2024年2月16日发(作者：功鸿志)
实验8-1 红曲霉的分离纯化
一、实验目的
熟悉红曲霉菌种的分离纯化方法。
二、实验原理
红曲霉广泛分布于自然界，因此可以从自然界中分离纯化得到。鉴于我国劳动人民很早就开始利用红曲，他们将红曲霉制成了各种各样的发酵食品，因此，要得到红曲霉菌种，最简便的办法是直接从这些发酵食品中去分离。
培养红曲霉多用麦芽汁琼脂培养基，红曲霉在该培养基上生长良好，菌落较大，培养初期菌落为白色，老熟后变为淡红色、紫红色、橙红色、烟灰色等，因种而异。菌落有呈绒毡状的，也有呈皮膜状的，呈皮膜状的菌落少褶皱或只有辐射纹。红曲霉在马铃薯培养基（PDA）上呈现局限性生长，而不像在麦芽汁琼脂上那样蔓延。某些种能在PDA培养基上形成疮疤状菌落。红曲霉产生的是水溶性红色色素，能分泌到培养基中，使培养基着色。
三、实验器材与试剂
1. 样品
市售红曲米或红曲酒酒药。
2. 培养基
（1）半合成培养基：葡萄糖30g，NaNO3
3 g，酵母提取物1 g，K2HPO4
1 g，MgSO4·7H2O
0.5g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，pH5.6，用蒸馏水定容至1 L。固体培养基添加20 g琼脂；
（2）麦芽汁培养基：5～8。P麦芽汁；
（3）豆芽汁培养基：豆芽200 g，加水1000 mL，煮沸10 min后过滤，滤液加2％葡萄糖即成，固体培养基添加2％琼脂。
3. 器材
水浴锅、培养箱、灭菌锅、培养皿、移液管、试管等。
四、实验步骤
1. 实验准备
配制上述半合成固体培养基（或麦芽汁培养基、豆芽汁培养基），高压蒸汽灭菌；准备无菌水，移液管、培养皿等，灭菌备用；实验前将培养基倒入平皿中，冷却凝固后于30 ℃培养箱中放置5～6 h，以烘去冷凝水。
2. 红曲霉的分离纯化
称取红曲米5 g，放入45 mL无菌水中，振荡摇匀后置于60 ℃水浴中保温30 min以杀
死不耐热的细菌及酵母，将上层孢子悬液用稀释涂平板法分离，30℃培养5 d，挑取能产红曲色素的霉菌单菌落，用显微镜检查是否纯种（细胞形态是否一致），确认后保存。
3. 菌种保藏
（1）斜面保藏：取纯化后的红曲霉，以无菌操作方式移接到斜面培养基中，30 ℃培养5 d，待斜面菌体呈紫红色时即可保藏于4 ℃冰箱内，每2个月移植一次；
（2）矿油保藏：是一种隔绝空气保藏法，将已灭菌并冷却的石蜡油以无菌操作方式加至培养成熟的斜面红曲霉中，加量以液面高过斜面顶端1 cm左右为止；
（3）曲粉保藏：称取麸皮或米粉2 g，加1％乳酸2 mL，混匀制成曲粉，0.1 MPa灭菌30 min，冷却后接种，30℃培养7 d，然后用无菌角匙挑取约0.5 g培养物装入已灭菌的安瓿管中，再放入装有P2O5的干燥器中干燥（或抽真空），封口后放入室温中保存；
（4）沙土管保藏：取细沙（经24目筛筛过），用10％HCl加热处理，以去除其中的有机物质，水洗去酸，烘干，分装入安瓿管中，装量约1 cm高。用无菌水制成红曲霉的孢子悬浮液，加至砂土管中，每管5滴，同上法干燥，然后封口保藏；
（5）制曲保藏：用大米制成红曲后，放干燥处保存。
五、注意事项
1. 注意无菌操作，防止杂菌污染。
2. 由于霉菌的菌落较大，为了便于挑取单菌落、分离时稀释度以稍大一点为好。
3. 红曲酒酒药中除红曲霉外，还可能有毛霉、根霉等菌株，它们的菌落是蔓延型的，因此培养时应逐日观察，挑取所需的菌株。
六、思考题
1. 为什么要在60 ℃水浴保温30min？
2. 是否可从市售红腐乳中分离红曲霉？为什么？
2024年2月16日发(作者：功鸿志)
实验8-1 红曲霉的分离纯化
一、实验目的
熟悉红曲霉菌种的分离纯化方法。
二、实验原理
红曲霉广泛分布于自然界，因此可以从自然界中分离纯化得到。鉴于我国劳动人民很早就开始利用红曲，他们将红曲霉制成了各种各样的发酵食品，因此，要得到红曲霉菌种，最简便的办法是直接从这些发酵食品中去分离。
培养红曲霉多用麦芽汁琼脂培养基，红曲霉在该培养基上生长良好，菌落较大，培养初期菌落为白色，老熟后变为淡红色、紫红色、橙红色、烟灰色等，因种而异。菌落有呈绒毡状的，也有呈皮膜状的，呈皮膜状的菌落少褶皱或只有辐射纹。红曲霉在马铃薯培养基（PDA）上呈现局限性生长，而不像在麦芽汁琼脂上那样蔓延。某些种能在PDA培养基上形成疮疤状菌落。红曲霉产生的是水溶性红色色素，能分泌到培养基中，使培养基着色。
三、实验器材与试剂
1. 样品
市售红曲米或红曲酒酒药。
2. 培养基
（1）半合成培养基：葡萄糖30g，NaNO3
3 g，酵母提取物1 g，K2HPO4
1 g，MgSO4·7H2O
0.5g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，pH5.6，用蒸馏水定容至1 L。固体培养基添加20 g琼脂；
（2）麦芽汁培养基：5～8。P麦芽汁；
（3）豆芽汁培养基：豆芽200 g，加水1000 mL，煮沸10 min后过滤，滤液加2％葡萄糖即成，固体培养基添加2％琼脂。
3. 器材
水浴锅、培养箱、灭菌锅、培养皿、移液管、试管等。
四、实验步骤
1. 实验准备
配制上述半合成固体培养基（或麦芽汁培养基、豆芽汁培养基），高压蒸汽灭菌；准备无菌水，移液管、培养皿等，灭菌备用；实验前将培养基倒入平皿中，冷却凝固后于30 ℃培养箱中放置5～6 h，以烘去冷凝水。
2. 红曲霉的分离纯化
称取红曲米5 g，放入45 mL无菌水中，振荡摇匀后置于60 ℃水浴中保温30 min以杀
死不耐热的细菌及酵母，将上层孢子悬液用稀释涂平板法分离，30℃培养5 d，挑取能产红曲色素的霉菌单菌落，用显微镜检查是否纯种（细胞形态是否一致），确认后保存。
3. 菌种保藏
（1）斜面保藏：取纯化后的红曲霉，以无菌操作方式移接到斜面培养基中，30 ℃培养5 d，待斜面菌体呈紫红色时即可保藏于4 ℃冰箱内，每2个月移植一次；
（2）矿油保藏：是一种隔绝空气保藏法，将已灭菌并冷却的石蜡油以无菌操作方式加至培养成熟的斜面红曲霉中，加量以液面高过斜面顶端1 cm左右为止；
（3）曲粉保藏：称取麸皮或米粉2 g，加1％乳酸2 mL，混匀制成曲粉，0.1 MPa灭菌30 min，冷却后接种，30℃培养7 d，然后用无菌角匙挑取约0.5 g培养物装入已灭菌的安瓿管中，再放入装有P2O5的干燥器中干燥（或抽真空），封口后放入室温中保存；
（4）沙土管保藏：取细沙（经24目筛筛过），用10％HCl加热处理，以去除其中的有机物质，水洗去酸，烘干，分装入安瓿管中，装量约1 cm高。用无菌水制成红曲霉的孢子悬浮液，加至砂土管中，每管5滴，同上法干燥，然后封口保藏；
（5）制曲保藏：用大米制成红曲后，放干燥处保存。
五、注意事项
1. 注意无菌操作，防止杂菌污染。
2. 由于霉菌的菌落较大，为了便于挑取单菌落、分离时稀释度以稍大一点为好。
3. 红曲酒酒药中除红曲霉外，还可能有毛霉、根霉等菌株，它们的菌落是蔓延型的，因此培养时应逐日观察，挑取所需的菌株。
六、思考题
1. 为什么要在60 ℃水浴保温30min？
2. 是否可从市售红腐乳中分离红曲霉？为什么？