2024年5月22日发(作者：庆丽玉)
EM益生菌种的保存方法 微生物具有容易变异的特性因此在保藏过程中必须使微生
物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态才能在一定的时间内使其不发生变异而又
保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素所以菌
种保藏方法虽多但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种 1
传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等后者作保藏厌氧细菌
用培养后于4—6℃冰箱内保存。 2液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法能够
适当延长保藏时间它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡一方面
可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡另一方面可阻止氧气进入以减弱代谢作
用。 3载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体如土壤、沙子、硅胶、滤纸上而后
进行干燥的保藏法例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4寄主保藏法 用于
目前尚不能在人工培养基上生长的微生物如病毒、立克次氏体、螺旋体等它们必须
在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5冷冻保
藏法 可分低温冰箱-20—-30℃-50—-80℃、干冰酒精快速冻结约-70℃和液氮-196℃
等保藏法。 6冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度-70℃左右下快速冷冻然后在
减压下利用升华现象除去水分真空干燥。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷
冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液以防止因冷冻或水分不断升华对细
胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成
分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵
母菌放线菌和霉菌 肉膏蛋白胨斜面培养基灭菌脱脂牛乳灭菌水化学纯的液体石蜡
甘油五氧化二磷河沙瘦黄土或红土冰块、食盐干冰95酒精10盐酸无水氯化钙 灭菌吸
管灭菌滴管灭菌培养皿管形安瓿管泪滴形安瓿管长颈球形底40目与 100目筛子油纸
滤纸条05×12cm干燥器真空泵真空压力表喷灯L形五通管冰箱低温冰箱-30℃液氮冷
冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室
具体条件与需要选做。 1斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上待
菌充分生长后棉塞部分用油纸包扎好移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物
的种类而有不同霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月移种一次。酵母菌两个
月细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法优点是操作简
单使用方便不需特殊设备能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。
缺点是容易变异因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的屡次传代会使微生物
的代谢改变而影响微生物的性状污染杂菌的机会亦较多。 2液体石蜡保藏法 1将液
体石蜡分装于三角烧瓶内塞上棉塞并用牛皮纸包扎105kg/cm21213℃灭菌30分钟然
后放在40℃温箱中使水汽蒸发掉备用。 2将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基
中培养使得到健壮的菌体或孢子。 3用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡注入已长好菌
的斜面上其用量以高出斜面顶端1cm为准图Ⅶ-12使菌种与空气隔绝。 4将试管直立
置低温或室温下保存有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长。 此法实用而
效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死酵母菌可保藏1—2年一般无芽
孢细菌也可保藏1年左右甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌在37℃温箱内亦可
保藏3个月之久。此法的优点是制作简单不需特殊设备且不需经常移种。缺点是保存
时必须直立放置所占位置较大同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后接
种环在火焰上烧灼时培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅应特别注意。 3滤纸保
藏法 1将滤纸剪成05×12cm的小条装入06×8cm的安瓿管中每管1—2张塞以棉塞
105kg/cm21213℃灭菌30分钟。 2将需要保存的菌种在适宜的斜面培养基上培养使充
分生长。 3取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内取数环菌苔在牛乳内
混匀制成浓悬液。 4用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内使其吸饱再放回至
安瓿管中塞上棉塞。 5将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中用真空泵
抽气至干。 6将棉花塞入管内用火焰按图Ⅶ-13熔封保存于低温下。 7需要使用菌种
复活培养时可将安瓿管口在火焰上烧热滴一滴冷水在烧热的部位使玻璃破裂再用镊
子敲掉口端的玻璃待安瓿管开启后取出滤纸放入液体培养基内置温箱中培养。 细
菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏前两者可保藏2年左右有些丝状真菌甚至可保
藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便不需要特殊设备。 4沙土保藏法 1
取河沙加入10稀盐酸加热煮沸30分钟以去除其中的有机质。 2倒去酸水用自来水冲
洗至中性。 3烘干用40目筛子过筛以去掉粗颗粒备用。 4另取非耕作层的不含腐植
质的瘦黄土或红土加自来水浸泡洗涤数次直至中性。 5烘干碾碎通过100目筛子过筛
以去除粗颗粒。 6按一份黄土、三份沙的比例或根据需要而用其他比例甚至可全部
用沙或全部用土掺合均匀装入10×100mm的小试管或安瓿管中每管装1g左右塞上棉
塞进行灭菌烘干。 7抽样进行无菌检查每10支沙土管抽一支将沙土倒入肉汤培养基
中37℃培养48小时若仍有杂菌则需全部重新灭菌再作无菌试验直至证明无菌方可备
用。 8选择培养成熟的一般指孢子层生长丰满的营养细胞用此法效果不好优良菌种
以无菌水洗下制成孢子悬液。 9于每支沙土管中加入约05ml一般以刚刚使沙土润湿
为宜孢子悬液以接种针拌匀。 10放入真空干燥器内用真空泵抽干水分抽干时间越短
越好务使在12小时内抽干。 11每10支抽取一支用接种环取出少数沙粒接种于斜面培
养基上进行培养观察生长情况和有无杂菌生长如出现杂菌或菌落数很少或根本不长
则说明制作的沙土管有问题尚须进一步抽样检查。 12若经检查没有问题用火焰熔封
管口放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。 13需要使用菌种
复活培养时取沙土少许移入液体培养基内置温箱中培养。 此法多用于能产生孢子的
微生物如霉菌、放线菌因此在抗生素工业生产中应用最广效果亦好可保存2年左右但
应用于营养细胞效果不佳。 5液氮冷冻保藏法 1准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管
要求能耐受温度突然变化而不致破裂因此需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管安瓿
管的大小通常使用75×10mm的或能容12mm液体的。 2加保护剂与灭菌保存细菌、
酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时则将空安瓿管塞上棉塞105kg/cm21213℃灭
菌15分钟若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10的甘油蒸馏水
溶液或10二甲亚砜蒸馏水溶液加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限而后再用
105kg/cm21213℃灭菌15分钟。 3接入菌种将菌种用10的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液
装入已灭菌的安瓿管霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器从平板内切取菌落圆块放入含有
保护剂的安瓿管内然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。 4冻结再将已封口的
安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻则在细胞内会形成冰
的结晶因而降低存活率。 5保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器图
Ⅶ-14的小圆筒内然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃
液态氮内为-196℃。 6恢复培养保藏的菌种需要用时将安瓿管取出立即放入
38—40℃的水浴中进行急剧解冻直到全部融化为止。再打开安瓿管将内容物移入适
宜的培养基上培养。 此法除适宜于一般微生物的保藏外对一些用冷冻干燥法都难以
保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细
胞均可长期保藏而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。 6冷冻干燥保藏法 1准备
安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造形状可用长颈球形底的
亦称泪滴型安瓿管图Ⅶ-15大小要求外径6—75mm长105mm球部直径9—11mm壁厚
06—12mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞105kg/cm21213℃灭菌30分钟
备用。 2准备菌种用冷冻干燥法保藏的菌种其保藏期可达数年至十数年为了在许多
年后不出差错故所用菌种要特别注意其纯度即不能有杂菌污染然后在最适培养基中
用最适温度培养使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期若
用对数生长期的菌种进行保藏其存活率反而降低。一般细菌要求24—48小时的培养
物酵母需培养3天形成孢子的微生物则宜保存孢子放线菌与丝状真菌则培养7—10
天。 3制备菌悬液与分装以细菌斜面为例用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中制成
浓菌液每支安瓿管分装02ml。 4冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售价值昂贵此处介
绍的是简易方法与装置可达到同样的目的。 将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻无
低温冰箱可用冷冻剂如干冰固体CO2酒精液或干冰丙酮液温度可达-70℃。将安瓿管
插入冷冻剂只需冷冻4—5分钟即可使悬液结冰。 5真空干燥为在真空干燥时使样品
保持冻结状态需准备冷冻槽槽内放碎冰块与食盐混合均匀可冷至-15℃。装置仪器如
图Ⅶ-16安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。 抽气一般若在30分钟内艽
锏?33Pa07mmHg真空度时则干燥物不致熔化以后再继续抽气几小时内肉眼可观察
到被干燥物已趋干燥一般抽到真空度267Pa02mmHg保持压力6—8小时即可。 6封口
抽真空干燥后取出安瓿管接在封口用的玻璃管上可用L形五通管图Ⅶ-17继续抽气约
10分钟即可达到267Pa02mmHg。于真空状态下以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央
进行封口。封口以后保存于冰箱或室温暗处。 此法为菌种保藏方法中最有效的方法
之一对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用即使对一些很难保存的
致病菌如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存一般可保存数年
至十余年但设备和操作都比较复杂。
2024年5月22日发(作者：庆丽玉)
EM益生菌种的保存方法 微生物具有容易变异的特性因此在保藏过程中必须使微生
物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态才能在一定的时间内使其不发生变异而又
保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素所以菌
种保藏方法虽多但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种 1
传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等后者作保藏厌氧细菌
用培养后于4—6℃冰箱内保存。 2液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法能够
适当延长保藏时间它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡一方面
可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡另一方面可阻止氧气进入以减弱代谢作
用。 3载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体如土壤、沙子、硅胶、滤纸上而后
进行干燥的保藏法例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4寄主保藏法 用于
目前尚不能在人工培养基上生长的微生物如病毒、立克次氏体、螺旋体等它们必须
在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5冷冻保
藏法 可分低温冰箱-20—-30℃-50—-80℃、干冰酒精快速冻结约-70℃和液氮-196℃
等保藏法。 6冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度-70℃左右下快速冷冻然后在
减压下利用升华现象除去水分真空干燥。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷
冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液以防止因冷冻或水分不断升华对细
胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成
分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵
母菌放线菌和霉菌 肉膏蛋白胨斜面培养基灭菌脱脂牛乳灭菌水化学纯的液体石蜡
甘油五氧化二磷河沙瘦黄土或红土冰块、食盐干冰95酒精10盐酸无水氯化钙 灭菌吸
管灭菌滴管灭菌培养皿管形安瓿管泪滴形安瓿管长颈球形底40目与 100目筛子油纸
滤纸条05×12cm干燥器真空泵真空压力表喷灯L形五通管冰箱低温冰箱-30℃液氮冷
冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室
具体条件与需要选做。 1斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上待
菌充分生长后棉塞部分用油纸包扎好移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物
的种类而有不同霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月移种一次。酵母菌两个
月细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法优点是操作简
单使用方便不需特殊设备能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。
缺点是容易变异因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的屡次传代会使微生物
的代谢改变而影响微生物的性状污染杂菌的机会亦较多。 2液体石蜡保藏法 1将液
体石蜡分装于三角烧瓶内塞上棉塞并用牛皮纸包扎105kg/cm21213℃灭菌30分钟然
后放在40℃温箱中使水汽蒸发掉备用。 2将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基
中培养使得到健壮的菌体或孢子。 3用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡注入已长好菌
的斜面上其用量以高出斜面顶端1cm为准图Ⅶ-12使菌种与空气隔绝。 4将试管直立
置低温或室温下保存有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长。 此法实用而
效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死酵母菌可保藏1—2年一般无芽
孢细菌也可保藏1年左右甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌在37℃温箱内亦可
保藏3个月之久。此法的优点是制作简单不需特殊设备且不需经常移种。缺点是保存
时必须直立放置所占位置较大同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后接
种环在火焰上烧灼时培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅应特别注意。 3滤纸保
藏法 1将滤纸剪成05×12cm的小条装入06×8cm的安瓿管中每管1—2张塞以棉塞
105kg/cm21213℃灭菌30分钟。 2将需要保存的菌种在适宜的斜面培养基上培养使充
分生长。 3取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内取数环菌苔在牛乳内
混匀制成浓悬液。 4用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内使其吸饱再放回至
安瓿管中塞上棉塞。 5将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中用真空泵
抽气至干。 6将棉花塞入管内用火焰按图Ⅶ-13熔封保存于低温下。 7需要使用菌种
复活培养时可将安瓿管口在火焰上烧热滴一滴冷水在烧热的部位使玻璃破裂再用镊
子敲掉口端的玻璃待安瓿管开启后取出滤纸放入液体培养基内置温箱中培养。 细
菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏前两者可保藏2年左右有些丝状真菌甚至可保
藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便不需要特殊设备。 4沙土保藏法 1
取河沙加入10稀盐酸加热煮沸30分钟以去除其中的有机质。 2倒去酸水用自来水冲
洗至中性。 3烘干用40目筛子过筛以去掉粗颗粒备用。 4另取非耕作层的不含腐植
质的瘦黄土或红土加自来水浸泡洗涤数次直至中性。 5烘干碾碎通过100目筛子过筛
以去除粗颗粒。 6按一份黄土、三份沙的比例或根据需要而用其他比例甚至可全部
用沙或全部用土掺合均匀装入10×100mm的小试管或安瓿管中每管装1g左右塞上棉
塞进行灭菌烘干。 7抽样进行无菌检查每10支沙土管抽一支将沙土倒入肉汤培养基
中37℃培养48小时若仍有杂菌则需全部重新灭菌再作无菌试验直至证明无菌方可备
用。 8选择培养成熟的一般指孢子层生长丰满的营养细胞用此法效果不好优良菌种
以无菌水洗下制成孢子悬液。 9于每支沙土管中加入约05ml一般以刚刚使沙土润湿
为宜孢子悬液以接种针拌匀。 10放入真空干燥器内用真空泵抽干水分抽干时间越短
越好务使在12小时内抽干。 11每10支抽取一支用接种环取出少数沙粒接种于斜面培
养基上进行培养观察生长情况和有无杂菌生长如出现杂菌或菌落数很少或根本不长
则说明制作的沙土管有问题尚须进一步抽样检查。 12若经检查没有问题用火焰熔封
管口放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。 13需要使用菌种
复活培养时取沙土少许移入液体培养基内置温箱中培养。 此法多用于能产生孢子的
微生物如霉菌、放线菌因此在抗生素工业生产中应用最广效果亦好可保存2年左右但
应用于营养细胞效果不佳。 5液氮冷冻保藏法 1准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管
要求能耐受温度突然变化而不致破裂因此需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管安瓿
管的大小通常使用75×10mm的或能容12mm液体的。 2加保护剂与灭菌保存细菌、
酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时则将空安瓿管塞上棉塞105kg/cm21213℃灭
菌15分钟若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10的甘油蒸馏水
溶液或10二甲亚砜蒸馏水溶液加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限而后再用
105kg/cm21213℃灭菌15分钟。 3接入菌种将菌种用10的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液
装入已灭菌的安瓿管霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器从平板内切取菌落圆块放入含有
保护剂的安瓿管内然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。 4冻结再将已封口的
安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻则在细胞内会形成冰
的结晶因而降低存活率。 5保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器图
Ⅶ-14的小圆筒内然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃
液态氮内为-196℃。 6恢复培养保藏的菌种需要用时将安瓿管取出立即放入
38—40℃的水浴中进行急剧解冻直到全部融化为止。再打开安瓿管将内容物移入适
宜的培养基上培养。 此法除适宜于一般微生物的保藏外对一些用冷冻干燥法都难以
保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细
胞均可长期保藏而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。 6冷冻干燥保藏法 1准备
安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造形状可用长颈球形底的
亦称泪滴型安瓿管图Ⅶ-15大小要求外径6—75mm长105mm球部直径9—11mm壁厚
06—12mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞105kg/cm21213℃灭菌30分钟
备用。 2准备菌种用冷冻干燥法保藏的菌种其保藏期可达数年至十数年为了在许多
年后不出差错故所用菌种要特别注意其纯度即不能有杂菌污染然后在最适培养基中
用最适温度培养使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期若
用对数生长期的菌种进行保藏其存活率反而降低。一般细菌要求24—48小时的培养
物酵母需培养3天形成孢子的微生物则宜保存孢子放线菌与丝状真菌则培养7—10
天。 3制备菌悬液与分装以细菌斜面为例用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中制成
浓菌液每支安瓿管分装02ml。 4冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售价值昂贵此处介
绍的是简易方法与装置可达到同样的目的。 将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻无
低温冰箱可用冷冻剂如干冰固体CO2酒精液或干冰丙酮液温度可达-70℃。将安瓿管
插入冷冻剂只需冷冻4—5分钟即可使悬液结冰。 5真空干燥为在真空干燥时使样品
保持冻结状态需准备冷冻槽槽内放碎冰块与食盐混合均匀可冷至-15℃。装置仪器如
图Ⅶ-16安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。 抽气一般若在30分钟内艽
锏?33Pa07mmHg真空度时则干燥物不致熔化以后再继续抽气几小时内肉眼可观察
到被干燥物已趋干燥一般抽到真空度267Pa02mmHg保持压力6—8小时即可。 6封口
抽真空干燥后取出安瓿管接在封口用的玻璃管上可用L形五通管图Ⅶ-17继续抽气约
10分钟即可达到267Pa02mmHg。于真空状态下以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央
进行封口。封口以后保存于冰箱或室温暗处。 此法为菌种保藏方法中最有效的方法
之一对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用即使对一些很难保存的
致病菌如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存一般可保存数年
至十余年但设备和操作都比较复杂。