2024年5月6日发(作者：倪妍晨)
微生物学杂志
2422
年
12
月第
44
卷第
7
期
JOURNAL
OF
MICROBITLOGY
Dec.
2422
VcP
24
Nw
9
53
硫酸镁对枯草芽胞杆菌发酵的影响
张丽霞
7
杨帆
4
娄恺^
,
王琦
7
*
*
(7
新疆天物生态科技股份有限公司,新疆乌鲁木齐
530009
；
21
中农绿康(北京)生物技术有限公司
4
匕京
102101
；
5
•新疆农业科学院微生物应用研究所,新疆乌鲁木齐
532091
；
41
中国农业大学植物病理学系
，
北京
/9195
)
摘
要
为明确工业配方中不同
MgSO/
添加量对枯草芽胞杆菌
B227
发酵过程及菌液保存的影响
，采用单因
素法设置
5
个
MgSO
4
添加量梯度(质量分数
，
下同
)(
4.
13%
、
4.24%
、
4.
46%
、
4.
87%
、
1.
74%
)
。
分别记录不
同梯度
MgSO
4
处理的发酵液灭菌前后
pH
值
，
以及发酵过程中的菌体形态的变化
，
统计发酵结束后细菌的发
酵周期
、活菌数和芽胞率
，
测量发酵结束后发酵液
pH
以及残糖和残氮含量
。
实验表明
,
MgSO/
的不同添加量
对菌株
B227
发酵及菌液保存均有显著影响
。添加量为
4.37%
和
).64%
处理组灭菌后培养基的
pH
较灭菌前
升高
，
培养基由中性变为弱碱性
。
接种后
19
h
取样观察，
菌体明显变形
，
视野內菌数较少
，
且随着
MgSO/
添加
量的增加发酵液活菌数下降
，
残糖和残氮升高
，
不利于保存
。
MgSO/
相对合适的添加量为
4.
15%
4.94%
和
4.
46%
，
三种
MgSO
0
添加量的发酵液活菌数
、
残氮含量无显著差异
；
MgSO
0
添加量为
4.
24%
时菌株
B227
芽胞
率最高为
891
33%
，
而
MgSO
0
添加量为
4113%
和
4.
26%
时
，
芽胞率分别为
84%
和
82.
67%
；
4.
26%
MgSO
0
添加
量可加速菌株
B227
发酵进程
，
发酵周期较其他两个处理缩短
45.8%
。
为提高菌株
B227
的发酵水平
，
降低其
生产成本
，
综合考虑
MgSO
0
的添加量以
4.46%
为宜
。
研究结果不仅为实验室菌株
B227
的发酵优化提供参
考
，
还为培养基的优化拓宽了思路
。
关键词
芽胞杆菌；
硫酸镁
；发酵调控
；
产抱
中图分类号
Q932.67
文献标识码
A
文章编号
1045
-742)(2424)46
-0453
-46
do/14.3969/j.
issn.
1245
-
7427
2424.46.008
Effect
of
Magnesium
Sulfate
on
Fermentation
of
Bacillus
subtilis
ZHANG
Li-xia
7
,
YANG
Fan
2
,
LOU
Kai
5
,
WANG
Qi
3
(
0
Xggang
Tiannu
Ecolopicai
TecUoolopy
C
o
.
Ltd
,
Urumql
536000
；
2.
Sinr
Green
Agp-BiofcU
C
o
.
Ltd
,
Bepinn
162101
；
3.
Institute
of
Microbiology
,
Xggcmg
Acagemy
yf
Agpcu,ltu,ral
Sciences
,
Uunqi
530091
；
4.
DepaPmeni
of
PU
u
Patdology
,
Chinn
Agpcu,ltnral
Universitd
,
Bepinn
190193
)
Abstract
The
puryose
of
this
stupp
was
to
stupp
the
effect
of
di/erext
maguesium
sulfate
coxtext
ic
indusWial
formula
ox
the
fermextakox
process
and
the
puseuatiox
of
Bacillus
subtills
B221.
Five
coxcexWatiox
gradiexts
of
maguesium
sulfate
(4.
15%
,
4.
02%
,
4.
26%
,
4.
57%
,7
70%
(
were
set
bp
single
Sactcr
methwU
The
pH
value
before
and
k-
Wr
stefPzatiox
of
the
fermextakox
li/uib
treated
with
di/ereut
coxcexWatioxs
of
maguesium
sulfate
was
recorheh
re-
spectivep
,
morphologp
of
the
bacteria
ic
the
fermextakox
process
was
obseueh
,
the
fermextakox
cyclo
,
the
uumber
of
viadlc
bacteria
and
the
sporulakox
rate
were
connteh
,
and
the
pH
value
,
the
coxtext
of
residual
supar
and
ni/ogex
ic
the
fermextakox
li/uib
after
fermextakox
were
measuuX.
The
results
sPoweh
that
the
addiPox
of
maguesium
sulfate
had
significaut
ehect
ox
the
fermextatiox
and
puseuatiox
of
sWaic
B241.
The
pH
of
the
treateh
gunp
with
4.
87%
and
7
77%
maguesium
sulfate
iucreaseh
after
stefPzatiox
,
which
chanaeP
the
mehium
exviroxmext
from
pentrai
to
基金项目
：
国家重点研发计划资助项目
(
2019YFD/0250
)
；
2019
自治区重点技术创新专项新疆煤气化炉渣的资源化利用综合研
究项目
(
新工信科技
[
2019
]
26
)
作者简介:张丽霞
女
,
正高级工程师
,
博士
。
主要从事植物病理学研究
。
Tel
：
619-61193375-0019
,
:
Zhan/imad223@
103.
1om
*
通讯作者
。
娄恺
,
男
，
教授
,
博士生导师
。
研究方向为特殊生境微生物
。
Tel
：
0991C19060,E-maP
：
jwUai@maP.
Winghua.
edu.
co
王琦
男
，
教授
,博士生导师
。
研究方向为植物病理学
。
Tel
：
,E-maP
：
wangqi@cau.
edu.
co
收稿日期
：
2020C5C7
54
微生物学杂志
40
卷
weaS
alPaSne.
Sampling
and
observation
12
hours
Ster
inochWSon
,
the
cells
were
oPviously
PeformeV
,
and
the
num
ber
ol
bacteVo
in
the
fielP
was
small
,
and
with
the
increase
ol
magnesium
sulfate,
the
number
ol
viabW
bacteVo
in
the
fermenWPon
broth
PecreaseV
,
and
the
residual
su
/
s
and
nitrogen
increaseV
,
which
was
not
conducive
V
preservation.
The
ahdiPon
of
0.
13%
,
0.
90%
and
0.
47%
was
a
relahvely
appropVaW
amount
ol
magnesium
sulfate
,
and
there
was
no
significant
dikerence
in
the
number
ol
viahlo
bacteVo
and
the
content
ol
residual
nitrogen
in
the
fermenVSon
lipuid
ol
the
three
gyups
；
the
highest
sporuWSon
rate
ol
strain
B201
was
89. 33%
m
the
0.
90%
addition
group
,
80%
and
82.
67%
in
the
0.
18%
and
0.46%
ahdiPon
gyup
,
respectively
；
the
fermenVSon
process
ol
strain
B201
was
acceler-
awV
in
the
0.46%
ahdiPon
gyup
,
and the
fermenVSon
cycle
was
45.8%
shoDer
than
the
other
two
NeatwenV.
Con
sidering
compyhensiveW
,
in
orOer
V
improve
the
fermenVUon
level
ol
strain
B201
and
reVuce
its
probuction
cost,the
ahdiPon
ol
magnesium
suWate
at
0.46%
was
suitahW.
This
swUp
not
only
laid
a
founPaUon
for
the
fermenWPon
opP-
mization
ol
the
WhoraVy
strain
B201
,
but
aWo
byaPenea
the
thinking
for
the
opPmizaSon
ol
the
ceWure
meVium.
KeyworVs
Bacillus
subtilU
；
maynesium
sulphate
；
fermenVSon
reguWSon
；
syoruWPon
以芽胞杆菌及其代谢产物为核心的生防制剂
的使用在提升农作物品质
,
增加产量
,
减少化肥农
°C
湿热灭菌
32
min
；
②
发酵培养基:淀粉
47.97
,
酵母粉
11.92
,
蛋白胨
15.78,CaCO
9
5.0
,
K
2
HPO
5
3.
33
,
MnPO
5
2.
017
,
葡萄糖
15.67
,
KCi
/
11
,
药的使用方面做出了重要的贡献⑴
,
尤其在防治
植物病原真菌引起的各种病害方面效果显著⑵
,
枯草芽胞杆菌普遍具有安全
、
繁殖快
、
抗逆性
MgSO
。
浓度待调整
,
2
日
7,118
C
湿热灭菌
32
min
。
装液量
470
mL/2
L
,
接种量为培养基装液量的
16%
（
体积分数、
。
1.1.3
主要仪器及设备
生化培养箱
（
DHP-
强⑶
、
易于定殖等优势
，
研究发现枯草芽胞杆菌能
够分泌抗生素
、
抗菌蛋白
、
酶或多肽等活性物
质
”
7
］,防治植物病害的同时促进植物生长
。
芽胞
9272,
上海一恒科技有限公司
）
;
恒温振荡摇床
杆菌的发酵培养是其走向生产应用的第一步
，
也
是最重要的一步
。
在培养基优化的过程中发现
（
DHZ-DA
,
江苏省太仓市豪成实验仪器制造有限
公司
）
；
紫外-可见分光光度计
（
Lah
Tech
UV
BLUE
STAR
B,
北京莱伯泰科仪器有限公司
）
；
分析天平
MgSO
5
的添加量对枯草芽胞杆菌
B221
的发酵过
程有着显著的影响
。
镁离子对芽胞杆菌发酵产抱
（
METTLER
TOLEDO
AL167
,
梅特勒-托利多仪器
的积极作用已有不少报道,金华等⑺发现镁离子
（
上海
）
有限公司
）
；
生物显微镜
（
OLYMPUS
CX22）
；
电热恒温水浴箱
（
HW
-
SY21-K
,
北京市
对丁酸梭状芽胞杆菌
ZC2
芽胞的形成具有显著
的促进作用
，
林陈强等
［
2
］
报道培养基中添加适量
的镁离子对芽胞杆菌
CHB221
的菌体生长和芽胞
形成有显著影响
。
目前培养基的优化多以发酵周
长风仪器仪表公司
、
；
pH
计
（SaDoDnsPBW2
,
赛多
利斯科学仪器
（
北京
）
有限公司
、
。
1.9
方法
1.9.1
期
、
活菌数以及芽胞率为主要衡量指标
®
S1
］
，
但是
在生产上芽胞杆菌的发酵对后续微生物产品的加
工以及储存起着决定性的作用
［
I4
］
o
本研究将在
保留传统指标的前提下
，
结合发酵液中残糖残氮
MgSO
5
添加量设置
根据预实验设置
5
个MgSO
5
添加量梯度
（
质量分数
，下同
）
，
分别为
2.
18%
D.
24%
D.
47%
D.
87%
、
1
.
67%
添加量
。
1.6.6
发酵周期
、
活菌数和芽胞率统计将枯草
含量等指标综合选择适用于菌株
B221
发酵生产
芽胞杆菌
B221
甘油菌接种于固体活化培养基上,
32
C
培养待单菌落出现
。
挑取单菌落于种子培
的
MgSO
5
添加量
。
1
材料与方法
1.1
材料
养基中
,32
C
132
r/min
培养
16
h,
以
16%
的接种
量接种至发酵培养基中
,32
C
182
r/min
培养
，
不
定期涂片观察
,
直到发酵结束
,
从接种到完成产抱
为一个发酵周期
。
发酵结束后
，
取发酵液采用涂
平板计数方法进行活菌计数
，
采用计数器进行芽
1.1.1
供试菌株
枯草芽胞杆菌
（
Bacillss
subtl-
U
）
B221
,
由中国农业大学分离保藏
。
1.1.0
培养基
（
g/L
）
①
种子培养基:
NaC15,
牛
肉膏
3,
蛋白胨
7,
pH
7,
装液量
590
m-2
-161
胞率统计,每个处理统计
3
个视野
。
1.2.1
发酵液灭菌前后
pH
变化
配置好培养
2
期
张丽霞等:硫酸镁对枯草芽胞杆菌发酵的影响
55
基
，
以
pH
试纸为参考用
NaOH
溶液调节培养基
pH
至中性后
，
用
pH
计进行测量
。
装液量
220
mL/500
mL,
灭菌后检测培养基
pH
o
1-2.2
菌体形态变化
通过预实验
，
初步判断约
2
结果与分析
2.
4
MgSO
4
添加量对菌株
B221
发酵周期
、
活菌
数
、
芽胞率的影响
59
h
结束发酵
，
同时为减小中途取样对发酵过程
造成的影响
，
设置
6
h
为取样节点
，
用移液枪取
2
mL
发酵液用于
pH
检测
。
在完成
pH
测量后
，
涂
由表
1
可知
，
培养基中
MgSO
5
的添加量对枯草
芽胞杆菌
B221
发酵周期
、
活菌数及芽胞率具显著
影响
。
随着
MgSO
5
添加量的增加
，
活菌数逐渐降
片观察并拍照
。
1.2.6
发酵液
pH
、
残糖和残氮的测定发酵结
低
,MgSO
5
添加量为
2.
13%
时活菌数为
111.
67
x
U
9
cfu/mL,1.67%
时活菌数为
62
x
U
9
cfn/mL
。
发
束后测量发酵液的
pH
值
。
DNS
法检测残糖发酵
液还原糖含量
，
检测用样
2
mL
；
凯氏定氮法检测
酵周期和芽胞率随着
MgSO
5
添加量的增加先升后
降
,MgSO
5
添加量为
2.
47%
时发酵周期最短为
22
发酵液氨基氮含量
，
检测用样
2
mL
o
1.2.2
数据处理与作图文中数据分析软件为
SPSS
22.
2
,
作图软件为
Grayppae
PVsm
8。
h,
其他处理发酵周期相同为
45
y,2.27%
时
，
芽胞
率为
30.13%
，
与
2.18%
时相比无显著差异,但显著
高于
2.
46%
、
2.
87%
和
/
67%
的处理
。
表
1
不同
MgSO
添加量培养基发酵基本情况
Tahle
1
Basic
situatiou
of
meVium
fermeatatVu
with
Pifereat
mapaesium
sulfate
ahditiou
MgS0
4
添加量
/%
。
指标
发酵周期
/h
活菌数
/
X
12
4
芽胞率
/%
2.
11
2.
4
2.422.17
1.27
48
45
111.67
±8.
80v
45
120
±
11.21a
22
01.
59
±14.
Hah
80.67
±2.
33b
48
84.67
±1.67
ah
68±2252b
4
±
0.52b
89.33
±0.6v
76.33
±0.23
bo
70.67
±0.
10c
注:表中同一行数据后不同小写字母表示在
5%
水平上差异显著
,
下表同
2.3
培养基灭菌前后
pH
值变化
基的
pH
存在约
7%
的误差
。
添加
2.13%
、
2.27%
、
2.46%MgSO
5
的培养基灭菌后
pH
下降,
而添加
2.
77%
和
1.67%
MgSO
5
的培养基灭菌后
pH
明显上升
，
随着
MgSO
5
添加量的增加灭菌后
的培养基
pH
逐渐升高
。
本次实验在使用
NaOH
调节
pH
的过程中
，
由于大量添加了
2.
77%
和
1.77%
“
£-0
5,
使
MgSO
5
与NaOH
反应生成片状
Mg(OH
)
0
沉淀
，
剧烈搅拌后
，
沉淀均匀分散
。
其
中
Mg(OH
)
4
溶于水的
Mg(OH
)
4
的部分是完全
电离的
，
而高温灭菌使
Mg(OH
)2
沉淀溶解度增
大
，
推测这可能是添加
0.57%
和
/
67%
MgSO
5
灭
图
1
不同培养基灭菌前后
pH
变化
Fig.
1
pH
changes
beero
and
aPcs
steVlizatiou
wiN
dkferevt
meVio
pH
图中不同小写字母表示在
5%
水平上差异显著
Dikerext
lowercase
lette/
ia
the
fi/ure
indicate
菌后培养基
pH
剧烈升高的原因
。
2.2
发酵过程中不同时期菌体生长状态
发酵
4
h
时涂片观察
,2.
87%和
1.97%
处理
菌体较少
，
且菌体形状会发生变化
，
在高浓度
MgSOq
的培养基中菌体短小
，
菌体形态的改变从
sianificaat
dikereaces
at
5%
Wvel
2.26%
处理时就开始出现
，
随着
MgSO
5
浓度增
大
，
导致细菌细胞膜内外渗透压不同
，
膜内的水分
实验结果表明
（
图
1
、
，
用
pH
试纸调节培养
透过膜进入培养基
,
造成细胞失水
,
菌体生长受到
56
微生物学杂志
44
卷
影响
。
发酵
24
h时,不同培养基中的菌体形态无
和
1.
79%MgSO
7
的培养基处理均有产抱迹象
,48
差异
，
发酵
36
h
时
，
添加
0.
13%
、
0.24%
、
0.87%
12
h
h
发酵结束°结果见图
2
°
36
h
48
h
24
h
0.13%
0.24%
0.46%
0.87%
1.70%
图
2
不同发酵时期菌体形态
Fig.
2
Cell
morpPolooy
in
diFerext
fewnextation
stages
2.4
MgSO
4
添加量对发酵液
pH
、
残糖和残氮的
和
0.
24%
两处理发酵液残糖含量较低
，
且均低于
影响
从表
2
可以看出
，
发酵液中的剩余还原糖和
0.46%
、
0.
67%
和
1.50%
处理组
，
且两处理组间
无差异
。
添加
0.54%MgSO
7
发酵液
pH
值低于其
氨基氮随着
MgS0
7
添加量的增加而升高
。
添加
0.
13%MgSO
7
的发酵液中剩余还原糖和残留氨基
他处理组
。
实际生产中多用采苯甲酸钠防腐
3
5
]
,
由于苯甲酸钠发挥防腐作用的
yH
值需要小于
4
[4R5
]
，
因此需要加入大量的酸来调节
pH,
这在一
氮含量最少
。
添加
0.87%
和
1.50%
MgS0
7
的残
氮量较高
,
均高于添加
0.
13%
、
0.
24%
和
0.
44%
定程度上增加了生防菌剂的生产成本
，
如果放罐
MgS0
7
处理组
，
且两种处理间无显著差异
,0.
13%
时发酵液的
pH
值低
，
应减少调酸用量
。
表
2
MgSO
4
添加量对发酵液
pH
、
残糖和残氮的影响
Tadle
2
pH,
residual
sugar
and
niFogex
in
fermentation
broth
with
diFerext
treatments
MgSO
4
添加量
/%
检测指标
0213
7279±0201d
0.81
±0.002d
0.27
7.99
±0.01c
0.82
±0.004
—
6.450.87
1.07
8.05
±0.01b
0.95
±0.004a
pH
7.24
±0.04
0.85
±0.401c
8.
19
±0.
01a
残糖
/%
残氮
/(mg
•
mL"
1
)
0.85
±0.003b
0.
4
±0.005
0208±02003b
6.08
±
0.003b
0.48
±
6.605b
0.
4
±
0.000a
6
期
张丽霞等:硫酸镁对枯草芽胞杆菌发酵的影响
57
3
讨论
本研究发现芽胞杆菌
B241
可在
MgSO
/
添加
量为
1
.
60%
条件下完成整个生长周期
，
表明该菌
参考文献
：
[1]
张宝
，
于雅琼
，
韩玉竹
，
等
.
产
Tufa
族脂肽生防芽抱杆
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217-227
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王若琳
，
徐伟芳
，
王飞
，等
.
桑树内生拮抗菌的分离鉴定
株有一定的耐盐能力
，
这为菌株
B241
田间应用
优异表现又添新的力证
。
姚露燕等
［
4
］
研究了多种金属离子对枯草芽
及其对桑断枝烂叶病的生防初探
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J].
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3
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P1
Spores
of
Bacillus
subtilis
:
their
resistance
to
and
kill
胞杆菌
BS-MM08
芽胞形成的影响,结果发现镁离
子可明显影响其芽胞率
，
关于金属镁离子对芽胞
ing
by
radiation
,
heat
and
chemicals
[
J
].
Journal
of
Applied
杆菌发酵的影响
，
研究者多谈到其对芽胞杆菌芽
胞率和活菌数的影响
［
I2N7
］
，
而对金属镁离子在缩
短发酵周期
，
加速产抱进程方面的报道较少
。
本
研究发现
0106%
的
MgSO
/
添加量使菌株
B201
发
酵周期较其他处理缩短了
451
38%
。
已有研究证
实镁离子是许多酶的辅助因子
,MgSO
/
参与微生
物细胞壁的形成
，
对菌体生长具有重要的作
用
［
22
］
0
然而
，
在芽胞生产过程中
，
不同菌种所需
镁离子的质量浓度存在差异
,
罗顺等回
］
研究发现
混凝土自修复菌
Badi
sp.
高芽胞获得率的最
适镁离子质量浓度为
01
26
//L,
董佩佩等
［
2
］
对
1
株凝结芽胞杆菌产芽胞培养基进行优化发现,其
所需镁离子最适质量浓度为
0.49
p/L
。
吴迎奔
等
［
25
］
发现
M/
7
（
PO
/
）
2
的添加量为
0.6
//L
时有
助于侧抱芽胞杆菌
C5
芽胞形成
，
本研究表明
MgSO
/
添加量为
0.24%
时
，
菌株
B241
的芽胞率最
高
。
单因素实验表明
，
MgSO
/
对枯草芽胞杆菌发
酵进程
、
芽胞率以及活菌数都有着极其显著的影
响
，
且不同指标的最高值出现在不同量的
MgSO
/
添加条件下
。
芽胞杆菌的芽胞形成是数百个基因
协同作用的复杂过程
，
其中芽胞形成最主要调控
因子为
SpoPA
和几个
sigma
因子
［
/
］
,同时研究报
道
SpoPA
因子的磷酸化状态
（
SpoPA
~P
）
对
sig-
mu
因子的转录起着重要的调控作用
J
5
］
o
近期研
究人员发现
S
s
WA
因子的激活作用是受到磷酸
化激酶
KCA
的诱导
，
KCA
的积累达到一定程度
才能诱导
SpoPA
因子发挥作用
［
4
］
o
猜测镁离子
可能是
KCA
的重要辅助因子
，
合适的镁离子浓
度加速了产抱的进程
，
而镁离子对菌株
B241
芽
胞形成产生显著影响的内部机理还有待进一步探
究
。
本研究不仅对菌株
B201
发酵培养基中
M/
S0
/
用量进行了优化
，
还为培养基的优化调控提
供了更多的思路
。
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pronase,
chaucter-
ization
and
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towarhs
Bacillus
oereus
and
EscUePcUm
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，
汪祥燕
，
刘元香
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｛
Bacillus
coagulant
；
发酵培养基的优化
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B68
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ML
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HarWp
PJ
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KWia
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((N
eV)
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Devi
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Fujitsa
M
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the
New
YorO
：
McGras-Will
Companies,
lac
,2020
：
90,
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罗顺
，
刘冰
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Bacilli
p
•芽抱
BacUu
subtilu
syorulatiox
Pecisiox
[
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ProceeVings
of
the
Natioxal
Acahemp
of Scieaces
of
the
UniteV
States
of
AmeV-
ca,
2214,120(52)
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E32
19
-E3240.
生产和萌发条件的优化
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深圳大学学报(理工版)
，
2222,
37(1)
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25-80.
欢迎订阅
《
微主物学杂志
》
2024年5月6日发(作者：倪妍晨)
微生物学杂志
2422
年
12
月第
44
卷第
7
期
JOURNAL
OF
MICROBITLOGY
Dec.
2422
VcP
24
Nw
9
53
硫酸镁对枯草芽胞杆菌发酵的影响
张丽霞
7
杨帆
4
娄恺^
,
王琦
7
*
*
(7
新疆天物生态科技股份有限公司,新疆乌鲁木齐
530009
；
21
中农绿康(北京)生物技术有限公司
4
匕京
102101
；
5
•新疆农业科学院微生物应用研究所,新疆乌鲁木齐
532091
；
41
中国农业大学植物病理学系
，
北京
/9195
)
摘
要
为明确工业配方中不同
MgSO/
添加量对枯草芽胞杆菌
B227
发酵过程及菌液保存的影响
，采用单因
素法设置
5
个
MgSO
4
添加量梯度(质量分数
，
下同
)(
4.
13%
、
4.24%
、
4.
46%
、
4.
87%
、
1.
74%
)
。
分别记录不
同梯度
MgSO
4
处理的发酵液灭菌前后
pH
值
，
以及发酵过程中的菌体形态的变化
，
统计发酵结束后细菌的发
酵周期
、活菌数和芽胞率
，
测量发酵结束后发酵液
pH
以及残糖和残氮含量
。
实验表明
,
MgSO/
的不同添加量
对菌株
B227
发酵及菌液保存均有显著影响
。添加量为
4.37%
和
).64%
处理组灭菌后培养基的
pH
较灭菌前
升高
，
培养基由中性变为弱碱性
。
接种后
19
h
取样观察，
菌体明显变形
，
视野內菌数较少
，
且随着
MgSO/
添加
量的增加发酵液活菌数下降
，
残糖和残氮升高
，
不利于保存
。
MgSO/
相对合适的添加量为
4.
15%
4.94%
和
4.
46%
，
三种
MgSO
0
添加量的发酵液活菌数
、
残氮含量无显著差异
；
MgSO
0
添加量为
4.
24%
时菌株
B227
芽胞
率最高为
891
33%
，
而
MgSO
0
添加量为
4113%
和
4.
26%
时
，
芽胞率分别为
84%
和
82.
67%
；
4.
26%
MgSO
0
添加
量可加速菌株
B227
发酵进程
，
发酵周期较其他两个处理缩短
45.8%
。
为提高菌株
B227
的发酵水平
，
降低其
生产成本
，
综合考虑
MgSO
0
的添加量以
4.46%
为宜
。
研究结果不仅为实验室菌株
B227
的发酵优化提供参
考
，
还为培养基的优化拓宽了思路
。
关键词
芽胞杆菌；
硫酸镁
；发酵调控
；
产抱
中图分类号
Q932.67
文献标识码
A
文章编号
1045
-742)(2424)46
-0453
-46
do/14.3969/j.
issn.
1245
-
7427
2424.46.008
Effect
of
Magnesium
Sulfate
on
Fermentation
of
Bacillus
subtilis
ZHANG
Li-xia
7
,
YANG
Fan
2
,
LOU
Kai
5
,
WANG
Qi
3
(
0
Xggang
Tiannu
Ecolopicai
TecUoolopy
C
o
.
Ltd
,
Urumql
536000
；
2.
Sinr
Green
Agp-BiofcU
C
o
.
Ltd
,
Bepinn
162101
；
3.
Institute
of
Microbiology
,
Xggcmg
Acagemy
yf
Agpcu,ltu,ral
Sciences
,
Uunqi
530091
；
4.
DepaPmeni
of
PU
u
Patdology
,
Chinn
Agpcu,ltnral
Universitd
,
Bepinn
190193
)
Abstract
The
puryose
of
this
stupp
was
to
stupp
the
effect
of
di/erext
maguesium
sulfate
coxtext
ic
indusWial
formula
ox
the
fermextakox
process
and
the
puseuatiox
of
Bacillus
subtills
B221.
Five
coxcexWatiox
gradiexts
of
maguesium
sulfate
(4.
15%
,
4.
02%
,
4.
26%
,
4.
57%
,7
70%
(
were
set
bp
single
Sactcr
methwU
The
pH
value
before
and
k-
Wr
stefPzatiox
of
the
fermextakox
li/uib
treated
with
di/ereut
coxcexWatioxs
of
maguesium
sulfate
was
recorheh
re-
spectivep
,
morphologp
of
the
bacteria
ic
the
fermextakox
process
was
obseueh
,
the
fermextakox
cyclo
,
the
uumber
of
viadlc
bacteria
and
the
sporulakox
rate
were
connteh
,
and
the
pH
value
,
the
coxtext
of
residual
supar
and
ni/ogex
ic
the
fermextakox
li/uib
after
fermextakox
were
measuuX.
The
results
sPoweh
that
the
addiPox
of
maguesium
sulfate
had
significaut
ehect
ox
the
fermextatiox
and
puseuatiox
of
sWaic
B241.
The
pH
of
the
treateh
gunp
with
4.
87%
and
7
77%
maguesium
sulfate
iucreaseh
after
stefPzatiox
,
which
chanaeP
the
mehium
exviroxmext
from
pentrai
to
基金项目
：
国家重点研发计划资助项目
(
2019YFD/0250
)
；
2019
自治区重点技术创新专项新疆煤气化炉渣的资源化利用综合研
究项目
(
新工信科技
[
2019
]
26
)
作者简介:张丽霞
女
,
正高级工程师
,
博士
。
主要从事植物病理学研究
。
Tel
：
619-61193375-0019
,
:
Zhan/imad223@
103.
1om
*
通讯作者
。
娄恺
,
男
，
教授
,
博士生导师
。
研究方向为特殊生境微生物
。
Tel
：
0991C19060,E-maP
：
jwUai@maP.
Winghua.
edu.
co
王琦
男
，
教授
,博士生导师
。
研究方向为植物病理学
。
Tel
：
,E-maP
：
wangqi@cau.
edu.
co
收稿日期
：
2020C5C7
54
微生物学杂志
40
卷
weaS
alPaSne.
Sampling
and
observation
12
hours
Ster
inochWSon
,
the
cells
were
oPviously
PeformeV
,
and
the
num
ber
ol
bacteVo
in
the
fielP
was
small
,
and
with
the
increase
ol
magnesium
sulfate,
the
number
ol
viabW
bacteVo
in
the
fermenWPon
broth
PecreaseV
,
and
the
residual
su
/
s
and
nitrogen
increaseV
,
which
was
not
conducive
V
preservation.
The
ahdiPon
of
0.
13%
,
0.
90%
and
0.
47%
was
a
relahvely
appropVaW
amount
ol
magnesium
sulfate
,
and
there
was
no
significant
dikerence
in
the
number
ol
viahlo
bacteVo
and
the
content
ol
residual
nitrogen
in
the
fermenVSon
lipuid
ol
the
three
gyups
；
the
highest
sporuWSon
rate
ol
strain
B201
was
89. 33%
m
the
0.
90%
addition
group
,
80%
and
82.
67%
in
the
0.
18%
and
0.46%
ahdiPon
gyup
,
respectively
；
the
fermenVSon
process
ol
strain
B201
was
acceler-
awV
in
the
0.46%
ahdiPon
gyup
,
and the
fermenVSon
cycle
was
45.8%
shoDer
than
the
other
two
NeatwenV.
Con
sidering
compyhensiveW
,
in
orOer
V
improve
the
fermenVUon
level
ol
strain
B201
and
reVuce
its
probuction
cost,the
ahdiPon
ol
magnesium
suWate
at
0.46%
was
suitahW.
This
swUp
not
only
laid
a
founPaUon
for
the
fermenWPon
opP-
mization
ol
the
WhoraVy
strain
B201
,
but
aWo
byaPenea
the
thinking
for
the
opPmizaSon
ol
the
ceWure
meVium.
KeyworVs
Bacillus
subtilU
；
maynesium
sulphate
；
fermenVSon
reguWSon
；
syoruWPon
以芽胞杆菌及其代谢产物为核心的生防制剂
的使用在提升农作物品质
,
增加产量
,
减少化肥农
°C
湿热灭菌
32
min
；
②
发酵培养基:淀粉
47.97
,
酵母粉
11.92
,
蛋白胨
15.78,CaCO
9
5.0
,
K
2
HPO
5
3.
33
,
MnPO
5
2.
017
,
葡萄糖
15.67
,
KCi
/
11
,
药的使用方面做出了重要的贡献⑴
,
尤其在防治
植物病原真菌引起的各种病害方面效果显著⑵
,
枯草芽胞杆菌普遍具有安全
、
繁殖快
、
抗逆性
MgSO
。
浓度待调整
,
2
日
7,118
C
湿热灭菌
32
min
。
装液量
470
mL/2
L
,
接种量为培养基装液量的
16%
（
体积分数、
。
1.1.3
主要仪器及设备
生化培养箱
（
DHP-
强⑶
、
易于定殖等优势
，
研究发现枯草芽胞杆菌能
够分泌抗生素
、
抗菌蛋白
、
酶或多肽等活性物
质
”
7
］,防治植物病害的同时促进植物生长
。
芽胞
9272,
上海一恒科技有限公司
）
;
恒温振荡摇床
杆菌的发酵培养是其走向生产应用的第一步
，
也
是最重要的一步
。
在培养基优化的过程中发现
（
DHZ-DA
,
江苏省太仓市豪成实验仪器制造有限
公司
）
；
紫外-可见分光光度计
（
Lah
Tech
UV
BLUE
STAR
B,
北京莱伯泰科仪器有限公司
）
；
分析天平
MgSO
5
的添加量对枯草芽胞杆菌
B221
的发酵过
程有着显著的影响
。
镁离子对芽胞杆菌发酵产抱
（
METTLER
TOLEDO
AL167
,
梅特勒-托利多仪器
的积极作用已有不少报道,金华等⑺发现镁离子
（
上海
）
有限公司
）
；
生物显微镜
（
OLYMPUS
CX22）
；
电热恒温水浴箱
（
HW
-
SY21-K
,
北京市
对丁酸梭状芽胞杆菌
ZC2
芽胞的形成具有显著
的促进作用
，
林陈强等
［
2
］
报道培养基中添加适量
的镁离子对芽胞杆菌
CHB221
的菌体生长和芽胞
形成有显著影响
。
目前培养基的优化多以发酵周
长风仪器仪表公司
、
；
pH
计
（SaDoDnsPBW2
,
赛多
利斯科学仪器
（
北京
）
有限公司
、
。
1.9
方法
1.9.1
期
、
活菌数以及芽胞率为主要衡量指标
®
S1
］
，
但是
在生产上芽胞杆菌的发酵对后续微生物产品的加
工以及储存起着决定性的作用
［
I4
］
o
本研究将在
保留传统指标的前提下
，
结合发酵液中残糖残氮
MgSO
5
添加量设置
根据预实验设置
5
个MgSO
5
添加量梯度
（
质量分数
，下同
）
，
分别为
2.
18%
D.
24%
D.
47%
D.
87%
、
1
.
67%
添加量
。
1.6.6
发酵周期
、
活菌数和芽胞率统计将枯草
含量等指标综合选择适用于菌株
B221
发酵生产
芽胞杆菌
B221
甘油菌接种于固体活化培养基上,
32
C
培养待单菌落出现
。
挑取单菌落于种子培
的
MgSO
5
添加量
。
1
材料与方法
1.1
材料
养基中
,32
C
132
r/min
培养
16
h,
以
16%
的接种
量接种至发酵培养基中
,32
C
182
r/min
培养
，
不
定期涂片观察
,
直到发酵结束
,
从接种到完成产抱
为一个发酵周期
。
发酵结束后
，
取发酵液采用涂
平板计数方法进行活菌计数
，
采用计数器进行芽
1.1.1
供试菌株
枯草芽胞杆菌
（
Bacillss
subtl-
U
）
B221
,
由中国农业大学分离保藏
。
1.1.0
培养基
（
g/L
）
①
种子培养基:
NaC15,
牛
肉膏
3,
蛋白胨
7,
pH
7,
装液量
590
m-2
-161
胞率统计,每个处理统计
3
个视野
。
1.2.1
发酵液灭菌前后
pH
变化
配置好培养
2
期
张丽霞等:硫酸镁对枯草芽胞杆菌发酵的影响
55
基
，
以
pH
试纸为参考用
NaOH
溶液调节培养基
pH
至中性后
，
用
pH
计进行测量
。
装液量
220
mL/500
mL,
灭菌后检测培养基
pH
o
1-2.2
菌体形态变化
通过预实验
，
初步判断约
2
结果与分析
2.
4
MgSO
4
添加量对菌株
B221
发酵周期
、
活菌
数
、
芽胞率的影响
59
h
结束发酵
，
同时为减小中途取样对发酵过程
造成的影响
，
设置
6
h
为取样节点
，
用移液枪取
2
mL
发酵液用于
pH
检测
。
在完成
pH
测量后
，
涂
由表
1
可知
，
培养基中
MgSO
5
的添加量对枯草
芽胞杆菌
B221
发酵周期
、
活菌数及芽胞率具显著
影响
。
随着
MgSO
5
添加量的增加
，
活菌数逐渐降
片观察并拍照
。
1.2.6
发酵液
pH
、
残糖和残氮的测定发酵结
低
,MgSO
5
添加量为
2.
13%
时活菌数为
111.
67
x
U
9
cfu/mL,1.67%
时活菌数为
62
x
U
9
cfn/mL
。
发
束后测量发酵液的
pH
值
。
DNS
法检测残糖发酵
液还原糖含量
，
检测用样
2
mL
；
凯氏定氮法检测
酵周期和芽胞率随着
MgSO
5
添加量的增加先升后
降
,MgSO
5
添加量为
2.
47%
时发酵周期最短为
22
发酵液氨基氮含量
，
检测用样
2
mL
o
1.2.2
数据处理与作图文中数据分析软件为
SPSS
22.
2
,
作图软件为
Grayppae
PVsm
8。
h,
其他处理发酵周期相同为
45
y,2.27%
时
，
芽胞
率为
30.13%
，
与
2.18%
时相比无显著差异,但显著
高于
2.
46%
、
2.
87%
和
/
67%
的处理
。
表
1
不同
MgSO
添加量培养基发酵基本情况
Tahle
1
Basic
situatiou
of
meVium
fermeatatVu
with
Pifereat
mapaesium
sulfate
ahditiou
MgS0
4
添加量
/%
。
指标
发酵周期
/h
活菌数
/
X
12
4
芽胞率
/%
2.
11
2.
4
2.422.17
1.27
48
45
111.67
±8.
80v
45
120
±
11.21a
22
01.
59
±14.
Hah
80.67
±2.
33b
48
84.67
±1.67
ah
68±2252b
4
±
0.52b
89.33
±0.6v
76.33
±0.23
bo
70.67
±0.
10c
注:表中同一行数据后不同小写字母表示在
5%
水平上差异显著
,
下表同
2.3
培养基灭菌前后
pH
值变化
基的
pH
存在约
7%
的误差
。
添加
2.13%
、
2.27%
、
2.46%MgSO
5
的培养基灭菌后
pH
下降,
而添加
2.
77%
和
1.67%
MgSO
5
的培养基灭菌后
pH
明显上升
，
随着
MgSO
5
添加量的增加灭菌后
的培养基
pH
逐渐升高
。
本次实验在使用
NaOH
调节
pH
的过程中
，
由于大量添加了
2.
77%
和
1.77%
“
£-0
5,
使
MgSO
5
与NaOH
反应生成片状
Mg(OH
)
0
沉淀
，
剧烈搅拌后
，
沉淀均匀分散
。
其
中
Mg(OH
)
4
溶于水的
Mg(OH
)
4
的部分是完全
电离的
，
而高温灭菌使
Mg(OH
)2
沉淀溶解度增
大
，
推测这可能是添加
0.57%
和
/
67%
MgSO
5
灭
图
1
不同培养基灭菌前后
pH
变化
Fig.
1
pH
changes
beero
and
aPcs
steVlizatiou
wiN
dkferevt
meVio
pH
图中不同小写字母表示在
5%
水平上差异显著
Dikerext
lowercase
lette/
ia
the
fi/ure
indicate
菌后培养基
pH
剧烈升高的原因
。
2.2
发酵过程中不同时期菌体生长状态
发酵
4
h
时涂片观察
,2.
87%和
1.97%
处理
菌体较少
，
且菌体形状会发生变化
，
在高浓度
MgSOq
的培养基中菌体短小
，
菌体形态的改变从
sianificaat
dikereaces
at
5%
Wvel
2.26%
处理时就开始出现
，
随着
MgSO
5
浓度增
大
，
导致细菌细胞膜内外渗透压不同
，
膜内的水分
实验结果表明
（
图
1
、
，
用
pH
试纸调节培养
透过膜进入培养基
,
造成细胞失水
,
菌体生长受到
56
微生物学杂志
44
卷
影响
。
发酵
24
h时,不同培养基中的菌体形态无
和
1.
79%MgSO
7
的培养基处理均有产抱迹象
,48
差异
，
发酵
36
h
时
，
添加
0.
13%
、
0.24%
、
0.87%
12
h
h
发酵结束°结果见图
2
°
36
h
48
h
24
h
0.13%
0.24%
0.46%
0.87%
1.70%
图
2
不同发酵时期菌体形态
Fig.
2
Cell
morpPolooy
in
diFerext
fewnextation
stages
2.4
MgSO
4
添加量对发酵液
pH
、
残糖和残氮的
和
0.
24%
两处理发酵液残糖含量较低
，
且均低于
影响
从表
2
可以看出
，
发酵液中的剩余还原糖和
0.46%
、
0.
67%
和
1.50%
处理组
，
且两处理组间
无差异
。
添加
0.54%MgSO
7
发酵液
pH
值低于其
氨基氮随着
MgS0
7
添加量的增加而升高
。
添加
0.
13%MgSO
7
的发酵液中剩余还原糖和残留氨基
他处理组
。
实际生产中多用采苯甲酸钠防腐
3
5
]
,
由于苯甲酸钠发挥防腐作用的
yH
值需要小于
4
[4R5
]
，
因此需要加入大量的酸来调节
pH,
这在一
氮含量最少
。
添加
0.87%
和
1.50%
MgS0
7
的残
氮量较高
,
均高于添加
0.
13%
、
0.
24%
和
0.
44%
定程度上增加了生防菌剂的生产成本
，
如果放罐
MgS0
7
处理组
，
且两种处理间无显著差异
,0.
13%
时发酵液的
pH
值低
，
应减少调酸用量
。
表
2
MgSO
4
添加量对发酵液
pH
、
残糖和残氮的影响
Tadle
2
pH,
residual
sugar
and
niFogex
in
fermentation
broth
with
diFerext
treatments
MgSO
4
添加量
/%
检测指标
0213
7279±0201d
0.81
±0.002d
0.27
7.99
±0.01c
0.82
±0.004
—
6.450.87
1.07
8.05
±0.01b
0.95
±0.004a
pH
7.24
±0.04
0.85
±0.401c
8.
19
±0.
01a
残糖
/%
残氮
/(mg
•
mL"
1
)
0.85
±0.003b
0.
4
±0.005
0208±02003b
6.08
±
0.003b
0.48
±
6.605b
0.
4
±
0.000a
6
期
张丽霞等:硫酸镁对枯草芽胞杆菌发酵的影响
57
3
讨论
本研究发现芽胞杆菌
B241
可在
MgSO
/
添加
量为
1
.
60%
条件下完成整个生长周期
，
表明该菌
参考文献
：
[1]
张宝
，
于雅琼
，
韩玉竹
，
等
.
产
Tufa
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王若琳
，
徐伟芳
，
王飞
，等
.
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株有一定的耐盐能力
，
这为菌株
B241
田间应用
优异表现又添新的力证
。
姚露燕等
［
4
］
研究了多种金属离子对枯草芽
及其对桑断枝烂叶病的生防初探
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3
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Spores
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subtilis
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their
resistance
to
and
kill
胞杆菌
BS-MM08
芽胞形成的影响,结果发现镁离
子可明显影响其芽胞率
，
关于金属镁离子对芽胞
ing
by
radiation
,
heat
and
chemicals
[
J
].
Journal
of
Applied
杆菌发酵的影响
，
研究者多谈到其对芽胞杆菌芽
胞率和活菌数的影响
［
I2N7
］
，
而对金属镁离子在缩
短发酵周期
，
加速产抱进程方面的报道较少
。
本
研究发现
0106%
的
MgSO
/
添加量使菌株
B201
发
酵周期较其他处理缩短了
451
38%
。
已有研究证
实镁离子是许多酶的辅助因子
,MgSO
/
参与微生
物细胞壁的形成
，
对菌体生长具有重要的作
用
［
22
］
0
然而
，
在芽胞生产过程中
，
不同菌种所需
镁离子的质量浓度存在差异
,
罗顺等回
］
研究发现
混凝土自修复菌
Badi
sp.
高芽胞获得率的最
适镁离子质量浓度为
01
26
//L,
董佩佩等
［
2
］
对
1
株凝结芽胞杆菌产芽胞培养基进行优化发现,其
所需镁离子最适质量浓度为
0.49
p/L
。
吴迎奔
等
［
25
］
发现
M/
7
（
PO
/
）
2
的添加量为
0.6
//L
时有
助于侧抱芽胞杆菌
C5
芽胞形成
，
本研究表明
MgSO
/
添加量为
0.24%
时
，
菌株
B241
的芽胞率最
高
。
单因素实验表明
，
MgSO
/
对枯草芽胞杆菌发
酵进程
、
芽胞率以及活菌数都有着极其显著的影
响
，
且不同指标的最高值出现在不同量的
MgSO
/
添加条件下
。
芽胞杆菌的芽胞形成是数百个基因
协同作用的复杂过程
，
其中芽胞形成最主要调控
因子为
SpoPA
和几个
sigma
因子
［
/
］
,同时研究报
道
SpoPA
因子的磷酸化状态
（
SpoPA
~P
）
对
sig-
mu
因子的转录起着重要的调控作用
J
5
］
o
近期研
究人员发现
S
s
WA
因子的激活作用是受到磷酸
化激酶
KCA
的诱导
，
KCA
的积累达到一定程度
才能诱导
SpoPA
因子发挥作用
［
4
］
o
猜测镁离子
可能是
KCA
的重要辅助因子
，
合适的镁离子浓
度加速了产抱的进程
，
而镁离子对菌株
B241
芽
胞形成产生显著影响的内部机理还有待进一步探
究
。
本研究不仅对菌株
B201
发酵培养基中
M/
S0
/
用量进行了优化
，
还为培养基的优化调控提
供了更多的思路
。
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粉芽胞杆菌
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di/erent
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