2024年6月12日发(作者：开新月)

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.X

(22)申请日 2011.12.06

(71)申请人 吉林大学

地址 130012 吉林省长春市前进大街2699号

(72)发明人 潘洪玉 余刚 张世宏 刘金亮 陈宣明 王雪亮 贾承国 李桂华

(74)专利代理机构 长春吉大专利代理有限责任公司

代理人 邵铭康

(51)

C07K14/415

C12N15/29

C12N15/63

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

(10)申请公布号 CN 102492030 A

(43)申请公布日 2012.06.13

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

包含脱水素功能域的基因及其抗旱

抗碱基因工程应用

(57)摘要

包含脱水素功能域的基因及其抗旱

抗碱基因工程应用属植物基因工程技术领

域，本发明提供一种植物抗逆相关蛋白

AcDHN，包含由SEQ ID NO：2氨基酸序

列组成和将SEQ ID NO：2的氨基酸序列

经一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或

添加且由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质；

编码基因AcDHN的编码序列如下列之

一：a.编码序列的核苷酸序列如SEQ ID

NO：1所示；b.编码SEQ ID NO：2蛋白

序列的核苷酸分子；c.与a核苷酸序列具有

90％以上同源性且编码蛋白的核苷酸分

子；d.与a的核苷酸序列杂交且编码蛋白的

核苷酸分子；将AcDHN导入酿酒酵母得

到的转基因酿酒酵母，可提升酵母耐干旱

耐盐碱能力。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

1.一种植物抗逆相关蛋白AcDHN，其特征在于其中包含如下两类蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或

缺失或

添加且与植物抗逆相关的由序列表中SEQ ID NO：2衍

生的蛋白质。

2.按权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN，其特征在于

所述的编 码基因AcDHN的编码序列为序列表中SEQ ID NO：1

的5’端第99-1113位脱氧核苷酸。

3.按权利要求2所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN，其特征在于

所述编码

1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白序列的核苷酸分子；

3)与1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述植物抗逆

相关

4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述植物抗逆相关

蛋白AcDHN的核苷酸分子；

基因AcDHN的编码序列为下列之一：

蛋

白AcDHN的核苷酸分子。

4.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述植物抗逆相关蛋白

AcDHN

5.一种重组菌，其特征在于含有权利要求2或3所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的

编码基因

的编码基因AcDHN。

AcDHN。

说 明 书

技术领域

本发明属植物基因工程技术领域，具体涉及运用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae

背景技术

自然界中存在多种如盐、碱、高温、低温、干旱、病虫害等多种生物和非生物胁迫，

限 制了作物的生长发育，从而影响作物产量直接威胁到粮食安全，因此，

转入作物中进行分子育种改良作物性状引起了科

功能的研究能够为通过基因

多研究

INVSc1菌株表达一种与植物抗逆相关的蛋白AcDHN。

将抗逆境胁迫的基因

研工作者的兴趣。而克隆逆境相关基因及其

工程进行植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。但是，当前很

主要集中在草本植物，很少对木本植物特别是盐生木本植物进行分子遗传学的研究。

木本植物和草本植物在应对生物和非生物胁迫时在结构、生长、发育

异性，因此克隆和研究木本植物中与抗逆相关的

非生物胁迫的耐受力提供更

以及生理等方面存在差

基因能够为通过基因工程提高作物对生物和

多的候选基因。

四翅滨藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是藜科，滨藜属木本植物，是干旱、半干

旱地 区的典型植物，在年降雨量180mm以上，年均气温5℃左右，极端

干旱荒漠、盐碱地生长良好，种源产地海拔

被有些国家称为“生

最低温度-40℃的干旱、半

2377m，人工栽植区已达3150m。据报道四翅滨藜

物脱盐器”，种6.07亩四翅滨藜，一年能从土壤中吸收1t以上的盐分，是

荒漠、半荒漠山旱地极有价值的优良饲料灌木，高产优质、富含营养，枝叶

蛋白，生物量达15t/hm²，同时有积累硒的

要还是用于牧场改良。

含12％以上的粗

能力，在美国广泛用于路坡固定和水土保持，但主

在印度，从美国等国引进了12种滨藜品种改良了700万hm²的盐碱地，

突尼斯和北非一些国家为开发盐碱地资源已有2万hm²

北非、以色列和北美地区滨

持的优

荒漠地种植了滨藜，在澳大利亚、南非、

藜是干旱半干旱地区最主要的饲料灌木之一，也是绿化和水土保

良树种。近几年先后在我国甘肃、青海、新疆、宁夏等地进行了区域性引种栽培试

验，

酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae不仅具有生长快、容易培养和易于遗传操作等

优点， 而且具有典型真核系统的特性，具有糖基化、二硫键形成以及

程，其表达模式与植物表达模式更为接近，

不可替代的优越性。

显示了极强的耐干旱、低温、贫瘠、抗盐碱等优良特性。

蛋白质折叠等翻译后加工等过

所以用酵母筛选植物抗逆基因具有原核表达系统

采用酵母突变体筛选植物的不同cDNA文库来鉴定和挖掘新基因的方法已

经广泛应用于植物功能基因的研究。用酵母的2种不同氨基酸转运缺陷突变

cDNA文库，Frommer等和Hsu等(1993年)成功地克隆

NAT2/AAP1。酵母表达系统还被

利用酵母表达

体筛选拟南芥

到相应的编码相同氨基酸透过酶的

广泛地应用到植物耐盐基因功能研究中，Yamada等(2002年)

体系验证了丙二烯环化氧化酶(AOC)基因大大增强转化子的耐盐性，从而表

明AOC基因在真核表达系统中增强抗盐胁迫的功能。唐玉林等(2007年)利

研究大豆SAL I3-2蛋白功

pYES2

用酵母表达系统

能，将大豆SAL I3-2蛋白cDNA及其缺失片段构建到酵母表达载体

上，并转化酵母菌INVSc1，检测酵母重组子在胁迫条件下的生长状况，结果表明，

SALI3-2基因可明显提高酵母转化子的耐盐能力。酿酒酵母菌株

leu2 trp1-289 ura3-52)是一种二倍体，并

造的尿嘧啶营养缺陷

INVSc1(基因型为MATa his3D1

且生长迅速的理想酵母表达菌株，该菌株是人工改

型菌株，运用SC-U培养基筛选转化子，假阳性率低，能够保证转化效率。

脱水素(Dehydrin)属于LEA家族，分子质量为9-200KDa，是一种广泛存在于高等

植物中 的干旱诱导蛋白，在植物胚胎发生晚期产生。植株处于低温、

外结晶等脱水胁迫的影响，会大量表达和外源ABA、干旱、盐碱以及胞

积累这类蛋白。脱水素分子具有很高的亲水性和热 稳定性，能将水分捕

获到细胞内，以保护细胞免受干旱和盐碱的损伤。能在植物胚胎发育后

期以及脱水素的重要结构特征是它具有三类非常保守的区域：K、S和Y片

所有脱水素都具有的。K片段富含赖氨酸，通常位于C

氨基酸残基组成

段，其中K片段是

端，可具有1到12个重复，一般由15个

(EKKGIMDKIKEKLPG)。许多脱水素还含有由丝氨酸残基组成的S片段，

有证据表明S片段的磷酸化可以使脱水素在信号肽的引导下进入细胞核。

具有另一类保守区域：Y片段，它的序列为

合位点有同源性。

很多脱水素的N端还

(V/T)DEYGNP，与植物和细菌分子伴侣的核酸结

其中，转化pYES-AcDHN重组载体的酵母INVSc1菌株在抗干旱和盐碱胁迫中表

现出较强 抗性，在众多研究中，还无有关含Dehydrin功能域的四翅滨

生理功能方面的相关报道。 藜基因在酵母抗逆和植物的抗逆

发明内容

本发明采用盐生灌木植物四翅滨藜(Atriplex canescens)作为研究材料，通过构建低

温(-10 ℃)和盐(400mM NaCl)胁迫下四翅滨藜的全长运用Invitrogen公司

cDNA Library Construction Kit构建全长cDNA文库，并通过

达载体pYES-DEST52中，混合质粒转化

冻害、高温、SOS

Full-Length

Gateway技术LR重组到酵母表

酵母菌株INVSc1，通过多种模拟逆境胁迫(盐碱、

胁迫、干旱胁迫)筛选出与逆境胁迫相关的基因，为今后利用耐盐碱、干

旱、冻害、SOS胁迫基因获得抗相应逆境胁迫的转基因农作物和林木奠定

翅滨藜耐盐碱和耐低温分子机制研究提供依据。 基础，同时也为四

本发明使用酵母表达载体pYES-DEST52(购自Invitrogen公司)，插入本发明

AcDHN蛋白 核苷酸编码序列以及得到重组表达载体pYES-AcDHN，它除

码序列外，还有T7启动子、GAL1启动

pUC复制基因、酵

了携带有AcDHN蛋白核苷酸编

子、CYC1终止转录信号、URA3基因、f1复制基因、

母2μ复制序列、氨苄青霉素抗性基因、attR1和attR2用于LR重组的重组

位点、致死基因ccdB用于逆向筛选转化子、氯霉素抗性基因用于对阳性转

V5epitope便于重组后蛋白表达检测、6xHis Tag用于重

达所需的各种调控元件。

化子的双重筛选、

组基因纯化，以及为外源蛋白高效表

AcDHN基因由1408个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架(Open Reading

Frame)1017bp，同时还提供5’-UTR和3’-UTR序列，AcDHN为序列表中的

1序列。开放读码框的起始密码子SEQ ID NO：

为ATG，终止密码子为TGA。

本发明的一个目的是提供含脱水素功能域的四翅滨藜中与植物抗逆相关的蛋白及其

编码

本发明所提供一种植物抗逆相关蛋白耐Na₂CO₃、

NaHCO₃和干旱等胁迫，名称为AcDHN

一种植物抗逆相关蛋白AcDHN，其中包含如下两类蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或

缺失或

白质。

添加且与植物抗逆相关的由序列表中SEQ ID NO：2衍生的蛋

(Atriplexcanescens Dehydrin)，来源于四翅滨藜。

基因，并进行应用。

序列表中SEQ ID NO：2由338个氨基酸残基组成，其中：91个疏水氨基酸，208

个亲 水氨基酸，亲水性极强，94个碱性氨基酸，79个酸性氨基酸，蛋白

电点为6.47，其中富含赖氨酸(Lys)占总蛋白量

要特征。四翅滨藜AcDHN

质分子量为38.3kD，等

的18.33％，这也是Dehydrin家族蛋白的主

蛋白未见报道。

编码基因AcDHN的编码序列为序列表中SEQ ID NO：1的5’端第99-1113位脱氧

核苷酸。

编码基因AcDHN的编码序列为下列之一：

1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白序列的核苷酸分子；

3)与1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码植物抗逆相关蛋白AcDHN

的核

4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码蛋白AcDHN的核苷酸分子。

以上4)中所述高严谨条件是指可为在0.1XSSC，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂

交

一种重组表达载体含有植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN。

一种重组菌含有植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN(以下简称编码基因

AcDHN)。

并洗膜的条件。

苷酸分子；

为了使(a)中的AcDHN便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的

蛋白

表1.标签的序列

具体可为对非生物胁迫的抗逆性，

Na₂CO₃、NaHCO₃胁迫的耐逆性。

将AcDHN导入酿酒酵母得到的转基因酿酒酵母，可提升酵母耐干旱耐盐碱能力。

附图说明

图1为四翅滨藜总RNA提取图片

其中：NaCl为400mM NaCl处理四翅滨藜后提取叶片和茎部总RNA电泳图；MW

为 1kb Plus核苷酸Ladder Marker由核苷酸片段10000bp、8000bp、

3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、

量为100ng，

6000bp、5000bp、4000bp、

800bp、500bp、以及300bp构成，其中3000bp的核苷酸

其余条带核苷酸量约为50ng；Cold为-10℃处理四翅滨藜后提取叶片和茎部总

图2为cDNA文库插入片段长度PCR检测图片

其中：1-8，9-16为挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定结果；MW为1kb Plus核苷酸

Ladder Marker由核苷酸片段10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、

1000bp、800bp、500bp、以及300bp构成，

酸量约为50ng。

RNA电泳图。

3000bp、2000bp、1500bp、

其中3000bp的核苷酸量为100ng，其余条带核苷

图3为重组pYES-AcDHN质粒PCR扩增电泳图

其中：M：marker自上到下大小为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、

100bp

图4为AcDHN在GenBank中功能域比对结果

图5为AcDHN与其他物种Dehydrin蛋白系统进化树

图6为pYES-AcDHN和pYES-DEST52酵母转化图

1，2：目的条带

其中：A为INVSc1酵母菌株；B为重组质粒pYES-AcDHN转化INVSc1酵母菌株；

C 为INVSc1酵母菌株；D为pYES-DEST52质粒转化INVSc1酵母菌

株。

图7为pYES-AcDHN酵母阳性转化子PCR鉴定图

其中：M：marker自上到下大小为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、

100bp

1，2，3：阳性转化子目的条带

图8为pYES-AcDHN酵母阳性转化子加入半乳糖诱导后生长曲线图

其中：横坐标表示加入半乳糖后生长时间；纵坐标表示吸光度OD₆₀₀

值。

图9为pYES-AcDHN酵母阳性转化子生长中全蛋白表达量曲线图

其中：横坐标表示生长时间；纵坐标表示pYES-AcDHN酵母全蛋白量。

图10为pYES-AcDHN酵母和pYES-DEST52酵母胁迫处理效果的照片I

其中：A为4M KCl处理酵母效果；B为5M NaCl处理酵母效果；C为高温处理酵

母效

图11为pYES-AcDHN酵母和pYES-DEST52酵母胁迫处理效果的照片II

其中：A为6％NaHCO₃处理酵母效果；B为8％NaHCO₃

处理酵母效果；C为6％Na₂CO₃处理酵母效果；D为8％

果；D为低温处理酵母效果。

Na₂CO₃处理酵母效果。

图12为pYES-AcDHN酵母和pYES-DEST52酵母胁迫处理效果的照片III

其中：A为40％PEG6000处理酵母效果；B为5M山梨醇处理酵母效果；C为

4mM百草

具体实施方式

实施例一：编码基因AcDHN全长cDNA的获得及序列分析

1.胁迫处理四翅滨藜：

将生长三个月的四翅滨藜植株从吉林省林业科学院-10℃野地移栽到吉林大学植物

科学学院植物培养室，种植10d，待植株存活，发出新叶。每天用

处理每株四翅滨藜植株，处理4d，采摘叶片，茎部和

以备建库。

枯处理酵母效果。

500mL 400mM NaCl

根清洗干净用液氮速冻，-80℃冻存，

2.构建cDNA文库：

将-10℃条件下采集和用400mMNaCl处理四翅滨藜植株的叶片、茎和根同时提取

总 RNA(图1)，然后使用Invitrogen公司的cap antibody module针对含有

一链cDNA进行富集，然后按照Invitrogen公司Full-

Construction Kit构建cDNA全长uncut文库(图

母表达载体pYES-DEST52中，

个文库克隆测

完整帽子结构的

Length cDNA Library

2)，并通过Gateway技术LR重组到酵

PCR检测插入片段长度，将片段长度超过1000bp的300

序，进行氨基酸比对和生物信息学分析，获得四翅滨藜抗性ESTs序列。

2.1Total RNA的提取：

2.11取100mg组织样品，在预冷的研钵中用液氮研成粉末，然后转入1.5mL离心

管中；

2.1.2加入1ml的Trizol试剂，振荡混匀，室温静置10min充分裂解细胞；

2.1.3加入200μL的氯仿，剧烈震荡15sec，室温静置5min；

2.1.4在4℃，12,000rpm高速冷冻离心15min；

2.1.5取上清于新1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温静置

10min；

2.1.6在4℃，12,000rpm高速冷冻离心10min；

2.1.7去上清，加入1mL的75％乙醇洗涤沉淀，7,500rpm高速冷冻离心5min；

2.1.8重复步骤2.1.7一次；

2.1.9去上清，空气中干燥RNA沉淀，然后溶解于50μL DEPC水中。

3.筛选编码基因AcDHN片段的克隆：

根据四翅滨藜ESTs序列中找出的编码基因AcDHN的cDNA序列，LR重组到酵母

表达 载体pYES-DEST52中得到重组酵母表达载体pYES-AcDHN，将重组

pYES-AcDHN转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单菌落

粒。根据载体上的序列设计PCR

酵母表达载体

之后，LB(Amp抗性)摇培后提取质

引物，并进行PCR扩增，验证cDNA序列和测序结果。

上游(T7)：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’

下游(R)：5’-AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3’

PCR反应体系：克隆PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s；56℃退

火30s； 72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％

位置上有一特异性的条带(图3)。

琼脂糖凝胶电泳检测，在1400bp

实施例二：编码基因AcDHN的序列分析

经测序编码基因AcDHN cDNA序列开放阅读框包含1017bp，由338个氨基酸残基

组 成，其中，91个疏水氨基酸，208个亲水氨基酸，亲水性极强，蛋白

电点为6.47，其中富含赖氨酸(Lys)占总蛋白量

要特征。结果表明获得全长

质分子量为38.3kD，等

的18.33％，这也是Dehydrin家族蛋白的主

基因的cDNA序列，其GenBank登录号为JN974246。

利用NCBI(/Structure/cdd/)对该基因编码的氨基

酸 进行保守区域分析(图4)，结果表明：该蛋白属于Dehydrin家族蛋白。

基因AcDHN的氨基酸序列进行BLAST，与已

和同源性分析，并用

在NCBI网站上对编码

确定功能的其他物种氨基酸序列进行进化分析

clustalX和MEGA4软件绘制进化树：编码基因AcDHN与菠菜Dehydrin

根据DNAMAN分析AcDHN不含信号肽。用DNAMAN对AcDHN进行二级结构

预测，

发现含有10.65％的helix，3.84％的strand，84.9％的coil。

编码的氨基酸进化距离最近。与拟南芥中Dehydrin蛋白同源性为57％(图5)。

实施例三：重组酵母的转化及检测

酿酒酵母INVSc1是尿氨酸营养缺陷型(Ura)，在不含尿氨酸的SC基本培养基(SC-

Ura) 上，该酵母不能繁殖和生长。pYES2-DEST52质粒上含有URA3基因，

SC-Ura培养基上正常生长。因此，可以用SC-Ura选择

性酵母。分别将质粒pYES-

涂布在

使重组酵母能够在

培养基进行筛选转化阳性酵母和非阳

AcDHN和pYES-DEST52转化酵母菌INVSc1菌株中，转化酵母

SC-Ura固体选择培养基上，以未转化的酵母做对照，进行培养，2d后除了空酵母

外

1.运用Lithium acetate化学转化法转化酿酒酵母INVSc1，其具体转化步骤：

1.1在10mLYPD液体培养基中加入一个酵母菌株单克隆(INVSc1)，30℃过夜摇培；

1.2检测培养菌液的OD₆₀₀，在50mL YPD培养基中加入过夜培养的

酵母菌液，稀释至

1.32500rpm冷冻离心5min沉淀收集菌体，之后用40mL1xTE重悬菌体；

1.42500rpm冷冻离心5min沉淀收集菌体，之后用2mL1xLiAc/0.5xTE重悬菌体；

1.5分装成100μL/1.5mLEP管；

1.6将酵母细胞置于室温孵育10min；

1.7每个转化体系(100μL)中，加入1μg质粒核苷酸，100μg变性鲑鱼精核苷酸，混

匀；

OD₆₀₀为0.4，再摇培2-4h；

均有菌落长出，说明酵母转化成功(图6)。

1.8加入700μL 1x LiAc/40％PEG-3350/1x TE，混匀；

1.930℃孵育步骤8中的混合液30min；

1.10加入88μLDMSO，混匀，42℃热击7min；

1.115000rpm冷冻离心1min，移除上清；

1.12用1mL1xTE重悬菌体，5000rpm冷冻离心1min，移除上清；

1.13用100μL1xTE重悬菌体，涂布于筛选培养基上。

2.阳性转化子的鉴定

从筛选培养基上随机挑取3个INVSc1(pYES2-AcDHN)单克隆，30℃，200rpm振

荡培 养过夜，取过夜培养物，沸水浴5min，冰上放置5min破碎细胞，以

为模板进行菌液PCR以引物T7和R进行PCR

dNTP 1μL，

细胞破碎液离心浓缩作

扩增，PCR反应体系(20μL)为：PCR Buffer 2μL，

T7 Primer 0.5μL，R Primer 0.5μL，Template 1μL，ddH₂O 14.5μL。扩

增产物在1％ 的琼脂糖凝胶上电泳，其扩增片段与预期的1400bp长度相吻

pYES2-AcDHN已经转化进入到酵母中。 合(图7)。证明重组质粒

实施例四：转基因酵母生长及蛋白表达

在实验室使用酿酒酵母菌株INVSc1中，GAL1启动子会被葡萄糖抑制，而在半乳

糖作为 碳源的情况下能够诱导转录(图8)。其中蛋白在12h左右表达

量最高(图9)。

1.蛋白诱导表达步骤

1.1将含有目标基因的pYES-AcDHN接种于含有2％葡萄糖的SC-U培养基中，

30℃，过

1.2测算过夜菌液的OD₆₀₀，保证能够使接种于50mL SC-U(含半乳糖)

培养基中OD₆₀₀等于0.4；

1.3吸出步骤2中计算的酵母细胞体积，3500rpm，5min，4℃离心，弃上清；

1.4将步骤3中的细胞重悬于50mL诱导培养基(SC-U，半乳糖)中，30℃摇培；

1.5分别在0，4，8，12，16，和24h处取出相同体积的诱导细胞，并且测量

OD₆₀₀值；

1.6将取出的细胞3500rpm，5min，4℃离心，收集菌体；

1.7弃上清，将细胞重悬于500μL无菌水中；

1.8将细胞转移到灭菌的1.5mL的离心管中，12000rpm，30s，弃上清；

1.9将细胞保存在-80℃，备用。

2.重组蛋白定量

将酵母细胞用裂解Buffer裂解之后，运用Bradford法进行总蛋白量的测定，模拟

酵母细 胞生长曲线和总蛋白表达曲线

夜摇培；

2.1准备好细胞裂解液，在准备实验之前最好能够了解裂解细胞的

OD₆₀₀；

2.2将细胞重悬于500μl裂解缓冲液中，3500rpm，5min，4℃离心，收集菌体；

2.3取出上清，然后加入适量(计算加入裂解缓冲液的体积)裂解缓冲液，使OD600

2.4加入等量的酸洗玻璃珠；

2.5将步骤4中的处理液放在涡旋仪上涡旋1min，冰上放置1min，重复该步骤20

次，

2.6将步骤5中裂解之后混合液，12000rpm，10s，4℃离心；

2.7将上清转移到新的1.5mLEP管中，可以用BSA进行蛋白质定量。

实施例五：阳性转化酵母逆境胁迫处理

1.逆境胁迫处理前处理

吸取酵母INVSc1(pYES-DEST52)和验证正确的INVSc1(pYES2-AcDHN)的保存菌

液或者 挑取单菌落，接种于SC-U液体培养基(加入终浓度2％的葡萄

测量其OD₆₀₀值，并用SC-

裂解细胞。细胞能被机械剪切力裂解，可以显微镜下边观察裂解效果；

至50-100；

糖)中，30℃摇床振荡培养24h，

U液体培养基(葡萄糖)将菌液浓度调整OD₆₀₀为0.4，体积为5mL，

8000rpm离心1min，加入2mL诱导培养基(SC-U+2％半乳糖)重悬菌体，接

于5mL的诱导培养 基中，30℃振荡培养24h，测量INVSc1(pYES-DEST52)

并将两种重组酵母的和INVSc1(pYES2-AcDHN)的OD₆₀₀值，

浓度统一调整到OD₆₀₀值为2，取等量的酵母，8000g离心1min，弃

上清。 对这两种酵母进行不同的胁迫处理，比较(pYES-DEST52)和

每种实验重复3次。 INVSc1(pYES2-AcDHN)的抗性，

2.模拟逆境胁迫处理

植物存在于自然界中要面对各种生物和非生物逆境，其中最主要的有以下几种：盐

害 (NaCl、KCl等)，碱害(Na₂CO₃、

NaHCO₃等)，干旱胁迫、冻害低温胁迫、高温胁迫以及植

在室内下，运用高浓度NaCl和KCl模拟盐胁迫，高浓度

Na₂CO₃和NaHCO₃模拟碱胁迫，

PEG6000和山梨醇模拟干旱胁迫，低温(-20℃)模拟冷冻胁迫，高温(53℃)模

运用百草枯可以产生活性氧模拟植物病原微生物侵染植

植物病原菌等生物胁迫。运用以上

从而评价基因

物病原菌胁迫。

拟高温胁迫，

物过程中产生的活性氧物质从而模拟

处理，模拟生物和非生物胁迫对转基因酿酒酵母的影响，

对各种胁迫的应答效果(图10)。

2.1NaCl处理：将上述菌体重悬于5mol/L NaCl溶液，混匀后30℃振动放置24h，

然后将不稀释 的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，

固体培养基上，30℃培养48h，比取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的

较两种菌的菌落的生长差异。

2.2KCl处理：将菌体重悬于4mol/L KCL溶液中混匀，30℃振动胁迫24h，然后将

不稀释的菌 体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样

在SC-U(含2％葡萄糖)的固体

菌落的生长差异。

培养基上，30℃培养48h，比较两种菌的

2.3Na₂CO₃处理：将菌体分别重悬于6％和8％的

Na₂CO₃溶液，混匀30℃振动胁迫2h，将然后

将不稀释的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL直接

2％葡萄糖)的固体培养基上，

点样在SC-U(含

30℃恒温培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.4NaHCO₃处理：将菌体重悬于6％和8％的NaHCO₃溶

液，混匀后，30℃振动胁迫2h，将然 后将不稀释的菌体和分别稀释10、

SC-U(含2％葡萄糖)

100、1000、10000倍的菌体，取2μL直接点样在

的固体培养基上，30℃培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.540％PEG6000处理：将菌体重悬于40％的PEG6000和5mol/L的山梨醇中，30℃

振动胁迫 24h，然后将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌

2％葡萄糖)的固体培养基上，30℃恒温培养48h，

体，取2μL点样在SC-U(含

比较两种菌的菌落的生长差异。

2.65mol/L山梨醇(Sorbitol)处理：将菌体重悬于5mol/L的山梨醇中，30℃振动胁迫

24h， 然后将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL

葡萄糖)的固体培养基上，30℃恒温培养48h，比较两

点样在SC-U(含2％

种菌的菌落的生长差异。

2.7冷冻处理：将菌体重悬于SC-U液体培养基，冷冻(-20℃)胁迫48h，其间每隔

6h把菌体 冻融一次。将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的

2％葡萄糖)的固体培养基上30℃培养48h，

菌体，取2μL点样在SC-U(含

比较两种菌的菌落的生长差异。

2.8高温处理：将菌体重悬于SC-U液体培养基，53℃胁迫1h。将不稀释和分别稀

释100、1 000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的

比较两种菌的菌落的生长差异。 固体培养基上30℃培养48h，

2.9百草枯(Paraquat)：将菌体重悬于4mM百草枯溶液中，30℃胁迫2h。将不稀释

和分 别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％

基上30℃培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。 葡萄糖)的固体培养

其中，pYES-AcDHN转化酵母对于4M KCl、5M NaCl、6％NaHCO₃、

8％NaHCO₃、6％ Na₂CO₃、8％

Na₂CO₃、40％PEG6000、5M山梨醇等逆境效果明显强于

空白质粒pYES-DEST52

转化酵母。

2024年6月12日发(作者：开新月)

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.X

(22)申请日 2011.12.06

(71)申请人 吉林大学

地址 130012 吉林省长春市前进大街2699号

(72)发明人 潘洪玉 余刚 张世宏 刘金亮 陈宣明 王雪亮 贾承国 李桂华

(74)专利代理机构 长春吉大专利代理有限责任公司

代理人 邵铭康

(51)

C07K14/415

C12N15/29

C12N15/63

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

(10)申请公布号 CN 102492030 A

(43)申请公布日 2012.06.13

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

包含脱水素功能域的基因及其抗旱

抗碱基因工程应用

(57)摘要

包含脱水素功能域的基因及其抗旱

抗碱基因工程应用属植物基因工程技术领

域，本发明提供一种植物抗逆相关蛋白

AcDHN，包含由SEQ ID NO：2氨基酸序

列组成和将SEQ ID NO：2的氨基酸序列

经一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或

添加且由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质；

编码基因AcDHN的编码序列如下列之

一：a.编码序列的核苷酸序列如SEQ ID

NO：1所示；b.编码SEQ ID NO：2蛋白

序列的核苷酸分子；c.与a核苷酸序列具有

90％以上同源性且编码蛋白的核苷酸分

子；d.与a的核苷酸序列杂交且编码蛋白的

核苷酸分子；将AcDHN导入酿酒酵母得

到的转基因酿酒酵母，可提升酵母耐干旱

耐盐碱能力。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

1.一种植物抗逆相关蛋白AcDHN，其特征在于其中包含如下两类蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或

缺失或

添加且与植物抗逆相关的由序列表中SEQ ID NO：2衍

生的蛋白质。

2.按权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN，其特征在于

所述的编 码基因AcDHN的编码序列为序列表中SEQ ID NO：1

的5’端第99-1113位脱氧核苷酸。

3.按权利要求2所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN，其特征在于

所述编码

1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白序列的核苷酸分子；

3)与1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述植物抗逆

相关

4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述植物抗逆相关

蛋白AcDHN的核苷酸分子；

基因AcDHN的编码序列为下列之一：

蛋

白AcDHN的核苷酸分子。

4.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述植物抗逆相关蛋白

AcDHN

5.一种重组菌，其特征在于含有权利要求2或3所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的

编码基因

的编码基因AcDHN。

AcDHN。

说 明 书

技术领域

本发明属植物基因工程技术领域，具体涉及运用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae

背景技术

自然界中存在多种如盐、碱、高温、低温、干旱、病虫害等多种生物和非生物胁迫，

限 制了作物的生长发育，从而影响作物产量直接威胁到粮食安全，因此，

转入作物中进行分子育种改良作物性状引起了科

功能的研究能够为通过基因

多研究

INVSc1菌株表达一种与植物抗逆相关的蛋白AcDHN。

将抗逆境胁迫的基因

研工作者的兴趣。而克隆逆境相关基因及其

工程进行植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。但是，当前很

主要集中在草本植物，很少对木本植物特别是盐生木本植物进行分子遗传学的研究。

木本植物和草本植物在应对生物和非生物胁迫时在结构、生长、发育

异性，因此克隆和研究木本植物中与抗逆相关的

非生物胁迫的耐受力提供更

以及生理等方面存在差

基因能够为通过基因工程提高作物对生物和

多的候选基因。

四翅滨藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是藜科，滨藜属木本植物，是干旱、半干

旱地 区的典型植物，在年降雨量180mm以上，年均气温5℃左右，极端

干旱荒漠、盐碱地生长良好，种源产地海拔

被有些国家称为“生

最低温度-40℃的干旱、半

2377m，人工栽植区已达3150m。据报道四翅滨藜

物脱盐器”，种6.07亩四翅滨藜，一年能从土壤中吸收1t以上的盐分，是

荒漠、半荒漠山旱地极有价值的优良饲料灌木，高产优质、富含营养，枝叶

蛋白，生物量达15t/hm²，同时有积累硒的

要还是用于牧场改良。

含12％以上的粗

能力，在美国广泛用于路坡固定和水土保持，但主

在印度，从美国等国引进了12种滨藜品种改良了700万hm²的盐碱地，

突尼斯和北非一些国家为开发盐碱地资源已有2万hm²

北非、以色列和北美地区滨

持的优

荒漠地种植了滨藜，在澳大利亚、南非、

藜是干旱半干旱地区最主要的饲料灌木之一，也是绿化和水土保

良树种。近几年先后在我国甘肃、青海、新疆、宁夏等地进行了区域性引种栽培试

验，

酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae不仅具有生长快、容易培养和易于遗传操作等

优点， 而且具有典型真核系统的特性，具有糖基化、二硫键形成以及

程，其表达模式与植物表达模式更为接近，

不可替代的优越性。

显示了极强的耐干旱、低温、贫瘠、抗盐碱等优良特性。

蛋白质折叠等翻译后加工等过

所以用酵母筛选植物抗逆基因具有原核表达系统

采用酵母突变体筛选植物的不同cDNA文库来鉴定和挖掘新基因的方法已

经广泛应用于植物功能基因的研究。用酵母的2种不同氨基酸转运缺陷突变

cDNA文库，Frommer等和Hsu等(1993年)成功地克隆

NAT2/AAP1。酵母表达系统还被

利用酵母表达

体筛选拟南芥

到相应的编码相同氨基酸透过酶的

广泛地应用到植物耐盐基因功能研究中，Yamada等(2002年)

体系验证了丙二烯环化氧化酶(AOC)基因大大增强转化子的耐盐性，从而表

明AOC基因在真核表达系统中增强抗盐胁迫的功能。唐玉林等(2007年)利

研究大豆SAL I3-2蛋白功

pYES2

用酵母表达系统

能，将大豆SAL I3-2蛋白cDNA及其缺失片段构建到酵母表达载体

上，并转化酵母菌INVSc1，检测酵母重组子在胁迫条件下的生长状况，结果表明，

SALI3-2基因可明显提高酵母转化子的耐盐能力。酿酒酵母菌株

leu2 trp1-289 ura3-52)是一种二倍体，并

造的尿嘧啶营养缺陷

INVSc1(基因型为MATa his3D1

且生长迅速的理想酵母表达菌株，该菌株是人工改

型菌株，运用SC-U培养基筛选转化子，假阳性率低，能够保证转化效率。

脱水素(Dehydrin)属于LEA家族，分子质量为9-200KDa，是一种广泛存在于高等

植物中 的干旱诱导蛋白，在植物胚胎发生晚期产生。植株处于低温、

外结晶等脱水胁迫的影响，会大量表达和外源ABA、干旱、盐碱以及胞

积累这类蛋白。脱水素分子具有很高的亲水性和热 稳定性，能将水分捕

获到细胞内，以保护细胞免受干旱和盐碱的损伤。能在植物胚胎发育后

期以及脱水素的重要结构特征是它具有三类非常保守的区域：K、S和Y片

所有脱水素都具有的。K片段富含赖氨酸，通常位于C

氨基酸残基组成

段，其中K片段是

端，可具有1到12个重复，一般由15个

(EKKGIMDKIKEKLPG)。许多脱水素还含有由丝氨酸残基组成的S片段，

有证据表明S片段的磷酸化可以使脱水素在信号肽的引导下进入细胞核。

具有另一类保守区域：Y片段，它的序列为

合位点有同源性。

很多脱水素的N端还

(V/T)DEYGNP，与植物和细菌分子伴侣的核酸结

其中，转化pYES-AcDHN重组载体的酵母INVSc1菌株在抗干旱和盐碱胁迫中表

现出较强 抗性，在众多研究中，还无有关含Dehydrin功能域的四翅滨

生理功能方面的相关报道。 藜基因在酵母抗逆和植物的抗逆

发明内容

本发明采用盐生灌木植物四翅滨藜(Atriplex canescens)作为研究材料，通过构建低

温(-10 ℃)和盐(400mM NaCl)胁迫下四翅滨藜的全长运用Invitrogen公司

cDNA Library Construction Kit构建全长cDNA文库，并通过

达载体pYES-DEST52中，混合质粒转化

冻害、高温、SOS

Full-Length

Gateway技术LR重组到酵母表

酵母菌株INVSc1，通过多种模拟逆境胁迫(盐碱、

胁迫、干旱胁迫)筛选出与逆境胁迫相关的基因，为今后利用耐盐碱、干

旱、冻害、SOS胁迫基因获得抗相应逆境胁迫的转基因农作物和林木奠定

翅滨藜耐盐碱和耐低温分子机制研究提供依据。 基础，同时也为四

本发明使用酵母表达载体pYES-DEST52(购自Invitrogen公司)，插入本发明

AcDHN蛋白 核苷酸编码序列以及得到重组表达载体pYES-AcDHN，它除

码序列外，还有T7启动子、GAL1启动

pUC复制基因、酵

了携带有AcDHN蛋白核苷酸编

子、CYC1终止转录信号、URA3基因、f1复制基因、

母2μ复制序列、氨苄青霉素抗性基因、attR1和attR2用于LR重组的重组

位点、致死基因ccdB用于逆向筛选转化子、氯霉素抗性基因用于对阳性转

V5epitope便于重组后蛋白表达检测、6xHis Tag用于重

达所需的各种调控元件。

化子的双重筛选、

组基因纯化，以及为外源蛋白高效表

AcDHN基因由1408个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架(Open Reading

Frame)1017bp，同时还提供5’-UTR和3’-UTR序列，AcDHN为序列表中的

1序列。开放读码框的起始密码子SEQ ID NO：

为ATG，终止密码子为TGA。

本发明的一个目的是提供含脱水素功能域的四翅滨藜中与植物抗逆相关的蛋白及其

编码

本发明所提供一种植物抗逆相关蛋白耐Na₂CO₃、

NaHCO₃和干旱等胁迫，名称为AcDHN

一种植物抗逆相关蛋白AcDHN，其中包含如下两类蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或

缺失或

白质。

添加且与植物抗逆相关的由序列表中SEQ ID NO：2衍生的蛋

(Atriplexcanescens Dehydrin)，来源于四翅滨藜。

基因，并进行应用。

序列表中SEQ ID NO：2由338个氨基酸残基组成，其中：91个疏水氨基酸，208

个亲 水氨基酸，亲水性极强，94个碱性氨基酸，79个酸性氨基酸，蛋白

电点为6.47，其中富含赖氨酸(Lys)占总蛋白量

要特征。四翅滨藜AcDHN

质分子量为38.3kD，等

的18.33％，这也是Dehydrin家族蛋白的主

蛋白未见报道。

编码基因AcDHN的编码序列为序列表中SEQ ID NO：1的5’端第99-1113位脱氧

核苷酸。

编码基因AcDHN的编码序列为下列之一：

1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2蛋白序列的核苷酸分子；

3)与1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码植物抗逆相关蛋白AcDHN

的核

4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码蛋白AcDHN的核苷酸分子。

以上4)中所述高严谨条件是指可为在0.1XSSC，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂

交

一种重组表达载体含有植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN。

一种重组菌含有植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN(以下简称编码基因

AcDHN)。

并洗膜的条件。

苷酸分子；

为了使(a)中的AcDHN便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的

蛋白

表1.标签的序列

具体可为对非生物胁迫的抗逆性，

Na₂CO₃、NaHCO₃胁迫的耐逆性。

将AcDHN导入酿酒酵母得到的转基因酿酒酵母，可提升酵母耐干旱耐盐碱能力。

附图说明

图1为四翅滨藜总RNA提取图片

其中：NaCl为400mM NaCl处理四翅滨藜后提取叶片和茎部总RNA电泳图；MW

为 1kb Plus核苷酸Ladder Marker由核苷酸片段10000bp、8000bp、

3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、

量为100ng，

6000bp、5000bp、4000bp、

800bp、500bp、以及300bp构成，其中3000bp的核苷酸

其余条带核苷酸量约为50ng；Cold为-10℃处理四翅滨藜后提取叶片和茎部总

图2为cDNA文库插入片段长度PCR检测图片

其中：1-8，9-16为挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定结果；MW为1kb Plus核苷酸

Ladder Marker由核苷酸片段10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、

1000bp、800bp、500bp、以及300bp构成，

酸量约为50ng。

RNA电泳图。

3000bp、2000bp、1500bp、

其中3000bp的核苷酸量为100ng，其余条带核苷

图3为重组pYES-AcDHN质粒PCR扩增电泳图

其中：M：marker自上到下大小为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、

100bp

图4为AcDHN在GenBank中功能域比对结果

图5为AcDHN与其他物种Dehydrin蛋白系统进化树

图6为pYES-AcDHN和pYES-DEST52酵母转化图

1，2：目的条带

其中：A为INVSc1酵母菌株；B为重组质粒pYES-AcDHN转化INVSc1酵母菌株；

C 为INVSc1酵母菌株；D为pYES-DEST52质粒转化INVSc1酵母菌

株。

图7为pYES-AcDHN酵母阳性转化子PCR鉴定图

其中：M：marker自上到下大小为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、

100bp

1，2，3：阳性转化子目的条带

图8为pYES-AcDHN酵母阳性转化子加入半乳糖诱导后生长曲线图

其中：横坐标表示加入半乳糖后生长时间；纵坐标表示吸光度OD₆₀₀

值。

图9为pYES-AcDHN酵母阳性转化子生长中全蛋白表达量曲线图

其中：横坐标表示生长时间；纵坐标表示pYES-AcDHN酵母全蛋白量。

图10为pYES-AcDHN酵母和pYES-DEST52酵母胁迫处理效果的照片I

其中：A为4M KCl处理酵母效果；B为5M NaCl处理酵母效果；C为高温处理酵

母效

图11为pYES-AcDHN酵母和pYES-DEST52酵母胁迫处理效果的照片II

其中：A为6％NaHCO₃处理酵母效果；B为8％NaHCO₃

处理酵母效果；C为6％Na₂CO₃处理酵母效果；D为8％

果；D为低温处理酵母效果。

Na₂CO₃处理酵母效果。

图12为pYES-AcDHN酵母和pYES-DEST52酵母胁迫处理效果的照片III

其中：A为40％PEG6000处理酵母效果；B为5M山梨醇处理酵母效果；C为

4mM百草

具体实施方式

实施例一：编码基因AcDHN全长cDNA的获得及序列分析

1.胁迫处理四翅滨藜：

将生长三个月的四翅滨藜植株从吉林省林业科学院-10℃野地移栽到吉林大学植物

科学学院植物培养室，种植10d，待植株存活，发出新叶。每天用

处理每株四翅滨藜植株，处理4d，采摘叶片，茎部和

以备建库。

枯处理酵母效果。

500mL 400mM NaCl

根清洗干净用液氮速冻，-80℃冻存，

2.构建cDNA文库：

将-10℃条件下采集和用400mMNaCl处理四翅滨藜植株的叶片、茎和根同时提取

总 RNA(图1)，然后使用Invitrogen公司的cap antibody module针对含有

一链cDNA进行富集，然后按照Invitrogen公司Full-

Construction Kit构建cDNA全长uncut文库(图

母表达载体pYES-DEST52中，

个文库克隆测

完整帽子结构的

Length cDNA Library

2)，并通过Gateway技术LR重组到酵

PCR检测插入片段长度，将片段长度超过1000bp的300

序，进行氨基酸比对和生物信息学分析，获得四翅滨藜抗性ESTs序列。

2.1Total RNA的提取：

2.11取100mg组织样品，在预冷的研钵中用液氮研成粉末，然后转入1.5mL离心

管中；

2.1.2加入1ml的Trizol试剂，振荡混匀，室温静置10min充分裂解细胞；

2.1.3加入200μL的氯仿，剧烈震荡15sec，室温静置5min；

2.1.4在4℃，12,000rpm高速冷冻离心15min；

2.1.5取上清于新1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，室温静置

10min；

2.1.6在4℃，12,000rpm高速冷冻离心10min；

2.1.7去上清，加入1mL的75％乙醇洗涤沉淀，7,500rpm高速冷冻离心5min；

2.1.8重复步骤2.1.7一次；

2.1.9去上清，空气中干燥RNA沉淀，然后溶解于50μL DEPC水中。

3.筛选编码基因AcDHN片段的克隆：

根据四翅滨藜ESTs序列中找出的编码基因AcDHN的cDNA序列，LR重组到酵母

表达 载体pYES-DEST52中得到重组酵母表达载体pYES-AcDHN，将重组

pYES-AcDHN转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取单菌落

粒。根据载体上的序列设计PCR

酵母表达载体

之后，LB(Amp抗性)摇培后提取质

引物，并进行PCR扩增，验证cDNA序列和测序结果。

上游(T7)：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’

下游(R)：5’-AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3’

PCR反应体系：克隆PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s；56℃退

火30s； 72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％

位置上有一特异性的条带(图3)。

琼脂糖凝胶电泳检测，在1400bp

实施例二：编码基因AcDHN的序列分析

经测序编码基因AcDHN cDNA序列开放阅读框包含1017bp，由338个氨基酸残基

组 成，其中，91个疏水氨基酸，208个亲水氨基酸，亲水性极强，蛋白

电点为6.47，其中富含赖氨酸(Lys)占总蛋白量

要特征。结果表明获得全长

质分子量为38.3kD，等

的18.33％，这也是Dehydrin家族蛋白的主

基因的cDNA序列，其GenBank登录号为JN974246。

利用NCBI(/Structure/cdd/)对该基因编码的氨基

酸 进行保守区域分析(图4)，结果表明：该蛋白属于Dehydrin家族蛋白。

基因AcDHN的氨基酸序列进行BLAST，与已

和同源性分析，并用

在NCBI网站上对编码

确定功能的其他物种氨基酸序列进行进化分析

clustalX和MEGA4软件绘制进化树：编码基因AcDHN与菠菜Dehydrin

根据DNAMAN分析AcDHN不含信号肽。用DNAMAN对AcDHN进行二级结构

预测，

发现含有10.65％的helix，3.84％的strand，84.9％的coil。

编码的氨基酸进化距离最近。与拟南芥中Dehydrin蛋白同源性为57％(图5)。

实施例三：重组酵母的转化及检测

酿酒酵母INVSc1是尿氨酸营养缺陷型(Ura)，在不含尿氨酸的SC基本培养基(SC-

Ura) 上，该酵母不能繁殖和生长。pYES2-DEST52质粒上含有URA3基因，

SC-Ura培养基上正常生长。因此，可以用SC-Ura选择

性酵母。分别将质粒pYES-

涂布在

使重组酵母能够在

培养基进行筛选转化阳性酵母和非阳

AcDHN和pYES-DEST52转化酵母菌INVSc1菌株中，转化酵母

SC-Ura固体选择培养基上，以未转化的酵母做对照，进行培养，2d后除了空酵母

外

1.运用Lithium acetate化学转化法转化酿酒酵母INVSc1，其具体转化步骤：

1.1在10mLYPD液体培养基中加入一个酵母菌株单克隆(INVSc1)，30℃过夜摇培；

1.2检测培养菌液的OD₆₀₀，在50mL YPD培养基中加入过夜培养的

酵母菌液，稀释至

1.32500rpm冷冻离心5min沉淀收集菌体，之后用40mL1xTE重悬菌体；

1.42500rpm冷冻离心5min沉淀收集菌体，之后用2mL1xLiAc/0.5xTE重悬菌体；

1.5分装成100μL/1.5mLEP管；

1.6将酵母细胞置于室温孵育10min；

1.7每个转化体系(100μL)中，加入1μg质粒核苷酸，100μg变性鲑鱼精核苷酸，混

匀；

OD₆₀₀为0.4，再摇培2-4h；

均有菌落长出，说明酵母转化成功(图6)。

1.8加入700μL 1x LiAc/40％PEG-3350/1x TE，混匀；

1.930℃孵育步骤8中的混合液30min；

1.10加入88μLDMSO，混匀，42℃热击7min；

1.115000rpm冷冻离心1min，移除上清；

1.12用1mL1xTE重悬菌体，5000rpm冷冻离心1min，移除上清；

1.13用100μL1xTE重悬菌体，涂布于筛选培养基上。

2.阳性转化子的鉴定

从筛选培养基上随机挑取3个INVSc1(pYES2-AcDHN)单克隆，30℃，200rpm振

荡培 养过夜，取过夜培养物，沸水浴5min，冰上放置5min破碎细胞，以

为模板进行菌液PCR以引物T7和R进行PCR

dNTP 1μL，

细胞破碎液离心浓缩作

扩增，PCR反应体系(20μL)为：PCR Buffer 2μL，

T7 Primer 0.5μL，R Primer 0.5μL，Template 1μL，ddH₂O 14.5μL。扩

增产物在1％ 的琼脂糖凝胶上电泳，其扩增片段与预期的1400bp长度相吻

pYES2-AcDHN已经转化进入到酵母中。 合(图7)。证明重组质粒

实施例四：转基因酵母生长及蛋白表达

在实验室使用酿酒酵母菌株INVSc1中，GAL1启动子会被葡萄糖抑制，而在半乳

糖作为 碳源的情况下能够诱导转录(图8)。其中蛋白在12h左右表达

量最高(图9)。

1.蛋白诱导表达步骤

1.1将含有目标基因的pYES-AcDHN接种于含有2％葡萄糖的SC-U培养基中，

30℃，过

1.2测算过夜菌液的OD₆₀₀，保证能够使接种于50mL SC-U(含半乳糖)

培养基中OD₆₀₀等于0.4；

1.3吸出步骤2中计算的酵母细胞体积，3500rpm，5min，4℃离心，弃上清；

1.4将步骤3中的细胞重悬于50mL诱导培养基(SC-U，半乳糖)中，30℃摇培；

1.5分别在0，4，8，12，16，和24h处取出相同体积的诱导细胞，并且测量

OD₆₀₀值；

1.6将取出的细胞3500rpm，5min，4℃离心，收集菌体；

1.7弃上清，将细胞重悬于500μL无菌水中；

1.8将细胞转移到灭菌的1.5mL的离心管中，12000rpm，30s，弃上清；

1.9将细胞保存在-80℃，备用。

2.重组蛋白定量

将酵母细胞用裂解Buffer裂解之后，运用Bradford法进行总蛋白量的测定，模拟

酵母细 胞生长曲线和总蛋白表达曲线

夜摇培；

2.1准备好细胞裂解液，在准备实验之前最好能够了解裂解细胞的

OD₆₀₀；

2.2将细胞重悬于500μl裂解缓冲液中，3500rpm，5min，4℃离心，收集菌体；

2.3取出上清，然后加入适量(计算加入裂解缓冲液的体积)裂解缓冲液，使OD600

2.4加入等量的酸洗玻璃珠；

2.5将步骤4中的处理液放在涡旋仪上涡旋1min，冰上放置1min，重复该步骤20

次，

2.6将步骤5中裂解之后混合液，12000rpm，10s，4℃离心；

2.7将上清转移到新的1.5mLEP管中，可以用BSA进行蛋白质定量。

实施例五：阳性转化酵母逆境胁迫处理

1.逆境胁迫处理前处理

吸取酵母INVSc1(pYES-DEST52)和验证正确的INVSc1(pYES2-AcDHN)的保存菌

液或者 挑取单菌落，接种于SC-U液体培养基(加入终浓度2％的葡萄

测量其OD₆₀₀值，并用SC-

裂解细胞。细胞能被机械剪切力裂解，可以显微镜下边观察裂解效果；

至50-100；

糖)中，30℃摇床振荡培养24h，

U液体培养基(葡萄糖)将菌液浓度调整OD₆₀₀为0.4，体积为5mL，

8000rpm离心1min，加入2mL诱导培养基(SC-U+2％半乳糖)重悬菌体，接

于5mL的诱导培养 基中，30℃振荡培养24h，测量INVSc1(pYES-DEST52)

并将两种重组酵母的和INVSc1(pYES2-AcDHN)的OD₆₀₀值，

浓度统一调整到OD₆₀₀值为2，取等量的酵母，8000g离心1min，弃

上清。 对这两种酵母进行不同的胁迫处理，比较(pYES-DEST52)和

每种实验重复3次。 INVSc1(pYES2-AcDHN)的抗性，

2.模拟逆境胁迫处理

植物存在于自然界中要面对各种生物和非生物逆境，其中最主要的有以下几种：盐

害 (NaCl、KCl等)，碱害(Na₂CO₃、

NaHCO₃等)，干旱胁迫、冻害低温胁迫、高温胁迫以及植

在室内下，运用高浓度NaCl和KCl模拟盐胁迫，高浓度

Na₂CO₃和NaHCO₃模拟碱胁迫，

PEG6000和山梨醇模拟干旱胁迫，低温(-20℃)模拟冷冻胁迫，高温(53℃)模

运用百草枯可以产生活性氧模拟植物病原微生物侵染植

植物病原菌等生物胁迫。运用以上

从而评价基因

物病原菌胁迫。

拟高温胁迫，

物过程中产生的活性氧物质从而模拟

处理，模拟生物和非生物胁迫对转基因酿酒酵母的影响，

对各种胁迫的应答效果(图10)。

2.1NaCl处理：将上述菌体重悬于5mol/L NaCl溶液，混匀后30℃振动放置24h，

然后将不稀释 的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，

固体培养基上，30℃培养48h，比取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的

较两种菌的菌落的生长差异。

2.2KCl处理：将菌体重悬于4mol/L KCL溶液中混匀，30℃振动胁迫24h，然后将

不稀释的菌 体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样

在SC-U(含2％葡萄糖)的固体

菌落的生长差异。

培养基上，30℃培养48h，比较两种菌的

2.3Na₂CO₃处理：将菌体分别重悬于6％和8％的

Na₂CO₃溶液，混匀30℃振动胁迫2h，将然后

将不稀释的菌体和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL直接

2％葡萄糖)的固体培养基上，

点样在SC-U(含

30℃恒温培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.4NaHCO₃处理：将菌体重悬于6％和8％的NaHCO₃溶

液，混匀后，30℃振动胁迫2h，将然 后将不稀释的菌体和分别稀释10、

SC-U(含2％葡萄糖)

100、1000、10000倍的菌体，取2μL直接点样在

的固体培养基上，30℃培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。

2.540％PEG6000处理：将菌体重悬于40％的PEG6000和5mol/L的山梨醇中，30℃

振动胁迫 24h，然后将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌

2％葡萄糖)的固体培养基上，30℃恒温培养48h，

体，取2μL点样在SC-U(含

比较两种菌的菌落的生长差异。

2.65mol/L山梨醇(Sorbitol)处理：将菌体重悬于5mol/L的山梨醇中，30℃振动胁迫

24h， 然后将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL

葡萄糖)的固体培养基上，30℃恒温培养48h，比较两

点样在SC-U(含2％

种菌的菌落的生长差异。

2.7冷冻处理：将菌体重悬于SC-U液体培养基，冷冻(-20℃)胁迫48h，其间每隔

6h把菌体 冻融一次。将不稀释和分别稀释10、100、1000、10000倍的

2％葡萄糖)的固体培养基上30℃培养48h，

菌体，取2μL点样在SC-U(含

比较两种菌的菌落的生长差异。

2.8高温处理：将菌体重悬于SC-U液体培养基，53℃胁迫1h。将不稀释和分别稀

释100、1 000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％葡萄糖)的

比较两种菌的菌落的生长差异。 固体培养基上30℃培养48h，

2.9百草枯(Paraquat)：将菌体重悬于4mM百草枯溶液中，30℃胁迫2h。将不稀释

和分 别稀释10、100、1000、10000倍的菌体，取2μL点样在SC-U(含2％

基上30℃培养48h，比较两种菌的菌落的生长差异。 葡萄糖)的固体培养

其中，pYES-AcDHN转化酵母对于4M KCl、5M NaCl、6％NaHCO₃、

8％NaHCO₃、6％ Na₂CO₃、8％

Na₂CO₃、40％PEG6000、5M山梨醇等逆境效果明显强于

空白质粒pYES-DEST52

转化酵母。