2024年3月17日发(作者：党白薇)
基因组学与应用生物学，2014年，
第33卷，第4期，第860－868页
GenomicsandAppliedBiology,2014,Vol.33,No.4,860－868
研究报告
Research
Report
胡杨
PeAPY1
和
PePY2
在提高植物抗旱耐盐性上的功能解析
檀叶青
邓澍荣孙苑玲赵瑞荆晓姝申泽丹钱泽勇张会龙陈少良
*
沈昕
*
北京林业大学生物科学与技术学院,北京,
100083
*通讯作者,xinshen77@,lschen@
广泛用于干旱盐碱地带的造林绿化。本实验
胡杨(
Populuseuphratica
Oliv.)是典型的抗旱耐盐树种，
室前期研究结果表明，盐胁迫下胡杨腺苷三磷酸双磷酸水解酶(Apyrase)基因(
PeAPY
)的转录水平上调，表明
摘
要
该基因可能在胡杨的抗盐性功能上发挥作用。已有研究证明APY是水解eATP的关键酶，而eATP是植物
细胞重要的信使分子，调控植物的生长发育及抗性反应。本研究以
PeAPY
过表达拟南芥株系、拟南芥apy1、
apy2突变体和野生型拟南芥为实验材料，分析了胡杨
PeAPY
对植物抗旱和耐盐能力的影响。研究结果表
明，
PeAPY1
和
PeAPY2
转基因株系的抗旱性明显提高，这可能与
PeAPY1
和
PeAPY2
过表达减少了叶片表
皮的气孔密度，降低了叶片的失水速率，从而提高了植株的保水能力有关。此外，我们还发现
PeAPY1
和
在盐胁迫条件下，过表达
PeAPY1
和
PeAPY2
转基因植物的种子萌
PeAPY2
转基因株系耐盐能力有所提高：
发率和生长、成活率均明显高于突变体apy1、apy2和野生型拟南芥(NaCl处理的浓度分别为0,50mmol/L,
100mmol/L,150mmol/L,200mmol/L)。这可能是由于盐处理条件下，
PeAPY
通过降低盐诱导的eATP浓度，
阻止了eATP诱导的细胞凋亡。综上所述，胡杨
PeAPY
的过表达能够提高植物对盐胁迫、干旱胁迫的耐受
性，
PeAPY
对eATP浓度调控及其对植物抗逆性的具体机制有待进一步研究。
关键词
PeAPY
,eATP,抗盐耐旱,气孔,失水率,生长发育
Functional
Analysisof
PopuluseuphraticaPeAPY1
and
PePY2
inEnhanc-
ingSaltandDroughtTolerance
Tan
YeqingDengShurongSunYuanlingZhaoRuiJinXiaoshuShenZedanQianZeyongZhangHuilong
ChenShaoliang
*
Shen
Xin
*
College
ofBiologicalSciencesandTechnology,BeijingForestryUniversity,Beijing,100083
*Correspondingauthor,xinshen77@,lschen@
DOI:10.13417/.033.000860
Abstract
Being
asasalt-anddrought-tolerantwoodyplants,
Populuseuphratica
isavaluabletreespeciesused
previouslyshownthat
Populuseuphratica
apyrase
gene,
PeAPY
,dicatesthat
PeAPY
playsanimportantrole
in
Populuseuphratica
eisthekeyenzymetohydrolyzeATPintheextra-
ellularATP(eATP)servesasacrucialsignalcomponentregulatingplantgrowth,develop-
ectofthisstudywastoexploretheroleof
PeAPY
insaltand
edtothewildtypeArabidopsisandapy1,apy2mutants,
PeAPY1
－and
PeAPY2
－trans-
duetothereduceddensityofstomatain
snumberofstomataresultedinawaterlossreductionunder
air-dryingconditions,whipression
of
PeAPY1
and
PeAPY2
alsoincreasedsalttoleranceoftransgenicplants.
PeAPY1
－and
PeAPY2
－transgenic
本研究由国家自然科学基金项目(31270654)、教育部科学技术研究(科学技术类)项目(113013A)、人事部留学人员科技
基金项目：
活动项目择优资助经费、高等学校学科创新引智计划(111计划,B13007)和教育部创新团队发展计划(IRT13047)共同资助
861
基因组学与应用生物学
Genomics
andAppliedBiology
plants
exhibitedgreatergerminationrate,rootandshootgrowth,andsurvivalrateduringtheperiodofsalttreat
ment(NaClsalineserieswere0,50mmol/L,100mmol/L,150mmol/L,and200mmol/L).Thisispresumablydue
tothe
PeAPY
reductionofsalt-elicitedeATP,whichblockstheeATP-inducedcelldeathinsalt-treatedplants.
Collectively,weconcludethattheoverexpressionof
PeAPY1
and
PeAPY2
increasedthedroughtandsalttoler-
relationbetween
PeAPY
andeATPconcentration,andtherelevanceto
stresstoleranceneedsfurtherinvestigation.
KeywordsPeAPY
,eATP,Saltanddroughttolerance,Stoma,Waterlossrate,Growth
胡杨是我国西北地区荒漠和戈壁地带惟一能够
大量生长的高大乔木树种。该树种具有很强的耐盐
性，在治理西部的水土流失、改善西部的生态环境中
起到非常重要的作用。近年来，国内外很多学者将胡
杨作为耐盐的木本模式植物，从生理、生化和分子生
物学等方面对其耐盐机理进行了较为系统和深入的
研究，为树木的抗逆性遗传改良提供了理论依据和
技术支撑。
Apyrase是生物中普遍存在的一种蛋白，具有裂
解ATP和ADP磷酸酐键的功能(Komoszynskiand
Wojtczak,1996;Cohnetal.,2001)。在植物中，Apyrase
还具有抵抗外源性物质、清除磷酸盐和调节生长过程
等功能(Sunetal.,2009;2010)。拟南芥中的Apyrase家
族成员
AtAPY1
和
AtAPY2
具有87%的同源性，且
AtAPY1
或
AtAPY2
基因的过表达会引起下胚轴和
花粉管的旺盛生长(Wuetal.,2007)，而单独敲除其
中一个基因不会使植株有明显的表型变化，但若将
这两个基因同时敲除，则植株的花粉无法正常生长,
并导致不能结种(Steinebrunneretal.,2003)。而且，在
apy2单突变体上通过RNA干扰敲掉
AtAPY1
时，整
个植株的生长都受到抑制，下胚轴和根受到的抑制
最为突出(Wuetal.,2007)。一些研究表明，AtAPY1
和AtAPY2是通过调节胞外ATP(eATP)信号而对植
株的生长产生的抑制效应(Dayetal.,2000;Etzleret
al.,1999)。当Apyrase的活性被加入的AtAPY1的化
学抑制剂或其多克隆抗体所抑制时，测量生长中的
花粉管的细胞外基质的eATP浓度，发现Apyrase活
性的减少会使得eATP的浓度升高，从而抑制了花粉
管的生长(Wuetal.,2007;Clarketal.,2010a)。
综上所述，国内外学者多是研究Apyrase在植
物生长发育中的功能(Thomasetal.,1999;Chenetal.,
2003;ChenandPolle,2010)，而对Apyrase在植物抗
逆性中作用还属未知。本实验室前期通过对胡杨的转
录组基因芯片进行了分析，研究结果发现在盐胁迫下
胡杨腺苷三磷酸双磷酸水解酶(Apyrase)基因(
PeAPY
)
被显著性诱导表达。因此，我们推测该基因在其应对
盐胁迫的过程中可能发挥着重要作用。本研究重点探
究了Apyrase在植物抗旱耐盐中的作用。我们将胡杨
PeAPY1
和
PeAPY2
在拟南芥中过表达，并利用
PeAPY
过表达的植株和拟南芥Apyrase突变体apy1
和apy2为供试材料，研究Apyrase蛋白在盐胁迫和干
旱胁迫下所起到的作用，初步探索其作用机理，为今后
提高植物的抗旱和抗盐胁迫能力提供理论依据。
1
结果与分析
1.1
胡杨
Apyrase
序列与结构分析
1.1.1胡杨APY
和其它物种APY对比与分析
本文根据NCBI数据库中毛果杨(
Populustricho
-
以胡杨cDNA
carpa
)中同源基因设计
PeAPY
基因引物，
为模板，PCR克隆得到胡杨的两个
PeAPY
基因：
通过生物学软件DNAman对其
PeAPY1
和
PeAPY2
。
进行基因序列比对发现，胡杨的
PeAPY
基因与拟南
芥、毛果杨等物种的
APY
的基因序列同源性可以达
到58.45%(图1)，氨基酸同源性高达76.04%(图2)，
说明
APY
基因系统进化上的保守性不高，但胡杨
PeAPY
和拟南芥
AtAPY
基因的序列同源性高达
94%，氨基酸同源性75.88%。另外，通过进化树分析
显示，胡杨的
PeAPY2
基因与拟南芥的进化关系非
常近(图3)，所以，可以确定
PeAPY
和
AtAPY
具有相
近的进化关系和类似的生物学功能。
1.1.2PeAPY1和PeAPY2蛋白的三级结构预测
本实验通过构建PeAPY1和PeAPY2蛋白的
SWISS-MODEL模型来分析其蛋白结构。在线提交
蛋白质氨基酸序列，以网站默认模式在已有的三维
结构数据库中搜索、比对并构建模型(图4)。结果显
示，PeAPY1和PeAPY2两个蛋白结构非常接近，均
由两个平行
β
－折叠片结构域构成，有八个
α
－螺旋
区，C端以卷曲结束。整个模型接近椭球形，中部有
一裂沟，可能与蛋白的生物学功能有关。
1.2PeAPY
对拟南芥耐盐性的影响
本实验把拟南芥的野生型、
PeAPY1
和
PeAPY2
2024年3月17日发(作者：党白薇)
基因组学与应用生物学，2014年，
第33卷，第4期，第860－868页
GenomicsandAppliedBiology,2014,Vol.33,No.4,860－868
研究报告
Research
Report
胡杨
PeAPY1
和
PePY2
在提高植物抗旱耐盐性上的功能解析
檀叶青
邓澍荣孙苑玲赵瑞荆晓姝申泽丹钱泽勇张会龙陈少良
*
沈昕
*
北京林业大学生物科学与技术学院,北京,
100083
*通讯作者,xinshen77@,lschen@
广泛用于干旱盐碱地带的造林绿化。本实验
胡杨(
Populuseuphratica
Oliv.)是典型的抗旱耐盐树种，
室前期研究结果表明，盐胁迫下胡杨腺苷三磷酸双磷酸水解酶(Apyrase)基因(
PeAPY
)的转录水平上调，表明
摘
要
该基因可能在胡杨的抗盐性功能上发挥作用。已有研究证明APY是水解eATP的关键酶，而eATP是植物
细胞重要的信使分子，调控植物的生长发育及抗性反应。本研究以
PeAPY
过表达拟南芥株系、拟南芥apy1、
apy2突变体和野生型拟南芥为实验材料，分析了胡杨
PeAPY
对植物抗旱和耐盐能力的影响。研究结果表
明，
PeAPY1
和
PeAPY2
转基因株系的抗旱性明显提高，这可能与
PeAPY1
和
PeAPY2
过表达减少了叶片表
皮的气孔密度，降低了叶片的失水速率，从而提高了植株的保水能力有关。此外，我们还发现
PeAPY1
和
在盐胁迫条件下，过表达
PeAPY1
和
PeAPY2
转基因植物的种子萌
PeAPY2
转基因株系耐盐能力有所提高：
发率和生长、成活率均明显高于突变体apy1、apy2和野生型拟南芥(NaCl处理的浓度分别为0,50mmol/L,
100mmol/L,150mmol/L,200mmol/L)。这可能是由于盐处理条件下，
PeAPY
通过降低盐诱导的eATP浓度，
阻止了eATP诱导的细胞凋亡。综上所述，胡杨
PeAPY
的过表达能够提高植物对盐胁迫、干旱胁迫的耐受
性，
PeAPY
对eATP浓度调控及其对植物抗逆性的具体机制有待进一步研究。
关键词
PeAPY
,eATP,抗盐耐旱,气孔,失水率,生长发育
Functional
Analysisof
PopuluseuphraticaPeAPY1
and
PePY2
inEnhanc-
ingSaltandDroughtTolerance
Tan
YeqingDengShurongSunYuanlingZhaoRuiJinXiaoshuShenZedanQianZeyongZhangHuilong
ChenShaoliang
*
Shen
Xin
*
College
ofBiologicalSciencesandTechnology,BeijingForestryUniversity,Beijing,100083
*Correspondingauthor,xinshen77@,lschen@
DOI:10.13417/.033.000860
Abstract
Being
asasalt-anddrought-tolerantwoodyplants,
Populuseuphratica
isavaluabletreespeciesused
previouslyshownthat
Populuseuphratica
apyrase
gene,
PeAPY
,dicatesthat
PeAPY
playsanimportantrole
in
Populuseuphratica
eisthekeyenzymetohydrolyzeATPintheextra-
ellularATP(eATP)servesasacrucialsignalcomponentregulatingplantgrowth,develop-
ectofthisstudywastoexploretheroleof
PeAPY
insaltand
edtothewildtypeArabidopsisandapy1,apy2mutants,
PeAPY1
－and
PeAPY2
－trans-
duetothereduceddensityofstomatain
snumberofstomataresultedinawaterlossreductionunder
air-dryingconditions,whipression
of
PeAPY1
and
PeAPY2
alsoincreasedsalttoleranceoftransgenicplants.
PeAPY1
－and
PeAPY2
－transgenic
本研究由国家自然科学基金项目(31270654)、教育部科学技术研究(科学技术类)项目(113013A)、人事部留学人员科技
基金项目：
活动项目择优资助经费、高等学校学科创新引智计划(111计划,B13007)和教育部创新团队发展计划(IRT13047)共同资助
861
基因组学与应用生物学
Genomics
andAppliedBiology
plants
exhibitedgreatergerminationrate,rootandshootgrowth,andsurvivalrateduringtheperiodofsalttreat
ment(NaClsalineserieswere0,50mmol/L,100mmol/L,150mmol/L,and200mmol/L).Thisispresumablydue
tothe
PeAPY
reductionofsalt-elicitedeATP,whichblockstheeATP-inducedcelldeathinsalt-treatedplants.
Collectively,weconcludethattheoverexpressionof
PeAPY1
and
PeAPY2
increasedthedroughtandsalttoler-
relationbetween
PeAPY
andeATPconcentration,andtherelevanceto
stresstoleranceneedsfurtherinvestigation.
KeywordsPeAPY
,eATP,Saltanddroughttolerance,Stoma,Waterlossrate,Growth
胡杨是我国西北地区荒漠和戈壁地带惟一能够
大量生长的高大乔木树种。该树种具有很强的耐盐
性，在治理西部的水土流失、改善西部的生态环境中
起到非常重要的作用。近年来，国内外很多学者将胡
杨作为耐盐的木本模式植物，从生理、生化和分子生
物学等方面对其耐盐机理进行了较为系统和深入的
研究，为树木的抗逆性遗传改良提供了理论依据和
技术支撑。
Apyrase是生物中普遍存在的一种蛋白，具有裂
解ATP和ADP磷酸酐键的功能(Komoszynskiand
Wojtczak,1996;Cohnetal.,2001)。在植物中，Apyrase
还具有抵抗外源性物质、清除磷酸盐和调节生长过程
等功能(Sunetal.,2009;2010)。拟南芥中的Apyrase家
族成员
AtAPY1
和
AtAPY2
具有87%的同源性，且
AtAPY1
或
AtAPY2
基因的过表达会引起下胚轴和
花粉管的旺盛生长(Wuetal.,2007)，而单独敲除其
中一个基因不会使植株有明显的表型变化，但若将
这两个基因同时敲除，则植株的花粉无法正常生长,
并导致不能结种(Steinebrunneretal.,2003)。而且，在
apy2单突变体上通过RNA干扰敲掉
AtAPY1
时，整
个植株的生长都受到抑制，下胚轴和根受到的抑制
最为突出(Wuetal.,2007)。一些研究表明，AtAPY1
和AtAPY2是通过调节胞外ATP(eATP)信号而对植
株的生长产生的抑制效应(Dayetal.,2000;Etzleret
al.,1999)。当Apyrase的活性被加入的AtAPY1的化
学抑制剂或其多克隆抗体所抑制时，测量生长中的
花粉管的细胞外基质的eATP浓度，发现Apyrase活
性的减少会使得eATP的浓度升高，从而抑制了花粉
管的生长(Wuetal.,2007;Clarketal.,2010a)。
综上所述，国内外学者多是研究Apyrase在植
物生长发育中的功能(Thomasetal.,1999;Chenetal.,
2003;ChenandPolle,2010)，而对Apyrase在植物抗
逆性中作用还属未知。本实验室前期通过对胡杨的转
录组基因芯片进行了分析，研究结果发现在盐胁迫下
胡杨腺苷三磷酸双磷酸水解酶(Apyrase)基因(
PeAPY
)
被显著性诱导表达。因此，我们推测该基因在其应对
盐胁迫的过程中可能发挥着重要作用。本研究重点探
究了Apyrase在植物抗旱耐盐中的作用。我们将胡杨
PeAPY1
和
PeAPY2
在拟南芥中过表达，并利用
PeAPY
过表达的植株和拟南芥Apyrase突变体apy1
和apy2为供试材料，研究Apyrase蛋白在盐胁迫和干
旱胁迫下所起到的作用，初步探索其作用机理，为今后
提高植物的抗旱和抗盐胁迫能力提供理论依据。
1
结果与分析
1.1
胡杨
Apyrase
序列与结构分析
1.1.1胡杨APY
和其它物种APY对比与分析
本文根据NCBI数据库中毛果杨(
Populustricho
-
以胡杨cDNA
carpa
)中同源基因设计
PeAPY
基因引物，
为模板，PCR克隆得到胡杨的两个
PeAPY
基因：
通过生物学软件DNAman对其
PeAPY1
和
PeAPY2
。
进行基因序列比对发现，胡杨的
PeAPY
基因与拟南
芥、毛果杨等物种的
APY
的基因序列同源性可以达
到58.45%(图1)，氨基酸同源性高达76.04%(图2)，
说明
APY
基因系统进化上的保守性不高，但胡杨
PeAPY
和拟南芥
AtAPY
基因的序列同源性高达
94%，氨基酸同源性75.88%。另外，通过进化树分析
显示，胡杨的
PeAPY2
基因与拟南芥的进化关系非
常近(图3)，所以，可以确定
PeAPY
和
AtAPY
具有相
近的进化关系和类似的生物学功能。
1.1.2PeAPY1和PeAPY2蛋白的三级结构预测
本实验通过构建PeAPY1和PeAPY2蛋白的
SWISS-MODEL模型来分析其蛋白结构。在线提交
蛋白质氨基酸序列，以网站默认模式在已有的三维
结构数据库中搜索、比对并构建模型(图4)。结果显
示，PeAPY1和PeAPY2两个蛋白结构非常接近，均
由两个平行
β
－折叠片结构域构成，有八个
α
－螺旋
区，C端以卷曲结束。整个模型接近椭球形，中部有
一裂沟，可能与蛋白的生物学功能有关。
1.2PeAPY
对拟南芥耐盐性的影响
本实验把拟南芥的野生型、
PeAPY1
和
PeAPY2