2024年6月6日发(作者：皇嘉福)
兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特
性(1)
】 目的：在体外分离纯化VX2肿瘤细胞，观察其生物学特性. 方法：采用组织
块法和消化法结合对兔VX2肿瘤进行原代培养,体外传代观察,传代40次并对培
养细胞进行形态 学观察、细胞周期检查、核型分析、兔及裸鼠移植. 结果：纯
化的兔VX2肿瘤细胞形态一致，呈圆形、多角形的上皮细胞,体积小,核浆比倒
置,体外连续培养8 mo,传代50次以上,细胞倍增时间为26.4 h,细胞周期测定
G1期为74.61%, G2期为7.78%, S期为17.6%. 染色体为亚三倍体核型,众数为
60条. 高细胞浓度可保证同种移植成瘤率,裸鼠移植可成瘤, 无支原体污染.
结论：兔VX2肿瘤细胞系来源于Shope病毒致乳头瘤恶变形成的鳞状上皮细胞
恶性肿瘤,目前已经纯化，可应用于进一步肿瘤实验研究.
【关键词】 兔; 肿瘤细胞,培养的; 肿瘤标记,生物学
0引言
兔VX2肿瘤是来源于Shope病毒致乳头瘤恶变形成的上皮细胞恶性肿瘤，
属于鳞状细胞癌，1940年建株［1］，国内文献对其来源描述不统一. 其特点
可接种在兔体内，具有较高的肺、肝转移特性，在大型动物模型的研究上具有
很高的应用价值. 国际上一直没有建成受到公认并广泛使用的VX2细胞系，多
数仍以组织块方法保存. 为进一步进行离体研究，我们分离并纯化了VX2瘤
株，并进行了生物学特性观察.
1材料和方法
1.1材料新西兰大白兔9只和BALB/c裸鼠均购自第四军医大学实验动物中
心；原代培养所用肿瘤组织来源于本院液氮保存冰冻组织块，于新西兰大白兔
腿部肌肉内接种并增殖. 胎牛血清（FBS, Gibco）；培养瓶（Costar）；RPMI
1640（Gibco）；24孔板(Nunc, Roskilde, Denmark)；广谱抗细胞角蛋白(PCK)
混合型鼠抗兔mAb（Boster），广谱抗细胞波形蛋白鼠抗猪mAb（福州迈新公
司）；秋水仙素（西安山川公司）离心机（LD52A，北京医用离心机厂）；其他
试剂及仪器取自唐都医院中心实验室.
1.2方法
1.2.1肿瘤细胞的分离纯化无菌摘取VX2肿瘤边缘增殖活跃部分,用PBS液
冲洗3次,在显微镜下剔除多余组织，剪成直径0.5～1.0 mm左右的小块,以
2.5 g/L胰酶加1 g/L胶原酶于37℃消化20 min，200目尼龙网过滤后800
r/min离心5 min，取沉淀物培养，较低密度接种于6孔板. 组织块贴壁接种于
预先涂抹薄层FBS的培养瓶（Costar）瓶底，瓶底朝上，向瓶内加入含100
mL/L FBS和青链霉素双抗的RPMI 1640培养液5 mL，置37℃，50 mL/L CO2，
饱和湿度的培养箱内, 2 h后缓慢将培养瓶翻转. 消化法第2日即见细胞生长.
组织块法于第3日组织块均浮起，可见细胞生长. 于岛状生长的细胞处在倒置
显微镜下无菌刮取，培养，取得多瓶纯化细胞，其形态、生长速度基本一致.
待细胞成片生长、占据大部分瓶底时即用2.5 g/L胰蛋白酶于37℃下消化传代.
1.2.2形态学观察分别取纯化后第10代和50代的细胞进行细胞爬片、HE
染色、倒置显微镜镜下观察. 将VX2瘤接种于兔腿部肌肉，待成瘤后切片光镜
下观察.
1.2.3生长特性测定将第50代细胞以1×107/L的密度接种于24孔板，每
孔加入含100 mL/L FBS的1640培养基0.5 mL，置细胞培养箱中培养. 每日同
一时间用胰蛋白酶消化3孔细胞，血球计数板进行计数，连续进行4 d，绘制
细胞生长曲线. 利用SPSS软件指数函数拟合模型(Exponential)辅助计算细胞
群体倍增时间［2］. 制作细胞爬片，分别于贴壁后24，48，72 h计算分裂指
数.
1.2.4琼脂集落形成率测定收集第52代细胞和相应的对照细胞，制备含细
胞的3.5 g/L琼脂糖液，并加到7 g/L琼脂糖凝胶上，于37℃，50 mL/L
CO2、饱和湿度条件下培养. 3 wk后计算集落形成率.
1.2.5免疫细胞化学分析取第55代细胞爬片，室温下用1∶1混合的甲醇
与丙酮将生长在盖玻片上的细胞固定15～20 min，分别应用PCK混合型鼠抗兔
mAb及超敏加广谱抗细胞波形蛋白鼠抗猪mAb行免疫组织化学染色，光学显微
镜下观察.
1.2.6染色体分析取处于80%汇合时的第60代细胞加入终浓度为0.3 mg/L
的秋水仙素，在37℃，50 mL/L CO2、饱和湿度的培养箱中孵育5 h, 然后尽量
吹打使阻断于分裂中期的细胞脱壁，将细胞悬液装入10 mL离心管. 1100
r/min离心10 min，去上清液，再向离心管中轻轻加入6 mL低渗盐溶液75
mmol/L KCl，37℃静置30 min. 然后加入2 mL新鲜固定液（甲醇∶冰乙酸
=3∶1）预固定，用移液管吹打调匀. 1100 r/min离心10 min，去上清液. 之
后加入新鲜固定液8 mL，轻轻吹打均匀，离心10 min；本步骤再重复2遍. 末
次离心后，小心吸除大部分上清液，余下0.5～1.0 mL固定液，轻轻吹打调匀.
吸少量细胞悬液，滴落在-20℃预冷过的洁净载玻片上,迅速在酒精灯火焰上烤
干. 制备好的玻片立即用Giemsa染色. 显微镜下观察染色后的标本，统计其染
色体数目.
作者：苏畅，张惠中，李文海，林芳，梁晓华，江吕泉，程庆书【关键词】肿
瘤细胞Culture in vitro and related biolog
2024年6月6日发(作者：皇嘉福)
兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特
性(1)
】 目的：在体外分离纯化VX2肿瘤细胞，观察其生物学特性. 方法：采用组织
块法和消化法结合对兔VX2肿瘤进行原代培养,体外传代观察,传代40次并对培
养细胞进行形态 学观察、细胞周期检查、核型分析、兔及裸鼠移植. 结果：纯
化的兔VX2肿瘤细胞形态一致，呈圆形、多角形的上皮细胞,体积小,核浆比倒
置,体外连续培养8 mo,传代50次以上,细胞倍增时间为26.4 h,细胞周期测定
G1期为74.61%, G2期为7.78%, S期为17.6%. 染色体为亚三倍体核型,众数为
60条. 高细胞浓度可保证同种移植成瘤率,裸鼠移植可成瘤, 无支原体污染.
结论：兔VX2肿瘤细胞系来源于Shope病毒致乳头瘤恶变形成的鳞状上皮细胞
恶性肿瘤,目前已经纯化，可应用于进一步肿瘤实验研究.
【关键词】 兔; 肿瘤细胞,培养的; 肿瘤标记,生物学
0引言
兔VX2肿瘤是来源于Shope病毒致乳头瘤恶变形成的上皮细胞恶性肿瘤，
属于鳞状细胞癌，1940年建株［1］，国内文献对其来源描述不统一. 其特点
可接种在兔体内，具有较高的肺、肝转移特性，在大型动物模型的研究上具有
很高的应用价值. 国际上一直没有建成受到公认并广泛使用的VX2细胞系，多
数仍以组织块方法保存. 为进一步进行离体研究，我们分离并纯化了VX2瘤
株，并进行了生物学特性观察.
1材料和方法
1.1材料新西兰大白兔9只和BALB/c裸鼠均购自第四军医大学实验动物中
心；原代培养所用肿瘤组织来源于本院液氮保存冰冻组织块，于新西兰大白兔
腿部肌肉内接种并增殖. 胎牛血清（FBS, Gibco）；培养瓶（Costar）；RPMI
1640（Gibco）；24孔板(Nunc, Roskilde, Denmark)；广谱抗细胞角蛋白(PCK)
混合型鼠抗兔mAb（Boster），广谱抗细胞波形蛋白鼠抗猪mAb（福州迈新公
司）；秋水仙素（西安山川公司）离心机（LD52A，北京医用离心机厂）；其他
试剂及仪器取自唐都医院中心实验室.
1.2方法
1.2.1肿瘤细胞的分离纯化无菌摘取VX2肿瘤边缘增殖活跃部分,用PBS液
冲洗3次,在显微镜下剔除多余组织，剪成直径0.5～1.0 mm左右的小块,以
2.5 g/L胰酶加1 g/L胶原酶于37℃消化20 min，200目尼龙网过滤后800
r/min离心5 min，取沉淀物培养，较低密度接种于6孔板. 组织块贴壁接种于
预先涂抹薄层FBS的培养瓶（Costar）瓶底，瓶底朝上，向瓶内加入含100
mL/L FBS和青链霉素双抗的RPMI 1640培养液5 mL，置37℃，50 mL/L CO2，
饱和湿度的培养箱内, 2 h后缓慢将培养瓶翻转. 消化法第2日即见细胞生长.
组织块法于第3日组织块均浮起，可见细胞生长. 于岛状生长的细胞处在倒置
显微镜下无菌刮取，培养，取得多瓶纯化细胞，其形态、生长速度基本一致.
待细胞成片生长、占据大部分瓶底时即用2.5 g/L胰蛋白酶于37℃下消化传代.
1.2.2形态学观察分别取纯化后第10代和50代的细胞进行细胞爬片、HE
染色、倒置显微镜镜下观察. 将VX2瘤接种于兔腿部肌肉，待成瘤后切片光镜
下观察.
1.2.3生长特性测定将第50代细胞以1×107/L的密度接种于24孔板，每
孔加入含100 mL/L FBS的1640培养基0.5 mL，置细胞培养箱中培养. 每日同
一时间用胰蛋白酶消化3孔细胞，血球计数板进行计数，连续进行4 d，绘制
细胞生长曲线. 利用SPSS软件指数函数拟合模型(Exponential)辅助计算细胞
群体倍增时间［2］. 制作细胞爬片，分别于贴壁后24，48，72 h计算分裂指
数.
1.2.4琼脂集落形成率测定收集第52代细胞和相应的对照细胞，制备含细
胞的3.5 g/L琼脂糖液，并加到7 g/L琼脂糖凝胶上，于37℃，50 mL/L
CO2、饱和湿度条件下培养. 3 wk后计算集落形成率.
1.2.5免疫细胞化学分析取第55代细胞爬片，室温下用1∶1混合的甲醇
与丙酮将生长在盖玻片上的细胞固定15～20 min，分别应用PCK混合型鼠抗兔
mAb及超敏加广谱抗细胞波形蛋白鼠抗猪mAb行免疫组织化学染色，光学显微
镜下观察.
1.2.6染色体分析取处于80%汇合时的第60代细胞加入终浓度为0.3 mg/L
的秋水仙素，在37℃，50 mL/L CO2、饱和湿度的培养箱中孵育5 h, 然后尽量
吹打使阻断于分裂中期的细胞脱壁，将细胞悬液装入10 mL离心管. 1100
r/min离心10 min，去上清液，再向离心管中轻轻加入6 mL低渗盐溶液75
mmol/L KCl，37℃静置30 min. 然后加入2 mL新鲜固定液（甲醇∶冰乙酸
=3∶1）预固定，用移液管吹打调匀. 1100 r/min离心10 min，去上清液. 之
后加入新鲜固定液8 mL，轻轻吹打均匀，离心10 min；本步骤再重复2遍. 末
次离心后，小心吸除大部分上清液，余下0.5～1.0 mL固定液，轻轻吹打调匀.
吸少量细胞悬液，滴落在-20℃预冷过的洁净载玻片上,迅速在酒精灯火焰上烤
干. 制备好的玻片立即用Giemsa染色. 显微镜下观察染色后的标本，统计其染
色体数目.
作者：苏畅，张惠中，李文海，林芳，梁晓华，江吕泉，程庆书【关键词】肿
瘤细胞Culture in vitro and related biolog