2024年5月23日发(作者：舜云露)
中国骨质疏松杂志 2020年2月第26卷第2期 ChinJOsteoporos,February2020,Vol26,No.2
doi:10.3969/.1006-7108.2020.02.001
157
·论著·
CEMP1基因修饰骨质疏松大鼠BMSCs与β-TCP体外
复合培养实验
1.福建医科大学附属口腔医院,福建福州350002
4.温州医科大学附属口腔医院,浙江温州325027
江俊
1#
吴玉铭
2#
何梦娇
1,3
郑宝玉
4
许雄程
1,3
李艳芬
1
陈玉玲
1
骆凯
1∗
2.中国科学技术大学附属第一医院安徽省立医院,安徽合肥230000
3.福建医科大学口腔医学研究院,福建福州350002
中图分类号:R681 文献标识码:A 文章编号:1006-7108(2020)02-0157-05
摘要:目的 探讨牙骨质蛋白1(cementumprotein1,CEMP1)基因修饰骨质疏松大鼠骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,
BMSCs)与β-磷酸三钙(β-tricalciumphosphate,β-TCP)体外复合培养的可行性。方法 体外培养骨质疏松大鼠BMSCs,将携
带有CEMP1基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP转染BMSCs,采用荧光显微镜观察转染情况,通过流式细胞仪检测转染率,通过
实时荧光定量PCR检测转染后BMSCs中CEMP1基因的表达,WesternBlot及免疫细胞化学染色检测BMSCs中CEMP1蛋白
的表达情况。将CEMP1基因修饰的BMSCs与β-TCP体外复合培养,在荧光显微镜和扫描电镜下观察细胞的生长状况。结果
LV-CEMP1-EGFP具有较高的转染率,CEMP1基因修饰的BMSCs可高表达CEMP1,且在β-TCP上保持良好的生长状态。结论
CEMP1基因修饰骨质疏松大鼠BMSCs与β-TCP复合培养,有望应用于骨质疏松状态下的牙周组织再生研究。
关键词:牙骨质蛋白1;骨髓基质细胞;骨质疏松;慢病毒;β-磷酸三钙
Co-cultureofCEMP1genemodifiedosteoporoticratBMSCswithβ-TCPinvitro
andHospitalofStomatology,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350002
stAffiliatedHospitalofUSTCAnhuiProvincialHospital,Hefei230000
uteofStomatology,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350002
∗Correspondingauthor:LUOKai,Email:luokai39@
#:Co-firstauthor
JIANGJun
1#
,WUYuming
2#
,HEMengjiao
1,3
,ZHENGBaoyu
4
,XUXiongcheng
1,3
,LIYanfen
1
,CHENYuling
1
,LUOKai
1∗
andHospitalofStomatology,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China
Abstract:Objective Toevaluatethefeasibilityofco-cultureofcementumprotein1(CEMP1)genemodifiedosteoporoticrat
bonemarrowstromalcells(BMSCs)withβ-s BMSCsofosteoporoticratswereisolatedandculturedin
vitroandtransfectedwithlentiviralvectorcarryingCEMP1gene(LV-CEMP1-EGFP)anddetectedunderinvertedfluorescence
ectsionofCEMP1inBMSCswas
detectedbyrealtimePCR,-CEMP1-EGFPtransfectedcellswereco-culturedwithβ-
TCPandwereobservedunderinvertedfluorescencemicroscopeandscanningelectronmicroscope(SEM).Results LV-CEMP1-
scentmicroscopeandSEMdemonstratedthat
CEMP1genemodifiedBMSCscouldmigrateintoβ-sion Recombinantlentiviral
vectorcontaininghu1genemodifiedBMSCscan
becombinedwithβ-positemightbebeneficialforperiodontaltissueregenerationwithosteoporosis.
Keywords:CEMP1;BMSCs;osteoporosis;lentiviralvector;β-TCP
基金项目:国家自然科学基金项目(81870766);福建省自然科
学基金项目(2017J01522);福建省卫生系统中青年骨干人才培养项
目(2015-ZQN-ZD-28);福建医科大学启航基金项目(2016QH079)
∗通信作者:骆凯,Email:luokai39@
#:共同第一作者
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种骨代谢疾
床表现,易出现骨折,严重影响中老年人的生活质
病,以骨结构异常、骨脆性增高和骨量减少为主要临
158
中国骨质疏松杂志 2020年2月第26卷第2期 ChinJOsteoporos,February2020,Vol26,No.2
量。更年期妇女随着体内雌激素水平的下降,骨量
迅速丢失,易出现绝经后骨质疏松(postmenopausal
osteoporosis,PMO)
[1]
。研究显示
[2
-
3]
PMO与牙周炎
存在明显相关性,可加速牙周组织的破坏。如何实
现PMO状态下的牙周组织再生是当前牙周病临床
治疗所面临的众多挑战之一。近年来,组织工程技
术与基因工程技术的联合应用为实现牙周组织的修
复再生提供了新的思路。牙骨质蛋白1(cementum
protein1,CEMP1)作为牙骨质特异性蛋白之一,可
课题组前期方法
[5]
建立骨质疏松大鼠模型,模型建
立成功后将大鼠经麻醉颈椎脱臼处死。无菌条件下
取出大鼠双侧股骨和胫骨,剪去骨端两侧,采用细胞
培养液反复冲洗骨髓腔,直到骨头发白为止。将获
取的细胞悬液经1000r/min,离心5min,弃上清,
100mg/L,10%FBS)重悬,置于37℃、5%CO
2
细胞
培养箱中。第3天首次半量换液,之后按常规进行
换液。待细胞密度达到80%~90%时进行消化传
DMEM低糖培养液(含青霉素100U/mL,链霉素
促进非矿化细胞向成骨细胞分化,有望应用于牙周
组织的再生
[4]
基因重组慢病毒过表达载体
。因此,本研究拟通过构建人
,并转染PMO大鼠骨髓
CEMP1
基质
CEMP1
细胞
表达
在
(
PMO
bone
大鼠
marrow
BMSCs
stromal
中稳定表达
cells,BMSCs),使
phosphate,
CEMP1
况,为后续利用
β-TCP)
的BMSCs
CEMP1
复合培养
与β磷酸三钙
,同时将过
实现骨质疏松状态下的牙
,观察细胞的生长情
(β-tricalcium
周组织再生奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.
(SD)
1.1
SCXK(
雌性大鼠
实验动
,
物
体重
:3月
280
龄
~300
SPF
g,
级
动物许可证号
Sprague-Dawley
:
南京军区福州总医院比较医学科
沪)2012
-
0002。按啮齿类动物标准饲养于
,适应性喂养1周
后开始实验。
1.1.2 主要试剂与仪器:DMEM低糖培养基、胎牛
血清
BRL,
(
室保存
美国
Hyclone,
);抗坏血酸
);重组慢病毒
美国);0.25%胰蛋白酶(Gibico
、β
-
磷酸甘油
LV-CEMP1-EGFP
、地塞米松和茜素
(本实验
红(Sigma,美国);碱性磷酸酯酶显色试剂盒、碱性
磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公
司
Ex
);PrimeScript
TM
RTReagentKit和SYBRPrimix
(Invitrogen,
Taq
TM
试剂盒(Takara,日本);Trizol试剂盒
限公司);CEMP1
美国);β-TCP
多克隆抗体
(上海贝奥路生物材料有
(Abcam公司);生物
安全柜(力申科学仪器有限公司,上海);细胞培养
箱(Heraeus,德国);iMARK酶标仪(Bio-Rad,美
国);实时荧光定量PCR仪(RocheLightCycler480,
德国
(
);相差荧光显微镜(Olympus,日本
SEM230,
Bio-Rad,美国);扫描电镜(FEI
);
Nova
电泳装置
Nano
1.2 方法
美国)。
1.2.1 PMO大鼠BMSCs的获取及体外培养:参照
代,实验选择P3以内细胞进行。
1.
PMO
2.2
大鼠
PMO
BMSCs
大鼠
以每孔
BMSCs
1
体外成骨分化能力检测
×
10
:
5
个接种于6孔板,以
成骨诱导液
C、10
(
行培养
mmol
ALP染色
,每
/
,诱导
3
L
基础培养液中加入
天换液
β-磷酸甘油
21d后进行矿化结节茜素红染色
。诱导
、10
7
nmol
50
d后收集细胞进行
/L
μg
地塞米松
/mL维生素
)进
1.2.3 PMO大鼠BMSCs基因转染检测:将PMO
。
大
鼠BMSCs以1
×
10
4
/cm
2
密度进行接种,待细胞生长
至约70%融合时参照课题组前期方法
[6]
进行目的
基因
EGFP)、
转染。实验分组如下:转染组(LV-CEMP1-
目的基因转染后通过倒置荧光显微镜对转染细胞进
空载体组(LV-EGFP)和空白对照组(BC)。
行观察,采用流式细胞仪检测细胞的转染效率,通过
实时荧
CEMP1
光定量
序列见表
的表达情况
PCR
1。
。
及
实时荧光定量
免疫细胞化
PCR
学染
反应引物
色检测
表1 PCR反应引物序列及产物大小
Table1 SpecificprimersofPCRandproductsize
基因引物序列产物大小
(NM_001048212)
CEMP15’-GATACCCACCTCTGCCTTGA-3’
5’-AGAACCTCACCTGCCTCTCC-3’
303bp
(NC_005103)
GAPDH5’-CGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3’
5’-ACGACATACTCAGCACCAGCATCACC-3’
129bp
1.2.4 基因转染PMO大鼠BMSCs与β-TCP复合
培养
LV-CEMP1-EGFP
:β-TCP预湿后置于37℃培养箱中备用
调整细胞密度至1
转染的
×
10
7
个
PMO
/mL
大鼠
接种于
BMSCs
β-TCP
消化后
,将
表面
,
,
每平方厘米接种50μL。37°C培养箱中静置2h后
缓慢加入培养液,24h后进行倒置荧光显微镜和扫
描电镜观察。
2 结果
2.1 PMO大鼠BMSCs原代培养及成骨分化能力
检测
中国骨质疏松杂志 2020年2月第26卷第2期 ChinJOsteoporos,February2020,Vol26,No.2
159
胞存在,也可见到少量梭形贴壁细胞。随着时间的
延长,细胞呈集落样生长,形态表现为纺锤形或多角
BMSCs原代培养3d时,镜下仍有较多的红细
行传代(图1a)。成骨诱导液培养7d时细胞ALP
染色呈棕黑色(图1b),成骨诱导液培养21d时即
可观察到茜素红染色呈橘红色的矿化结节(图1c)。
形。培养10d左右,细胞即可达到80%~90%,可进
图1 PMO大鼠BMSCs体外培养及成骨分化检测(
×
100)a:原代培养的BMSCs;b:ALP染色;c:钙结节茜素红染色。
Fig.1 MorphologicalobservationandosteogenicdifferentiationofPMOratBMSCs(
×
100)
2.2 CEMP1基因转染PMO大鼠BMSCs检测
到绿色荧光,随着时间的增加,细胞荧光逐渐加强,
细胞形态未出现明显的改变,BC组未见荧光表达
LV-CEMP1-EGFP组荧光表达率为86.9%,见图2e。
表达检测
PMO大鼠BMSCs后,仅LV-CEMP1-EGFP组有
CEMP1基因的扩增曲线,而LV-EGFP组和BC组均
未见该基因扩增曲线(图3)。
实时荧光定量PCR结果显示CEMP1基因转染
(图2)。通过流式细胞仪检测发现,转染72h后
2.3 基因转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1基因
图2 LV-CEMP1-EGFP转染PMO大鼠BMSCs检测(
×
CEMP1-EGFP组转染率。
100)a&b:LV-CEMP1-EGFP组;c&d:BC组;e:LV-
PMO大鼠BMSCs经慢病毒转染24h即可观察
Fig.2 DetectionofPMOratBMSCsafterLV-CEMP1-
EGFPtransfection(
×
100)
图3 PMO大鼠BMSCs中CEMP1mRNA的表达 a:GAPDH扩增曲线;b:LV-CEMP1-EGFP转染组目的基因扩
增曲线;c:空载体LV-EGFP转染组;d:BC组。
Fig.3 DetectionofCEMP1mRNAexpressionbyRealtimePCR
160
中国骨质疏松杂志 2020年2月第26卷第2期 ChinJOsteoporos,February2020,Vol26,No.2
2.4 基因转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白
表达检测
WesternBlot检测结果显示,LV-EGFP组和BC
(图6a、图6b),在扫描电镜下观察可见材料表面细
胞充分伸展,状态较好(图6c)。
组均未见CEMP1蛋白表达,仅LV-CEMP1-EGFP组
可检测到CEMP1蛋白的表达(图4)。免疫细胞化
学染色结果显示,LV-CEMP1-EGFP组细胞可见明
显棕色染色(图5a),而LV-EGFP组和BC组细胞均
2.5 基因转染PMO大鼠BMSCs与β-TCP复合
培养
β-TCP复合培养24h,倒置荧光显微镜下观察可见
转染LV-CEMP1-EGFP的PMO大鼠BMSCs与
未见明显着色(图5b~图5c)。
图4 转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白的表达
1:BC组;2:空载体LV-EGFP转染组;3:LV-CEMP1-EGFP
转染组。
Fig.4 WesternBlotofCEMP1proteinexpressioninPMOrat
BMSCsaftergenetransfection
有绿色荧光的细胞附着于β-TCP的不同层面
图5 转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白免疫细胞化学染色(
×
100)a:LV-CEMP1-EGFP转染组;b:空载体
LV-EGFP转染组;c:BC组。
Fig.5 ImmunohistochemicalstainingofCEMP1proteinexpressioninPMOratBMSCsaftergenetransfection(
×
100)
常用于组织工程技术和基因治疗中,可实现牙周组
织的修复再生
[7
-
9]
。但现有的研究
[10]
认为PMO患
者的BMSCs更易于向脂肪细胞分化,成脂能力更
高,而细胞的成骨分化能力相应的有所减弱。动物
实验
[11]
也证实与假手术组相比,PMO大鼠BMSCs
的增殖与迁移能力显著降低,细胞的凋亡活性增加。
因此,如何提升PMO状态下BMSCs的成骨分化能
力是学者们亟待解决的问题。
CEMP1是从成牙骨质细胞瘤中发现的一种牙
图6 基因转染PMO大鼠BMSCs与β-TCP复合培
养(
×
100)a&b:LV-CEMP1-EGFP转染细胞与β-TCP
复合培养倒置荧光显微镜观察;c:LV-CEMP1-EGFP
转染细胞与β-TCP复合培养扫描电镜观察;d:β-
TCP扫描电镜观察。
Fig.6 Co-cultureofPMOratBMSCswithβ-TCPafter
genetransfection(
×
100)
骨质特异性蛋白
[12]
,可促进牙周膜细胞向成牙骨质
表型分化,促进牙骨质的再生
[13-15]
。转染CEMP1
基因的人牙龈成纤维细胞的成骨及成牙骨质相关基
因表达增高,碱性磷酸酶活性增强,矿化结节形成能
力得到显著提升
[16]
。上述研究提示,CEMP1可提
高细胞的成骨分化能力,有望应用于牙周组织再生
研究。因此本研究利用慢病毒载体将CEMP1转染
至PMO大鼠BMSCs,结果显示转染细胞高表达
CEMP1,这为后续探讨CEMP1基因修饰PMO大鼠
BMSCs实现牙周组织再生研究创造了条件。
β-TCP属于人工合成材料,可作为组织工程支
3 讨论
BMSCs具有多向分化能力,且取材相对容易,
中国骨质疏松杂志 2020年2月第26卷第2期 ChinJOsteoporos,February2020,Vol26,No.2
161
架材料构建工程化复合物,实现骨组织再生
[17]
。研
究
[18]
发现将重组人骨形成蛋白-2复合于β-TCP后
植入兔肌肉内8周,即可观察到明显的新生骨样组
织。课题组以往研究
[19]
[7] ZhengB,JiangJ,ChenY,overexpressioninbone
marrowstromalcellspromotesperiodontalregenerationinarat
modelofosteoporosis[J].JPeriodontol,2017,88(8):808-818.
β-TCP复合培养构建组织工程复合物,实现犬的牙
周组织再生。因此,本研究选择多孔β-TCP作为种
子细胞的支架材料。研究结果显示CEMP1基因修
饰的PMO大鼠BMSCs在β-TCP上生长良好,形态
正常,细胞间连接紧密,提示β-TCP对细胞的生长
成功将犬颌骨骨膜细胞与
[8] KawaiT,KatagiriW,OsugiM,omesfrombone
marrow-derivedmesenchymalstromalcellsenhanceperiodontal
tissueregeneration[J].Cytotherapy,2015,17(4):369-381.
[9] DerubeisAR,rrowstromalcells(BMSCs)
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[10] RodriguezJP,MontecinosL,RiosS,hymalstem
没有影响,生物相容性较好。
牙周炎与OP同为中老年人的常见病、多发病。
如何实现OP患者牙周组织的再生是当前牙周临床
医生所关注的重点。基因工程技术和组织工程技术
的联合应用使理想的牙周组织再生成为可能。本实
验首次以OP状态的BMSC为靶细胞转染CEMP1
并与β-TCP复合,构建CEMP1修改的工程化复合
物
EGFP
。结果显示,PMO大鼠
及内部附着并生长良好
后能稳定高效表达
,分泌胞外基质
CEMP1,
BMSCs
且在
转染LV-CEMP1-
。
β-TCP
表明在本
表面
实验条件下可成功构建以β-TCP为支架的CEMP1
基因修饰的工程化复合物,但该复合物的体内成骨
能力及能否实现OP状态下牙周组织再生仍需后续
进一步的研究探讨。
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(收稿日期:2018-11-01;修回日期:2019-03-06)
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摘要:目的 探讨牙骨质蛋白1(cementumprotein1,CEMP1)基因修饰骨质疏松大鼠骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,
BMSCs)与β-磷酸三钙(β-tricalciumphosphate,β-TCP)体外复合培养的可行性。方法 体外培养骨质疏松大鼠BMSCs,将携
带有CEMP1基因的慢病毒LV-CEMP1-EGFP转染BMSCs,采用荧光显微镜观察转染情况,通过流式细胞仪检测转染率,通过
实时荧光定量PCR检测转染后BMSCs中CEMP1基因的表达,WesternBlot及免疫细胞化学染色检测BMSCs中CEMP1蛋白
的表达情况。将CEMP1基因修饰的BMSCs与β-TCP体外复合培养,在荧光显微镜和扫描电镜下观察细胞的生长状况。结果
LV-CEMP1-EGFP具有较高的转染率,CEMP1基因修饰的BMSCs可高表达CEMP1,且在β-TCP上保持良好的生长状态。结论
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关键词:牙骨质蛋白1;骨髓基质细胞;骨质疏松;慢病毒;β-磷酸三钙
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JIANGJun
1#
,WUYuming
2#
,HEMengjiao
1,3
,ZHENGBaoyu
4
,XUXiongcheng
1,3
,LIYanfen
1
,CHENYuling
1
,LUOKai
1∗
andHospitalofStomatology,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China
Abstract:Objective Toevaluatethefeasibilityofco-cultureofcementumprotein1(CEMP1)genemodifiedosteoporoticrat
bonemarrowstromalcells(BMSCs)withβ-s BMSCsofosteoporoticratswereisolatedandculturedin
vitroandtransfectedwithlentiviralvectorcarryingCEMP1gene(LV-CEMP1-EGFP)anddetectedunderinvertedfluorescence
ectsionofCEMP1inBMSCswas
detectedbyrealtimePCR,-CEMP1-EGFPtransfectedcellswereco-culturedwithβ-
TCPandwereobservedunderinvertedfluorescencemicroscopeandscanningelectronmicroscope(SEM).Results LV-CEMP1-
scentmicroscopeandSEMdemonstratedthat
CEMP1genemodifiedBMSCscouldmigrateintoβ-sion Recombinantlentiviral
vectorcontaininghu1genemodifiedBMSCscan
becombinedwithβ-positemightbebeneficialforperiodontaltissueregenerationwithosteoporosis.
Keywords:CEMP1;BMSCs;osteoporosis;lentiviralvector;β-TCP
基金项目:国家自然科学基金项目(81870766);福建省自然科
学基金项目(2017J01522);福建省卫生系统中青年骨干人才培养项
目(2015-ZQN-ZD-28);福建医科大学启航基金项目(2016QH079)
∗通信作者:骆凯,Email:luokai39@
#:共同第一作者
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种骨代谢疾
床表现,易出现骨折,严重影响中老年人的生活质
病,以骨结构异常、骨脆性增高和骨量减少为主要临
158
中国骨质疏松杂志 2020年2月第26卷第2期 ChinJOsteoporos,February2020,Vol26,No.2
量。更年期妇女随着体内雌激素水平的下降,骨量
迅速丢失,易出现绝经后骨质疏松(postmenopausal
osteoporosis,PMO)
[1]
。研究显示
[2
-
3]
PMO与牙周炎
存在明显相关性,可加速牙周组织的破坏。如何实
现PMO状态下的牙周组织再生是当前牙周病临床
治疗所面临的众多挑战之一。近年来,组织工程技
术与基因工程技术的联合应用为实现牙周组织的修
复再生提供了新的思路。牙骨质蛋白1(cementum
protein1,CEMP1)作为牙骨质特异性蛋白之一,可
课题组前期方法
[5]
建立骨质疏松大鼠模型,模型建
立成功后将大鼠经麻醉颈椎脱臼处死。无菌条件下
取出大鼠双侧股骨和胫骨,剪去骨端两侧,采用细胞
培养液反复冲洗骨髓腔,直到骨头发白为止。将获
取的细胞悬液经1000r/min,离心5min,弃上清,
100mg/L,10%FBS)重悬,置于37℃、5%CO
2
细胞
培养箱中。第3天首次半量换液,之后按常规进行
换液。待细胞密度达到80%~90%时进行消化传
DMEM低糖培养液(含青霉素100U/mL,链霉素
促进非矿化细胞向成骨细胞分化,有望应用于牙周
组织的再生
[4]
基因重组慢病毒过表达载体
。因此,本研究拟通过构建人
,并转染PMO大鼠骨髓
CEMP1
基质
CEMP1
细胞
表达
在
(
PMO
bone
大鼠
marrow
BMSCs
stromal
中稳定表达
cells,BMSCs),使
phosphate,
CEMP1
况,为后续利用
β-TCP)
的BMSCs
CEMP1
复合培养
与β磷酸三钙
,同时将过
实现骨质疏松状态下的牙
,观察细胞的生长情
(β-tricalcium
周组织再生奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.
(SD)
1.1
SCXK(
雌性大鼠
实验动
,
物
体重
:3月
280
龄
~300
SPF
g,
级
动物许可证号
Sprague-Dawley
:
南京军区福州总医院比较医学科
沪)2012
-
0002。按啮齿类动物标准饲养于
,适应性喂养1周
后开始实验。
1.1.2 主要试剂与仪器:DMEM低糖培养基、胎牛
血清
BRL,
(
室保存
美国
Hyclone,
);抗坏血酸
);重组慢病毒
美国);0.25%胰蛋白酶(Gibico
、β
-
磷酸甘油
LV-CEMP1-EGFP
、地塞米松和茜素
(本实验
红(Sigma,美国);碱性磷酸酯酶显色试剂盒、碱性
磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公
司
Ex
);PrimeScript
TM
RTReagentKit和SYBRPrimix
(Invitrogen,
Taq
TM
试剂盒(Takara,日本);Trizol试剂盒
限公司);CEMP1
美国);β-TCP
多克隆抗体
(上海贝奥路生物材料有
(Abcam公司);生物
安全柜(力申科学仪器有限公司,上海);细胞培养
箱(Heraeus,德国);iMARK酶标仪(Bio-Rad,美
国);实时荧光定量PCR仪(RocheLightCycler480,
德国
(
);相差荧光显微镜(Olympus,日本
SEM230,
Bio-Rad,美国);扫描电镜(FEI
);
Nova
电泳装置
Nano
1.2 方法
美国)。
1.2.1 PMO大鼠BMSCs的获取及体外培养:参照
代,实验选择P3以内细胞进行。
1.
PMO
2.2
大鼠
PMO
BMSCs
大鼠
以每孔
BMSCs
1
体外成骨分化能力检测
×
10
:
5
个接种于6孔板,以
成骨诱导液
C、10
(
行培养
mmol
ALP染色
,每
/
,诱导
3
L
基础培养液中加入
天换液
β-磷酸甘油
21d后进行矿化结节茜素红染色
。诱导
、10
7
nmol
50
d后收集细胞进行
/L
μg
地塞米松
/mL维生素
)进
1.2.3 PMO大鼠BMSCs基因转染检测:将PMO
。
大
鼠BMSCs以1
×
10
4
/cm
2
密度进行接种,待细胞生长
至约70%融合时参照课题组前期方法
[6]
进行目的
基因
EGFP)、
转染。实验分组如下:转染组(LV-CEMP1-
目的基因转染后通过倒置荧光显微镜对转染细胞进
空载体组(LV-EGFP)和空白对照组(BC)。
行观察,采用流式细胞仪检测细胞的转染效率,通过
实时荧
CEMP1
光定量
序列见表
的表达情况
PCR
1。
。
及
实时荧光定量
免疫细胞化
PCR
学染
反应引物
色检测
表1 PCR反应引物序列及产物大小
Table1 SpecificprimersofPCRandproductsize
基因引物序列产物大小
(NM_001048212)
CEMP15’-GATACCCACCTCTGCCTTGA-3’
5’-AGAACCTCACCTGCCTCTCC-3’
303bp
(NC_005103)
GAPDH5’-CGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3’
5’-ACGACATACTCAGCACCAGCATCACC-3’
129bp
1.2.4 基因转染PMO大鼠BMSCs与β-TCP复合
培养
LV-CEMP1-EGFP
:β-TCP预湿后置于37℃培养箱中备用
调整细胞密度至1
转染的
×
10
7
个
PMO
/mL
大鼠
接种于
BMSCs
β-TCP
消化后
,将
表面
,
,
每平方厘米接种50μL。37°C培养箱中静置2h后
缓慢加入培养液,24h后进行倒置荧光显微镜和扫
描电镜观察。
2 结果
2.1 PMO大鼠BMSCs原代培养及成骨分化能力
检测
中国骨质疏松杂志 2020年2月第26卷第2期 ChinJOsteoporos,February2020,Vol26,No.2
159
胞存在,也可见到少量梭形贴壁细胞。随着时间的
延长,细胞呈集落样生长,形态表现为纺锤形或多角
BMSCs原代培养3d时,镜下仍有较多的红细
行传代(图1a)。成骨诱导液培养7d时细胞ALP
染色呈棕黑色(图1b),成骨诱导液培养21d时即
可观察到茜素红染色呈橘红色的矿化结节(图1c)。
形。培养10d左右,细胞即可达到80%~90%,可进
图1 PMO大鼠BMSCs体外培养及成骨分化检测(
×
100)a:原代培养的BMSCs;b:ALP染色;c:钙结节茜素红染色。
Fig.1 MorphologicalobservationandosteogenicdifferentiationofPMOratBMSCs(
×
100)
2.2 CEMP1基因转染PMO大鼠BMSCs检测
到绿色荧光,随着时间的增加,细胞荧光逐渐加强,
细胞形态未出现明显的改变,BC组未见荧光表达
LV-CEMP1-EGFP组荧光表达率为86.9%,见图2e。
表达检测
PMO大鼠BMSCs后,仅LV-CEMP1-EGFP组有
CEMP1基因的扩增曲线,而LV-EGFP组和BC组均
未见该基因扩增曲线(图3)。
实时荧光定量PCR结果显示CEMP1基因转染
(图2)。通过流式细胞仪检测发现,转染72h后
2.3 基因转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1基因
图2 LV-CEMP1-EGFP转染PMO大鼠BMSCs检测(
×
CEMP1-EGFP组转染率。
100)a&b:LV-CEMP1-EGFP组;c&d:BC组;e:LV-
PMO大鼠BMSCs经慢病毒转染24h即可观察
Fig.2 DetectionofPMOratBMSCsafterLV-CEMP1-
EGFPtransfection(
×
100)
图3 PMO大鼠BMSCs中CEMP1mRNA的表达 a:GAPDH扩增曲线;b:LV-CEMP1-EGFP转染组目的基因扩
增曲线;c:空载体LV-EGFP转染组;d:BC组。
Fig.3 DetectionofCEMP1mRNAexpressionbyRealtimePCR
160
中国骨质疏松杂志 2020年2月第26卷第2期 ChinJOsteoporos,February2020,Vol26,No.2
2.4 基因转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白
表达检测
WesternBlot检测结果显示,LV-EGFP组和BC
(图6a、图6b),在扫描电镜下观察可见材料表面细
胞充分伸展,状态较好(图6c)。
组均未见CEMP1蛋白表达,仅LV-CEMP1-EGFP组
可检测到CEMP1蛋白的表达(图4)。免疫细胞化
学染色结果显示,LV-CEMP1-EGFP组细胞可见明
显棕色染色(图5a),而LV-EGFP组和BC组细胞均
2.5 基因转染PMO大鼠BMSCs与β-TCP复合
培养
β-TCP复合培养24h,倒置荧光显微镜下观察可见
转染LV-CEMP1-EGFP的PMO大鼠BMSCs与
未见明显着色(图5b~图5c)。
图4 转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白的表达
1:BC组;2:空载体LV-EGFP转染组;3:LV-CEMP1-EGFP
转染组。
Fig.4 WesternBlotofCEMP1proteinexpressioninPMOrat
BMSCsaftergenetransfection
有绿色荧光的细胞附着于β-TCP的不同层面
图5 转染后PMO大鼠BMSCs中CEMP1蛋白免疫细胞化学染色(
×
100)a:LV-CEMP1-EGFP转染组;b:空载体
LV-EGFP转染组;c:BC组。
Fig.5 ImmunohistochemicalstainingofCEMP1proteinexpressioninPMOratBMSCsaftergenetransfection(
×
100)
常用于组织工程技术和基因治疗中,可实现牙周组
织的修复再生
[7
-
9]
。但现有的研究
[10]
认为PMO患
者的BMSCs更易于向脂肪细胞分化,成脂能力更
高,而细胞的成骨分化能力相应的有所减弱。动物
实验
[11]
也证实与假手术组相比,PMO大鼠BMSCs
的增殖与迁移能力显著降低,细胞的凋亡活性增加。
因此,如何提升PMO状态下BMSCs的成骨分化能
力是学者们亟待解决的问题。
CEMP1是从成牙骨质细胞瘤中发现的一种牙
图6 基因转染PMO大鼠BMSCs与β-TCP复合培
养(
×
100)a&b:LV-CEMP1-EGFP转染细胞与β-TCP
复合培养倒置荧光显微镜观察;c:LV-CEMP1-EGFP
转染细胞与β-TCP复合培养扫描电镜观察;d:β-
TCP扫描电镜观察。
Fig.6 Co-cultureofPMOratBMSCswithβ-TCPafter
genetransfection(
×
100)
骨质特异性蛋白
[12]
,可促进牙周膜细胞向成牙骨质
表型分化,促进牙骨质的再生
[13-15]
。转染CEMP1
基因的人牙龈成纤维细胞的成骨及成牙骨质相关基
因表达增高,碱性磷酸酶活性增强,矿化结节形成能
力得到显著提升
[16]
。上述研究提示,CEMP1可提
高细胞的成骨分化能力,有望应用于牙周组织再生
研究。因此本研究利用慢病毒载体将CEMP1转染
至PMO大鼠BMSCs,结果显示转染细胞高表达
CEMP1,这为后续探讨CEMP1基因修饰PMO大鼠
BMSCs实现牙周组织再生研究创造了条件。
β-TCP属于人工合成材料,可作为组织工程支
3 讨论
BMSCs具有多向分化能力,且取材相对容易,
中国骨质疏松杂志 2020年2月第26卷第2期 ChinJOsteoporos,February2020,Vol26,No.2
161
架材料构建工程化复合物,实现骨组织再生
[17]
。研
究
[18]
发现将重组人骨形成蛋白-2复合于β-TCP后
植入兔肌肉内8周,即可观察到明显的新生骨样组
织。课题组以往研究
[19]
[7] ZhengB,JiangJ,ChenY,overexpressioninbone
marrowstromalcellspromotesperiodontalregenerationinarat
modelofosteoporosis[J].JPeriodontol,2017,88(8):808-818.
β-TCP复合培养构建组织工程复合物,实现犬的牙
周组织再生。因此,本研究选择多孔β-TCP作为种
子细胞的支架材料。研究结果显示CEMP1基因修
饰的PMO大鼠BMSCs在β-TCP上生长良好,形态
正常,细胞间连接紧密,提示β-TCP对细胞的生长
成功将犬颌骨骨膜细胞与
[8] KawaiT,KatagiriW,OsugiM,omesfrombone
marrow-derivedmesenchymalstromalcellsenhanceperiodontal
tissueregeneration[J].Cytotherapy,2015,17(4):369-381.
[9] DerubeisAR,rrowstromalcells(BMSCs)
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inboneengineering:limitationsandrecentadvances[J].Ann
[10] RodriguezJP,MontecinosL,RiosS,hymalstem
没有影响,生物相容性较好。
牙周炎与OP同为中老年人的常见病、多发病。
如何实现OP患者牙周组织的再生是当前牙周临床
医生所关注的重点。基因工程技术和组织工程技术
的联合应用使理想的牙周组织再生成为可能。本实
验首次以OP状态的BMSC为靶细胞转染CEMP1
并与β-TCP复合,构建CEMP1修改的工程化复合
物
EGFP
。结果显示,PMO大鼠
及内部附着并生长良好
后能稳定高效表达
,分泌胞外基质
CEMP1,
BMSCs
且在
转染LV-CEMP1-
。
β-TCP
表明在本
表面
实验条件下可成功构建以β-TCP为支架的CEMP1
基因修饰的工程化复合物,但该复合物的体内成骨
能力及能否实现OP状态下牙周组织再生仍需后续
进一步的研究探讨。
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