2024年4月21日发(作者：子车瀚昂)

※生物工程食品科学

2010, Vol. 31, No. 11

147

产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产

抗菌物质性质

李 云，杨胜远*，林晓东，钟瑜红，苏 婷，刘湘嘉

(韩山师范学院生物系食品与发酵工程研究所，广东 潮州 521041)

摘 要：从腌制蔬菜表面分离到一株产细菌素的菌株K2，其中和后的无细胞发酵液主要抑制革兰氏阳性细菌，特

别是对芽孢杆菌有强烈的抑制作用。发酵上清液经硫酸铵盐析和透析后，仍然有很强的抗菌活性，并对多种蛋白

酶敏感，表明抗菌活性物质为蛋白类物质。通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA序列比对及系统发育

分析，鉴定菌株K2是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。菌株K2产生的抗菌物质在pH6～9条件下80℃处理

30min仍保持稳定的抗菌活性，其对敏感菌的作用主要是杀菌，而且对芽孢萌发有很好的抑制作用。该抗菌物质

在菌体生长对数中期产生，在稳定期中期抗菌活性达到最大。

关键词：苏云金芽孢杆菌；细菌素；鉴定；抗菌物质

Identification of Bacteriocin-producing Bacillus thuringiensis and Properties of Its Antibacterial Substances

LI Yun，YANG Sheng-yuan*，LIN Xiao-dong，ZHONG Yu-hong，SU Ting，LIU Xiang-jia

(Food and Fermentation Engineering Institute, Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)

Abstract ：Strain K2 having the ability to produce bacteriocin was isolated from the surface of picked vegetables. The neutralized

cell-free fermentation supernatant exhibited an inhibition effect against Gram-positive bacteria, especially strong inhibition

effect against Bacillus strains. The inhibition activity of the fermentation supernatant still kept high after ammonium sulphate

precipitation and dialysis, and the activity of the dialysis retentate was sensitive to a variety of proteases. These results

indicated the protein nature of antibacterial substances contained in the dialysis retentate. Base on morphological, physiological

and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence and phylogenic analysis, the strain K2 was classified as Bacillus thuringiensis.

The antibacterial substance from strain K2 remained strong antibacterial activity after heating treatment at 80 ℃ and pH 6－9

for 30 min, suggesting its excellent thermostable property and pH resistance. The antibacterial activity was generated from mid-

logarithmic growth phase and reached the maximum activity at mid-stationary phase.

Key words：Bacillus thuringiensis；bacteriocin；identification；antibacterial substance

中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)11-0147-06

细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机

制产生的一类具有生物活性的蛋白质或多肽，主要抑制

其他相近种类的细菌，一般产生菌自身对其细菌素具有

免疫性

[1]

。大多数细菌能产生至少一种细菌素

[2]

。食源

性细菌所产细菌素由于其安全、无毒和高效抗菌作用，

具有替代化学合成防腐剂的应用潜力，而被广泛研究与

开发

[3]

。

食品应用细菌素的研究集中在乳酸菌(lactic acid

bacterium，LAB)细菌素，目前已报道的许多种LAB

收稿日期：2009-09-25

细菌素中，Nisin是已被商品化生产并广泛使用的细菌

素

[4]

。Nisin的生物活性、稳定性受到许多物理和化学

因素的影响，在一定程度上限制了它的应用。因此，

寻找稳定、安全、高效、具备应用潜力的新型细菌素

具有十分重要的意义。芽孢杆菌(Bacillus)在自然界分布

非常广泛，生理特性丰富多样，能够代谢产生脂肽类、

磷脂类、细菌素等多种拮抗性物质，其中细菌素资源

非常丰富。本实验对腌制蔬菜表面分离到的一株产细菌

基金项目：广东省自然科学基金项目(84521)；国家星火计划项目(2008GA780032)；韩山师范学院科研基金项目

作者简介：李云(1977—)，男，讲师，硕士，研究方向为应用微生物学和发酵工程。E-mail：fgtmyself@

*通信作者：杨胜远(1972—)，男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。 E-mail：yshengyuan2004@

148 2010, Vol. 31, No. 11

食品科学※生物工程

素的芽孢杆菌进行鉴定，并研究其所产抗菌物质的部分

性质。

１

1.1

材料与方法

菌株

采用细菌16S rDNA的通用引物：27F：5'-

GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1541R：5'-

AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，由上海生工生物工程

技术服务有限公司合成。

1.5

1.5.1

方法

细菌素产生菌的分离筛选

菌株K2分离自腌制蔬菜。用TSB琼脂斜面于35℃

培养24h后，于4℃冰箱保藏。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，ATCC 8099)、金

黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 6538)、

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCC 15442)、

白假丝酵母(Candida albicans，ATCC 10231)和黑曲霉

(Aspergillus niger，ATCC 16404)由广东省微生物所提

供；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，CMCC 63501)、

大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC 35218)由中国医学细

菌保藏管理中心提供；藤黄微球菌(Micrococcus luteus，

STL3101)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus，STL 3301)、

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，STL 3302)、枯

草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，STL 3303)由河南农业大

学黄现青博士馈赠；酿酒酵母(Saccharomyces

cerevisiae，STL 3401)、乳酸乳球菌(Lactococcus

lactis，STL 3102)、屎肠球菌(Enterococcus faecium，

STL 3103) 分离自发酵食品；痢疾志贺氏菌(Shigella

dysenteriae，STL 3201)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter

freundii，STL 3202)分离自污染食品；巨大芽孢杆菌

(Bacillus megaterium，STL 3304)、灰绿青霉

(Penicillium glaucum，STL 3501)、康宁木霉

(Trichoderma koningii，STL 3502)由韩山师范学院生物

系食品与发酵工程研究所保藏。

1.2培养基

TSB培养基

[5]

用于菌株K2培养，牛肉膏蛋白胨培养

基用于培养指示细菌，MRS培养基

[6]

用于培养乳酸菌，

PDA培养基用于培养酵母及霉菌。

1.3试剂与仪器

胰蛋白酶、蛋白酶K Sigma公司；中性蛋白酶

上海生工生物工程技术服务有限公司；酸性蛋白酶、木

瓜蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司；DNA纯

化试剂盒 北京天为时代科技有限公司；其他试剂为分

析纯。

PTC-100 PCR仪 MJ Research公司；VITEK32全

TM

采集发酵食品(泡菜、腌菜、发酵豆制品等)样品，

经适当梯度稀释后进行平板涂布分离，挑取单菌落于TSB

平板上划线纯化。取纯化后菌落，涂片革兰氏染色，镜

检，保留革兰氏阳性的菌株。将分离获得的菌株点种于

平板(MRS、TSB培养基)中，于35℃培养12h，然后在

菌落上平铺一层含指示菌的培养基，适温培养后根据抗菌

圈的大小和清晰程度来判断受试菌对指示菌的抗菌能力。

将初筛后有活性的菌株接种于液体培养基，培养24h，于

4℃以8000×g离心15min，收集上清液，用1mol/L NaOH

溶液调pH值到6.5，采用牛津杯法点样复筛。

1.5.2菌株K2发酵液抗菌活性的测定

菌株K2发酵液的处理：活化后的K2菌株以2%接

种量接种于TSB液体培养基中，32℃静置培养24h，于

4℃以8000×g离心15min，收集上清液，用1mol/L NaOH

溶液调pH值到6.5，排除产酸的干扰。上清液用0.22μm

滤膜过滤，除去菌体及其他杂质，即为碱中和后的无

细胞发酵液，放入－20℃冰箱中备用。

采用牛津杯法测定抗菌活性：将指示菌分别接种于

各种培养基中适温活化培养12h，经传代两次使各菌株

达到良好生长状态，然后涂布接种于各种固体培养基中

(厌氧菌与熔化固体培养基混匀倾倒平板)，均匀放置牛

津杯，每杯中点样200μL碱中和后无细胞发酵液，适

温培养24h后，检测产细菌素菌株对各种指示菌的抑制

作用，测量抑菌圈直径，每组实验重复测定3次。

1.5.3形态培养特征及生理生化特征实验

形态、培养及基本生理特征实验参照文献[7]。生

16S rDNA序列比对及系统发育分析

按文献[8]方法提取细菌基因组DNA，采用细菌16S

化特征实验采用Vitek32微生物自动鉴定系统鉴定。

1.5.4

rDNA的通用引物27F和1541R进行扩增。扩增体系为

10mmol/mL MgCl

2

3μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP

(2.5μmol/L) 4μL，Taq酶 (5U/μL) 0.25μL，上游引物

和下游引物(2.5μmol/L)各1μL，模板DNA 1μL，最后

加双蒸水至50μL，混合后瞬间离心，置于PCR仪上95

℃变性5 min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延

伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min反应结束。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观

察并拍照记录结果。PCR产物通过电泳，利用北京天

为时代科技有限公司凝胶回收试剂盒割胶回收纯化。

自动微生物分析仪 法国生物梅里埃公司；Hermle Z36HK

冷冻离心机 Hermle公司；Sigma2-16离心机 美国

Sigma公司；UV-2100分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有

限公司；FD-1D-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有

限公司；Olympus CX41生物显微镜 奥林巴斯公司。

1.4PCR引物

2024年4月21日发(作者：子车瀚昂)

※生物工程食品科学

2010, Vol. 31, No. 11

147

产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产

抗菌物质性质

李 云，杨胜远*，林晓东，钟瑜红，苏 婷，刘湘嘉

(韩山师范学院生物系食品与发酵工程研究所，广东 潮州 521041)

摘 要：从腌制蔬菜表面分离到一株产细菌素的菌株K2，其中和后的无细胞发酵液主要抑制革兰氏阳性细菌，特

别是对芽孢杆菌有强烈的抑制作用。发酵上清液经硫酸铵盐析和透析后，仍然有很强的抗菌活性，并对多种蛋白

酶敏感，表明抗菌活性物质为蛋白类物质。通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA序列比对及系统发育

分析，鉴定菌株K2是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。菌株K2产生的抗菌物质在pH6～9条件下80℃处理

30min仍保持稳定的抗菌活性，其对敏感菌的作用主要是杀菌，而且对芽孢萌发有很好的抑制作用。该抗菌物质

在菌体生长对数中期产生，在稳定期中期抗菌活性达到最大。

关键词：苏云金芽孢杆菌；细菌素；鉴定；抗菌物质

Identification of Bacteriocin-producing Bacillus thuringiensis and Properties of Its Antibacterial Substances

LI Yun，YANG Sheng-yuan*，LIN Xiao-dong，ZHONG Yu-hong，SU Ting，LIU Xiang-jia

(Food and Fermentation Engineering Institute, Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)

Abstract ：Strain K2 having the ability to produce bacteriocin was isolated from the surface of picked vegetables. The neutralized

cell-free fermentation supernatant exhibited an inhibition effect against Gram-positive bacteria, especially strong inhibition

effect against Bacillus strains. The inhibition activity of the fermentation supernatant still kept high after ammonium sulphate

precipitation and dialysis, and the activity of the dialysis retentate was sensitive to a variety of proteases. These results

indicated the protein nature of antibacterial substances contained in the dialysis retentate. Base on morphological, physiological

and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence and phylogenic analysis, the strain K2 was classified as Bacillus thuringiensis.

The antibacterial substance from strain K2 remained strong antibacterial activity after heating treatment at 80 ℃ and pH 6－9

for 30 min, suggesting its excellent thermostable property and pH resistance. The antibacterial activity was generated from mid-

logarithmic growth phase and reached the maximum activity at mid-stationary phase.

Key words：Bacillus thuringiensis；bacteriocin；identification；antibacterial substance

中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)11-0147-06

细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机

制产生的一类具有生物活性的蛋白质或多肽，主要抑制

其他相近种类的细菌，一般产生菌自身对其细菌素具有

免疫性

[1]

。大多数细菌能产生至少一种细菌素

[2]

。食源

性细菌所产细菌素由于其安全、无毒和高效抗菌作用，

具有替代化学合成防腐剂的应用潜力，而被广泛研究与

开发

[3]

。

食品应用细菌素的研究集中在乳酸菌(lactic acid

bacterium，LAB)细菌素，目前已报道的许多种LAB

收稿日期：2009-09-25

细菌素中，Nisin是已被商品化生产并广泛使用的细菌

素

[4]

。Nisin的生物活性、稳定性受到许多物理和化学

因素的影响，在一定程度上限制了它的应用。因此，

寻找稳定、安全、高效、具备应用潜力的新型细菌素

具有十分重要的意义。芽孢杆菌(Bacillus)在自然界分布

非常广泛，生理特性丰富多样，能够代谢产生脂肽类、

磷脂类、细菌素等多种拮抗性物质，其中细菌素资源

非常丰富。本实验对腌制蔬菜表面分离到的一株产细菌

基金项目：广东省自然科学基金项目(84521)；国家星火计划项目(2008GA780032)；韩山师范学院科研基金项目

作者简介：李云(1977—)，男，讲师，硕士，研究方向为应用微生物学和发酵工程。E-mail：fgtmyself@

*通信作者：杨胜远(1972—)，男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。 E-mail：yshengyuan2004@

148 2010, Vol. 31, No. 11

食品科学※生物工程

素的芽孢杆菌进行鉴定，并研究其所产抗菌物质的部分

性质。

１

1.1

材料与方法

菌株

采用细菌16S rDNA的通用引物：27F：5'-

GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1541R：5'-

AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，由上海生工生物工程

技术服务有限公司合成。

1.5

1.5.1

方法

细菌素产生菌的分离筛选

菌株K2分离自腌制蔬菜。用TSB琼脂斜面于35℃

培养24h后，于4℃冰箱保藏。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli，ATCC 8099)、金

黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 6538)、

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCC 15442)、

白假丝酵母(Candida albicans，ATCC 10231)和黑曲霉

(Aspergillus niger，ATCC 16404)由广东省微生物所提

供；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，CMCC 63501)、

大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC 35218)由中国医学细

菌保藏管理中心提供；藤黄微球菌(Micrococcus luteus，

STL3101)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus，STL 3301)、

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，STL 3302)、枯

草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，STL 3303)由河南农业大

学黄现青博士馈赠；酿酒酵母(Saccharomyces

cerevisiae，STL 3401)、乳酸乳球菌(Lactococcus

lactis，STL 3102)、屎肠球菌(Enterococcus faecium，

STL 3103) 分离自发酵食品；痢疾志贺氏菌(Shigella

dysenteriae，STL 3201)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter

freundii，STL 3202)分离自污染食品；巨大芽孢杆菌

(Bacillus megaterium，STL 3304)、灰绿青霉

(Penicillium glaucum，STL 3501)、康宁木霉

(Trichoderma koningii，STL 3502)由韩山师范学院生物

系食品与发酵工程研究所保藏。

1.2培养基

TSB培养基

[5]

用于菌株K2培养，牛肉膏蛋白胨培养

基用于培养指示细菌，MRS培养基

[6]

用于培养乳酸菌，

PDA培养基用于培养酵母及霉菌。

1.3试剂与仪器

胰蛋白酶、蛋白酶K Sigma公司；中性蛋白酶

上海生工生物工程技术服务有限公司；酸性蛋白酶、木

瓜蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司；DNA纯

化试剂盒 北京天为时代科技有限公司；其他试剂为分

析纯。

PTC-100 PCR仪 MJ Research公司；VITEK32全

TM

采集发酵食品(泡菜、腌菜、发酵豆制品等)样品，

经适当梯度稀释后进行平板涂布分离，挑取单菌落于TSB

平板上划线纯化。取纯化后菌落，涂片革兰氏染色，镜

检，保留革兰氏阳性的菌株。将分离获得的菌株点种于

平板(MRS、TSB培养基)中，于35℃培养12h，然后在

菌落上平铺一层含指示菌的培养基，适温培养后根据抗菌

圈的大小和清晰程度来判断受试菌对指示菌的抗菌能力。

将初筛后有活性的菌株接种于液体培养基，培养24h，于

4℃以8000×g离心15min，收集上清液，用1mol/L NaOH

溶液调pH值到6.5，采用牛津杯法点样复筛。

1.5.2菌株K2发酵液抗菌活性的测定

菌株K2发酵液的处理：活化后的K2菌株以2%接

种量接种于TSB液体培养基中，32℃静置培养24h，于

4℃以8000×g离心15min，收集上清液，用1mol/L NaOH

溶液调pH值到6.5，排除产酸的干扰。上清液用0.22μm

滤膜过滤，除去菌体及其他杂质，即为碱中和后的无

细胞发酵液，放入－20℃冰箱中备用。

采用牛津杯法测定抗菌活性：将指示菌分别接种于

各种培养基中适温活化培养12h，经传代两次使各菌株

达到良好生长状态，然后涂布接种于各种固体培养基中

(厌氧菌与熔化固体培养基混匀倾倒平板)，均匀放置牛

津杯，每杯中点样200μL碱中和后无细胞发酵液，适

温培养24h后，检测产细菌素菌株对各种指示菌的抑制

作用，测量抑菌圈直径，每组实验重复测定3次。

1.5.3形态培养特征及生理生化特征实验

形态、培养及基本生理特征实验参照文献[7]。生

16S rDNA序列比对及系统发育分析

按文献[8]方法提取细菌基因组DNA，采用细菌16S

化特征实验采用Vitek32微生物自动鉴定系统鉴定。

1.5.4

rDNA的通用引物27F和1541R进行扩增。扩增体系为

10mmol/mL MgCl

2

3μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP

(2.5μmol/L) 4μL，Taq酶 (5U/μL) 0.25μL，上游引物

和下游引物(2.5μmol/L)各1μL，模板DNA 1μL，最后

加双蒸水至50μL，混合后瞬间离心，置于PCR仪上95

℃变性5 min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延

伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min反应结束。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观

察并拍照记录结果。PCR产物通过电泳，利用北京天

为时代科技有限公司凝胶回收试剂盒割胶回收纯化。

自动微生物分析仪 法国生物梅里埃公司；Hermle Z36HK

冷冻离心机 Hermle公司；Sigma2-16离心机 美国

Sigma公司；UV-2100分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有

限公司；FD-1D-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有

限公司；Olympus CX41生物显微镜 奥林巴斯公司。

1.4PCR引物