2024年3月30日发(作者：闭如容)
1株具有广谱抗菌活性的海洋小单孢菌MN10的分离及鉴定
张晓敏;刘秋;刘限;王皓;闫建芳;齐小辉;白湜
【摘 要】采用稀释平板法,从辽宁省大连海域海泥中分离筛选具有抑菌活性的稀有
放线菌小单孢菌属菌种,并依据多相分类方法确定该菌的分类地位.结果表明:分离得
到1株具有广谱抗菌活性的小单孢菌种；16S rRNA基因的系统发育分析结果表明,
该菌与Microromonospora marine (99.652％)亲缘关系最近,且生理生化
结果与Micromonospora marine 相一致；根据形态特征、培养特征、化
学分类特征以及16S rRNA基因序列系统发育分析,确定该菌为Micromonospora
marina ;该菌对金黄色葡萄球菌、弯曲假单孢菌、枯草芽孢杆菌、尖刀镰孢
菌均具有抑菌活性.
【期刊名称】《甘肃农业大学学报》
【年(卷),期】2013(048)002
【总页数】6页(P99-104)
【关键词】小单孢菌;多相分类;抗菌活性;鉴定
【作 者】张晓敏;刘秋;刘限;王皓;闫建芳;齐小辉;白湜
【作者单位】沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110000;大连民族学院生
命科学学院,辽宁大连116600;沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110000;
沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110000;大连民族学院生命科学学院,辽
宁大连116600;大连民族学院生命科学学院,辽宁大连116600;沈阳农业大学生物
科学技术学院,辽宁沈阳 110000
【正文语种】中 文
【中图分类】Q93-331
小单孢菌属最初以形态特征命名［1］，具有发达分枝的基底菌丝，无气生菌丝，
孢子单生，无鞭毛，不游动.目前为止，小单孢菌属已报道的菌种有40个［2］.小
单孢菌属分布广泛，在土壤、水、海砂中均有分布，特别是在固氮植物根瘤部的发
生率为100%［3－5］.由小单孢菌属产生的抗生素庆大霉素、紫苏霉素、福堤霉
素A在临床上广泛应用，是仅次于链霉菌属的第二大抗生素来源［3］.此外，小
单孢菌属也是抗肿瘤活性物质的主要来源，包括lomaiviticins A 和 B、Rakicidin
B、Diazepinomicin、Tetrocarcin A以及最引人注目的烯二炔类
Calicheamicinγ1、Dynemicin A 等［6－7］.
近些年来由于抗药性问题日益严重，寻找具有新型作用机制的抗生素已迫在眉睫.
海洋小单孢菌属由于其分布广泛以及特殊生长环境（高盐、高压、低温、寡营养），
有可能产生结构新颖、活性广泛的抗菌活性物质.我国大连海域海岸线占辽宁省海
岸线总长度的73%［8］，蕴藏着丰富的海洋放线菌资源.2008年，矫文策等［8］
首次在大连地区海泥样品中分离到具有抗菌活性的小单孢菌种iaca.林灵
等［9］对大连老虎滩海域沉积物进行了生物多样性研究，并分离到11个科共15
属的放线菌，显示了我国大连海域放线菌资源的多样性.本实验室对大连新港、金
海岸海域以及丹东鸭绿江口沉积物海泥进行研究，共分离到318株海洋放线菌，
本研究拟对其中1株具有广谱抗菌活性的小单孢菌进行了分类鉴定，以期为进一
步开发海洋小单孢菌属放线菌提供一定的科学参考.
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 海泥样品 丹东鸭绿江口沉积物海泥样品13份，新港、金海岸海域沉积物海
泥样品6份.取样时，取水深20m以下的样品，置于灭菌塑料袋中，迅速带回实验
室置4℃保存备用.
1.1.2 培养基 分离培养基：淀粉－酪蛋白酸钠培养基（SC）：可溶性淀粉10g，
酪蛋白酸钠0.3g，KNO32g，K2HPO4·3H2O 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，
FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15g，以人造海水定容1 000mL，pH 7.0～7.4，
37μmg制霉菌素，25μmg重铬酸钾.纯化培养基及形态观察ISP系列培养基均参
考文献［2，10］，种子培养基及发酵培养基均参照文献［9］.以上培养基以蒸馏
水和人造海水各500mL定容，pH 7.0～7.4，121℃灭菌30min.
1.2 试验方法
1.2.1 放线菌的分离 海泥样品经预处理：终浓度1.5%苯酚处理30min，100℃加
热1min以及1.5%吐温80（500μg/mL AMP），27 ℃振荡2h后，稀释到浓度
为10－3、10－4、10－5稀释液.各吸取0.2mL稀释液涂布在含37μg/mL制霉
菌素以及25μg/mL重铬酸钾的SC平板上，每份样品3次重复.28℃恒温培养
30d，观察菌落生长情况.分离菌株在SC培养基上进行纯化，2%蛋白胨－80℃冻
干管保存.
1.2.2 形态观察和显微结构特征 采用插片培养法，28℃培养14d，观察菌株的基
内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态，依据文献［11－13］进行放线菌形态观察和
显微结构特征鉴定，排除链霉菌.
1.2.3 培养特征 主要采用国际规定的ISP系列培养基及营养琼脂培养基，28℃培养，
分别于7、14、21、28d进行观察，依据文献［11－13］进行鉴定.
1.2.4 生理生化特征鉴定
1.2.4.1 温度生长耐受试验 采用海水配置的Bennett琼脂培养基作为基础培养基，
分别在4、10、15、20、28、37、40、45℃条件下划线培养20d.
1.2.4.2 盐浓度耐受试验 菌株分别接种于NaCl浓度为 0%、3%、5%、7%、9%、
12% 的 Bennett液体培养基，28℃摇床培养.
1.2.4.3 pH耐受试验 采用人工海水配置的Bennett液体培养基和pH缓冲液（灭
菌）混合，用无菌的NaOH和HCl将混合液pH值分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、
8.0、pH 9.0及10.0，接种，28℃摇床培养.
1.2.4.4 碳氮源利用试验 不同碳氮源经乙醚灭菌后分别按0.1%和0.5%浓度加入普
戈二氏无碳源基础培养基以及氮源利用基础培养基.
1.2.4.5 酶学特性实验 参照文献测定明胶液化、淀粉水解、牛奶胨化、硝酸盐还原
等酶学特性以及H2S、黑色素代谢产物［11］.以上均培养20d，每5d观察1次.
1.2.5 16SrRNA基因序列分析和进化树的构建参考微波法［12］提取总DNA，
PCR扩增16S rRNA序列，测序结果输入GenBank数据库进行Blast比较，用
MEGA5软件构建Neighbor－Joining（N－J）树，并进行Bootstrap分析.
1.2.6 细胞化学组分分析 参照文献［11］进行细胞壁主要氨基酸以及全细胞水解
糖分析.
1.2.7 抗菌筛选试验 采用菌碟法［14］，以大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄
色葡萄球菌（Stephylococcus aureus）、番茄溃疡病菌（Clavibater
michiganensis）、尖刀镰孢菌（Fusarium oxysporum）、辣椒疫霉
（Phytophthora－copsici）以及本试验分离到的弯曲假单胞菌（Pseudomonas
geniculata）和枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）为指示菌进行抗菌活性测定.
2 结果与分析
2.1 放线菌的分离及其抗菌活性
在大连新港海域沉积物海泥样品中分离到1株抗菌活性较强的放线菌，编号为
MN10，其抗菌谱如图1所示.该菌具有拮抗革兰氏阳性菌的强活性，且对尖刀镰
孢菌、弯曲假单胞菌均有抑菌活性，但对大肠杆菌、番茄溃疡病菌、辣椒疫霉无抑
菌活性，对枯草芽孢杆菌的抑菌活性不稳定.
图1 放线菌MN10发酵液的抗菌活性Fig.1 Antimicrobial activity of
fermented broth from strain of actinomycete MN10
2.2 形态特征与显微结构特征
将放线菌接种于SC平板培养7d，观察菌落形态.由图2～3看出，该菌落成微黄
色，圆形，隆起.无气生菌丝，基内菌丝发达，无色素产生，并经传代后仍比较稳
定.
将放线菌MN10菌株接种至ISP2平板作插片培养，14d后取下插片，在扫描电
子显微镜下观察菌落形态（图4）.放线菌MN10基内菌丝体发达，分枝，有横隔，
菌丝连续不断裂，无气生菌丝，无孢子链和孢子囊；孢子呈球形，椭球形，表面光
滑，单个着生在短孢子梗上，无鞭毛，不游动.
2.3 培养特征
放线菌MN10在ISP2、ISP3、ISP5培养基上生长良好，在IS2、ISP3、ISP7以
及营养琼脂培养基上产生浅黄、浅棕色可溶性色素，如表1所示.
2.4 生理生化特性
图2 放线菌MN10菌落形态Fig.2 Colony morphology of actinomycete
MN10
图3 放线菌MN10菌落基底形态Fig.3 Colony substrate morphology
actinomycete MN10
表1 稀有放线菌MN10的培养特征Tab.1 Culture characteristics of strains
rare actinomycetes MN10＋＋＋：良好；＋＋：中等；＋：较少；28℃培养7d.
浅黄色燕麦粉琼脂（ISP3）橙褐色 ＋＋＋ 浅黄色无机盐淀粉琼脂（ISP4）橙色
＋＋ －甘油－天冬酰胺琼脂（ISP5）棕黑色 ＋＋＋ －蛋白胨－酵母提取物铁琼脂
（ISP6）浅黄 ＋ －酪氨酸琼脂（ISP7）深黄 ＋ 浅棕色营养琼脂 浅黄 ＋培养基
菌丝颜色 生长状况 可溶性色素酵母麦芽糖提取物琼脂（ISP2）橙褐色 ＋＋＋浅黄
色
图4 菌株MN10孢子的扫描电子显微镜图Fig.4 Scanning electron micrograph
of cells of strain MN10producing spores
放线菌MN10能降解淀粉、酪氨酸，使明胶液化，牛奶胨化，但不能还原硝酸盐，
不产生黑色素和硫化氢；能利用 D－甘露糖、L－阿拉伯糖、D－果糖、D－核糖、
蜜二糖、D－木糖、D－半乳糖、D－葡萄糖、棉子糖，对甘油利用较弱，不利用
乳糖、L－鼠李糖、水杨苷、D－甘露醇.以Bennett培养基为基础培养基进行温度、
pH以及盐耐受试验测定，结果显示，MN10在温度为15～40℃，pH为6～9，
NaCl浓度为0～5%范围内均能生长，其中，生长的最适温度为25～30℃，最适
NaCl浓度为3%，接近海洋环境盐浓度；在温度45℃以及NaCl浓度为7%的条
件不能生长，有别于小单孢菌种，如表2所示.
表2 稀有放线菌MN10与亲缘关系相近小单孢菌属菌种的生理生化特征Tab.2
Differential characteristics of strain MN10and related species of the genus
Micromonospora1：菌 株 MN10；2： JSM1－1T［2］；3：
spora DSM 43816T［15］；4：iaca DSM 43813T［15］；
5：is JCM 13248T［5］；6：a DSM 43026T［5］；＋：阳
性；－：阴性；ND：无数据；V：可变；W：较弱.所有菌株都能利用 D－葡萄糖、
D－棉子糖、D－半乳糖，不能利用D－甘露醇.菌种特征 菌种＋＋－＋＋＋1 2 3
4 5 6 碳源利用＋＋－－＋明胶液化 ＋ ＋ ND ND ND ND L－鼠李糖 － － ＋ －
W －淀粉水解 ＋ ＋ ＋ － ND V 甘油 W W － － ＋ －硝酸盐还原 － － － ＋
ND － 水杨苷 － － ND － ＋ －牛奶胨化 ＋ ＋ ND ND ND ND 乳糖 － － －
－ ＋ ＋酪氨酸分解 ＋ ＋ － ＋ ND － L－阿拉伯糖 ＋ ＋ ＋ W ＋ W NaCl% 5 7
2 4 3 5 D－果糖 ＋ ＋ － ＋ ＋ W 45℃ － ＋ － － － － D－核糖 ＋ ＋ － － ＋
－黑色素和H2S － ND － ND － ND 蜜二糖 ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋PH 6 ＋ ＋ ＋ ＋
＋ － D－木糖1 2 3 4 5 6可溶色素 浅黄 浅黄 － ND － ND D－甘露糖
2.5 细胞壁化学组成分析
经全细胞TLC以及纯细胞壁水解分析表明［11］，菌株MN10细胞壁氨基酸主要
组成为meso－DAP、甘氨酸，细胞壁型为Ⅱ型；全细胞水解液检测到葡萄糖、木
糖、甘露糖、核糖、半乳糖、阿拉伯糖，糖型为D型.
2.6 基于16SrRNA的系统发育分析
放线菌MN10的16SrRNA经PCR扩增并测序，获得基因序列，GenBank序列
号为JX193794.将所测序列与GenBank Datebase相关菌株进行16S rRNA
Blast比对，并建立系统发育树，结果如图5所示.
图5 基于16SrRNA基因序列构建的小单孢菌种MN10的系统发育树Fig.5
Phylogenetic tree of species MN10of Micromonospora based on 16SrRNA
gene sequences
2.7 分类鉴定结果
通过形态和培养特征、生理生化特征以及细胞壁化学组成分析对放线菌MN10进
行分类研究，初步确定MN10菌株为小单孢菌科小单孢菌属；16S rRNA基因序
列分析显示，MN10菌株（JX193794）与 （99.652% ）、
iaca（99.449%）、is（99.035%）、spora
（99.006%）同源性均在99%以上，确定菌株MN10 为 ；
且 与 （AB196712）形成1个支系，亲缘关系最近，初步鉴定菌株
MN10为小单孢菌种Micromonospora marina .除最高生长温度以及
NaCl耐受盐度不同之外，MN10菌株的生理生化特性与Micromonospora
marina基本一致..
3 讨论
大连海域存在丰富的海洋放线菌资源，近年来分子生物学方法已经证明绝大部分的
海洋放线菌仍然是难以培养的.海洋小单孢菌属由于其生长周期较长，易受真菌、
细菌、杆菌污染，因此出菌率较链霉菌低.Nonomura和Ohara等研究发现120℃
左右干热处理1h对小单孢菌的孢子影响不大，但可以显著降低链霉菌和丝状细菌
的干扰［16］.Hayakawa等研究表明经1.5%的苯酚、葡萄糖酸洗必泰（CG，
0.01%）和苄索氯铵（BC，0.01%）30℃处理30min可杀死链霉菌孢子、杆菌以
及假单胞菌的营养细胞，而小单孢菌属孢子却表现出一定的耐受性［17］.本试验
预处理采用121℃高温加热、1.5%苯酚处理以及吐温80摇床培养，显著降低了链
霉菌、细菌、真菌以及杆菌的污染.吐温80作为一种表面活性剂，有利于孢子分散
在稀释液中，提高了小单孢菌的出菌率.分离到的菌株Micromonospora marina
MN10传代培养稳定，基本解决了该菌种的纯培养问题，为进一步开发海洋小单
孢菌属奠定了一定基础.该菌具有拮抗革兰氏阳性菌的强活性，且对尖刀镰孢菌、
弯曲假单胞菌均有抑菌活性，具有广谱抗菌活性，但对大肠杆菌、番茄溃疡病菌、
辣椒疫霉无抑菌活性，且对枯草芽孢杆菌的抗菌活性不稳定，其抑菌机制待进一步
研究.Hirsch等报道小单孢菌的抑菌活性，不仅仅是通过合成抗真菌和抗微生物的
活性成分，还通过激活防御途径的key基因最终抑制病原菌的生长［6］.
相比于链霉菌，无论从抗生素的产量及种类来看，小单孢菌属都是仅次于链霉菌属
的产生新型活性物质的重要来源.但海洋来源的小单孢菌属出菌率较低，很难在实
验室中实现其次生代谢产物的生产，将其产生次生代谢产物的基因簇转化到已知工
程菌种进行异源表达成为目前研究的热点.Thiocoraline是由小单孢菌科中发现的
一种环硫代缩酚酸肽类的酶抑制剂，它可显著抑制DNA及RNA的合成，对革兰
氏阳性菌株具有强抑菌活性［18］.Lombó等成功实现了海洋来源的小单孢菌
Micromonospora 2－092 和 Micromonospora 1的
Thiocoraline基因簇在生物工程菌白色链霉菌和变铅青链霉
菌n中的异源表达，为实现海洋放线菌次生代谢产物的工业
化大生产奠定了基础［7］.小单孢菌属不仅是微生物抗生素的主要来源，而且在土
壤生态学，生物降解、生物防治和促进植物生长方面也起着重要作用.目前，小单
孢菌属的研究已经很深入，但对小单孢菌生态学习性以及在不同生态环境下菌种之
间特征基因型有待进一步研究.
参考文献
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2024年3月30日发(作者：闭如容)
1株具有广谱抗菌活性的海洋小单孢菌MN10的分离及鉴定
张晓敏;刘秋;刘限;王皓;闫建芳;齐小辉;白湜
【摘 要】采用稀释平板法,从辽宁省大连海域海泥中分离筛选具有抑菌活性的稀有
放线菌小单孢菌属菌种,并依据多相分类方法确定该菌的分类地位.结果表明:分离得
到1株具有广谱抗菌活性的小单孢菌种；16S rRNA基因的系统发育分析结果表明,
该菌与Microromonospora marine (99.652％)亲缘关系最近,且生理生化
结果与Micromonospora marine 相一致；根据形态特征、培养特征、化
学分类特征以及16S rRNA基因序列系统发育分析,确定该菌为Micromonospora
marina ;该菌对金黄色葡萄球菌、弯曲假单孢菌、枯草芽孢杆菌、尖刀镰孢
菌均具有抑菌活性.
【期刊名称】《甘肃农业大学学报》
【年(卷),期】2013(048)002
【总页数】6页(P99-104)
【关键词】小单孢菌;多相分类;抗菌活性;鉴定
【作 者】张晓敏;刘秋;刘限;王皓;闫建芳;齐小辉;白湜
【作者单位】沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110000;大连民族学院生
命科学学院,辽宁大连116600;沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110000;
沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳 110000;大连民族学院生命科学学院,辽
宁大连116600;大连民族学院生命科学学院,辽宁大连116600;沈阳农业大学生物
科学技术学院,辽宁沈阳 110000
【正文语种】中 文
【中图分类】Q93-331
小单孢菌属最初以形态特征命名［1］，具有发达分枝的基底菌丝，无气生菌丝，
孢子单生，无鞭毛，不游动.目前为止，小单孢菌属已报道的菌种有40个［2］.小
单孢菌属分布广泛，在土壤、水、海砂中均有分布，特别是在固氮植物根瘤部的发
生率为100%［3－5］.由小单孢菌属产生的抗生素庆大霉素、紫苏霉素、福堤霉
素A在临床上广泛应用，是仅次于链霉菌属的第二大抗生素来源［3］.此外，小
单孢菌属也是抗肿瘤活性物质的主要来源，包括lomaiviticins A 和 B、Rakicidin
B、Diazepinomicin、Tetrocarcin A以及最引人注目的烯二炔类
Calicheamicinγ1、Dynemicin A 等［6－7］.
近些年来由于抗药性问题日益严重，寻找具有新型作用机制的抗生素已迫在眉睫.
海洋小单孢菌属由于其分布广泛以及特殊生长环境（高盐、高压、低温、寡营养），
有可能产生结构新颖、活性广泛的抗菌活性物质.我国大连海域海岸线占辽宁省海
岸线总长度的73%［8］，蕴藏着丰富的海洋放线菌资源.2008年，矫文策等［8］
首次在大连地区海泥样品中分离到具有抗菌活性的小单孢菌种iaca.林灵
等［9］对大连老虎滩海域沉积物进行了生物多样性研究，并分离到11个科共15
属的放线菌，显示了我国大连海域放线菌资源的多样性.本实验室对大连新港、金
海岸海域以及丹东鸭绿江口沉积物海泥进行研究，共分离到318株海洋放线菌，
本研究拟对其中1株具有广谱抗菌活性的小单孢菌进行了分类鉴定，以期为进一
步开发海洋小单孢菌属放线菌提供一定的科学参考.
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 海泥样品 丹东鸭绿江口沉积物海泥样品13份，新港、金海岸海域沉积物海
泥样品6份.取样时，取水深20m以下的样品，置于灭菌塑料袋中，迅速带回实验
室置4℃保存备用.
1.1.2 培养基 分离培养基：淀粉－酪蛋白酸钠培养基（SC）：可溶性淀粉10g，
酪蛋白酸钠0.3g，KNO32g，K2HPO4·3H2O 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，
FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15g，以人造海水定容1 000mL，pH 7.0～7.4，
37μmg制霉菌素，25μmg重铬酸钾.纯化培养基及形态观察ISP系列培养基均参
考文献［2，10］，种子培养基及发酵培养基均参照文献［9］.以上培养基以蒸馏
水和人造海水各500mL定容，pH 7.0～7.4，121℃灭菌30min.
1.2 试验方法
1.2.1 放线菌的分离 海泥样品经预处理：终浓度1.5%苯酚处理30min，100℃加
热1min以及1.5%吐温80（500μg/mL AMP），27 ℃振荡2h后，稀释到浓度
为10－3、10－4、10－5稀释液.各吸取0.2mL稀释液涂布在含37μg/mL制霉
菌素以及25μg/mL重铬酸钾的SC平板上，每份样品3次重复.28℃恒温培养
30d，观察菌落生长情况.分离菌株在SC培养基上进行纯化，2%蛋白胨－80℃冻
干管保存.
1.2.2 形态观察和显微结构特征 采用插片培养法，28℃培养14d，观察菌株的基
内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态，依据文献［11－13］进行放线菌形态观察和
显微结构特征鉴定，排除链霉菌.
1.2.3 培养特征 主要采用国际规定的ISP系列培养基及营养琼脂培养基，28℃培养，
分别于7、14、21、28d进行观察，依据文献［11－13］进行鉴定.
1.2.4 生理生化特征鉴定
1.2.4.1 温度生长耐受试验 采用海水配置的Bennett琼脂培养基作为基础培养基，
分别在4、10、15、20、28、37、40、45℃条件下划线培养20d.
1.2.4.2 盐浓度耐受试验 菌株分别接种于NaCl浓度为 0%、3%、5%、7%、9%、
12% 的 Bennett液体培养基，28℃摇床培养.
1.2.4.3 pH耐受试验 采用人工海水配置的Bennett液体培养基和pH缓冲液（灭
菌）混合，用无菌的NaOH和HCl将混合液pH值分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、
8.0、pH 9.0及10.0，接种，28℃摇床培养.
1.2.4.4 碳氮源利用试验 不同碳氮源经乙醚灭菌后分别按0.1%和0.5%浓度加入普
戈二氏无碳源基础培养基以及氮源利用基础培养基.
1.2.4.5 酶学特性实验 参照文献测定明胶液化、淀粉水解、牛奶胨化、硝酸盐还原
等酶学特性以及H2S、黑色素代谢产物［11］.以上均培养20d，每5d观察1次.
1.2.5 16SrRNA基因序列分析和进化树的构建参考微波法［12］提取总DNA，
PCR扩增16S rRNA序列，测序结果输入GenBank数据库进行Blast比较，用
MEGA5软件构建Neighbor－Joining（N－J）树，并进行Bootstrap分析.
1.2.6 细胞化学组分分析 参照文献［11］进行细胞壁主要氨基酸以及全细胞水解
糖分析.
1.2.7 抗菌筛选试验 采用菌碟法［14］，以大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄
色葡萄球菌（Stephylococcus aureus）、番茄溃疡病菌（Clavibater
michiganensis）、尖刀镰孢菌（Fusarium oxysporum）、辣椒疫霉
（Phytophthora－copsici）以及本试验分离到的弯曲假单胞菌（Pseudomonas
geniculata）和枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）为指示菌进行抗菌活性测定.
2 结果与分析
2.1 放线菌的分离及其抗菌活性
在大连新港海域沉积物海泥样品中分离到1株抗菌活性较强的放线菌，编号为
MN10，其抗菌谱如图1所示.该菌具有拮抗革兰氏阳性菌的强活性，且对尖刀镰
孢菌、弯曲假单胞菌均有抑菌活性，但对大肠杆菌、番茄溃疡病菌、辣椒疫霉无抑
菌活性，对枯草芽孢杆菌的抑菌活性不稳定.
图1 放线菌MN10发酵液的抗菌活性Fig.1 Antimicrobial activity of
fermented broth from strain of actinomycete MN10
2.2 形态特征与显微结构特征
将放线菌接种于SC平板培养7d，观察菌落形态.由图2～3看出，该菌落成微黄
色，圆形，隆起.无气生菌丝，基内菌丝发达，无色素产生，并经传代后仍比较稳
定.
将放线菌MN10菌株接种至ISP2平板作插片培养，14d后取下插片，在扫描电
子显微镜下观察菌落形态（图4）.放线菌MN10基内菌丝体发达，分枝，有横隔，
菌丝连续不断裂，无气生菌丝，无孢子链和孢子囊；孢子呈球形，椭球形，表面光
滑，单个着生在短孢子梗上，无鞭毛，不游动.
2.3 培养特征
放线菌MN10在ISP2、ISP3、ISP5培养基上生长良好，在IS2、ISP3、ISP7以
及营养琼脂培养基上产生浅黄、浅棕色可溶性色素，如表1所示.
2.4 生理生化特性
图2 放线菌MN10菌落形态Fig.2 Colony morphology of actinomycete
MN10
图3 放线菌MN10菌落基底形态Fig.3 Colony substrate morphology
actinomycete MN10
表1 稀有放线菌MN10的培养特征Tab.1 Culture characteristics of strains
rare actinomycetes MN10＋＋＋：良好；＋＋：中等；＋：较少；28℃培养7d.
浅黄色燕麦粉琼脂（ISP3）橙褐色 ＋＋＋ 浅黄色无机盐淀粉琼脂（ISP4）橙色
＋＋ －甘油－天冬酰胺琼脂（ISP5）棕黑色 ＋＋＋ －蛋白胨－酵母提取物铁琼脂
（ISP6）浅黄 ＋ －酪氨酸琼脂（ISP7）深黄 ＋ 浅棕色营养琼脂 浅黄 ＋培养基
菌丝颜色 生长状况 可溶性色素酵母麦芽糖提取物琼脂（ISP2）橙褐色 ＋＋＋浅黄
色
图4 菌株MN10孢子的扫描电子显微镜图Fig.4 Scanning electron micrograph
of cells of strain MN10producing spores
放线菌MN10能降解淀粉、酪氨酸，使明胶液化，牛奶胨化，但不能还原硝酸盐，
不产生黑色素和硫化氢；能利用 D－甘露糖、L－阿拉伯糖、D－果糖、D－核糖、
蜜二糖、D－木糖、D－半乳糖、D－葡萄糖、棉子糖，对甘油利用较弱，不利用
乳糖、L－鼠李糖、水杨苷、D－甘露醇.以Bennett培养基为基础培养基进行温度、
pH以及盐耐受试验测定，结果显示，MN10在温度为15～40℃，pH为6～9，
NaCl浓度为0～5%范围内均能生长，其中，生长的最适温度为25～30℃，最适
NaCl浓度为3%，接近海洋环境盐浓度；在温度45℃以及NaCl浓度为7%的条
件不能生长，有别于小单孢菌种，如表2所示.
表2 稀有放线菌MN10与亲缘关系相近小单孢菌属菌种的生理生化特征Tab.2
Differential characteristics of strain MN10and related species of the genus
Micromonospora1：菌 株 MN10；2： JSM1－1T［2］；3：
spora DSM 43816T［15］；4：iaca DSM 43813T［15］；
5：is JCM 13248T［5］；6：a DSM 43026T［5］；＋：阳
性；－：阴性；ND：无数据；V：可变；W：较弱.所有菌株都能利用 D－葡萄糖、
D－棉子糖、D－半乳糖，不能利用D－甘露醇.菌种特征 菌种＋＋－＋＋＋1 2 3
4 5 6 碳源利用＋＋－－＋明胶液化 ＋ ＋ ND ND ND ND L－鼠李糖 － － ＋ －
W －淀粉水解 ＋ ＋ ＋ － ND V 甘油 W W － － ＋ －硝酸盐还原 － － － ＋
ND － 水杨苷 － － ND － ＋ －牛奶胨化 ＋ ＋ ND ND ND ND 乳糖 － － －
－ ＋ ＋酪氨酸分解 ＋ ＋ － ＋ ND － L－阿拉伯糖 ＋ ＋ ＋ W ＋ W NaCl% 5 7
2 4 3 5 D－果糖 ＋ ＋ － ＋ ＋ W 45℃ － ＋ － － － － D－核糖 ＋ ＋ － － ＋
－黑色素和H2S － ND － ND － ND 蜜二糖 ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋PH 6 ＋ ＋ ＋ ＋
＋ － D－木糖1 2 3 4 5 6可溶色素 浅黄 浅黄 － ND － ND D－甘露糖
2.5 细胞壁化学组成分析
经全细胞TLC以及纯细胞壁水解分析表明［11］，菌株MN10细胞壁氨基酸主要
组成为meso－DAP、甘氨酸，细胞壁型为Ⅱ型；全细胞水解液检测到葡萄糖、木
糖、甘露糖、核糖、半乳糖、阿拉伯糖，糖型为D型.
2.6 基于16SrRNA的系统发育分析
放线菌MN10的16SrRNA经PCR扩增并测序，获得基因序列，GenBank序列
号为JX193794.将所测序列与GenBank Datebase相关菌株进行16S rRNA
Blast比对，并建立系统发育树，结果如图5所示.
图5 基于16SrRNA基因序列构建的小单孢菌种MN10的系统发育树Fig.5
Phylogenetic tree of species MN10of Micromonospora based on 16SrRNA
gene sequences
2.7 分类鉴定结果
通过形态和培养特征、生理生化特征以及细胞壁化学组成分析对放线菌MN10进
行分类研究，初步确定MN10菌株为小单孢菌科小单孢菌属；16S rRNA基因序
列分析显示，MN10菌株（JX193794）与 （99.652% ）、
iaca（99.449%）、is（99.035%）、spora
（99.006%）同源性均在99%以上，确定菌株MN10 为 ；
且 与 （AB196712）形成1个支系，亲缘关系最近，初步鉴定菌株
MN10为小单孢菌种Micromonospora marina .除最高生长温度以及
NaCl耐受盐度不同之外，MN10菌株的生理生化特性与Micromonospora
marina基本一致..
3 讨论
大连海域存在丰富的海洋放线菌资源，近年来分子生物学方法已经证明绝大部分的
海洋放线菌仍然是难以培养的.海洋小单孢菌属由于其生长周期较长，易受真菌、
细菌、杆菌污染，因此出菌率较链霉菌低.Nonomura和Ohara等研究发现120℃
左右干热处理1h对小单孢菌的孢子影响不大，但可以显著降低链霉菌和丝状细菌
的干扰［16］.Hayakawa等研究表明经1.5%的苯酚、葡萄糖酸洗必泰（CG，
0.01%）和苄索氯铵（BC，0.01%）30℃处理30min可杀死链霉菌孢子、杆菌以
及假单胞菌的营养细胞，而小单孢菌属孢子却表现出一定的耐受性［17］.本试验
预处理采用121℃高温加热、1.5%苯酚处理以及吐温80摇床培养，显著降低了链
霉菌、细菌、真菌以及杆菌的污染.吐温80作为一种表面活性剂，有利于孢子分散
在稀释液中，提高了小单孢菌的出菌率.分离到的菌株Micromonospora marina
MN10传代培养稳定，基本解决了该菌种的纯培养问题，为进一步开发海洋小单
孢菌属奠定了一定基础.该菌具有拮抗革兰氏阳性菌的强活性，且对尖刀镰孢菌、
弯曲假单胞菌均有抑菌活性，具有广谱抗菌活性，但对大肠杆菌、番茄溃疡病菌、
辣椒疫霉无抑菌活性，且对枯草芽孢杆菌的抗菌活性不稳定，其抑菌机制待进一步
研究.Hirsch等报道小单孢菌的抑菌活性，不仅仅是通过合成抗真菌和抗微生物的
活性成分，还通过激活防御途径的key基因最终抑制病原菌的生长［6］.
相比于链霉菌，无论从抗生素的产量及种类来看，小单孢菌属都是仅次于链霉菌属
的产生新型活性物质的重要来源.但海洋来源的小单孢菌属出菌率较低，很难在实
验室中实现其次生代谢产物的生产，将其产生次生代谢产物的基因簇转化到已知工
程菌种进行异源表达成为目前研究的热点.Thiocoraline是由小单孢菌科中发现的
一种环硫代缩酚酸肽类的酶抑制剂，它可显著抑制DNA及RNA的合成，对革兰
氏阳性菌株具有强抑菌活性［18］.Lombó等成功实现了海洋来源的小单孢菌
Micromonospora 2－092 和 Micromonospora 1的
Thiocoraline基因簇在生物工程菌白色链霉菌和变铅青链霉
菌n中的异源表达，为实现海洋放线菌次生代谢产物的工业
化大生产奠定了基础［7］.小单孢菌属不仅是微生物抗生素的主要来源，而且在土
壤生态学，生物降解、生物防治和促进植物生长方面也起着重要作用.目前，小单
孢菌属的研究已经很深入，但对小单孢菌生态学习性以及在不同生态环境下菌种之
间特征基因型有待进一步研究.
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