/c小鼠血清等量混合，采用间接ELISA法检测各组
2.免疫BALB/c小鼠的抗猪流行性腹泻病毒保护性抗原蛋白抗体水平的检测
分别采集免疫前、首免后2周和二免后2周的BALB/c小鼠血清利用间接ELISA
方法检测血清IgG抗体； 分别于免疫后21d，28d随机取2-3只BALB/c
中，用
小鼠，颈椎脱臼处死，刮取肠道表面粘液于1.5ml离心管
pH 7.4PBS稀释，利用间接ELISA方法检测黏膜sIgA抗体。按照文献《疫苗关键
技术详解》原著 第二版(A.罗宾逊等，2006)，将原核表达蛋白(COE蛋
将待检血清或肠黏膜内容物
白和SD蛋白)按0.5μg/孔的浓度包被酶标板，
从1∶2或1∶10开始进行倍比稀释，分别加入到相应反应孔内进行检测。
检测结果如下：①sIgA产生情况，重组菌C501-COE和C501-SD口服免疫组sIgA
抗体滴度分别为1∶1280 和1∶2048，而肌肉注射组的sIgA抗体滴度分
生情况，重组别为1∶640和1∶1024(如图13所示)；②血清IgG抗体产
菌C501-COE和C501-SD肌肉注射组中的IgG抗体滴度分别为1∶4096和1∶2560，
而口服免疫
所示)
组所产生的IgG抗体滴度分别为1∶2048和1∶1280(如图14
(3)免疫BALB/c小鼠沙门氏菌抗体水平ELISA检测
沙门氏菌ELISA抗原的制备：挑取沙门氏菌单菌落于5mL TSB液体培养基中，
37℃，活化过夜，用 体积比为1∶100转接至100mL TSB液体培养基，
收集菌体，用pH 7.437℃，200r/min，培养8h，8000r/min，离心10min，
的PBS洗涤2次，然后，用pH 7.4的PBS以体积比为1∶10倍浓缩重悬，冰上超
声 破碎至清亮(UP 200S超声波处理器-德国her公司制造，功
24KHz，超声波破碎时间：30s/次，
光度计
率：200W、振幅：60％、操作频率：
间隔时间：1min/次)，12000r/min，离心20min，弃沉淀。用分光
测定上清蛋白浓度，分装500μl/管，于-20℃保存备用。按照文献《疫苗关键技术
详解》原著第二 版(A.罗宾逊等，2006)，将制备的沙门氏菌蛋白按
免疫BALB/c小鼠血
0.5μg/孔的浓度包被酶联板，间接ELISA方法检测
清中的IgG抗体和肠黏膜中的特异性IgA抗体水平。
检测结果显示，重组菌株C501-COE和C501-SD免疫组BALB/c小鼠均诱导产生
了与空载体对照菌株 C501-pYA免疫组BALB/c小鼠相似水平的沙门
氏菌血清IgG抗体和肠道sIgA抗体(如图15所示)
(4)细胞免疫检测
具体方法按文献(肖少波，2004)进行：
制备小鼠脾淋巴细胞，并调整细胞浓度为2×106/mL，加入到24孔细
胞培养板中，1mL/孔，以纯化 的目的蛋白作体外刺激原，并使蛋白终浓
度为10μg/mL。将24孔细胞培养板放于37℃，5％CO2细胞培养
箱中培养，20h后，各选择一个细胞孔，提取细胞总RNA，通过相对荧光
达水平上的差异。剩余细胞孔，在72h后，定量的方法测定IFN-γmRNA表
收集细胞上清，利用双夹心ELISA方法(采用R&D公司小鼠IFN-
γ检测试剂盒进行检测，具体操作步骤参照该试剂盒的说明书)，检测IFN-γ
蛋白表达水平上的差异。
利用SYBR Green Real-time PCR的方法，检测BALB/c小鼠免疫脾细胞中IFN-γ的
mRNA相对于β -actin的mRNA的表达量，并进行了相对定量分析，结
小鼠脾细胞中IFN-果显示，重组菌C501-COE和C501-SD免疫组BALB/c
γmRNA的相对表达量高于空载体质粒C501-pYA免疫组，且肌肉注射组的IFN-
γmRNA
采用双夹心ELISA方法(采用R&D公司小鼠IFN-γ检测试剂盒进行检测，具
体操作步骤参照该试剂 盒的说明书)检测各免疫组脾细胞分泌的IFN-γ
免疫组
的相对表达量要高于口服免疫组(如图16所示)。
水平，结果表明，本发明的重组菌C501-COE和C501-SD
BALB/c小鼠脾细胞中IFN-γ蛋白表达水平明显高于高于空载体质粒C501-pYA免
疫组，且重组菌
图17所示)
此外，沙门氏菌空质粒对照组C501-pYA所诱导的IFN-γ无论是在mRNA水平还
是在蛋白水平上都比 TSB对照组的要高一些，这可能与沙门氏菌本
反应。
肌肉注射组IFN-γ抗体水平要略高于口服免疫组。(如
身可充当佐剂有关，因而可刺激机体产生比较强的细胞免疫
实施例6：利用重组的沙门氏菌C501-COE和C501-SD制备二价基因工程疫苗
将重组菌C501-COE和C501-SD在TSA固体培养基上划线培养，挑取单菌落于
TSB液体培养基中培养， 培养至活菌浓度达到
2.5×1010CFU/mL。将菌液低速离心集菌，按沙门氏菌C501-COE和
C501-SD的菌液： 明胶保护剂(体积：体积)为2∶1的比例加入明胶保护
剂(保护剂配制方法：每100mL ddH2O中加入蔗糖 40g，
明胶8g；充分溶解后于121℃高压灭菌30min，保存备用)，于灭菌冻干瓶中按
2.0mL/瓶分装，置-50 ℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，用
确保没有杂菌
生理盐水或PBS(pH7.4)溶解并进行活菌计数(CFU)，并且
污染，置于-20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。
实施例7：重组疫苗菌株的初步临床保护效果观察
(1)重组疫苗菌株对新生仔猪的安全性试验
从一规模化养猪场随机抽取2窝健康1日龄仔猪(品种为长白猪)，以
3×109CFU的免疫剂量，口服
免疫本发明制备的冻干减毒
沙门氏菌疫苗，跟踪观察7天，发现免疫前后仔猪体温无变化，且仔猪能够正
(2)本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗对仔猪的免疫保护试验
选择两个PEDV感染的规模化猪场，以3×109CFU的免疫剂量，口服
免疫本发明制备的冻干减毒沙门 氏菌疫苗，跟踪观察1周，记录各猪场免
表3和表4)。
常吸吮母乳，由此说明本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗是安全的。
疫后的仔猪(品种为长白猪)发病率和成活率，评价免疫效果(见
表3猪场A应用本发明制备的猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活
疫苗的免疫效果
表4猪场B应用本发明制备的猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活
疫苗的免疫效果
由表3和表4的临床试验统计数据可知，本发明制备的冻干减毒沙门氏菌疫苗不仅
安全性较好，且具 有较好的预防效果。新生仔猪免疫重组疫苗后，A场腹
下降到8％～
泻率由100％下降到18％～30％，B场死亡率则由80％
20％，结果显示了该重组疫苗具有较好的免疫预防效果。
参考文献
1.A.罗宾逊等.疫苗关键技术详解.原著第二版.(李琦涵，刘龙丁，车艳春等译).北京：
化学工业出版
2.葛俊伟，汪淼，李一经等.表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌
免疫小鼠诱导的免疫
3.汪淼.表达猪流行性腹泻病毒中和抗原区重组乳酸乳球菌系统的构建东北农业大学
硕士毕业论文.[硕
4.徐引弟，郭爱珍，刘维红等.猪霍乱沙门氏菌C500株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载
体系统的构建及鉴
5.徐引弟.猪霍乱沙门氏菌C500株crp-、asd-缺失株平衡致
死系统的构建及应用.[博士学位论文].武
汉：华中农业大学图书馆，2006.
定[J].生物工程学报，2006，22(3)：366-372.
士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，2006.
应答[J].中国兽医科学，2010，40(07)：708-712.
社，2006，12-14.
6.肖少波.伪狂犬病毒gC基因“自杀性”DNA疫苗及VP22蛋白转导的免疫增强效应
研究.[博士学位论
7.张坤，何启盖.猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重
RT-PCR检测方法的建
1001-1005.
M D，
Ames B ort of antibiotics and metabolite analogs by systems under cyclic
AMP control：
立及临床应用[J].畜牧兽医学报，2010，41(8)：
文].武汉：华中农业大学图书馆，2004.
positive selection of Salmonella typhimurium cya and crp mutants[J].J Bacteriol，
gh D，Brian D A，Briton P，et rales：
a new order comprising Coronaviridae and
142(3)：629-633.
D，Cartwright S -
like particles associated with porcine epidemic diarrhea.
25(2)：255-256.
H.，Schifferli D.M，
et ed immune responses to vira lepitopes by combining macrophage-
Res Vet Sci，1978，
Arteriviridae[J].Arch Virol，1997，
1978，133(1)：149-157.
inducible expression with multimeric display on a Salmonella e，2001，
ch G，Bubert A，Gentschev I，et ry of antigen-
encoding plasmid DNA into the
19(20-22)：3009-3018.
cytosol of macrophages by attenuated suicide Listeria monocytogenes[J].Nat Biot
16(2)：181-185. echnol，1998，
G，Chatfield S，Pickard D，Bester J，
O’Callaghan D and Maskell uction and
characterization of vaccine strains of Salmonella harboring mutations in two diffe
genes[J].J Infect Dis，1988，158(6)：1329-1335. rent aro
J E and Curtiss III nce and vaccine potential of phoP mutants of Salmo
nella
J E，Nakayama K，
Curtiss R g and characterization of the asd gene of Salmonella
typhimurium：
typhimurium[J].Microb Pathogen，1989，6：433-443.
use in stable maintenance of recombinant plasmids in Salmonella vaccine strains[J].
nier R，
Furer ion and characterization of GalE mutant Ty 21a of Salmonellu
typhi：a candidate strain fora live，oral typhoid vaccine[J].J Infect Dis，1975，
Gene，1990，94：29-35.
131：553-558.
X H，Young S K，Sang C J，et tion of a Heat-
labile Enterotoxin B Subunit-porcine
P，Medina E，Arioli I，et transfer in dendritic cells，
induced by oral DNA vaccination with Salmonella typhimurium，
Epidemic Diarrhea Virus-
neutralizing Epitope Fusion Protein in Transgenic Lettuce(Lactuca
sativa)[J].BIOTECHNOLO BIOPROC E，2009，14：731-737.
results in protective immunity against a murine
1998，92(9)：3172-3176.
fibrosarcoma[J].Blood，
rt M e Epidemic esofSwine[J].Iowa State University P
ress，
rt M B，Yeo S e epidemic ：Straw B E，Zim-merman J J，
D’Allaire S，Taylor D J.(eds.)，Diseases of -Blackwell，
1986，402-406.
Ames，2006，9：367-372.
chil A，Stuedli A，Kiupel M，
et on porcine epidemic diarrhea[J].J Swine
10(2)：81-85.
S，Dietrich G，Weidinger al design of Salmonella-
based vaccination
D B，Feng L，Shi H Y，Chen J F，et of two novel B cell epitopes on
porcine epidemic diarrhea virus spike protein[J].Veterinary Microbiology，2008，
strategies[J].Methods，2006，38：133-143.
Health Prod，2002，
131：73-81.
y J F，GillesPie J H，Seott F W，
et iology and Infectious Diease of Domestie
Comstock Publishing Associates，1988，897-898.
Z，Xue Y，Wu B，
et aneous vaccination with attenuated Salmonella enterica
serovar Choleraesuis C500 expressing recombinant filamentous hemagglutinin an
d pertactin
：
antigens protects mice against fatal infections with both ca serovar Choler
Bordetella bronchiseptica[J].Infect Immun，2008，76(5)：2157-aesuis and
2163