2024年4月27日发(作者：阴幻桃)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.9
(22)申请日 2012.12.31
(71)申请人 陈秀蓉;杨成德
地址 730000 甘肃省兰州市安宁区营门村1号
(72)发明人 陈秀蓉 杨成德 满百膺 李振东 李鹏 荆卓群 杨淑君 高晓星 邹雨坤 王辰月
(74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理有限公司
代理人 高松
(51)
C12N1/20
A01N63/00
A01P3/00
C12R1/425
(10)申请公布号 CN 103122330 A
(43)申请公布日 2013.05.29
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
GH010和其应用及以其制备的微生物菌剂
和制备方法
(57)摘要
本发明公开了一种能够抑制多种病
原菌的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
GH010，并公开了以其制备的微生物菌剂
及其制备方法。本发明的有益效果为：本
发明提供的普城沙雷氏菌株GH010及以其
制备的微生物菌剂，对多种病原菌均有良
好的抑制效果，其抑制结果为辣椒立枯病
菌67.5%，油菜菌核病菌69.5%，棉花立
枯病菌、茄子菌核病菌、番茄灰霉病菌、
黄瓜枯萎病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑
病菌或小麦长蠕孢的抑菌率均为大于等于
57.5%，且对紫花苜蓿等作物有促生作用，
以其制备的微生物农药和微生物肥料环保
性好，不易产生抗药性，安全性良好。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010，菌株GH010为沙雷氏菌属
（Serratia plymuthica），于2012年08月13日保藏于中国普通微生物菌种
保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC NO.6423。
2.根据权利要求1所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌
中的应用，其特征在于，所述病原菌为辣椒立枯病菌或油菜菌核病菌；所述普城沙
雷氏菌株GH010的抑菌率分别为辣椒立枯病菌67.5%，油菜菌核病菌69.5%。
3.根据权利要求1所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌
中的应用，其特征在于，所述病原菌为棉花立枯病菌、茄子菌核病菌、番茄灰霉病
菌、黄瓜枯萎病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌或小麦长蠕孢菌；所述普城沙雷
氏菌株GH010的抑菌率均为大于等于57.5%。
4.根据权利要求1所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌
中的应用，其特征在于，所述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在含有色
氨酸和不含色氨酸的金氏培养基中分泌吲哚乙酸的量分别为63.82mg/L和
5.38mg/L，在无机磷和有机磷培养液中，有效磷增量分别为88.63 mg/L和
86.05 mg/L。
5.高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂，其特征在于，所
述微生物菌剂的组成按照重量百分比计为普城沙雷氏菌株GH010 5-10%，普城沙
雷氏菌株GH010培养基90%-95%。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述普城沙雷氏菌株GH010
培养基包括以重量百分比计的以下组分：玉米粉1.5-2.5%，黄豆粉1-1.5%，蛋白
胨0.2-0.5%，蒸馏水或去离子水1000ml；所述普城沙雷氏菌株GH010培养基的
pH值为7.5-8.5。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述普城沙雷氏菌株GH010
培养基包括以重量百分比计的以下组分：玉米粉2%，黄豆粉1.25%，蛋白胨
0.35%，蒸馏水或去离子水1000ml；所述普城沙雷氏菌株GH010培养基的pH值为
7.5。
8.高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂的制备方法，其特
征在于，是将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在普城沙雷氏菌株GH010
培养基上液体发酵16-22小时得到的；所述液体发酵条件为温度25-29℃，转速
200-300r/min，通气量800-1000L/h；所述普城沙雷氏菌株GH010的活菌数为
9.86×1011cfu/mL-1.06×1013cfu/mL。
9.根据权利要求8所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物
菌剂的制备方法，其特征在于，所述液体发酵条件为温度27℃，转速250r/min，
通气量900L/h，发酵时间19小时。
10.高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂在制备微生物农药
或微生物肥料中的应用。
说 明 书
技术领域
本发明涉及生防领域，具体涉及高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010和其应
用及以其制备的微生物菌剂和制备方法。
背景技术
化学杀菌剂在环境和农产品中可以残留，加之病原对化学杀菌剂逐渐产生抗性，使
用药量逐渐增大，更加重了残留量，且对非目标生物如人、家畜、益虫和野生动物
等的毒害。在我国，近年来农产品安全受到人们的关注，特别是农产品农药残留超
标问题，其严重影响着全民的身心健康，同时影响生态环境及农业贸易。
随着人们生活水平的提高和环保意识的增强，在国际或国内市场，对蔬菜产品实行
准入制，要进入市场的蔬菜必须是无公害蔬菜。蔬菜农药残留量超标，则面临“绿
色贸易壁垒”，在WTO的大环境下无法进入国际市场。这就要求人们对农药品种
和性能进行调整，向无公害农药方向发展。生物农药则是生产无公害农产品过程中
防治病害的优良选项。
微生物农药是公认的“无公害农药”，可以通过直接或间接的作用方式来防治病害，
其防治效果较好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；具较强的选择性，不伤害有
益生物及天敌，不破坏生态平衡，不易产生抗药性；生产原料和有效成分为天然产
物，易降解，可回归大自然，保证可持续发展；还可用生物技术和基因工程的方法
对微生物进行改造，不断提高性能和质量，更好地发挥生物农药的环保性。随着环
境保护法的贯彻执行，以及参与国际市场竞争，微生物农药将作为一种高新技术，
在保护环境、保证人类健康，在农业可持续发展中，发挥愈来愈重要的作用。
化肥定位试验结果表明,磷、钾化肥的施用会导致重金属在土体中累积、资源与能
源大量消耗、环境污染；施入的氮磷肥利用率低，未被吸收利用的氮肥在农田中流
失或挥发，对地下水资源、土壤和空气造成了严重污染，使农畜产品的有毒物质超
标，给人类健康带来了极大的危害，同时化肥的长期大量施用破坏土壤团粒结构，
造成土壤板结，肥力下降。
微生物肥料作为一种新型肥料，施入土壤后，通过其特定菌株的快速繁殖，能固定
大气中的氮素、释放土壤中固定态的磷、钾元素，使得环境的养分潜力得以充分发
挥，并为作物生长营造一个良好的土壤微生物环境，在减少化肥用量、降低环境污
染、提高农作物品质等方面具有重要意义。尤其是集固氮、解磷、解钾和作物生长
素于一身的复合微生物肥料的研发,在农业可持续发展中有举足轻重的作用。
目前，国内外虽然对微生物农药和微生物肥料方面都投入了巨大的人力及物力，但
数量而言化学农药和肥料远远多于生物农药和肥料；另外，生物农药和肥料对环境
的要求较高。因此，开发符合当地环境条件的微生物农药和肥料尤为重要，促进当
地绿色农业的发展、参与国际农产品市场的竞争、保护环境和保证人类健康就显得
尤为重要。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了能够抑制多种病原菌的高寒
草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
GH010，菌株GH010为沙雷氏菌属（Serratia plymuthica），于2012年08
月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为中国北京市朝阳区北辰
西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC NO.6423。
本发明的第二个目的是提供了上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑
制病原菌中的应用，所述病原菌为辣椒立枯病菌或油菜菌核病菌；所述普城沙雷氏
菌株GH010的抑菌率分别为辣椒立枯病菌67.5%，油菜菌核病菌69.5%。
进一步的，上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌中的应用，
所述病原菌为棉花立枯病菌、茄子菌核病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、玉米
大斑病菌、玉米小斑病菌或小麦长蠕孢菌；所述普城沙雷氏菌株GH010的抑菌率
均为大于等于57.5%。
进一步的，上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌中的应用，
所述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在含有色氨酸和不含色氨酸的金氏
培养基中分泌吲哚乙酸的量分别为63.82mg/L和5.38mg/L，在无机磷和有机磷培
养液中，有效磷增量分别为88.63 mg/L和86.05 mg/L。
本发明的第三个目的是提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微
生物菌剂，所述微生物菌剂的组成按照重量百分比计为普城沙雷氏菌株GH010 5-
10%，普城沙雷氏菌株GH010培养基90%-95%。
进一步的，上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂，所
述普城沙雷氏菌株GH010培养基包括以重量百分比计的以下组分：玉米粉1.5-
2.5%，黄豆粉1-1.5%，蛋白胨0.2-0.5%，蒸馏水或去离子水1000ml；所述普城沙
雷氏菌株GH010培养基的pH值为7.5-8.5。
进一步的，上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂，所
述普城沙雷氏菌株GH010培养基包括以重量百分比计的以下组分：玉米粉2%，黄
豆粉1.25%，蛋白胨0.35%，蒸馏水或去离子水1000ml；所述普城沙雷氏菌株
GH010培养基的pH值为7.5。
本发明的第四个目的是提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微
生物菌剂的制备方法，是将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在普城沙雷
氏菌株GH010培养基上液体发酵16-22小时得到的；所述液体发酵条件为温度25-
29℃，转速200-300r/min，通气量800-1000L/h；所述普城沙雷氏菌株GH010的活
菌数为9.86×1011cfu/mL-1.06×1013cfu/mL。
进一步的，上述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂的
制备方法，所述液体发酵条件为温度27℃，转速250r/min，通气量900L/h，发酵
时间19小时。
本发明的第五个目的是提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微
生物菌剂在制备微生物农药或微生物肥料中的应用。
本发明的具体操作过程如下：
一、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010 Serratia plymuthica
（CGMCC No.6423）的形态鉴定。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）接种于在牛肉膏蛋白胨平板培养基（牛肉膏3g，蛋白胨5g，
琼脂10-12g，水1000ml，pH7.0-7.2）上，28℃培养5d的培养性状为：高寒草地牧
草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）菌落
呈圆形，边缘整齐，脐状凸起，表面有光泽，奶油色。在NA液体培养基（牛肉膏
3g，蛋白胨5g，水1000ml，pH7.0-7.2），28℃摇床培养3d后，生长丰富，高度
混浊，匀质，絮状沉淀，振荡完全分散，表面无生长，有气味，革兰氏染色呈阴性，
短杆状。
二、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的16S rDNA基因序列鉴定。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的16S rDNA基因序列在Genebank中与
Serratia plymuthica（EU266583）16S rDNA基因序列进行同源性比较。比较
结果表明，普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）
与Serratia plymuthica（EU266583）的同源性可以达到99%以上，可以证明
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的确属于沙雷氏菌Serratia。
三、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的室内抑菌活性进行测定。
首次筛选出高寒草地牧草内生菌普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）拮抗菌株，将该拮抗菌株接种于GH010（CGMCC No.6423）
培养基中进行培养；同时，将指示菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂（即PDA）培养
基（马铃薯200g，萄萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000m1，pH6.7-7.0）中进行培
养。当拮抗菌株和指示菌株在各自的培养基中培养活化后，分别用打孔器打成直径
为7mm的菌饼。选取拮抗菌株的菌饼一块，置于PDA培养基中；具体的，可以将
该菌饼接种于盛装PDA培养基的平皿的中央位置（平皿直径9cm）；再选取由指
示菌株得到的菌饼四块，根据对峙法，将该四块菌饼等距接种于距该平皿中央位置
为3.5cm的圆周上。将该培养皿在26℃的环境温度下培养5天后，用十字法多次
重复测定该PDA培养基中上述菌株的抑菌圈直径，在本试验中，重复测定3次。
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的无菌液对部分病原菌抑菌能力的测定结果可以参见表1。
由表1可知，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）对表1中的辣椒立枯丝核病菌抑菌率达到67.5%，油菜菌核
病菌抑菌率达到69.5%，对其余7种常见植物病菌的抑制率至少可以达到57.5%，
开发前景较好。
四、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的产生吲哚乙酸及溶磷能力检测及促生能力测定。
1、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的产生吲哚乙酸（IAA）能力测定。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）接种于含有100mg/L色氨酸（或者不含色氨酸）的金氏
（King）培养液（蛋白胨20g，K2HPO4 1.15g，
MgSO4.7H2O 1.5g，丙三醇15ml，L-色氨酸100mg(或不
加色氨酸））培养12 天后对菌悬浮液和空白对照离心10 min ，转速为10000 r/min，
取上清液4 mL分别加入等量比色液，黑暗中静置30min后立即用分光光度计测定
OD530值，普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）
在含有色氨酸和不含色氨酸的金氏培养基中分泌IAA的量分别为63.82mg/L和
5.38mg/L。
2、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的溶磷能力测定。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）接种于PKO（或蒙金娜）培养液
（Ca3(P04)23.0-5.0g，蔗糖10.0g，
(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.2g，
MgSO4.7H2O 0.1g，KC1 0.2g，酵母粉
0.5g,MnSO41mL(0.004 g/L)，
FeSO4() 0.1mL (0.002g/L)，琼脂15g，pH值7.0）中，装液量
为50/150ml，121℃灭菌20min，以不接菌的基础培养液为对照。然后置于28℃、
160 r/min恒温振荡器中培养10d后离心15 min，转速为10000 r/min，上清液采用
钼锑抗比色法测定有效磷增量，普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）在无机磷和有机磷培养液中，有效磷增量分别为88.63 mg/L
和86.05 mg/L。
3、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）促生能力测定。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）接种于牛肉膏蛋白胨培养液（牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂
10-12g，水1000ml，pH7.0-7.2）中，28℃下震荡培养48h，用无菌水稀释成1:30、
1:40、1:50的浓度。浸种24h，以清水处理为对照，置于培养皿中的滤纸上，每皿
100粒，每处理重复3次，观察、记录供试作物种子的发芽情况。待供试作物种子
露白后，将已露白的作物种子栽至小花盆，每天用不同浓度的菌液浇灌幼苗，记录
其株高的生长状况。结果表明，1：50菌液对作物种子发芽率和株高有显著的促进
作用。
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）对部分种子发芽率的测定结果参见表2。
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）对部分作物株高的测定结果参见表3。
五、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的最适培养基及其微生物菌剂的性能进行检测。
1、确定高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的最适培养基。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）分别接种于标号依次为A、B、C、D、E、F和G的培养基中，
观测普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）在这7
种培养基中的生长能力。
经观测，发现高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）在这7种培养基中均能生长，但活菌数有差异。其中，对高
寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）在这7种培养基中活菌数的测定结果可以参见表4。
在表4中，“A”表示营养琼脂（Nutrient Agar，简称NA）培养基，在NA培养基中，
包括牛肉胨5.0g、蛋白胨10g、蔗糖20g和蒸馏水/去离子水1000mL；“B”表示
PDA培养基，在PDA培养基中，包括马铃薯200g、蛋白胨10g、蔗糖20g和蒸馏
水/去离子水1000mL；“C”表示营养肉汤 (Nutrient Broth，简称NB)培养基，在NB
培养基中，包括牛肉胨3g、蛋白胨5.0g、葡萄糖2.5g和蒸馏水/去离子水1000mL；
“D”表示酵母葡萄糖固体（即NYDA）培养基，在NYDA培养基中，包括牛肉胨
8g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL；“E”表示第一玉米淀
粉培养基，在第一玉米淀粉培养基中，包括玉米淀粉2.5g、（NH4）2SO4 10g、蔗
糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL；“F”表示第二玉米淀粉培养基，在第二玉米淀
粉培养基中，包括玉米淀粉3.0g、（NH4）2SO4 10g、KH2PO4 15g、蔗糖10g和
蒸馏水/去离子水1000mL； “G”表示蛋白胨培养基，在蛋白胨培养基中，包括蛋白
胨10g、酵母浸膏5.0g、NaCl 10g和蒸馏水/去离子水1000mL。
由表4可知，在相同的条件下，选择7种不同的培养液培养GH010
（CGMCC No.6423），其活菌量有明显差异。培养液E中活菌数为
1.92×1011cfu/mL，而培养液A的活菌数达到
1.06×1012cfu/mL，是培养液E的5.52倍，两者之间存在显著差异。其
它5种培养液的活菌数为9.26×1011 cfu/mL～
6.36×1011cfu/mL，均与培养液A存在极显著差异。可见，培养液A较
为理想，因此，牛肉膏5.0g/L、蛋白胨 10g/L、蔗糖20g/L为GH010
（CGMCC No.6423）的基础培养基。
在确定NA培养基为最适合普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）生长的培养基的基础上，进一步利用正交法对NA培养基中
碳氮源含量和pH值进行优化。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）以5%的接种量，以140r/min的转速，在28℃的温度条件下
发酵24h后，以玉米粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、白砂糖和不加碳源为处理，测定
发酵液中的活菌数。
经综合测定，用4种不同的碳源培养，其活菌量有明显差异，而以玉米粉为碳源的
培养基更适合普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）
的生长，活菌量达到6.89×1011cfu/mL，即玉米粉为筛选出的较优的碳
源。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）以5%的接种量，以140r/min的转速，在28℃的温度条件下
发酵24h后，以黄豆粉、NH4Cl、（NH4）
2SO4、KNO3和不加氮源为处理，测定发酵液
中的活菌数。
经综合测定，用4种不同的氮源培养，其活菌量有明显差异，而以黄豆粉为氮源时
更适合高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的生长，活菌量达到7.83×1011cfu/mL，即黄豆
粉为筛选出的较优的氮源。
以玉米粉、黄豆粉、蛋白胨及pH进行正交试验，经综合测定，发现优化后的培养
基比上述NA培养基更适合普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的生长和抑菌。其中，上述优化后的培养基的组份、含量和
pH值分别为：玉米粉2%、黄豆粉1.25%、蛋白胨0.35%、pH值7.5，蒸馏水/去离
子水1000mL。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）在上述优化后的培养基中发酵，发酵液中活菌数可以达到
5.43×1011 cfu/mL -7.33×1012cfu/mL。另外，将普城沙雷氏
菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）在包含玉米粉2%、黄
豆粉1.25%、蛋白胨0.35%、pH值7.5，蒸馏水/去离子水1000ml的培养基中发酵，
发酵液中活菌数可以达到7.33×1012cfu/mL。
2、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂的活性进行检测。
在上述试验一中已确定高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）的最适培养基的基础上，将
保存在斜面培养基中的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423），在营养琼脂
（Nutrient Agar，简称NA）培养基的平皿上培养活化24h后，接种于营养肉汤
(Nutrient Broth，简称NB)培养基中；培养24h之后，以5%的接种量接入种子发酵
罐中培养20h之后，转接种于10L的发酵罐中进行发酵，以发酵液中活菌数为指
标，分别对通气量、转速、接种量和装液量进行优化，最终确定高寒草地牧草内生
普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）在10L发酵
罐中的最适发酵条件为：温度25-29℃，接种量5%-10%，pH7.5-8.5，通气量800-
1000L/h，转速200-300 r/min，培养时间为16-22h，活菌数为
9.859×1011/mL-1.06×1013cfu/mL。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）在上述发酵条件的发酵罐中发酵，即可制得到具有良好促生
能力和抑菌能力的微生物菌剂。其中，在温度为28℃，接种量为10%，pH值为
7.5，通气量为1000L/h，转速为200r/min和培养时间为19h的发酵条件下，发酵液
中活菌数可以达到1.06×1013cfu/mL。
3、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂的质量检测方法进行验证。
平板菌落计数法用于测定平板菌落中活菌体的密度，比浊法用于测定平板菌落中活
菌体的个数。这里，分别以平板菌落计数法和比浊法测定平板菌落中活菌体的密度
和个数，测定结果基本一致，即平板菌落上活菌体的密度越大、个数越多，紫外分
光光度计测定OD600nm处的吸收值越高。
可见，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂的质量可以采用平板菌落计数法检测，也可以采
用比浊法检测。
本发明的有益效果为：本发明提供的普城沙雷氏菌株GH010及以其制备的微生物
菌剂，对多种病原菌均有良好的抑制效果，其抑制结果为辣椒立枯病菌67.5%，油
菜菌核病菌69.5%，棉花立枯病菌、茄子菌核病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、
玉米大斑病菌、玉米小斑病菌或小麦长蠕孢的抑菌率均为大于等于57.5%，且对紫
花苜蓿等作物有促生作用，以其制备的微生物农药和微生物肥料环保性好，不易产
生抗药性，安全性良好。
附图说明
图1为本发明提供的普城沙雷氏菌株GH010的菌落形态（左）及菌体形态
（右）。
具体实施方式
实施例1：
一株普城沙雷氏菌株，该普城沙雷氏菌株的拉丁文名称为
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423），由中国微生物菌株保藏管
理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6423。
如图1所示，提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）的光学显微镜照片图。
实施例2：
普城沙雷氏菌株GH010能够对辣椒立枯病菌和油菜菌核病菌等病原菌的抑制，高
寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）对油菜菌核病菌的抑菌率为69.5%；对辣椒立枯病菌的抑菌
率为67.5%。
实施例3：
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）对棉花立枯病菌、茄子菌核病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎
病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌和小麦长蠕孢等病原菌具有抑制作用，抑菌率
至少为57.5%。
实施例4：
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的发酵液可以使紫花苜蓿种子发芽率提高18.9%，使株高增
加1.01cm。
实施例5：
一种普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物
菌剂，该微生物菌剂的生物活性组份和重量百分比含量包括：高寒草地牧草内生普
城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 5%和GH010
（CGMCC No.6423）培养基余量。
GH010（CGMCC No.6423）培养基的组份和含量包括：玉米粉1.5%、黄豆粉1.0%、
蛋白胨0.2%、pH值7.5，蒸馏水/去离子水1000ml。
实施例6：
与上述实施例不同的是，在本实施例中，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂的组份和重量百
分比含量包括：高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 8%和GH010
（CGMCC No.6423）培养基余量。
在本实施例中，GH010（CGMCC No.6423）培养基的组份和含量包括：玉米粉2%、
黄豆粉1.25%、蛋白胨0.35%、pH值8.0，蒸馏水/去离子水1000ml。
实施例7：
与上述实施例不同的是，在本实施例中，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂的组份和重量百
分比含量包括：高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 10%和GH010
（CGMCC No.6423）培养基余量。
在本实施例中，GH010（CGMCC No.6423）培养基的组份和含量包括：玉米粉
2.5%、黄豆粉1.5%、蛋白胨0.5%、pH值8.5，蒸馏水/去离子水1000ml。
实施例8：
一种高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂的制备方法，该制备方法包括：将高寒草地牧草
内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 5%接
种于GH010（CGMCC No.6423）培养基中，在温度为25℃、转速为200r/min和通
气量为800L/h的条件下，进行液体发酵16h，得到的发酵液可以直接作为高寒草
地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）
微生物菌剂使用。
在本实施例中，GH010（CGMCC No.6423）培养基的pH值为7.5，组份和含量可
以包括：玉米粉1.0%、黄豆粉1.0%、蛋白胨0.2%、pH值7.5，蒸馏水/去离子水
1000ml。
经测定，上述发酵液中高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）的活菌数可以达到
5.43×1012 cfu/mL。
实施例9：
与上述实施例不同的是，在本实施例中，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂的制备方法包括：
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423） 8%接种于GH010（CGMCC No.6423）培养基中，在温度为
27℃、转速为250r/min和通气量为900L/h的条件下，进行液体发酵19h，得到的
发酵液可以直接作为高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂使用。
在本实施例中，GH010（CGMCC No.6423）培养基的pH值为8.0，组份和含量可
以包括：玉米粉2%、黄豆粉1.25%、蛋白胨0.35%、pH值8.0，蒸馏水/去离子水
1000ml。
经测定，上述发酵液中高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）的活菌数可以达到
1.06×1013cfu/mL。
实施例10：
与上述实施例不同的是，在本实施例中，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂的制备方法包括：
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423） 10%接种于GH010（CGMCC No.6423）培养基中，在温度为
29℃、转速为300r/min和通气量为1000L/h的条件下，进行液体发酵22h，得到的
发酵液可以直接作为普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂使用。
在本实施例中，GH010（CGMCC No.6423）培养基的pH值为8.5，组份和含量可
以包括：玉米粉2.5%、黄豆粉1.5%、蛋白胨0.5%、pH值8.5，蒸馏水/去离子水
1000ml。
经测定，上述发酵液中高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）的活菌数可以达到
9.859×1012 cfu /mL。
经试验验证，上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂及其制备方法实
施例的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂，适宜在干旱、半干旱及冷凉地区使用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其
依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进
行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，
均应包含在本发明的保护范围之内。
2024年4月27日发(作者：阴幻桃)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.9
(22)申请日 2012.12.31
(71)申请人 陈秀蓉;杨成德
地址 730000 甘肃省兰州市安宁区营门村1号
(72)发明人 陈秀蓉 杨成德 满百膺 李振东 李鹏 荆卓群 杨淑君 高晓星 邹雨坤 王辰月
(74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理有限公司
代理人 高松
(51)
C12N1/20
A01N63/00
A01P3/00
C12R1/425
(10)申请公布号 CN 103122330 A
(43)申请公布日 2013.05.29
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
GH010和其应用及以其制备的微生物菌剂
和制备方法
(57)摘要
本发明公开了一种能够抑制多种病
原菌的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
GH010，并公开了以其制备的微生物菌剂
及其制备方法。本发明的有益效果为：本
发明提供的普城沙雷氏菌株GH010及以其
制备的微生物菌剂，对多种病原菌均有良
好的抑制效果，其抑制结果为辣椒立枯病
菌67.5%，油菜菌核病菌69.5%，棉花立
枯病菌、茄子菌核病菌、番茄灰霉病菌、
黄瓜枯萎病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑
病菌或小麦长蠕孢的抑菌率均为大于等于
57.5%，且对紫花苜蓿等作物有促生作用，
以其制备的微生物农药和微生物肥料环保
性好，不易产生抗药性，安全性良好。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010，菌株GH010为沙雷氏菌属
（Serratia plymuthica），于2012年08月13日保藏于中国普通微生物菌种
保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC NO.6423。
2.根据权利要求1所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌
中的应用，其特征在于，所述病原菌为辣椒立枯病菌或油菜菌核病菌；所述普城沙
雷氏菌株GH010的抑菌率分别为辣椒立枯病菌67.5%，油菜菌核病菌69.5%。
3.根据权利要求1所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌
中的应用，其特征在于，所述病原菌为棉花立枯病菌、茄子菌核病菌、番茄灰霉病
菌、黄瓜枯萎病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌或小麦长蠕孢菌；所述普城沙雷
氏菌株GH010的抑菌率均为大于等于57.5%。
4.根据权利要求1所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌
中的应用，其特征在于，所述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在含有色
氨酸和不含色氨酸的金氏培养基中分泌吲哚乙酸的量分别为63.82mg/L和
5.38mg/L，在无机磷和有机磷培养液中，有效磷增量分别为88.63 mg/L和
86.05 mg/L。
5.高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂，其特征在于，所
述微生物菌剂的组成按照重量百分比计为普城沙雷氏菌株GH010 5-10%，普城沙
雷氏菌株GH010培养基90%-95%。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述普城沙雷氏菌株GH010
培养基包括以重量百分比计的以下组分：玉米粉1.5-2.5%，黄豆粉1-1.5%，蛋白
胨0.2-0.5%，蒸馏水或去离子水1000ml；所述普城沙雷氏菌株GH010培养基的
pH值为7.5-8.5。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述普城沙雷氏菌株GH010
培养基包括以重量百分比计的以下组分：玉米粉2%，黄豆粉1.25%，蛋白胨
0.35%，蒸馏水或去离子水1000ml；所述普城沙雷氏菌株GH010培养基的pH值为
7.5。
8.高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂的制备方法，其特
征在于，是将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在普城沙雷氏菌株GH010
培养基上液体发酵16-22小时得到的；所述液体发酵条件为温度25-29℃，转速
200-300r/min，通气量800-1000L/h；所述普城沙雷氏菌株GH010的活菌数为
9.86×1011cfu/mL-1.06×1013cfu/mL。
9.根据权利要求8所述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物
菌剂的制备方法，其特征在于，所述液体发酵条件为温度27℃，转速250r/min，
通气量900L/h，发酵时间19小时。
10.高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂在制备微生物农药
或微生物肥料中的应用。
说 明 书
技术领域
本发明涉及生防领域，具体涉及高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010和其应
用及以其制备的微生物菌剂和制备方法。
背景技术
化学杀菌剂在环境和农产品中可以残留，加之病原对化学杀菌剂逐渐产生抗性，使
用药量逐渐增大，更加重了残留量，且对非目标生物如人、家畜、益虫和野生动物
等的毒害。在我国，近年来农产品安全受到人们的关注，特别是农产品农药残留超
标问题，其严重影响着全民的身心健康，同时影响生态环境及农业贸易。
随着人们生活水平的提高和环保意识的增强，在国际或国内市场，对蔬菜产品实行
准入制，要进入市场的蔬菜必须是无公害蔬菜。蔬菜农药残留量超标，则面临“绿
色贸易壁垒”，在WTO的大环境下无法进入国际市场。这就要求人们对农药品种
和性能进行调整，向无公害农药方向发展。生物农药则是生产无公害农产品过程中
防治病害的优良选项。
微生物农药是公认的“无公害农药”，可以通过直接或间接的作用方式来防治病害，
其防治效果较好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；具较强的选择性，不伤害有
益生物及天敌，不破坏生态平衡，不易产生抗药性；生产原料和有效成分为天然产
物，易降解，可回归大自然，保证可持续发展；还可用生物技术和基因工程的方法
对微生物进行改造，不断提高性能和质量，更好地发挥生物农药的环保性。随着环
境保护法的贯彻执行，以及参与国际市场竞争，微生物农药将作为一种高新技术，
在保护环境、保证人类健康，在农业可持续发展中，发挥愈来愈重要的作用。
化肥定位试验结果表明,磷、钾化肥的施用会导致重金属在土体中累积、资源与能
源大量消耗、环境污染；施入的氮磷肥利用率低，未被吸收利用的氮肥在农田中流
失或挥发，对地下水资源、土壤和空气造成了严重污染，使农畜产品的有毒物质超
标，给人类健康带来了极大的危害，同时化肥的长期大量施用破坏土壤团粒结构，
造成土壤板结，肥力下降。
微生物肥料作为一种新型肥料，施入土壤后，通过其特定菌株的快速繁殖，能固定
大气中的氮素、释放土壤中固定态的磷、钾元素，使得环境的养分潜力得以充分发
挥，并为作物生长营造一个良好的土壤微生物环境，在减少化肥用量、降低环境污
染、提高农作物品质等方面具有重要意义。尤其是集固氮、解磷、解钾和作物生长
素于一身的复合微生物肥料的研发,在农业可持续发展中有举足轻重的作用。
目前，国内外虽然对微生物农药和微生物肥料方面都投入了巨大的人力及物力，但
数量而言化学农药和肥料远远多于生物农药和肥料；另外，生物农药和肥料对环境
的要求较高。因此，开发符合当地环境条件的微生物农药和肥料尤为重要，促进当
地绿色农业的发展、参与国际农产品市场的竞争、保护环境和保证人类健康就显得
尤为重要。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了能够抑制多种病原菌的高寒
草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
GH010，菌株GH010为沙雷氏菌属（Serratia plymuthica），于2012年08
月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为中国北京市朝阳区北辰
西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC NO.6423。
本发明的第二个目的是提供了上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑
制病原菌中的应用，所述病原菌为辣椒立枯病菌或油菜菌核病菌；所述普城沙雷氏
菌株GH010的抑菌率分别为辣椒立枯病菌67.5%，油菜菌核病菌69.5%。
进一步的，上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌中的应用，
所述病原菌为棉花立枯病菌、茄子菌核病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、玉米
大斑病菌、玉米小斑病菌或小麦长蠕孢菌；所述普城沙雷氏菌株GH010的抑菌率
均为大于等于57.5%。
进一步的，上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在抑制病原菌中的应用，
所述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在含有色氨酸和不含色氨酸的金氏
培养基中分泌吲哚乙酸的量分别为63.82mg/L和5.38mg/L，在无机磷和有机磷培
养液中，有效磷增量分别为88.63 mg/L和86.05 mg/L。
本发明的第三个目的是提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微
生物菌剂，所述微生物菌剂的组成按照重量百分比计为普城沙雷氏菌株GH010 5-
10%，普城沙雷氏菌株GH010培养基90%-95%。
进一步的，上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂，所
述普城沙雷氏菌株GH010培养基包括以重量百分比计的以下组分：玉米粉1.5-
2.5%，黄豆粉1-1.5%，蛋白胨0.2-0.5%，蒸馏水或去离子水1000ml；所述普城沙
雷氏菌株GH010培养基的pH值为7.5-8.5。
进一步的，上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂，所
述普城沙雷氏菌株GH010培养基包括以重量百分比计的以下组分：玉米粉2%，黄
豆粉1.25%，蛋白胨0.35%，蒸馏水或去离子水1000ml；所述普城沙雷氏菌株
GH010培养基的pH值为7.5。
本发明的第四个目的是提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微
生物菌剂的制备方法，是将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010在普城沙雷
氏菌株GH010培养基上液体发酵16-22小时得到的；所述液体发酵条件为温度25-
29℃，转速200-300r/min，通气量800-1000L/h；所述普城沙雷氏菌株GH010的活
菌数为9.86×1011cfu/mL-1.06×1013cfu/mL。
进一步的，上述的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微生物菌剂的
制备方法，所述液体发酵条件为温度27℃，转速250r/min，通气量900L/h，发酵
时间19小时。
本发明的第五个目的是提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010制备的微
生物菌剂在制备微生物农药或微生物肥料中的应用。
本发明的具体操作过程如下：
一、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株GH010 Serratia plymuthica
（CGMCC No.6423）的形态鉴定。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）接种于在牛肉膏蛋白胨平板培养基（牛肉膏3g，蛋白胨5g，
琼脂10-12g，水1000ml，pH7.0-7.2）上，28℃培养5d的培养性状为：高寒草地牧
草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）菌落
呈圆形，边缘整齐，脐状凸起，表面有光泽，奶油色。在NA液体培养基（牛肉膏
3g，蛋白胨5g，水1000ml，pH7.0-7.2），28℃摇床培养3d后，生长丰富，高度
混浊，匀质，絮状沉淀，振荡完全分散，表面无生长，有气味，革兰氏染色呈阴性，
短杆状。
二、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的16S rDNA基因序列鉴定。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的16S rDNA基因序列在Genebank中与
Serratia plymuthica（EU266583）16S rDNA基因序列进行同源性比较。比较
结果表明，普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）
与Serratia plymuthica（EU266583）的同源性可以达到99%以上，可以证明
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的确属于沙雷氏菌Serratia。
三、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的室内抑菌活性进行测定。
首次筛选出高寒草地牧草内生菌普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）拮抗菌株，将该拮抗菌株接种于GH010（CGMCC No.6423）
培养基中进行培养；同时，将指示菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂（即PDA）培养
基（马铃薯200g，萄萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000m1，pH6.7-7.0）中进行培
养。当拮抗菌株和指示菌株在各自的培养基中培养活化后，分别用打孔器打成直径
为7mm的菌饼。选取拮抗菌株的菌饼一块，置于PDA培养基中；具体的，可以将
该菌饼接种于盛装PDA培养基的平皿的中央位置（平皿直径9cm）；再选取由指
示菌株得到的菌饼四块，根据对峙法，将该四块菌饼等距接种于距该平皿中央位置
为3.5cm的圆周上。将该培养皿在26℃的环境温度下培养5天后，用十字法多次
重复测定该PDA培养基中上述菌株的抑菌圈直径，在本试验中，重复测定3次。
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的无菌液对部分病原菌抑菌能力的测定结果可以参见表1。
由表1可知，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）对表1中的辣椒立枯丝核病菌抑菌率达到67.5%，油菜菌核
病菌抑菌率达到69.5%，对其余7种常见植物病菌的抑制率至少可以达到57.5%，
开发前景较好。
四、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的产生吲哚乙酸及溶磷能力检测及促生能力测定。
1、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的产生吲哚乙酸（IAA）能力测定。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）接种于含有100mg/L色氨酸（或者不含色氨酸）的金氏
（King）培养液（蛋白胨20g，K2HPO4 1.15g，
MgSO4.7H2O 1.5g，丙三醇15ml，L-色氨酸100mg(或不
加色氨酸））培养12 天后对菌悬浮液和空白对照离心10 min ，转速为10000 r/min，
取上清液4 mL分别加入等量比色液，黑暗中静置30min后立即用分光光度计测定
OD530值，普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）
在含有色氨酸和不含色氨酸的金氏培养基中分泌IAA的量分别为63.82mg/L和
5.38mg/L。
2、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的溶磷能力测定。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）接种于PKO（或蒙金娜）培养液
（Ca3(P04)23.0-5.0g，蔗糖10.0g，
(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.2g，
MgSO4.7H2O 0.1g，KC1 0.2g，酵母粉
0.5g,MnSO41mL(0.004 g/L)，
FeSO4() 0.1mL (0.002g/L)，琼脂15g，pH值7.0）中，装液量
为50/150ml，121℃灭菌20min，以不接菌的基础培养液为对照。然后置于28℃、
160 r/min恒温振荡器中培养10d后离心15 min，转速为10000 r/min，上清液采用
钼锑抗比色法测定有效磷增量，普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）在无机磷和有机磷培养液中，有效磷增量分别为88.63 mg/L
和86.05 mg/L。
3、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）促生能力测定。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）接种于牛肉膏蛋白胨培养液（牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂
10-12g，水1000ml，pH7.0-7.2）中，28℃下震荡培养48h，用无菌水稀释成1:30、
1:40、1:50的浓度。浸种24h，以清水处理为对照，置于培养皿中的滤纸上，每皿
100粒，每处理重复3次，观察、记录供试作物种子的发芽情况。待供试作物种子
露白后，将已露白的作物种子栽至小花盆，每天用不同浓度的菌液浇灌幼苗，记录
其株高的生长状况。结果表明，1：50菌液对作物种子发芽率和株高有显著的促进
作用。
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）对部分种子发芽率的测定结果参见表2。
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）对部分作物株高的测定结果参见表3。
五、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的最适培养基及其微生物菌剂的性能进行检测。
1、确定高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的最适培养基。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）分别接种于标号依次为A、B、C、D、E、F和G的培养基中，
观测普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）在这7
种培养基中的生长能力。
经观测，发现高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）在这7种培养基中均能生长，但活菌数有差异。其中，对高
寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）在这7种培养基中活菌数的测定结果可以参见表4。
在表4中，“A”表示营养琼脂（Nutrient Agar，简称NA）培养基，在NA培养基中，
包括牛肉胨5.0g、蛋白胨10g、蔗糖20g和蒸馏水/去离子水1000mL；“B”表示
PDA培养基，在PDA培养基中，包括马铃薯200g、蛋白胨10g、蔗糖20g和蒸馏
水/去离子水1000mL；“C”表示营养肉汤 (Nutrient Broth，简称NB)培养基，在NB
培养基中，包括牛肉胨3g、蛋白胨5.0g、葡萄糖2.5g和蒸馏水/去离子水1000mL；
“D”表示酵母葡萄糖固体（即NYDA）培养基，在NYDA培养基中，包括牛肉胨
8g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL；“E”表示第一玉米淀
粉培养基，在第一玉米淀粉培养基中，包括玉米淀粉2.5g、（NH4）2SO4 10g、蔗
糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL；“F”表示第二玉米淀粉培养基，在第二玉米淀
粉培养基中，包括玉米淀粉3.0g、（NH4）2SO4 10g、KH2PO4 15g、蔗糖10g和
蒸馏水/去离子水1000mL； “G”表示蛋白胨培养基，在蛋白胨培养基中，包括蛋白
胨10g、酵母浸膏5.0g、NaCl 10g和蒸馏水/去离子水1000mL。
由表4可知，在相同的条件下，选择7种不同的培养液培养GH010
（CGMCC No.6423），其活菌量有明显差异。培养液E中活菌数为
1.92×1011cfu/mL，而培养液A的活菌数达到
1.06×1012cfu/mL，是培养液E的5.52倍，两者之间存在显著差异。其
它5种培养液的活菌数为9.26×1011 cfu/mL～
6.36×1011cfu/mL，均与培养液A存在极显著差异。可见，培养液A较
为理想，因此，牛肉膏5.0g/L、蛋白胨 10g/L、蔗糖20g/L为GH010
（CGMCC No.6423）的基础培养基。
在确定NA培养基为最适合普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）生长的培养基的基础上，进一步利用正交法对NA培养基中
碳氮源含量和pH值进行优化。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）以5%的接种量，以140r/min的转速，在28℃的温度条件下
发酵24h后，以玉米粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、白砂糖和不加碳源为处理，测定
发酵液中的活菌数。
经综合测定，用4种不同的碳源培养，其活菌量有明显差异，而以玉米粉为碳源的
培养基更适合普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）
的生长，活菌量达到6.89×1011cfu/mL，即玉米粉为筛选出的较优的碳
源。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）以5%的接种量，以140r/min的转速，在28℃的温度条件下
发酵24h后，以黄豆粉、NH4Cl、（NH4）
2SO4、KNO3和不加氮源为处理，测定发酵液
中的活菌数。
经综合测定，用4种不同的氮源培养，其活菌量有明显差异，而以黄豆粉为氮源时
更适合高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的生长，活菌量达到7.83×1011cfu/mL，即黄豆
粉为筛选出的较优的氮源。
以玉米粉、黄豆粉、蛋白胨及pH进行正交试验，经综合测定，发现优化后的培养
基比上述NA培养基更适合普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的生长和抑菌。其中，上述优化后的培养基的组份、含量和
pH值分别为：玉米粉2%、黄豆粉1.25%、蛋白胨0.35%、pH值7.5，蒸馏水/去离
子水1000mL。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）在上述优化后的培养基中发酵，发酵液中活菌数可以达到
5.43×1011 cfu/mL -7.33×1012cfu/mL。另外，将普城沙雷氏
菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）在包含玉米粉2%、黄
豆粉1.25%、蛋白胨0.35%、pH值7.5，蒸馏水/去离子水1000ml的培养基中发酵，
发酵液中活菌数可以达到7.33×1012cfu/mL。
2、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂的活性进行检测。
在上述试验一中已确定高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）的最适培养基的基础上，将
保存在斜面培养基中的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423），在营养琼脂
（Nutrient Agar，简称NA）培养基的平皿上培养活化24h后，接种于营养肉汤
(Nutrient Broth，简称NB)培养基中；培养24h之后，以5%的接种量接入种子发酵
罐中培养20h之后，转接种于10L的发酵罐中进行发酵，以发酵液中活菌数为指
标，分别对通气量、转速、接种量和装液量进行优化，最终确定高寒草地牧草内生
普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）在10L发酵
罐中的最适发酵条件为：温度25-29℃，接种量5%-10%，pH7.5-8.5，通气量800-
1000L/h，转速200-300 r/min，培养时间为16-22h，活菌数为
9.859×1011/mL-1.06×1013cfu/mL。
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）在上述发酵条件的发酵罐中发酵，即可制得到具有良好促生
能力和抑菌能力的微生物菌剂。其中，在温度为28℃，接种量为10%，pH值为
7.5，通气量为1000L/h，转速为200r/min和培养时间为19h的发酵条件下，发酵液
中活菌数可以达到1.06×1013cfu/mL。
3、对高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂的质量检测方法进行验证。
平板菌落计数法用于测定平板菌落中活菌体的密度，比浊法用于测定平板菌落中活
菌体的个数。这里，分别以平板菌落计数法和比浊法测定平板菌落中活菌体的密度
和个数，测定结果基本一致，即平板菌落上活菌体的密度越大、个数越多，紫外分
光光度计测定OD600nm处的吸收值越高。
可见，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂的质量可以采用平板菌落计数法检测，也可以采
用比浊法检测。
本发明的有益效果为：本发明提供的普城沙雷氏菌株GH010及以其制备的微生物
菌剂，对多种病原菌均有良好的抑制效果，其抑制结果为辣椒立枯病菌67.5%，油
菜菌核病菌69.5%，棉花立枯病菌、茄子菌核病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、
玉米大斑病菌、玉米小斑病菌或小麦长蠕孢的抑菌率均为大于等于57.5%，且对紫
花苜蓿等作物有促生作用，以其制备的微生物农药和微生物肥料环保性好，不易产
生抗药性，安全性良好。
附图说明
图1为本发明提供的普城沙雷氏菌株GH010的菌落形态（左）及菌体形态
（右）。
具体实施方式
实施例1：
一株普城沙雷氏菌株，该普城沙雷氏菌株的拉丁文名称为
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423），由中国微生物菌株保藏管
理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6423。
如图1所示，提供了高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）的光学显微镜照片图。
实施例2：
普城沙雷氏菌株GH010能够对辣椒立枯病菌和油菜菌核病菌等病原菌的抑制，高
寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）对油菜菌核病菌的抑菌率为69.5%；对辣椒立枯病菌的抑菌
率为67.5%。
实施例3：
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）对棉花立枯病菌、茄子菌核病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎
病菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌和小麦长蠕孢等病原菌具有抑制作用，抑菌率
至少为57.5%。
实施例4：
高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）的发酵液可以使紫花苜蓿种子发芽率提高18.9%，使株高增
加1.01cm。
实施例5：
一种普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物
菌剂，该微生物菌剂的生物活性组份和重量百分比含量包括：高寒草地牧草内生普
城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 5%和GH010
（CGMCC No.6423）培养基余量。
GH010（CGMCC No.6423）培养基的组份和含量包括：玉米粉1.5%、黄豆粉1.0%、
蛋白胨0.2%、pH值7.5，蒸馏水/去离子水1000ml。
实施例6：
与上述实施例不同的是，在本实施例中，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂的组份和重量百
分比含量包括：高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 8%和GH010
（CGMCC No.6423）培养基余量。
在本实施例中，GH010（CGMCC No.6423）培养基的组份和含量包括：玉米粉2%、
黄豆粉1.25%、蛋白胨0.35%、pH值8.0，蒸馏水/去离子水1000ml。
实施例7：
与上述实施例不同的是，在本实施例中，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂的组份和重量百
分比含量包括：高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 10%和GH010
（CGMCC No.6423）培养基余量。
在本实施例中，GH010（CGMCC No.6423）培养基的组份和含量包括：玉米粉
2.5%、黄豆粉1.5%、蛋白胨0.5%、pH值8.5，蒸馏水/去离子水1000ml。
实施例8：
一种高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂的制备方法，该制备方法包括：将高寒草地牧草
内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423） 5%接
种于GH010（CGMCC No.6423）培养基中，在温度为25℃、转速为200r/min和通
气量为800L/h的条件下，进行液体发酵16h，得到的发酵液可以直接作为高寒草
地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）
微生物菌剂使用。
在本实施例中，GH010（CGMCC No.6423）培养基的pH值为7.5，组份和含量可
以包括：玉米粉1.0%、黄豆粉1.0%、蛋白胨0.2%、pH值7.5，蒸馏水/去离子水
1000ml。
经测定，上述发酵液中高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）的活菌数可以达到
5.43×1012 cfu/mL。
实施例9：
与上述实施例不同的是，在本实施例中，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂的制备方法包括：
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423） 8%接种于GH010（CGMCC No.6423）培养基中，在温度为
27℃、转速为250r/min和通气量为900L/h的条件下，进行液体发酵19h，得到的
发酵液可以直接作为高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂使用。
在本实施例中，GH010（CGMCC No.6423）培养基的pH值为8.0，组份和含量可
以包括：玉米粉2%、黄豆粉1.25%、蛋白胨0.35%、pH值8.0，蒸馏水/去离子水
1000ml。
经测定，上述发酵液中高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）的活菌数可以达到
1.06×1013cfu/mL。
实施例10：
与上述实施例不同的是，在本实施例中，高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂的制备方法包括：
将高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423） 10%接种于GH010（CGMCC No.6423）培养基中，在温度为
29℃、转速为300r/min和通气量为1000L/h的条件下，进行液体发酵22h，得到的
发酵液可以直接作为普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂使用。
在本实施例中，GH010（CGMCC No.6423）培养基的pH值为8.5，组份和含量可
以包括：玉米粉2.5%、黄豆粉1.5%、蛋白胨0.5%、pH值8.5，蒸馏水/去离子水
1000ml。
经测定，上述发酵液中高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）的活菌数可以达到
9.859×1012 cfu /mL。
经试验验证，上述高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株
Serratia plymuthica GH010（CGMCC No.6423）微生物菌剂及其制备方法实
施例的高寒草地牧草内生普城沙雷氏菌株Serratia plymuthica GH010
（CGMCC No.6423）微生物菌剂，适宜在干旱、半干旱及冷凉地区使用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其
依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进
行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，
均应包含在本发明的保护范围之内。