2024年3月20日发(作者：司马梦露)
湖南农业科学２０１０，（５）：７－８，１１ Ｈｕｎａｎ Ａ ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
白术和黄芪种子试管内萌发试验研究
洪森荣，尹明华，叶利民，李玲
（上饶师范学院生命科学学院，江西上饶３３４００１）
摘 要：采用不同消毒方式和培养基对白术和黄芪种子试管内萌发进行探究。实验结果表明：白术种子最佳消毒方式为７５％酒
精消毒３０ Ｓ再用Ｏ．Ｉ％ＨｇＣｌ 消毒５ ｍｉｎ；白术种子试管内萌发的适宜培养基为ｌ，２ Ｍｓ。黄芪种子最佳消毒方式为７５％酒精消毒
２０ Ｓ再用０．１％ＨｇＣｌ 消毒ｌＯ～１５ ａｒｉｎ；黄芪种子试管内萌发的适宜培养基为半固体培养基。
关键词：白术；黄芪；试管内萌发
中图分类号：￥３３６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—０６０Ｘ（２０１０）０５—０００７—０２
ｈ Ｖｉｔｒｏ Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｅｄｓ ｏｆ ＡｔｒａｃＯｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．
ａｎｄ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｈ）Ｂｇｅ．
ＨＯＮＧ Ｓｅｎ－ｒｏｎｇ，ＹＩＮ Ｍｉｎｇ－ｈｕａ，ＹＥ Ｌｉ—ｍｉｎ，ＬＩ Ｌｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｒａｏ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｒａｏ ３３４００１，脓ｃＪ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｅｄｓ ｏｆ
Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．ａｎｄ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｇｌｚｔｃｅｔ２￥（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ａ ｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．ｗａｓ ｆｉｒｓｔｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ７５％ｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒ ３０ Ｓ
ｎａｄ ｔｈｅｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｌｌ ０．１％ＨｇＣ１２ ｆｏｒ ５ ｍｉｎ；ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．ｓｅｅｄｓ ｗａｓ １１２
ＭＳ；ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｉｓｉｆｎｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ玎 ｅ玎 ｎ田ｌｃ ｃｅ （Ｆｉｓｃｈ．、Ｂｇｅ．ｗａｓ ｆｉｒｓｌｔｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ７５％
ｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒ ２０ Ｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｏ．１％ＨｇＣＩ２ ｆｏｒ １０ ｍｉｎ ｔｏ １５ ｍｉｎ；ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｅｅｄｓ ｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓ
ｍｅｍｂｒｏｌｔＡ１ｃｅｌｌ￣（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．Ｗａｓ ｓｅｍｉｓｏｌｉｄ ｍｅｄｉｕｍ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．；Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ，ｍ ｍ６ｒ 叽６【ｃｅ“ｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．；ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
白术（Ａ ｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．）系菊科
１．１试验材料
植物，其干燥根茎具有健脾益气、燥湿利水、止汗安
白术种子和黄芪种子购于浙江省景宁县梧桐
胎之效，主治脾虚食少、腹胀、水肿、胎动不安等症【ｌ】。
乡药材专业合作社，原产地为安徽毫州。
栽培中常用种子或块根繁殖，但都难以在短期内大
１．２试验方法
面积种植１２１，黄芪（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）
１．２．１ 不同消毒方式对白术种子萌发的影响 配
Ｂｇｅ．）属于豆科黄芪属的多年生草本植物［３１。黄芪具
置１１２ ＭＳ培养基（大量元素减半，其他基本成分不
有增强机体免疫力功能、强心降压、降血糖、利尿、
变），加入３０ ｇ／Ｌ蔗糖和７．５ ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ值调为
抗病毒等作用，国内外市场对其需要量越来越大 。
５．８～６．０。用聚乙烯封口膜封好，贴上标签。放入高压
目前对于黄芪的研究主要集中于其多糖、黄酮等有
灭菌锅内灭菌（温度：１２０￣Ｃ，时间：２０ ｍｉｎ）。灭菌冷
效成分的提取及其应用价值的研究，对黄芪组织培
却后备用。挑选成熟饱满的白术种子，分成３组，放
养的研究报道较少 。初步研究了白术和黄芪种子
人超净工作台内依次进行消毒，消毒方式设置如
的试管内萌发，以期为白术和黄芪无菌体系建立、
下：（１）用７５％酒精消毒３０ Ｓ，无菌水浸洗１次；再
快速繁殖以及白术和黄芪的产业化生产提供理论
用０．１％ＨｇＣ１ 消毒１ ｍｉｎ，无菌水浸洗１次。（２）用
依据。
７５％酒精消毒３０ Ｓ，无菌水浸洗１次；再用０．１％
１材料与方法
ＨｇＣ１ 消毒５ ｍｉｎ，无菌水浸洗１次。（３）用７５％酒
精消毒３０ Ｓ，无菌水浸洗１次；再用０．１％ＨｇＣ１ 消
收稿日期：２０１０—０１—２０
毒１０ ｍｉｎ，无菌水浸洗１次。材料消毒以后，接种
基金项目：２００９年江西省高校省级教改项目（ＪＸＪＧ一０９—１６—
在１１２ ＭＳ培养基上，放人光照培养箱中培养，培养
１０）
作者简介：洪森荣（１９７４一），男，江西永新县人，硕士，主要从
条件为：光照时间１２ ｈ／ｄ，光照强度１ ２００～１ ４００
事植物生物技术方面的研究。
１）【，温度（２５±１）ｏｃ，湿度６０％一８０％。每天观察种子萌
通讯作者：李玲
发情况并记录种子萌芽、生根、出苗的时间以及种
湖南农业科学 第５期
子污染情况，４５ ｄ时统计白术种子的萌发率、污染
率。萌发率＝（出芽的种子粒数／总接种数）×１００％，
污染率＝（污染粒数／总接种粒数）ｘ１００％。
１．２．２培养基无机盐水平对白术种子萌发的影响
挑选成熟饱满的白术种子，放人超净工作台内进行
消毒，种子消毒方法用７５％酒精消毒３０ Ｓ，无菌水
浸洗１次；再用０．１％ＨｇＣ１ 消毒５ ｒａｉｎ，无菌水浸
洗１次。材料消毒以后接种在不同无机盐水平的培
养基上，培养基设置如下：（１）ＭＳ；（２）１／２ ＭＳ；（３）１／４
ＭＳ。培养基中加入蔗糖３０ ｇ／Ｌ、琼脂７．５ ｇ／Ｌ，ｐＨ调节
为５．８～６．０，用封口膜封口，高压灭菌锅中灭菌。每个
瓶中接人５－６粒种子不等。接种后放入光照培养箱
中培养。每天观察种子萌发、生根情况，４５ ｄ时统计
萌发率。
１．２．３不同消毒方式和培养基类型对黄芪种子试
管内萌发的影响配置固体和半固体培养基，固体
培养基中加入琼脂７．５ ｇ／Ｌ，半固体培养基加入琼脂
３．５ ｇ／Ｌ。封口膜封口并灭菌。挑选饱满黄芪种子放
人工作台内消毒，消毒方式设置如下：（１）用７５％酒
精消毒２０ ｓ，无菌水浸洗１次；再用０．１％ＨｇＣ１ 消
毒５～８ ｍｉｎ，无菌水浸洗１次。种子消毒后接人固体
和半固体培养基中；（２）用７５％酒精消毒２０ Ｓ，无菌
水浸洗ｉ次；再用０．１％ＨｇＣ１：消毒ｌ０～１５ ｍｉｎ，无
菌水浸洗１次。种子消毒后接人固体和半固体培养
基中。每支试管接人３～１０粒黄芪种子不等，接种后
放人光照培养箱中培养。每天观察黄芪种子发芽情
况。１５ ｄ时统计其萌发率。
１．３数据处理
试验为单因子试验，数据均取平均值。
２结果与分析
２．１ 消毒方式对白术种子萌发的影响
种子接入培养基４ ｄ后，就出现种子污染情
况，用７５％酒精消毒３０ Ｓ再用０．１％ＨｇＣ１２消毒１
ｍｉｎ的种子最先出现污染，长出白色绒毛状菌体，
圆形菌落，菌落随时间不断扩大，最后布满整瓶，菌
体由白色变为墨绿色，最后变成黑色。接人的种子
有轻微的褪色，种子在逐渐胀大，但３０ ｄ后，无一
粒种子萌发，４５ ｄ时开始有种子发芽并生根。由表
１可知用０．１％ＨｇＣ１ 消毒时间越短，白术污染率越
高，但种子消毒时问过长或过短对白术种子的萌发
都不利。因此，白术种子最佳的消毒方式是：７５％酒
精消毒３０ Ｓ再用０．１％ＨｇＣ１２消毒５ ａｒｉｎ。
２．２无机盐水平对白术种子萌发的影响
表１消毒方式对白术种子萌发和污染的影响（４５ ｄ）
白术种子接到不同无机盐水平培养基上，有轻
微的褪色，种子也有一定胀大，但一直没有萌发迹
象，到４５ ｄ时开始出现种子萌发。无机盐浓度过低
对白术种子萌发不利。无机盐水平为１／４ ＭＳ时，种
子萌发率为０；无机盐水平为ＭＳ和１／２ ＭＳ时，白
术种子萌发率相对较高，分别为３．５％和３．７％，总体
上白术种子在试管内的萌发率较低。
２．３ 消毒方式和培养基类型对黄芪种子试
管内萌发的影响
黄芪种子培养２ ｄ后，用０．１％ＨｇＣ１ 消毒５
ｍｉｎ的种子接到半固体培养基上的最先有种子发
芽，４ ｄ后，其他种子也有发芽，萌发情况统计如表
２所示，从表２中可知，半固体培养基中种子萌发
率高于固体培养基，用０．１％ＨｇＣ１ 消毒１Ｏ一１５ ｍｉｎ
对黄芪种子适合。
表２消毒方式和培养基类型对黄芪种子
试管内萌发的影响（１５ ｄ）
消毒献 接种数萌发数萌发率
（个） （粒） （％）
固体７５％酒精２０ ｓ＋０．１％ＨｇＣｉ２ ５～８ ｍｉｎ １２
Ｉ ８．３
固体７５％酒精２０ ｓ＋０．１％ＨｇＣｌ２ １Ｏ～１５ ｍｉｎ ２２
５ ２２．７
半固体７５％酒精２０ ｓ＋０．１％Ｈｓｃｌ２ ５－８ ｍｉｎ ２８
７ ２７．８
半固体７５％酒精２０ ｓ＋０．１％ｎｇＣ１２ ｌＯ～１５ ｍｉｎ ６
２ ３３－３
３讨论
本试验对于白术萌发的初步研究表明，用
０．１％ＨｇＣＩ：对白术消毒５ ｍｉｎ的消毒效果最好，污
染率较低。但１／２ ＭＳ培养基上的种子萌发率仅为
３．７％。因此，在本试验中，白术种子总的萌发率较
低，究其原因可能有以下几点：首先是因为白术种
子外表皮有一层茸毛，如果消毒液没有完全浸透种
子，茸毛中的细菌无法杀死，种子易污染，从而影响
种子萌发。其次是因为种子体型较大，种子萌发需
要吸收一定量的水分通过吸胀阶段才能萌发，本试
验采用固体培养基水分不足，导致实验后期培养基
干裂，种子无法吸水导致萌发率低。另外可能是因
为本试验所购买的白术种子本身活力低，萌发率不
高。但李慧［２１把白术种子在流水中冲４～６ ｈ，剥去种
皮，用０．２％ＨｇＣ１ 浸泡２０ ｍｉｎ后，（下转第１１页）
第５期 陈星等：细菌总ＲＮＡ提取方法的研究进展
器皿，塑料制品和电泳槽等器材经常会有ＲＮａｓｅ的
公司开发研制的ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ６１００核酸提取仪。
污染。玻璃器皿，研钵等使用前需要在１ ８０￣（２下干烤 这是一个小型、多用途、快速而又经济的核酸纯化
８ ｈ或更长时间删；离心管等塑料制品可用氯仿浸泡
平台，半个小时即可完成９６个样品的纯化工作，并
过夜后用灭过菌的ｌ％的ＤＥＰＣ（焦炭酸二乙酯）水
且可纯化来自多种生物样本的总ＲＮＡ和基因组
冲洗或直接用ＤＥＰＣ水浸泡，装满水的塑料制品需
ＤＮＡ［２］。这种自动核酸提取仪也在不断的出现和更
要放置２ ｈ以上，然后在ｌ２ｌ℃下灭菌３０ ｍｉｎ；用于 新，越来越多的公司开始研发和生产，这种仪器也
凝胶电泳的电泳槽需要用去污剂清洗后，装满双氧 已经用于很多公司和机构，但目前对于大多数高校
水放置１０ ｒａｉｎ后再１％的ＤＥＰＣ水彻底冲洗后才 和科研机构而言还是很难实现此条件的。
能使用。
ＲＮＡ的提取是分子生物学研究的基础，ＲＮＡ
４．２．２实验人员的污染进行提取ＲＮＡ实验时，
的质量好坏直接影响下游研究结果的准确与否。随
实验人员自身也是重要的ＲＮａｓｅ污染源。在准备和
着科学技术的发展，ＲＮＡ的提取将不断向着快捷、
进行ＲＮＡ提取实验时，需带一次性手套，在实验过
准确和自动化的方向发展。
程中接触了可能带有ＲＮａｓｅ的物品时，要更换手
套，所以在整个实验过程中要勤换手套。另外，空气
参考文献：
和液体中也会有ＲＮａｓｅ，所以实验过程中要带口
［１１ Ｊｕｎｈｕｉ Ｌ，Ｃｈｕａｎｈｏｎｇ Ｔ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ
罩，尽量不说话，并减少实验区域的人员走动。
ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ ｆＪ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
４．２．３ 实验试剂的污染实验中用到的各种试剂，
Ｌｅｔｔ．，２００６，（２８）：１１９３—１１９７．
［２】庞昕，周冬生，杨瑞馥．细菌ｍＲＮＡ的提取方法 ．生物技
也是重要的ＲＮａｓｅ污染源。在配置所用试剂时，要
术通报，２００３，（１）：３Ｏ一３４．
使用经过处理的器皿，并且用灭过菌的１％的ＤＥ—
【３】陈晖，何海福．植物组织总ＲＮＡ提取方法的研究进展『Ｊ】．甘
ＰＣ水来配置；试剂使用次数多了，可能会被ＲＮａｓｅ
肃农业，２００６，（８）：２２８．
污染，所以尽量做到现配现用。
【４】杨占军，谷守琴，张健．几种植物组织总ＲＮＡ提取方法的特
点及疑难对策叨．安徽农业科学，２００９，３７（１８）：８３４１—８３４２．
５ 提取技术的发展前景
［５ ５】Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ，Ｓａｃｃｈｉ Ｎ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
目前，国内外有很多专门用于提取细菌ＲＮＡ的
ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ—ｐｈｅｎｏｌ—ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ『Ｊ］．
Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７。（１６２）：１５６—１５９．
方法，这些方法可以分为两大类：一类是依据特殊的
［６ Ｓｉ６］ｕｎ Ｃ Ｔ，Ｂｅｏｗ Ｃ Ｙ．ＤＮＡ，ＲＮＡ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：Ｔｈｅ
溶液来提取ＲＮＡ（如ＴＲＩＺＯＬ法）；另一类是依据离
Ｐａｓｔ ａｎｄ Ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｔ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ—
心柱，如硅化膜离心柱（Ｐｒｏｍｅｇａ ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏ—
ｇＹ，２００９，（１１）：１－１０．
ｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）等。这些方法大多数被开发成商业的
【７】周秦，黄有军，曾燕如，等．山核桃胚和胚乳总ＲＮＡ的提取
试剂盒，进而简化分子生物学的提取工艺［６１。
与ｅＤＮＡ的合成『ＪＪ。浙江林业科技，２００９，（１）：３９—４２．
当前国际上还出现了自动核酸提取仪，如ＡＢＩ
（责任编辑：石君）
（上接第８页）白术种子萌发率很高。本试验也表
【３】伍春莲．黄芪愈伤组织的培养及蛋白质含量的测定啪．西华师
明，培养基中添加琼脂量的多少对黄芪种子的萌发
范大学学报，２００９，３０（２）：１３８—１３９．
有影响，加入琼脂量少的半固体培养基，黄芪种子
『４１暴宪斌，沈俊兰．黄芪的药理作用及临床研究进展啪．山西中
萌发率高，而添加琼脂量多的固体培养基，培养基
医，２００６，２２（６）：４８—４９．
［５】陈兰兰，高山林，赵慧娜．蒙古黄芪组织培养及同源四倍体的
易硬化，影响了养分和水分的吸收，导致黄芪种子
诱导与鉴定［Ｊ１．药物生物技术，２００６，１３（６）：４１３—４１７．
萌发率低。因此，采取半固体培养基对于黄芪种子
【６】攀锐锋，梁冰，李海燕．黄芪属植物生物学特性及组织培养
萌发有利。本试验结果可以为白术和黄芪试管苗无
技术研究进展【Ｊ】．东北农业大学学报，２００６，（２）：３２—３５．
菌体系的建立提供理论依据。
【７】包英华，苏格尔．蒙古黄芪不同外植体愈伤组织中黄芪甲甙含
量比较『Ｊ］．蒙古大学学报，２００３，（４）：７８—８０．
参考文献
ｆ８】王忠．植物生理学［Ｍ】．北京：中国农业出版社．２００２．２１２—
【１】彭晓波．白术的炮制与应用ｆＪ１．中国现代药物应用，２００９，３
２】３．
（２１）：１１５～１１６．
［２］李慧．白术的组织培养【ＪＪ．特种经济动植物，２００２，（７）：２３—２４．
（责任编辑：卢红玲）
2024年3月20日发(作者：司马梦露)
湖南农业科学２０１０，（５）：７－８，１１ Ｈｕｎａｎ Ａ ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
白术和黄芪种子试管内萌发试验研究
洪森荣，尹明华，叶利民，李玲
（上饶师范学院生命科学学院，江西上饶３３４００１）
摘 要：采用不同消毒方式和培养基对白术和黄芪种子试管内萌发进行探究。实验结果表明：白术种子最佳消毒方式为７５％酒
精消毒３０ Ｓ再用Ｏ．Ｉ％ＨｇＣｌ 消毒５ ｍｉｎ；白术种子试管内萌发的适宜培养基为ｌ，２ Ｍｓ。黄芪种子最佳消毒方式为７５％酒精消毒
２０ Ｓ再用０．１％ＨｇＣｌ 消毒ｌＯ～１５ ａｒｉｎ；黄芪种子试管内萌发的适宜培养基为半固体培养基。
关键词：白术；黄芪；试管内萌发
中图分类号：￥３３６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—０６０Ｘ（２０１０）０５—０００７—０２
ｈ Ｖｉｔｒｏ Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｅｄｓ ｏｆ ＡｔｒａｃＯｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．
ａｎｄ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｈ）Ｂｇｅ．
ＨＯＮＧ Ｓｅｎ－ｒｏｎｇ，ＹＩＮ Ｍｉｎｇ－ｈｕａ，ＹＥ Ｌｉ—ｍｉｎ，ＬＩ Ｌｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｒａｏ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｒａｏ ３３４００１，脓ｃＪ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｅｄｓ ｏｆ
Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．ａｎｄ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｇｌｚｔｃｅｔ２￥（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ａ ｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．ｗａｓ ｆｉｒｓｔｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ７５％ｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒ ３０ Ｓ
ｎａｄ ｔｈｅｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｌｌ ０．１％ＨｇＣ１２ ｆｏｒ ５ ｍｉｎ；ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．ｓｅｅｄｓ ｗａｓ １１２
ＭＳ；ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｉｓｉｆｎｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ玎 ｅ玎 ｎ田ｌｃ ｃｅ （Ｆｉｓｃｈ．、Ｂｇｅ．ｗａｓ ｆｉｒｓｌｔｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ７５％
ｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒ ２０ Ｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｏ．１％ＨｇＣＩ２ ｆｏｒ １０ ｍｉｎ ｔｏ １５ ｍｉｎ；ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｅｅｄｓ ｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓ
ｍｅｍｂｒｏｌｔＡ１ｃｅｌｌ￣（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．Ｗａｓ ｓｅｍｉｓｏｌｉｄ ｍｅｄｉｕｍ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．；Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ，ｍ ｍ６ｒ 叽６【ｃｅ“ｓ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｂｇｅ．；ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
白术（Ａ ｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌａ Ｋｏｉｄｚ．）系菊科
１．１试验材料
植物，其干燥根茎具有健脾益气、燥湿利水、止汗安
白术种子和黄芪种子购于浙江省景宁县梧桐
胎之效，主治脾虚食少、腹胀、水肿、胎动不安等症【ｌ】。
乡药材专业合作社，原产地为安徽毫州。
栽培中常用种子或块根繁殖，但都难以在短期内大
１．２试验方法
面积种植１２１，黄芪（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ（Ｆｉｓｃｈ．）
１．２．１ 不同消毒方式对白术种子萌发的影响 配
Ｂｇｅ．）属于豆科黄芪属的多年生草本植物［３１。黄芪具
置１１２ ＭＳ培养基（大量元素减半，其他基本成分不
有增强机体免疫力功能、强心降压、降血糖、利尿、
变），加入３０ ｇ／Ｌ蔗糖和７．５ ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ值调为
抗病毒等作用，国内外市场对其需要量越来越大 。
５．８～６．０。用聚乙烯封口膜封好，贴上标签。放入高压
目前对于黄芪的研究主要集中于其多糖、黄酮等有
灭菌锅内灭菌（温度：１２０￣Ｃ，时间：２０ ｍｉｎ）。灭菌冷
效成分的提取及其应用价值的研究，对黄芪组织培
却后备用。挑选成熟饱满的白术种子，分成３组，放
养的研究报道较少 。初步研究了白术和黄芪种子
人超净工作台内依次进行消毒，消毒方式设置如
的试管内萌发，以期为白术和黄芪无菌体系建立、
下：（１）用７５％酒精消毒３０ Ｓ，无菌水浸洗１次；再
快速繁殖以及白术和黄芪的产业化生产提供理论
用０．１％ＨｇＣ１ 消毒１ ｍｉｎ，无菌水浸洗１次。（２）用
依据。
７５％酒精消毒３０ Ｓ，无菌水浸洗１次；再用０．１％
１材料与方法
ＨｇＣ１ 消毒５ ｍｉｎ，无菌水浸洗１次。（３）用７５％酒
精消毒３０ Ｓ，无菌水浸洗１次；再用０．１％ＨｇＣ１ 消
收稿日期：２０１０—０１—２０
毒１０ ｍｉｎ，无菌水浸洗１次。材料消毒以后，接种
基金项目：２００９年江西省高校省级教改项目（ＪＸＪＧ一０９—１６—
在１１２ ＭＳ培养基上，放人光照培养箱中培养，培养
１０）
作者简介：洪森荣（１９７４一），男，江西永新县人，硕士，主要从
条件为：光照时间１２ ｈ／ｄ，光照强度１ ２００～１ ４００
事植物生物技术方面的研究。
１）【，温度（２５±１）ｏｃ，湿度６０％一８０％。每天观察种子萌
通讯作者：李玲
发情况并记录种子萌芽、生根、出苗的时间以及种
湖南农业科学 第５期
子污染情况，４５ ｄ时统计白术种子的萌发率、污染
率。萌发率＝（出芽的种子粒数／总接种数）×１００％，
污染率＝（污染粒数／总接种粒数）ｘ１００％。
１．２．２培养基无机盐水平对白术种子萌发的影响
挑选成熟饱满的白术种子，放人超净工作台内进行
消毒，种子消毒方法用７５％酒精消毒３０ Ｓ，无菌水
浸洗１次；再用０．１％ＨｇＣ１ 消毒５ ｒａｉｎ，无菌水浸
洗１次。材料消毒以后接种在不同无机盐水平的培
养基上，培养基设置如下：（１）ＭＳ；（２）１／２ ＭＳ；（３）１／４
ＭＳ。培养基中加入蔗糖３０ ｇ／Ｌ、琼脂７．５ ｇ／Ｌ，ｐＨ调节
为５．８～６．０，用封口膜封口，高压灭菌锅中灭菌。每个
瓶中接人５－６粒种子不等。接种后放入光照培养箱
中培养。每天观察种子萌发、生根情况，４５ ｄ时统计
萌发率。
１．２．３不同消毒方式和培养基类型对黄芪种子试
管内萌发的影响配置固体和半固体培养基，固体
培养基中加入琼脂７．５ ｇ／Ｌ，半固体培养基加入琼脂
３．５ ｇ／Ｌ。封口膜封口并灭菌。挑选饱满黄芪种子放
人工作台内消毒，消毒方式设置如下：（１）用７５％酒
精消毒２０ ｓ，无菌水浸洗１次；再用０．１％ＨｇＣ１ 消
毒５～８ ｍｉｎ，无菌水浸洗１次。种子消毒后接人固体
和半固体培养基中；（２）用７５％酒精消毒２０ Ｓ，无菌
水浸洗ｉ次；再用０．１％ＨｇＣ１：消毒ｌ０～１５ ｍｉｎ，无
菌水浸洗１次。种子消毒后接人固体和半固体培养
基中。每支试管接人３～１０粒黄芪种子不等，接种后
放人光照培养箱中培养。每天观察黄芪种子发芽情
况。１５ ｄ时统计其萌发率。
１．３数据处理
试验为单因子试验，数据均取平均值。
２结果与分析
２．１ 消毒方式对白术种子萌发的影响
种子接入培养基４ ｄ后，就出现种子污染情
况，用７５％酒精消毒３０ Ｓ再用０．１％ＨｇＣ１２消毒１
ｍｉｎ的种子最先出现污染，长出白色绒毛状菌体，
圆形菌落，菌落随时间不断扩大，最后布满整瓶，菌
体由白色变为墨绿色，最后变成黑色。接人的种子
有轻微的褪色，种子在逐渐胀大，但３０ ｄ后，无一
粒种子萌发，４５ ｄ时开始有种子发芽并生根。由表
１可知用０．１％ＨｇＣ１ 消毒时间越短，白术污染率越
高，但种子消毒时问过长或过短对白术种子的萌发
都不利。因此，白术种子最佳的消毒方式是：７５％酒
精消毒３０ Ｓ再用０．１％ＨｇＣ１２消毒５ ａｒｉｎ。
２．２无机盐水平对白术种子萌发的影响
表１消毒方式对白术种子萌发和污染的影响（４５ ｄ）
白术种子接到不同无机盐水平培养基上，有轻
微的褪色，种子也有一定胀大，但一直没有萌发迹
象，到４５ ｄ时开始出现种子萌发。无机盐浓度过低
对白术种子萌发不利。无机盐水平为１／４ ＭＳ时，种
子萌发率为０；无机盐水平为ＭＳ和１／２ ＭＳ时，白
术种子萌发率相对较高，分别为３．５％和３．７％，总体
上白术种子在试管内的萌发率较低。
２．３ 消毒方式和培养基类型对黄芪种子试
管内萌发的影响
黄芪种子培养２ ｄ后，用０．１％ＨｇＣ１ 消毒５
ｍｉｎ的种子接到半固体培养基上的最先有种子发
芽，４ ｄ后，其他种子也有发芽，萌发情况统计如表
２所示，从表２中可知，半固体培养基中种子萌发
率高于固体培养基，用０．１％ＨｇＣ１ 消毒１Ｏ一１５ ｍｉｎ
对黄芪种子适合。
表２消毒方式和培养基类型对黄芪种子
试管内萌发的影响（１５ ｄ）
消毒献 接种数萌发数萌发率
（个） （粒） （％）
固体７５％酒精２０ ｓ＋０．１％ＨｇＣｉ２ ５～８ ｍｉｎ １２
Ｉ ８．３
固体７５％酒精２０ ｓ＋０．１％ＨｇＣｌ２ １Ｏ～１５ ｍｉｎ ２２
５ ２２．７
半固体７５％酒精２０ ｓ＋０．１％Ｈｓｃｌ２ ５－８ ｍｉｎ ２８
７ ２７．８
半固体７５％酒精２０ ｓ＋０．１％ｎｇＣ１２ ｌＯ～１５ ｍｉｎ ６
２ ３３－３
３讨论
本试验对于白术萌发的初步研究表明，用
０．１％ＨｇＣＩ：对白术消毒５ ｍｉｎ的消毒效果最好，污
染率较低。但１／２ ＭＳ培养基上的种子萌发率仅为
３．７％。因此，在本试验中，白术种子总的萌发率较
低，究其原因可能有以下几点：首先是因为白术种
子外表皮有一层茸毛，如果消毒液没有完全浸透种
子，茸毛中的细菌无法杀死，种子易污染，从而影响
种子萌发。其次是因为种子体型较大，种子萌发需
要吸收一定量的水分通过吸胀阶段才能萌发，本试
验采用固体培养基水分不足，导致实验后期培养基
干裂，种子无法吸水导致萌发率低。另外可能是因
为本试验所购买的白术种子本身活力低，萌发率不
高。但李慧［２１把白术种子在流水中冲４～６ ｈ，剥去种
皮，用０．２％ＨｇＣ１ 浸泡２０ ｍｉｎ后，（下转第１１页）
第５期 陈星等：细菌总ＲＮＡ提取方法的研究进展
器皿，塑料制品和电泳槽等器材经常会有ＲＮａｓｅ的
公司开发研制的ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ６１００核酸提取仪。
污染。玻璃器皿，研钵等使用前需要在１ ８０￣（２下干烤 这是一个小型、多用途、快速而又经济的核酸纯化
８ ｈ或更长时间删；离心管等塑料制品可用氯仿浸泡
平台，半个小时即可完成９６个样品的纯化工作，并
过夜后用灭过菌的ｌ％的ＤＥＰＣ（焦炭酸二乙酯）水
且可纯化来自多种生物样本的总ＲＮＡ和基因组
冲洗或直接用ＤＥＰＣ水浸泡，装满水的塑料制品需
ＤＮＡ［２］。这种自动核酸提取仪也在不断的出现和更
要放置２ ｈ以上，然后在ｌ２ｌ℃下灭菌３０ ｍｉｎ；用于 新，越来越多的公司开始研发和生产，这种仪器也
凝胶电泳的电泳槽需要用去污剂清洗后，装满双氧 已经用于很多公司和机构，但目前对于大多数高校
水放置１０ ｒａｉｎ后再１％的ＤＥＰＣ水彻底冲洗后才 和科研机构而言还是很难实现此条件的。
能使用。
ＲＮＡ的提取是分子生物学研究的基础，ＲＮＡ
４．２．２实验人员的污染进行提取ＲＮＡ实验时，
的质量好坏直接影响下游研究结果的准确与否。随
实验人员自身也是重要的ＲＮａｓｅ污染源。在准备和
着科学技术的发展，ＲＮＡ的提取将不断向着快捷、
进行ＲＮＡ提取实验时，需带一次性手套，在实验过
准确和自动化的方向发展。
程中接触了可能带有ＲＮａｓｅ的物品时，要更换手
套，所以在整个实验过程中要勤换手套。另外，空气
参考文献：
和液体中也会有ＲＮａｓｅ，所以实验过程中要带口
［１１ Ｊｕｎｈｕｉ Ｌ，Ｃｈｕａｎｈｏｎｇ Ｔ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ
罩，尽量不说话，并减少实验区域的人员走动。
ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ ｆＪ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
４．２．３ 实验试剂的污染实验中用到的各种试剂，
Ｌｅｔｔ．，２００６，（２８）：１１９３—１１９７．
［２】庞昕，周冬生，杨瑞馥．细菌ｍＲＮＡ的提取方法 ．生物技
也是重要的ＲＮａｓｅ污染源。在配置所用试剂时，要
术通报，２００３，（１）：３Ｏ一３４．
使用经过处理的器皿，并且用灭过菌的１％的ＤＥ—
【３】陈晖，何海福．植物组织总ＲＮＡ提取方法的研究进展『Ｊ】．甘
ＰＣ水来配置；试剂使用次数多了，可能会被ＲＮａｓｅ
肃农业，２００６，（８）：２２８．
污染，所以尽量做到现配现用。
【４】杨占军，谷守琴，张健．几种植物组织总ＲＮＡ提取方法的特
点及疑难对策叨．安徽农业科学，２００９，３７（１８）：８３４１—８３４２．
５ 提取技术的发展前景
［５ ５】Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ，Ｓａｃｃｈｉ Ｎ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
目前，国内外有很多专门用于提取细菌ＲＮＡ的
ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ—ｐｈｅｎｏｌ—ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ『Ｊ］．
Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７。（１６２）：１５６—１５９．
方法，这些方法可以分为两大类：一类是依据特殊的
［６ Ｓｉ６］ｕｎ Ｃ Ｔ，Ｂｅｏｗ Ｃ Ｙ．ＤＮＡ，ＲＮＡ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：Ｔｈｅ
溶液来提取ＲＮＡ（如ＴＲＩＺＯＬ法）；另一类是依据离
Ｐａｓｔ ａｎｄ Ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｔ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ—
心柱，如硅化膜离心柱（Ｐｒｏｍｅｇａ ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏ—
ｇＹ，２００９，（１１）：１－１０．
ｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）等。这些方法大多数被开发成商业的
【７】周秦，黄有军，曾燕如，等．山核桃胚和胚乳总ＲＮＡ的提取
试剂盒，进而简化分子生物学的提取工艺［６１。
与ｅＤＮＡ的合成『ＪＪ。浙江林业科技，２００９，（１）：３９—４２．
当前国际上还出现了自动核酸提取仪，如ＡＢＩ
（责任编辑：石君）
（上接第８页）白术种子萌发率很高。本试验也表
【３】伍春莲．黄芪愈伤组织的培养及蛋白质含量的测定啪．西华师
明，培养基中添加琼脂量的多少对黄芪种子的萌发
范大学学报，２００９，３０（２）：１３８—１３９．
有影响，加入琼脂量少的半固体培养基，黄芪种子
『４１暴宪斌，沈俊兰．黄芪的药理作用及临床研究进展啪．山西中
萌发率高，而添加琼脂量多的固体培养基，培养基
医，２００６，２２（６）：４８—４９．
［５】陈兰兰，高山林，赵慧娜．蒙古黄芪组织培养及同源四倍体的
易硬化，影响了养分和水分的吸收，导致黄芪种子
诱导与鉴定［Ｊ１．药物生物技术，２００６，１３（６）：４１３—４１７．
萌发率低。因此，采取半固体培养基对于黄芪种子
【６】攀锐锋，梁冰，李海燕．黄芪属植物生物学特性及组织培养
萌发有利。本试验结果可以为白术和黄芪试管苗无
技术研究进展【Ｊ】．东北农业大学学报，２００６，（２）：３２—３５．
菌体系的建立提供理论依据。
【７】包英华，苏格尔．蒙古黄芪不同外植体愈伤组织中黄芪甲甙含
量比较『Ｊ］．蒙古大学学报，２００３，（４）：７８—８０．
参考文献
ｆ８】王忠．植物生理学［Ｍ】．北京：中国农业出版社．２００２．２１２—
【１】彭晓波．白术的炮制与应用ｆＪ１．中国现代药物应用，２００９，３
２】３．
（２１）：１１５～１１６．
［２］李慧．白术的组织培养【ＪＪ．特种经济动植物，２００２，（７）：２３—２４．
（责任编辑：卢红玲）