2024年6月10日发(作者：僪梅青)
第三军医大学博士学位论文
Ａ２０基因修饰的血管内支架的研制及其防治猪颈动脉
再狭窄的实验研究
摘要
背景
脑血管疾病是常见病、多发病，病死率与致残率均高，其中缺血性脑血管病是脑
血管病中最常见者。近年来，微创的血管腔内介入治疗开始广泛应用于缺血性脑血管
病的二级预防，显著降低了卒中的发生率，与颈动脉内膜剥脱术（ＣＥＡ）疗效相当，而
并发症少，对颅内动脉而言与ＣＥＡ相比具有独到优势。但是支架内再狭窄严重影响了
其远期疗效，尤其是在直径较小的颅内血管成形术过程中更易发生。其中血管内皮细
胞的损伤是这一系列病理过程的始动因素，且炎性反应起着不可忽视的作用。
内皮祖细胞具有高度增殖能力，在体内局部微环境作用下可以发育为适宜局部生
长的内皮细胞，行使内皮细胞功能。Ａ２０基因能有效促进ＥＰＣ对抗致病因子损伤并抑
制ｓＭＣ病理性增殖，此外还能下调部分炎症介质从而限制炎症反应。前期研究表明
Ａ２０能有效阻止组织工程血管的再狭窄。所以研究Ａ２０基因修饰的ＥＰＣ种植支架在
防治再狭窄方面具有重要价值。
为此，我们首先研制了转基因内皮祖细胞种植支架，由于细胞种植支架存在释放
的技术难题，所以我们首先对Ａ２０基因修饰的支架进行了动物实验验证。本研究旨在
针对再狭窄发生发展的重要机制与环节，通过基因修饰研制新型血管内支架，为防治
再狭窄探索新途径。
方法
１．ＥＰＣｓ培养，鉴定
密度梯度离心法获取人脐血单个核细胞，在添加ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及其它生长因子
的Ｍ１９９培养液中诱导培养。倒置显微镜下观察细胞生长、形态学变化；ＤｉＩ．ＬＤＬ摄
取实验和ｕＥＡ．Ｉ结合观察ＥＰｃｓ是否具有内皮细胞功能特性；ＣＤ３４、ｃＤｌ３３、ｌ①Ｒ、
ｖｗＦ等鉴定是否具有内皮细胞表型；透射电镜观察是否具有内皮细胞超微结构；
２．转基因内皮祖细胞种植支架的研制
Ａ２０基因转染ＥＰＣｓ及鉴定；支架偶联ＣＤ３４抗体的加工（Ｂ组），Ａ组为对照组；
７
第二军医大学博士学位论文
转基因ＥＰＣｓ种植支架后经流动腔，激光共聚焦显微镜及电镜观察检测细胞改变。
３．Ａ２０基因修饰血管内支架防治再狭窄的实验研究
Ａ２０基因修饰支架的加工；活体植入猪的颈动脉，对照组ｐｃＤＮＡ３．１
ｖｏｉｄ
ｖｅｃｔｏｒｓ
为Ａ组，Ａ２０修饰的支架为Ｂ组；Ａ２０表达的检测；通过如下指标评判两组之间的效
果：颈动脉造影；病理组织形态分析及病理学积分；ｃＤ３１及ＰｃＮＡ免疫组化检测；凋
亡检测；电镜检测内皮细胞及平滑肌细胞。
结果
１．ＥＰＣｓ培养鉴定
１．１细胞体外培养２—３ｄ后，细胞呈短梭形、多角形等多种形态，有少量细胞突
起。培养７—９ｄ，出现鹅卵石样细胞组成的细胞集落，形成明显克隆。继续培养３—４ｄ
集落逐渐散开。重悬后继续培养仁５ｄ细胞逐渐融合，呈现典型的“铺路石’’样。
１．２
ＥＰＣｓ超微结构：透射电镜观察结果示ＥＰＣｓ内可见特征性的ＷＰ小体
（Ｗｅｉｂｅｌ一ｐａｌａｄｅ小体），同时可见大量吞噬小泡、线粒体、内质网等细胞器。
１．３培养ＥＰＣｓ免疫化学染色：早期ＣＤ３４、ＣＤｌ３３、ＫＤＲ表达呈阳性，三周后
细胞ＣＤ３４、砌）Ｒ、ｖＷＦ表达呈阳性，但ＣＤｌ３３表达呈阴性。
１．４生物学功能检测：能摄取ＤｉＩ—ａｃＬＤＬ并能结合ＦＩＴＣ—ＵＥＡ．Ｉ，双染色阳性细
胞，被认为是正在分化的ＥＰＣｓ，
２．转基因内皮祖细胞种植支架的研制
２．１
Ａ２０成功转染了ＥＰＣｓ，经免疫组化和Ｗ色ｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ检测阳性。
２．２支架上面细胞生长状况
培养七天后的支架经激光共聚焦显微镜观察：１）Ａ
Ｂ两组支架上面细胞均能完全
覆盖支架，实现支架的内皮化，且能吞噬ＬＤＬ，显示生物学功能良好。２）而经过流动
腔后Ａ
Ｂ两组支架上面细胞有所脱落，Ａ组细胞数量明显减少，呈散在分布，没有覆
盖支架表面；Ｂ组支架上面细胞虽有所脱落，但能基本覆盖支架，两种方法计数提示
Ｂ组明显多于Ａ组支架上面细胞数量（Ｐ＜Ｏ．０１）。
３．Ａ２０基因修饰血管内支架防治再狭窄的实验研究
３．１
Ａ２０表达检测：植入支架３天后植入段血管局部有Ａ２０表达。
３．２血管造影：支架植入３个月，支架内再狭窄在对照组与实验组之间有明显的
统计学差异（３７．９３％±２．１ｌ％，
１５．０３％±１．９５％，Ｐ＜０．０１）．
３．３病理结果：支架植入３个月，组织形态学测量结果如下：１）．内弹力板环绕面
积（正Ｌ，ｍｍ２）：两组之间无统计学差异。２）．管腔面积（ＬＡ，ｍｍ２）、新生内膜面积（ＮＡ，
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2024年6月10日发(作者：僪梅青)
第三军医大学博士学位论文
Ａ２０基因修饰的血管内支架的研制及其防治猪颈动脉
再狭窄的实验研究
摘要
背景
脑血管疾病是常见病、多发病，病死率与致残率均高，其中缺血性脑血管病是脑
血管病中最常见者。近年来，微创的血管腔内介入治疗开始广泛应用于缺血性脑血管
病的二级预防，显著降低了卒中的发生率，与颈动脉内膜剥脱术（ＣＥＡ）疗效相当，而
并发症少，对颅内动脉而言与ＣＥＡ相比具有独到优势。但是支架内再狭窄严重影响了
其远期疗效，尤其是在直径较小的颅内血管成形术过程中更易发生。其中血管内皮细
胞的损伤是这一系列病理过程的始动因素，且炎性反应起着不可忽视的作用。
内皮祖细胞具有高度增殖能力，在体内局部微环境作用下可以发育为适宜局部生
长的内皮细胞，行使内皮细胞功能。Ａ２０基因能有效促进ＥＰＣ对抗致病因子损伤并抑
制ｓＭＣ病理性增殖，此外还能下调部分炎症介质从而限制炎症反应。前期研究表明
Ａ２０能有效阻止组织工程血管的再狭窄。所以研究Ａ２０基因修饰的ＥＰＣ种植支架在
防治再狭窄方面具有重要价值。
为此，我们首先研制了转基因内皮祖细胞种植支架，由于细胞种植支架存在释放
的技术难题，所以我们首先对Ａ２０基因修饰的支架进行了动物实验验证。本研究旨在
针对再狭窄发生发展的重要机制与环节，通过基因修饰研制新型血管内支架，为防治
再狭窄探索新途径。
方法
１．ＥＰＣｓ培养，鉴定
密度梯度离心法获取人脐血单个核细胞，在添加ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ及其它生长因子
的Ｍ１９９培养液中诱导培养。倒置显微镜下观察细胞生长、形态学变化；ＤｉＩ．ＬＤＬ摄
取实验和ｕＥＡ．Ｉ结合观察ＥＰｃｓ是否具有内皮细胞功能特性；ＣＤ３４、ｃＤｌ３３、ｌ①Ｒ、
ｖｗＦ等鉴定是否具有内皮细胞表型；透射电镜观察是否具有内皮细胞超微结构；
２．转基因内皮祖细胞种植支架的研制
Ａ２０基因转染ＥＰＣｓ及鉴定；支架偶联ＣＤ３４抗体的加工（Ｂ组），Ａ组为对照组；
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第二军医大学博士学位论文
转基因ＥＰＣｓ种植支架后经流动腔，激光共聚焦显微镜及电镜观察检测细胞改变。
３．Ａ２０基因修饰血管内支架防治再狭窄的实验研究
Ａ２０基因修饰支架的加工；活体植入猪的颈动脉，对照组ｐｃＤＮＡ３．１
ｖｏｉｄ
ｖｅｃｔｏｒｓ
为Ａ组，Ａ２０修饰的支架为Ｂ组；Ａ２０表达的检测；通过如下指标评判两组之间的效
果：颈动脉造影；病理组织形态分析及病理学积分；ｃＤ３１及ＰｃＮＡ免疫组化检测；凋
亡检测；电镜检测内皮细胞及平滑肌细胞。
结果
１．ＥＰＣｓ培养鉴定
１．１细胞体外培养２—３ｄ后，细胞呈短梭形、多角形等多种形态，有少量细胞突
起。培养７—９ｄ，出现鹅卵石样细胞组成的细胞集落，形成明显克隆。继续培养３—４ｄ
集落逐渐散开。重悬后继续培养仁５ｄ细胞逐渐融合，呈现典型的“铺路石’’样。
１．２
ＥＰＣｓ超微结构：透射电镜观察结果示ＥＰＣｓ内可见特征性的ＷＰ小体
（Ｗｅｉｂｅｌ一ｐａｌａｄｅ小体），同时可见大量吞噬小泡、线粒体、内质网等细胞器。
１．３培养ＥＰＣｓ免疫化学染色：早期ＣＤ３４、ＣＤｌ３３、ＫＤＲ表达呈阳性，三周后
细胞ＣＤ３４、砌）Ｒ、ｖＷＦ表达呈阳性，但ＣＤｌ３３表达呈阴性。
１．４生物学功能检测：能摄取ＤｉＩ—ａｃＬＤＬ并能结合ＦＩＴＣ—ＵＥＡ．Ｉ，双染色阳性细
胞，被认为是正在分化的ＥＰＣｓ，
２．转基因内皮祖细胞种植支架的研制
２．１
Ａ２０成功转染了ＥＰＣｓ，经免疫组化和Ｗ色ｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ检测阳性。
２．２支架上面细胞生长状况
培养七天后的支架经激光共聚焦显微镜观察：１）Ａ
Ｂ两组支架上面细胞均能完全
覆盖支架，实现支架的内皮化，且能吞噬ＬＤＬ，显示生物学功能良好。２）而经过流动
腔后Ａ
Ｂ两组支架上面细胞有所脱落，Ａ组细胞数量明显减少，呈散在分布，没有覆
盖支架表面；Ｂ组支架上面细胞虽有所脱落，但能基本覆盖支架，两种方法计数提示
Ｂ组明显多于Ａ组支架上面细胞数量（Ｐ＜Ｏ．０１）。
３．Ａ２０基因修饰血管内支架防治再狭窄的实验研究
３．１
Ａ２０表达检测：植入支架３天后植入段血管局部有Ａ２０表达。
３．２血管造影：支架植入３个月，支架内再狭窄在对照组与实验组之间有明显的
统计学差异（３７．９３％±２．１ｌ％，
１５．０３％±１．９５％，Ｐ＜０．０１）．
３．３病理结果：支架植入３个月，组织形态学测量结果如下：１）．内弹力板环绕面
积（正Ｌ，ｍｍ２）：两组之间无统计学差异。２）．管腔面积（ＬＡ，ｍｍ２）、新生内膜面积（ＮＡ，
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