2024年5月19日发(作者：不烨华)
山东医药２０１２年第５２卷第２３
心肌细胞缺氧复氧损伤时Ｍｉｐｕｌ启动子活
Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ表达变化及意义 、
屈顺林 －一，郭芳 。范文静 ，张弛 ，詹向阳 。姜志胜
（１南华大学基础医学博士后流动站，湖南衡阳４２１００１；２南华大学医学院病理生理学教研室，
心血管病研究所，“动脉硬化学”湖南省重点实验室；３南华大学附属第二医院）
摘要：目的 探讨心肌细胞缺氧复氧损伤时心肌缺血预适应表达上调蛋白１（Ｍｉｐｕ１）启动子活性的变化及其
作用。方法按本课题组的常规方法复制心肌细胞缺氧复氧模型，先予缺氧（９５％Ｎ －５％ＣＯ：，无血清低糖ＤＭＥＭ）
处理６ ｈ，再分别复氧（９５％空气一５％ＣＯ：，１０％ＦＢＳ－高糖ＤＭＥＭ）６、１２、２４ ｈ。采用ＭＴＦ法检测心肌细胞活性，比色
法测定心肌细胞ＬＤＨ活性，双荧光素酶报告基因技术检测启动子ＰＧＬ３－Ｍｉｐｕｌ活性，实时定量ＰＣＲ法检测Ｍｉｐｕｌ
ｍＲＮＡ表达。结果缺氧６ ｈ复氧（６、１２、２４ ｈ）后心肌细胞活性减低，ＬＤＨ释放增加，启动子ＰＧＬ３－Ｍｉｐｕｌ活性增
Ｍｉｐｕｌ可能参与了心肌细胞的缺氧复氧 加，Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ表达上调，且在缺氧６ ｈ复氧１２ ｈ时变化最明显。结论
损伤，其可能通过调控凋亡相关基因发挥作用。
关键词：缺氧，复氧；心肌细胞；心肌缺血预适应表达上调蛋白１；启动子
中图分类号：Ｑ７８４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—２６６Ｘ（２０１２）２３－０００５－０３
Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｍｉｐｕｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ
ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
Ｑｕ Ｓｈｕｎ—ｌｉｎ ，ＧＵＯ Ｆａｎ，ＦＡＮ ｎ ｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｃｈｉ，ＺＨＡＮＸｉａｎｇ—ｙａｎｇ，ＪＩＡＮＧ ・ｓｈｅｎｇ
（１ Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ，
Ｈｅｎｇｙａｎｇ ４２１００１，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｍｉｐｕｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｈｙｐｏｘｉａ／
ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ Ｈ９ｃ２ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，Ｈ９ｃ２
ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ａ ｈｙｐｏｘｉｃ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ９５％Ｎ２－５％ＣＯ２ ｆｏｒ ６ ｈｓ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ
ｔｏ ａ ｎｏｒｍｏｘｉｅ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（９５％ａｉｒ－５％ＣＯ２）ｆｏｒ ６，１２ ａｎｄ ２４ ｈｓ．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈ９ｃ２ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＭＴＦ ｍｅｔｈｏｄ．
Ｓｅｒｕｍ ＬＤＨ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｍｅｔｒｙ．ＰＧＬ３一Ｍｉｐｕｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｄｅｃｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ
ｓｓａｙ．Ｍｉｐｕｌａ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ
ｒａｔｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ＬＤＨ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｍｉｐｕｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｅｓｐｅｃｉｌｌａｙ ａｔ
，
ｈｙｐｏｘｉａ ６ ｈ／１２ ｈ ｏｆ ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｍｉｐｕｌ ｍａｙ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉａ／
ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙｂｅ ｐａｒｔｌｙ ｄｕｅ ｔｏ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；ｅａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ；ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ｐｒｏ－
ｍａｔｅｒ
心肌缺血预适应表达上调蛋白１（Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓ．
ｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １，Ｍｉｐｕ１）
期研究已成功构建了含Ｍｉｐｕｌ启动子全长的报告基
因（ＰＧＬ３．Ｍｉｐｕ１） ，但心肌细胞缺氧复氧时Ｍｉｐｕｌ
启动子活性和ｍＲＮＡ变化及Ｍｉｐｕｌ在心肌细胞缺
氧复氧损伤中的作用尚不清楚。２００９年８月～
是大鼠在心肌缺血预适应过程中新发现的表达上调
的基因，其Ｇｅｎｂａｎｋ登录号为ＡＹ２２１７５０ Ｅ 。我们前
基金项目：国家自然科学基金项目（８１１００２１２／Ｈ０２１５）；中国博士点基金新教师类联合项目（２０１１４３２４１２０００４）；中国博士后科学基金项目
（２０１２Ｍ５１１３８３）；湖南省教育厅科研项目（１１Ｃ１０９４；０８Ｃ７４３）；南华大学高层次人才科研启动资助项目（２０１１ＸＱＤ２４）。
作者简介：屈顺林（１９７８一），男，ｔＯ￣，硕士研究生导师，长期从事动脉粥样硬化和心肌内源性保护的机制研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｕｓｈｕｎｌｉｎ７８＠ｆｏｘｍａｉｌ．
ｃａｍ
通讯作者：詹向阳（１９６４一），男，副主任医师，研究方向为心血管疾病的发病机制与防治。
通讯作者：姜志胜（１９６５一），男，教授，博士生导师，研究方向为心血管疾病的发病机制与防治。
５
２０１０年５月，我们观察了心肌细胞缺氧复氧损伤模
型报告基因ＰＧＬ３－Ｍｉｐｕｌ活性变化及Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ
表达，旨在探讨Ｍｉｐｕｌ在心肌细胞缺氧复氧损伤中
的作用。
１材料与方法
１．１材料大鼠来源的Ｈ９ｃ２心肌细胞购自中国
典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心）；乳酸脱
氢酶（ＬＤＨ）检、？贝０试剂盒和ＭＴｒ检测试剂盒均购自
南京建成生物研究所；脂质体转染试剂盒购自Ｉｎ—
ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＤＭＥＭ培养基购自美国Ｓｉｇｍａ公司；
新生小牛血清购自杭州四季青公司。ＤＨ５ｏｔ感受态
细菌购自大连宝生物工程（大连）有限公司，小量质
粒ＤＮＡ提取试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
公司。
１．２心肌细胞缺氧复氧模型复制及干预将Ｈ９ｃ２
心肌细胞按（１～２）×１０ ／瓶接种，置于含１０％胎牛
血清的高糖ＤＭＥＭ培养基中常规培养，待细胞长至
６０％～８０％时进行干预（干预前２４ ｈ换用无血清的
ＤＭＥＭ液培养，使细胞生长处于同一时相）：对照组
将细胞置于９５％空气一５％ＣＯ 中培养；缺氧复氧组
按本课题组的常规方法 对心肌细胞Ｈ９ｃ２进行缺
氧（９５％Ｎ －５％ＣＯ：，无血清低糖ＤＭＥＭ）处理６ ｈ，
再分别复氧（９５％空气－５％ＣＯ：，１０％ＦＢＳ一高糖
ＤＭＥＭ）处理６、１２、２４ ｈ。
１．３观察项目
１．３．１心肌细胞活性采用Ｍ１ＴＩ１法。将处理好的
细胞每孔加入２０ Ｌ质量浓度为５ ｇ／Ｌ的Ｍ１Ｔｒ，于
孵箱中培养４ ｈ，吸掉上清后加入１５０ ＩｘＬ的ＤＭＳＯ，
摇匀１５ ｍｉｎ（室温下），采用酶标仪测定各孔吸光度
值（ＯＤ），计算心肌细胞的相对活性。
１．３．２ ＬＤＨ活性严格按照试剂盒说明书（南京
建成生物制品公司）操作程序进行操作，采用比色
法进行检测 。
１．３．３ ＰＧＬ３一Ｍｉｐｕｌ活性应用双荧光素酶报告基
因技术。将荧光素酶报告基因质粒ＰＧＬ３．Ｍｉｐｕｌ和
ｐＲＬ．ＴＫ载体根据Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司提供的转染操作说
明书方法进行共转染Ｈ９ｃ２细胞。转染３６ ｈ后进行
上述缺氧复氧损伤，然后用ＰＢＳ液洗细胞２～３次，
加入４００ ＩｘＬ的细胞裂解液（ＰＬＢ）裂解细胞，将孔板
置于２５℃的孵箱中温育２０ ｍｉｎ。从孔板中吸４０
ＰＬＢ与荧光素酶检测试剂Ⅱ（ＬＡＲＩＩ）１００ 混
合，立即检测萤火虫荧光素酶活性。然后在待测试
管中加入Ｓｔｏｐ＆ＧｌｏＴＭ试剂１００ ｔｘＬ，并立即测量海
肾荧光素酶报告基因活性。
１．３．４ Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ表达检测提取两组细胞的
６
山东医药２０１２年第５２卷第２３
总ＲＮＡ，并逆转录成ｃＤＮＡ，采用实时定量ＰＣＲ法
检测Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ相对表达量 ］。
１．４统计学方法采用ＳＰＳＳ１４．０统计软件包，计
量数据以 ±Ｓ表示，组问比较采用ｔ检验，Ｐ≤０．０５
为差异有统计学意义。
２ 结果
２．１ 心肌细胞活性 ＭＴＦ检测结果显示，缺氧复
氧组复氧处理不同时段细胞活性均明显下降，与对
照组相比均有统计学意义，以缺氧６ ｈ复氧１２ ｈ细
胞活性下降最明显（图１）。
ｌ０ｏ
８０
趟６Ｏ
鎏４ｏ
蒜２０
０
对照组鳘萋 复ｌｉｌＯ氧ｔＫ６ｌ２ｈｈ鐾萋２６４ｈｈ
图１缺氧复氧后心肌细胞活性
注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５
２．２ ＬＤＨ活性缺氧复氧组ＬＤＨ活性明显增加，
与对照组相比均有统计学意义，且缺氧６ ｈ复氧１２
ｈ细胞ＬＤＨ活性增加最明显（图２）。
６００
—
５ＯＯ
４００
３００
銎２００
量１００
０
对照组鐾簧 ２鍪羞２：ｈｈ鐾萋 ｌｌ１
图２缺氧复氧后心肌细胞ＬＤＨ活性
注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５
２．３ Ｍｉｐｕｌ启动子活性和Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ表达缺
氧复氧组Ｍｉｐｕｌ启动子活性均明显增加，Ｍｉｐｕｌ
ｍＲＮＡ表达均明显上调，与对照组相比均有统计学
意义，且在缺氧６ ｈ复氧１２ ｈ最明显（图３和图４）。
对照组鐾萋 ２譬萋｛：ｈｈ鐾萋２ ｈｈ
图３缺氧复氧后心肌细胞Ｍｉｐｕｌ启动子活性
注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５
山东医药２０１２年第５２卷第２３期
靛罂露《ｚ 置Ｉｎｄ１窆
４ ３ ２ ｌ Ｏ
对照组鐾萋 ２ Ｊ复ｉｌＯ氧Ｋ６ｌ２ｈｈ鐾氢 ４ｈｈ
图４缺氧复氧后心肌细胞Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ表达
注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５
３讨论
研究证实，冠状动脉阻塞数秒钟后心肌即可发
生功能、代谢变化，这些变化随着缺血时间的延长进
行性加重；而在可恢复阶段及时恢复血液灌注能最
大限度地恢复心肌组织损伤。溶栓治疗及经皮冠状
动脉介入术（ＰＣＩ）是急性心肌梗死的主要治疗手
段，但其可引起心肌舒缩功能代谢异常及心肌超微
结构改变和心律失常，即心肌的缺血一再灌注损伤。
目前对心肌缺血一再灌注损伤发病机理的认识己深
人到细胞分子水平，减轻心肌损伤的研究重点亦转
移到细胞保护，即增强心肌细胞对缺血缺氧等损伤
的抵抗力，阻止细胞的不可逆损伤。
心肌缺血或缺血一再灌注损伤时，很多基因如
ｃ＿ｆ０ｓ、ｃ－ｉｎｎ、ｊｕｎＢ、ＨＳＰ７０和ＮＯ合酶等表达上调 ，
其中部分基因被认为是与内源性保护有关。Ｍｉｐｕｌ
是一种Ｎ端含有ＫＲＡＢ结构域和ｃ端含有典型１２
个Ｃ２Ｈ２锌指结构的锌指蛋白 Ｊ，定位于Ｈ９ｃ２心肌
细胞的胞核，在心肌缺血或活性氧刺激时表达上
调 。据文献报道，Ｍｉｐｕｌ过表达能减轻由无血清
培养所致的肌原细胞Ｃ２Ｃ１２损伤＿４］，但Ｍｉｐｕｌ在缺
氧复氧时的变化和作用目前尚不清楚。本研究发现
缺氧复氧能明显损伤心肌细胞，且在缺氧６ ｈ复氧
１２ ｈ时损伤最为严重，表现为心肌细胞活性降低，
ＬＤＨ活性增加，其机制可能为缺氧复氧损伤的初期
和中期形成了大量自由基，抗氧化系统负荷过重，清
除自由基系统因此受到消耗和抑制，表现为细胞活
性下降，而在损伤后期由于代偿的调整，慢慢达到新
的稳态平衡即超氧自由基生成减少，抗氧化系统功
能逐渐恢复。同时我们发现，缺氧复氧时Ｍｉｐｕｌ启
动子活性和ｍＲＮＡ表达均明显增加，提示Ｍｉｐｕｌ可
能参与了心肌细胞的缺氧复氧损伤。其机制可能为
Ｍｉｐｕｌ是一个转录抑制因子，其核心结合位点为５ －
ＴＧＴＣｒＩＴＡＴＣＧＡＡ．３ ，可能通过调控凋亡相关基因而
抑制细胞凋亡，在细胞凋亡过程中发挥重要调控作
用 Ｊ。我们进一步通过生物信息学发现凋亡相关
基因Ｂｉｄ和Ｂｃｌ－２等的启动子区含有Ｍｉｐｕｌ的核心
结合元件。下一步我们将通过改变Ｍｉｐｕｌ的表达水
平来观察Ｍｉｐｕｌ及Ｍｉｐｕｌ所调控的凋亡相关基因表
达在心肌细胞缺氧复氧中的作用，为减轻心肌缺
血一再灌注损伤提供新的理论依据。
参考文献：
［１］袁灿，张华莉，刘瑛，等．一个大鼠心肌缺血一再灌诱导表达上调
的新基因Ｍｉｐｕｌ的克隆和特性分析［Ｊ］．生物化学与生物物理
进展，２００４，３１（３）：２３１－２３６．
［２］屈顺林，肖献忠．ＣＲＥＢ介导的Ｍｉｐｕｌ表达上调及其在心肌缺血
后适应中的作用［Ｄ］．博士论文（中南大学），２０１０．
［３］Ｎｅｌｓｏｎ Ｄ，Ｗｅｃｈｓｌｅｒ Ｓ，Ｍｉｕｒａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ
ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｗｉｔｈ ｃａｒｄｉａｃ ｉｓｃｈｅｍｉａ－
ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ，２００２，７３（１）：１５６—１６２．
［４］袁灿，王秋鹏，刘瑛，等．新基因Ｍｉｐｌ的过表达对去血清培养条
件下Ｃ２Ｃ１２细胞生长周期的影响［Ｊ］．医学ｌ临床研究，２００４，２１
（８）：８３７－８３９．
［５］Ｗａｎｇ Ｇ，Ｚｕｏ Ｘ，Ｌｉｕ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｐｕｌ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ
ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２００９，１０（２）：４９２—
５０６．
［６］Ｊｉａｎｇ Ｌ，Ｔａｎｇ Ｄ，Ｗａｎｇ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ
ＫＲＡＢ／Ｃ２Ｉ－Ｉ２ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｐｕｌ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ
Ｃｏｍｍｕｎ，２００７，３５６（４）：８２９—８３５．
（收稿１３期：２０１２－０２－２０）
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2024年5月19日发(作者：不烨华)
山东医药２０１２年第５２卷第２３
心肌细胞缺氧复氧损伤时Ｍｉｐｕｌ启动子活
Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ表达变化及意义 、
屈顺林 －一，郭芳 。范文静 ，张弛 ，詹向阳 。姜志胜
（１南华大学基础医学博士后流动站，湖南衡阳４２１００１；２南华大学医学院病理生理学教研室，
心血管病研究所，“动脉硬化学”湖南省重点实验室；３南华大学附属第二医院）
摘要：目的 探讨心肌细胞缺氧复氧损伤时心肌缺血预适应表达上调蛋白１（Ｍｉｐｕ１）启动子活性的变化及其
作用。方法按本课题组的常规方法复制心肌细胞缺氧复氧模型，先予缺氧（９５％Ｎ －５％ＣＯ：，无血清低糖ＤＭＥＭ）
处理６ ｈ，再分别复氧（９５％空气一５％ＣＯ：，１０％ＦＢＳ－高糖ＤＭＥＭ）６、１２、２４ ｈ。采用ＭＴＦ法检测心肌细胞活性，比色
法测定心肌细胞ＬＤＨ活性，双荧光素酶报告基因技术检测启动子ＰＧＬ３－Ｍｉｐｕｌ活性，实时定量ＰＣＲ法检测Ｍｉｐｕｌ
ｍＲＮＡ表达。结果缺氧６ ｈ复氧（６、１２、２４ ｈ）后心肌细胞活性减低，ＬＤＨ释放增加，启动子ＰＧＬ３－Ｍｉｐｕｌ活性增
Ｍｉｐｕｌ可能参与了心肌细胞的缺氧复氧 加，Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ表达上调，且在缺氧６ ｈ复氧１２ ｈ时变化最明显。结论
损伤，其可能通过调控凋亡相关基因发挥作用。
关键词：缺氧，复氧；心肌细胞；心肌缺血预适应表达上调蛋白１；启动子
中图分类号：Ｑ７８４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—２６６Ｘ（２０１２）２３－０００５－０３
Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｍｉｐｕｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ
ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
Ｑｕ Ｓｈｕｎ—ｌｉｎ ，ＧＵＯ Ｆａｎ，ＦＡＮ ｎ ｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｃｈｉ，ＺＨＡＮＸｉａｎｇ—ｙａｎｇ，ＪＩＡＮＧ ・ｓｈｅｎｇ
（１ Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ，
Ｈｅｎｇｙａｎｇ ４２１００１，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｍｉｐｕｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｈｙｐｏｘｉａ／
ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ Ｈ９ｃ２ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，Ｈ９ｃ２
ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ａ ｈｙｐｏｘｉｃ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ９５％Ｎ２－５％ＣＯ２ ｆｏｒ ６ ｈｓ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ
ｔｏ ａ ｎｏｒｍｏｘｉｅ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（９５％ａｉｒ－５％ＣＯ２）ｆｏｒ ６，１２ ａｎｄ ２４ ｈｓ．Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈ９ｃ２ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＭＴＦ ｍｅｔｈｏｄ．
Ｓｅｒｕｍ ＬＤＨ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｍｅｔｒｙ．ＰＧＬ３一Ｍｉｐｕｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｄｅｃｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ
ｓｓａｙ．Ｍｉｐｕｌａ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ
ｒａｔｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ＬＤＨ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｍｉｐｕｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｅｓｐｅｃｉｌｌａｙ ａｔ
，
ｈｙｐｏｘｉａ ６ ｈ／１２ ｈ ｏｆ ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｍｉｐｕｌ ｍａｙ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉａ／
ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙｂｅ ｐａｒｔｌｙ ｄｕｅ ｔｏ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；ｅａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ；ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ｐｒｏ－
ｍａｔｅｒ
心肌缺血预适应表达上调蛋白１（Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓ．
ｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １，Ｍｉｐｕ１）
期研究已成功构建了含Ｍｉｐｕｌ启动子全长的报告基
因（ＰＧＬ３．Ｍｉｐｕ１） ，但心肌细胞缺氧复氧时Ｍｉｐｕｌ
启动子活性和ｍＲＮＡ变化及Ｍｉｐｕｌ在心肌细胞缺
氧复氧损伤中的作用尚不清楚。２００９年８月～
是大鼠在心肌缺血预适应过程中新发现的表达上调
的基因，其Ｇｅｎｂａｎｋ登录号为ＡＹ２２１７５０ Ｅ 。我们前
基金项目：国家自然科学基金项目（８１１００２１２／Ｈ０２１５）；中国博士点基金新教师类联合项目（２０１１４３２４１２０００４）；中国博士后科学基金项目
（２０１２Ｍ５１１３８３）；湖南省教育厅科研项目（１１Ｃ１０９４；０８Ｃ７４３）；南华大学高层次人才科研启动资助项目（２０１１ＸＱＤ２４）。
作者简介：屈顺林（１９７８一），男，ｔＯ￣，硕士研究生导师，长期从事动脉粥样硬化和心肌内源性保护的机制研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｕｓｈｕｎｌｉｎ７８＠ｆｏｘｍａｉｌ．
ｃａｍ
通讯作者：詹向阳（１９６４一），男，副主任医师，研究方向为心血管疾病的发病机制与防治。
通讯作者：姜志胜（１９６５一），男，教授，博士生导师，研究方向为心血管疾病的发病机制与防治。
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２０１０年５月，我们观察了心肌细胞缺氧复氧损伤模
型报告基因ＰＧＬ３－Ｍｉｐｕｌ活性变化及Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ
表达，旨在探讨Ｍｉｐｕｌ在心肌细胞缺氧复氧损伤中
的作用。
１材料与方法
１．１材料大鼠来源的Ｈ９ｃ２心肌细胞购自中国
典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心）；乳酸脱
氢酶（ＬＤＨ）检、？贝０试剂盒和ＭＴｒ检测试剂盒均购自
南京建成生物研究所；脂质体转染试剂盒购自Ｉｎ—
ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＤＭＥＭ培养基购自美国Ｓｉｇｍａ公司；
新生小牛血清购自杭州四季青公司。ＤＨ５ｏｔ感受态
细菌购自大连宝生物工程（大连）有限公司，小量质
粒ＤＮＡ提取试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
公司。
１．２心肌细胞缺氧复氧模型复制及干预将Ｈ９ｃ２
心肌细胞按（１～２）×１０ ／瓶接种，置于含１０％胎牛
血清的高糖ＤＭＥＭ培养基中常规培养，待细胞长至
６０％～８０％时进行干预（干预前２４ ｈ换用无血清的
ＤＭＥＭ液培养，使细胞生长处于同一时相）：对照组
将细胞置于９５％空气一５％ＣＯ 中培养；缺氧复氧组
按本课题组的常规方法 对心肌细胞Ｈ９ｃ２进行缺
氧（９５％Ｎ －５％ＣＯ：，无血清低糖ＤＭＥＭ）处理６ ｈ，
再分别复氧（９５％空气－５％ＣＯ：，１０％ＦＢＳ一高糖
ＤＭＥＭ）处理６、１２、２４ ｈ。
１．３观察项目
１．３．１心肌细胞活性采用Ｍ１ＴＩ１法。将处理好的
细胞每孔加入２０ Ｌ质量浓度为５ ｇ／Ｌ的Ｍ１Ｔｒ，于
孵箱中培养４ ｈ，吸掉上清后加入１５０ ＩｘＬ的ＤＭＳＯ，
摇匀１５ ｍｉｎ（室温下），采用酶标仪测定各孔吸光度
值（ＯＤ），计算心肌细胞的相对活性。
１．３．２ ＬＤＨ活性严格按照试剂盒说明书（南京
建成生物制品公司）操作程序进行操作，采用比色
法进行检测 。
１．３．３ ＰＧＬ３一Ｍｉｐｕｌ活性应用双荧光素酶报告基
因技术。将荧光素酶报告基因质粒ＰＧＬ３．Ｍｉｐｕｌ和
ｐＲＬ．ＴＫ载体根据Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司提供的转染操作说
明书方法进行共转染Ｈ９ｃ２细胞。转染３６ ｈ后进行
上述缺氧复氧损伤，然后用ＰＢＳ液洗细胞２～３次，
加入４００ ＩｘＬ的细胞裂解液（ＰＬＢ）裂解细胞，将孔板
置于２５℃的孵箱中温育２０ ｍｉｎ。从孔板中吸４０
ＰＬＢ与荧光素酶检测试剂Ⅱ（ＬＡＲＩＩ）１００ 混
合，立即检测萤火虫荧光素酶活性。然后在待测试
管中加入Ｓｔｏｐ＆ＧｌｏＴＭ试剂１００ ｔｘＬ，并立即测量海
肾荧光素酶报告基因活性。
１．３．４ Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ表达检测提取两组细胞的
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山东医药２０１２年第５２卷第２３
总ＲＮＡ，并逆转录成ｃＤＮＡ，采用实时定量ＰＣＲ法
检测Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ相对表达量 ］。
１．４统计学方法采用ＳＰＳＳ１４．０统计软件包，计
量数据以 ±Ｓ表示，组问比较采用ｔ检验，Ｐ≤０．０５
为差异有统计学意义。
２ 结果
２．１ 心肌细胞活性 ＭＴＦ检测结果显示，缺氧复
氧组复氧处理不同时段细胞活性均明显下降，与对
照组相比均有统计学意义，以缺氧６ ｈ复氧１２ ｈ细
胞活性下降最明显（图１）。
ｌ０ｏ
８０
趟６Ｏ
鎏４ｏ
蒜２０
０
对照组鳘萋 复ｌｉｌＯ氧ｔＫ６ｌ２ｈｈ鐾萋２６４ｈｈ
图１缺氧复氧后心肌细胞活性
注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５
２．２ ＬＤＨ活性缺氧复氧组ＬＤＨ活性明显增加，
与对照组相比均有统计学意义，且缺氧６ ｈ复氧１２
ｈ细胞ＬＤＨ活性增加最明显（图２）。
６００
—
５ＯＯ
４００
３００
銎２００
量１００
０
对照组鐾簧 ２鍪羞２：ｈｈ鐾萋 ｌｌ１
图２缺氧复氧后心肌细胞ＬＤＨ活性
注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５
２．３ Ｍｉｐｕｌ启动子活性和Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ表达缺
氧复氧组Ｍｉｐｕｌ启动子活性均明显增加，Ｍｉｐｕｌ
ｍＲＮＡ表达均明显上调，与对照组相比均有统计学
意义，且在缺氧６ ｈ复氧１２ ｈ最明显（图３和图４）。
对照组鐾萋 ２譬萋｛：ｈｈ鐾萋２ ｈｈ
图３缺氧复氧后心肌细胞Ｍｉｐｕｌ启动子活性
注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５
山东医药２０１２年第５２卷第２３期
靛罂露《ｚ 置Ｉｎｄ１窆
４ ３ ２ ｌ Ｏ
对照组鐾萋 ２ Ｊ复ｉｌＯ氧Ｋ６ｌ２ｈｈ鐾氢 ４ｈｈ
图４缺氧复氧后心肌细胞Ｍｉｐｕｌ ｍＲＮＡ表达
注：与对照组比较， Ｐ＜０．０５
３讨论
研究证实，冠状动脉阻塞数秒钟后心肌即可发
生功能、代谢变化，这些变化随着缺血时间的延长进
行性加重；而在可恢复阶段及时恢复血液灌注能最
大限度地恢复心肌组织损伤。溶栓治疗及经皮冠状
动脉介入术（ＰＣＩ）是急性心肌梗死的主要治疗手
段，但其可引起心肌舒缩功能代谢异常及心肌超微
结构改变和心律失常，即心肌的缺血一再灌注损伤。
目前对心肌缺血一再灌注损伤发病机理的认识己深
人到细胞分子水平，减轻心肌损伤的研究重点亦转
移到细胞保护，即增强心肌细胞对缺血缺氧等损伤
的抵抗力，阻止细胞的不可逆损伤。
心肌缺血或缺血一再灌注损伤时，很多基因如
ｃ＿ｆ０ｓ、ｃ－ｉｎｎ、ｊｕｎＢ、ＨＳＰ７０和ＮＯ合酶等表达上调 ，
其中部分基因被认为是与内源性保护有关。Ｍｉｐｕｌ
是一种Ｎ端含有ＫＲＡＢ结构域和ｃ端含有典型１２
个Ｃ２Ｈ２锌指结构的锌指蛋白 Ｊ，定位于Ｈ９ｃ２心肌
细胞的胞核，在心肌缺血或活性氧刺激时表达上
调 。据文献报道，Ｍｉｐｕｌ过表达能减轻由无血清
培养所致的肌原细胞Ｃ２Ｃ１２损伤＿４］，但Ｍｉｐｕｌ在缺
氧复氧时的变化和作用目前尚不清楚。本研究发现
缺氧复氧能明显损伤心肌细胞，且在缺氧６ ｈ复氧
１２ ｈ时损伤最为严重，表现为心肌细胞活性降低，
ＬＤＨ活性增加，其机制可能为缺氧复氧损伤的初期
和中期形成了大量自由基，抗氧化系统负荷过重，清
除自由基系统因此受到消耗和抑制，表现为细胞活
性下降，而在损伤后期由于代偿的调整，慢慢达到新
的稳态平衡即超氧自由基生成减少，抗氧化系统功
能逐渐恢复。同时我们发现，缺氧复氧时Ｍｉｐｕｌ启
动子活性和ｍＲＮＡ表达均明显增加，提示Ｍｉｐｕｌ可
能参与了心肌细胞的缺氧复氧损伤。其机制可能为
Ｍｉｐｕｌ是一个转录抑制因子，其核心结合位点为５ －
ＴＧＴＣｒＩＴＡＴＣＧＡＡ．３ ，可能通过调控凋亡相关基因而
抑制细胞凋亡，在细胞凋亡过程中发挥重要调控作
用 Ｊ。我们进一步通过生物信息学发现凋亡相关
基因Ｂｉｄ和Ｂｃｌ－２等的启动子区含有Ｍｉｐｕｌ的核心
结合元件。下一步我们将通过改变Ｍｉｐｕｌ的表达水
平来观察Ｍｉｐｕｌ及Ｍｉｐｕｌ所调控的凋亡相关基因表
达在心肌细胞缺氧复氧中的作用，为减轻心肌缺
血一再灌注损伤提供新的理论依据。
参考文献：
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ＫＲＡＢ／Ｃ２Ｉ－Ｉ２ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｐｕｌ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ
Ｃｏｍｍｕｎ，２００７，３５６（４）：８２９—８３５．
（收稿１３期：２０１２－０２－２０）
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