2024年4月27日发(作者：公冶溪)
生命科学与实验研究
生物技术
^世界
羊肚菌液体发酵培养基的优化及发酵液成分分析
胡彦营赵强屈虹男
(济宁学院生命科学与工程系山东曲阜273155)
摘要:
通过液体深层发酵获得羊肚菌菌丝体和发酵液为羊肚菌的开发利用提供了新的途径，本文以胞内多糖和胞外多糖为综合指标，对羊肚菌的
最佳培养基组成进行了优化，并对羊肚菌发酵液的成分进行了分析。
关键词:
羊肚菌液体培养基正交优化成分分析
中图分类号:
Q
3-3 文献标识码
:A
文章编号:1674-2060(2015)09-0008-02
Optimization
of
the
Liquid
Fermentation
Medium
of
Morchella
and
compositional
analysis
of
its
Fermentation
Broth
Hu
Yanying
Zhao
Qiang
Qu
Hongnan
(Department
of
Life
Science
and
Engineering，Jining
University
，
Qufu，Shandong
Province
，273155 )
AbSt
「
aCt
:
Mycelium
and
submerged
fermentation
Broth
provides
a
new
way
for
the
development
and
utilization
of
Morchella
.
In
this
paper，the
best
medium
composition
of
Morchella
had
been
optimized
using
the
extracellular
polysaccharide
and
intracellular
polysaccharide
yield
as
the
indicators
.
And
the
compositions
of
the
Morchella
fermentation
broth
were
analyzed
in
this
study
.
Key
W
〇
rdS
：
Morchella
;
liquid
medium
;
orthogonal
optimization
;
compositional
analysis
羊肚菌的药用价值及营养价值很高，但由于野生羊肚菌产量极小且其人工栽培技术未取得关键突破，致使市场上羊肚菌供不应
表1培养基组成优化实验设计表
- '
B
(
NH
4)2
S
〇4%
CK2HPO4
%
水平
1
2
3
A
葡萄糖％
DMgS
〇4%
求,价格居高不下，这严重限制了羊肚菌的开发和应用[1]。液体深层
发酵技术具有条件易控制、菌体生长速度快、产等优点，为羊肚菌的
开发利用提供了新的途径[2]。目前国内外对于羊肚菌的液体深层发
酵技术有了一定的研究，但对于其发酵液成分的研究鲜有报道[1，3]，
本文拟对羊肚菌的液体培养基进行优化，并对其发酵液的成分进行
2
3
4
0.25
0.5
0.75
0.05
0.1
0.15
0.05
0.1
0.15
表2羊肚菌发酵培养基的确定
实验
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K11
K
12
K
13
R
1
K
21
K
22
K
23
R
2
A
葡萄糖％
B
(
NH
4)2
S
〇4%
CK
2
HP
〇4%
DMgS
〇4%胞外多糖
g
/100
ml
0.1734
0.1903
0.1366
0.1113
0.2064
0.1872
0.1579
0.2075
0.1477
胞内多糖
mg
/
g
菌丝
41.98
56.84
35.06
47.34
52.88
58.23
45.95
51.49
39.31
1
1
1
2
2
2
3
3
3
0.167
0.168
0.171
0.004
44.627
52.817
45.583
8.19
1
2
3
1
2
3
1
2
3
0.148
0.201
0.157
0.053
45.09
53.737
44.2
9.537
1
2
3
2
3
1
3
1
2
0.189
0.15
0.167
0.039
50.567
47.83
44.63
5.937
1
2
3
3
1
2
2
3
1
0.176
0.178
0.152
0.026
44.723
53.673
44.63
9.043
注:
K
1*，
R
1分别的是胞外多糖的均值和极差,
K
2*，
R
2分别的是胞内多糖的均值和极差。
基金项目：山东省高校科技计划项目(
J
10
LB
58)，济宁学院科研基金项目（2010
KJLX
03)
8
生物技术世界日
lOTECHWORLD
生物技术
~世界
生命科学与实验研究
平。经优化,确定了
A
2
B
2
C
1
D
2为羊肚菌液体发酵的最佳培养基组
初步分析,以期为羊肚菌及其发酵产品的开发利用提供一定参考。
1材料和方法
1.1材料
菌种:羊肚菌，本实验室保存
基础培养基[4]:葡萄糖2.5%、(
NH
4)2
S
〇4 0.5%、
KH
2
P
〇4 0.
1%、
MgS
〇4 0.1%
其它主要试剂:苯酚、考马斯亮蓝试剂、3,5-二硝基水杨酸试
剂、浓硫酸
1.2主要仪器设备
立式压力蒸汽灭菌锅、无菌操作台、
HY
-6双层调速震荡仪、智
能型电热恒温鼓风干燥箱、电子天平、紫外可见分光光度计、
SHD
-
ffl
型循环水式多用真空泵、台式离心机、
pH
计、生化恒温培养箱
1.3实验方法
1.3.1羊社菌最佳培养基的确定
根据基础培养基，以葡萄糖、(
NH
4)2
S
〇4、、
KH
2
P
〇4、
MgS
〇4
四个因素设计
L
9(34)的正交实验[4]，如表1，以羊肚菌菌丝体多糖和发
酵液中的胞外多糖为指标，对羊肚菌培养基成分进行优化：
1.3.2羊社菌多糖的测定[5-71
羊肚菌胞外多糖测定方法:苯酚-硫酸法，首先绘制葡萄糖标准
曲线，准确吸取羊肚菌发酵溶液2
ml
,加6%的苯酚溶液1
ml
,慢慢地
加5
ml
浓硫酸，混匀后沸水浴中加热15
min
，冷却后，在495
nm
波长处
测定吸光度值，根据标准曲线计算羊肚菌胞外多糖含量。
羊肚菌胞内多糖测定方法:收集羊肚菌菌丝，无菌水清洗干净
后，加30倍的比例加人0.5
mol
/
L
的
Na
〇
H
溶液，80
C
水浴浸提1
h
,过
滤，收集上清液，按苯酚-硫酸法测定多糖含量。
1.3.3发酵液蛋白质含量的测定[8,91:
考马斯亮蓝法:首先绘制标准蛋白质曲线,得到回归方程，取合
适发酵液，进行适当稀释后，加人考马斯亮蓝,混匀后，测定其595
nm
处吸光值,根据标准曲线计算得发酵液蛋白质含量。
1.3.4发酵液总糖和还原糖的测定[9,101
发酵液总糖测定:苯酚-硫酸法，同1.2.2。
发酵液还原糖测定:
DNS
法，首先绘制葡萄糖标准曲线，将发酵
液适当稀释后，取1.0
ml
,准确加人
DNS
试剂2.0
ml
,沸水浴加热
2
min
，冷却后补去离子水到15
ml
，在540
nm
波长下测定其吸光度。从
标准曲线求出样品中还原糖含量。
1.3.5发酵液总酸测
t
[
s
|:
NaOH
滴定法。
1.3.6发酵液灰分测定[8,91:灼烧法
2结果与分析
2.1苯酚-硫酸法葡萄糖标准曲线
苯酚硫酸法葡萄糖标准曲线的回归方程为
y
=0.0199
x
+0.
0093，
R
2=0.9995。
2.2羊肚菌最佳培养基的确定
根据1.2.1的方法，进行正交实验，羊肚菌发酵培养基组成优化
的实验结果如表2:
由表2的可知，不同组合发酵培养基，最终测定的多糖含量是不
同的，对实验结果进行极差分析，结果为:氮源(
NH
4)2
S
〇4是对胞外
多糖和胞内多糖的产生影响最大的因素，碳源葡萄糖对胞外多糖的
产生影响最小，
K
2
HP
〇4对胞内多糖的产生影响最小。根据以上结
果，以胞外多糖指标,最佳的培养基组成为
A
3
B
2
C
1
D
2,以胞内多糖
为指标，最佳的培养基组成为
A
2
B
2
C
1
D
2。这两个培养基组成差别不
大，除葡萄糖外，其余三种成分的组成都是一样的，我们考虑到成本
及葡萄糖对胞内多糖的合成影响比较小,故选择
A
2为葡萄糖的水
成，即葡萄糖3%，(
NH
4)2
S
〇4 0.5%，
K
2
HP
〇4 0.05%，
MgS
〇4 1%。
对正交实验优化出的最佳培养基组成进行液体发酵实验，结果
是胞外多糖产量是0.2091
g
/100
ml
,胞内多糖产量是58.31
mg
/
g
菌
丝，均高于正交实验中的各个组合。
2.3发酵液成分的测定
2.3.1
DNS
法葡萄糖标准曲线
DNS
法葡萄糖标准曲线的回归方程为
y
=0.1215
x
+0.021,
R
2=0.9971。
2.3.2蛋白质标准曲线
蛋白质标准曲线的回归方程为
y
= 5.1171
X
+ 0.0024,
R
2=
0.9985。
2.3.3羊社菌发酵液成分测定结果
按1.2中的一系列方法，对羊肚菌发酵液的粗蛋白、总糖、还原
糖、灰分、总酸进行测定，用
pH
测定发酵液的
pH
,结果为粗蛋白0.
128
g
/
L
,总糖1.363
g
/
L
,还原糖0.769
g
/
L
,灰分0.093
g
/
L
,总酸1.
39%，发酵液的
pH
为3.55。
3结论与讨论
羊肚菌多糖是羊肚菌的有效药用成分之一，本实验采用羊肚菌
胞外多糖和胞内多糖产量为综合指标对羊肚菌液体发酵培养基的
成分进行了优化，得到了两个多糖产量均较高的最佳培养基组成，
葡萄糖3%，(
NH
4)2
S
〇4 0.5%，
K
2
HP
〇4 0.05%，
MgS
〇4 1%。同时
对发酵液的成分进行了测定，结果为发酵液粗蛋白为0.128
g
/
L
,总
糖含量为1.363
g
/
L
，还原糖为0.769
g
/
L
，灰分为0.093
g
/
L
。
以上结果表明，羊肚菌液体发酵液成分多样，具有一定的营养
价值，且发酵液本身具有香味和甜味，口感较好。且有研究证明，羊
肚菌和香菇、灰树花、灵芝等食药用真菌一样,发酵液中除我们测定
的物质外，还含有丰富的氨基酸[11]，因此，该发酵液可用于研制新型
的保健饮品,其中含有的多糖可提取出来，用于新型药物的研发，具
有一定的社会意义。
参考文献
[1] 陈杭，郑林用，赵艳妮.我国羊肚菌的资源现状及开发应用[J].中国
食用菌.2014，(02):7-9.
[2] 刘青青，戴玄，陈今朝.羊肚菌液体发酵研究进展[J].北方园艺.
2015，(01):190-3.
[3] 吕晓莲，郭宏，贾建会，陶国琴，彭义交，郭鸿源，et al.羊肚菌发酵产
物功能性研究[J].食品科学.2013，(01):311-4.
[4] 杨建，张光宇，杜秀娟等.羊肚菌液体发酵培养基成分及培养条件
的优化[J].中国酿造.2013，(1⑴:113-6.
[5] 武秋立，安家彦.羊肚菌多糖提取、分离条件的选择[J].食品科
学.2005，(01):116-20.
[6] 贾建会，吕晓莲，樊利青.深层发酵羊肚菌多糖的提取、分离及纯
化研究[J].食品科学.2002，(04):59-63.
[7] 张利平，陈彦.羊肚菌多糖提取分离条件的研究[J].中国中医药信
息杂志.2009，(09):40-2.
[8] 王慧中，赵培洁，王冀平等.虫草头孢菌发酵废液成分分析及其再
利用[J].中国环境科学.2000，(02):180-3.
[9] 李兆兰，郑涛.灵芝菌丝体和发酵液有效成分及含量分析[J].中草
药.1994，(01):17-9+54.
[10] 郝利民，邢新会，张延坤等.裂褶菌发酵液化学成分分析及其抗缺
氧效果研究[J].食品科学.2007，(07):320-3.
[11] 余群力.羊肚菌深层发酵液的制备及营养含量分析[J].卫生研
究.1998，(05):65-7.
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2024年4月27日发(作者：公冶溪)
生命科学与实验研究
生物技术
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羊肚菌液体发酵培养基的优化及发酵液成分分析
胡彦营赵强屈虹男
(济宁学院生命科学与工程系山东曲阜273155)
摘要:
通过液体深层发酵获得羊肚菌菌丝体和发酵液为羊肚菌的开发利用提供了新的途径，本文以胞内多糖和胞外多糖为综合指标，对羊肚菌的
最佳培养基组成进行了优化，并对羊肚菌发酵液的成分进行了分析。
关键词:
羊肚菌液体培养基正交优化成分分析
中图分类号:
Q
3-3 文献标识码
:A
文章编号:1674-2060(2015)09-0008-02
Optimization
of
the
Liquid
Fermentation
Medium
of
Morchella
and
compositional
analysis
of
its
Fermentation
Broth
Hu
Yanying
Zhao
Qiang
Qu
Hongnan
(Department
of
Life
Science
and
Engineering，Jining
University
，
Qufu，Shandong
Province
，273155 )
AbSt
「
aCt
:
Mycelium
and
submerged
fermentation
Broth
provides
a
new
way
for
the
development
and
utilization
of
Morchella
.
In
this
paper，the
best
medium
composition
of
Morchella
had
been
optimized
using
the
extracellular
polysaccharide
and
intracellular
polysaccharide
yield
as
the
indicators
.
And
the
compositions
of
the
Morchella
fermentation
broth
were
analyzed
in
this
study
.
Key
W
〇
rdS
：
Morchella
;
liquid
medium
;
orthogonal
optimization
;
compositional
analysis
羊肚菌的药用价值及营养价值很高，但由于野生羊肚菌产量极小且其人工栽培技术未取得关键突破，致使市场上羊肚菌供不应
表1培养基组成优化实验设计表
- '
B
(
NH
4)2
S
〇4%
CK2HPO4
%
水平
1
2
3
A
葡萄糖％
DMgS
〇4%
求,价格居高不下，这严重限制了羊肚菌的开发和应用[1]。液体深层
发酵技术具有条件易控制、菌体生长速度快、产等优点，为羊肚菌的
开发利用提供了新的途径[2]。目前国内外对于羊肚菌的液体深层发
酵技术有了一定的研究，但对于其发酵液成分的研究鲜有报道[1，3]，
本文拟对羊肚菌的液体培养基进行优化，并对其发酵液的成分进行
2
3
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0.5
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表2羊肚菌发酵培养基的确定
实验
序号
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K11
K
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R
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K
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K
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A
葡萄糖％
B
(
NH
4)2
S
〇4%
CK
2
HP
〇4%
DMgS
〇4%胞外多糖
g
/100
ml
0.1734
0.1903
0.1366
0.1113
0.2064
0.1872
0.1579
0.2075
0.1477
胞内多糖
mg
/
g
菌丝
41.98
56.84
35.06
47.34
52.88
58.23
45.95
51.49
39.31
1
1
1
2
2
2
3
3
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0.167
0.168
0.171
0.004
44.627
52.817
45.583
8.19
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0.201
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53.737
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0.039
50.567
47.83
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5.937
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0.176
0.178
0.152
0.026
44.723
53.673
44.63
9.043
注:
K
1*，
R
1分别的是胞外多糖的均值和极差,
K
2*，
R
2分别的是胞内多糖的均值和极差。
基金项目：山东省高校科技计划项目(
J
10
LB
58)，济宁学院科研基金项目（2010
KJLX
03)
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平。经优化,确定了
A
2
B
2
C
1
D
2为羊肚菌液体发酵的最佳培养基组
初步分析,以期为羊肚菌及其发酵产品的开发利用提供一定参考。
1材料和方法
1.1材料
菌种:羊肚菌，本实验室保存
基础培养基[4]:葡萄糖2.5%、(
NH
4)2
S
〇4 0.5%、
KH
2
P
〇4 0.
1%、
MgS
〇4 0.1%
其它主要试剂:苯酚、考马斯亮蓝试剂、3,5-二硝基水杨酸试
剂、浓硫酸
1.2主要仪器设备
立式压力蒸汽灭菌锅、无菌操作台、
HY
-6双层调速震荡仪、智
能型电热恒温鼓风干燥箱、电子天平、紫外可见分光光度计、
SHD
-
ffl
型循环水式多用真空泵、台式离心机、
pH
计、生化恒温培养箱
1.3实验方法
1.3.1羊社菌最佳培养基的确定
根据基础培养基，以葡萄糖、(
NH
4)2
S
〇4、、
KH
2
P
〇4、
MgS
〇4
四个因素设计
L
9(34)的正交实验[4]，如表1，以羊肚菌菌丝体多糖和发
酵液中的胞外多糖为指标，对羊肚菌培养基成分进行优化：
1.3.2羊社菌多糖的测定[5-71
羊肚菌胞外多糖测定方法:苯酚-硫酸法，首先绘制葡萄糖标准
曲线，准确吸取羊肚菌发酵溶液2
ml
,加6%的苯酚溶液1
ml
,慢慢地
加5
ml
浓硫酸，混匀后沸水浴中加热15
min
，冷却后，在495
nm
波长处
测定吸光度值，根据标准曲线计算羊肚菌胞外多糖含量。
羊肚菌胞内多糖测定方法:收集羊肚菌菌丝，无菌水清洗干净
后，加30倍的比例加人0.5
mol
/
L
的
Na
〇
H
溶液，80
C
水浴浸提1
h
,过
滤，收集上清液，按苯酚-硫酸法测定多糖含量。
1.3.3发酵液蛋白质含量的测定[8,91:
考马斯亮蓝法:首先绘制标准蛋白质曲线,得到回归方程，取合
适发酵液，进行适当稀释后，加人考马斯亮蓝,混匀后，测定其595
nm
处吸光值,根据标准曲线计算得发酵液蛋白质含量。
1.3.4发酵液总糖和还原糖的测定[9,101
发酵液总糖测定:苯酚-硫酸法，同1.2.2。
发酵液还原糖测定:
DNS
法，首先绘制葡萄糖标准曲线，将发酵
液适当稀释后，取1.0
ml
,准确加人
DNS
试剂2.0
ml
,沸水浴加热
2
min
，冷却后补去离子水到15
ml
，在540
nm
波长下测定其吸光度。从
标准曲线求出样品中还原糖含量。
1.3.5发酵液总酸测
t
[
s
|:
NaOH
滴定法。
1.3.6发酵液灰分测定[8,91:灼烧法
2结果与分析
2.1苯酚-硫酸法葡萄糖标准曲线
苯酚硫酸法葡萄糖标准曲线的回归方程为
y
=0.0199
x
+0.
0093，
R
2=0.9995。
2.2羊肚菌最佳培养基的确定
根据1.2.1的方法，进行正交实验，羊肚菌发酵培养基组成优化
的实验结果如表2:
由表2的可知，不同组合发酵培养基，最终测定的多糖含量是不
同的，对实验结果进行极差分析，结果为:氮源(
NH
4)2
S
〇4是对胞外
多糖和胞内多糖的产生影响最大的因素，碳源葡萄糖对胞外多糖的
产生影响最小，
K
2
HP
〇4对胞内多糖的产生影响最小。根据以上结
果，以胞外多糖指标,最佳的培养基组成为
A
3
B
2
C
1
D
2,以胞内多糖
为指标，最佳的培养基组成为
A
2
B
2
C
1
D
2。这两个培养基组成差别不
大，除葡萄糖外，其余三种成分的组成都是一样的，我们考虑到成本
及葡萄糖对胞内多糖的合成影响比较小,故选择
A
2为葡萄糖的水
成，即葡萄糖3%，(
NH
4)2
S
〇4 0.5%，
K
2
HP
〇4 0.05%，
MgS
〇4 1%。
对正交实验优化出的最佳培养基组成进行液体发酵实验，结果
是胞外多糖产量是0.2091
g
/100
ml
,胞内多糖产量是58.31
mg
/
g
菌
丝，均高于正交实验中的各个组合。
2.3发酵液成分的测定
2.3.1
DNS
法葡萄糖标准曲线
DNS
法葡萄糖标准曲线的回归方程为
y
=0.1215
x
+0.021,
R
2=0.9971。
2.3.2蛋白质标准曲线
蛋白质标准曲线的回归方程为
y
= 5.1171
X
+ 0.0024,
R
2=
0.9985。
2.3.3羊社菌发酵液成分测定结果
按1.2中的一系列方法，对羊肚菌发酵液的粗蛋白、总糖、还原
糖、灰分、总酸进行测定，用
pH
测定发酵液的
pH
,结果为粗蛋白0.
128
g
/
L
,总糖1.363
g
/
L
,还原糖0.769
g
/
L
,灰分0.093
g
/
L
,总酸1.
39%，发酵液的
pH
为3.55。
3结论与讨论
羊肚菌多糖是羊肚菌的有效药用成分之一，本实验采用羊肚菌
胞外多糖和胞内多糖产量为综合指标对羊肚菌液体发酵培养基的
成分进行了优化，得到了两个多糖产量均较高的最佳培养基组成，
葡萄糖3%，(
NH
4)2
S
〇4 0.5%，
K
2
HP
〇4 0.05%，
MgS
〇4 1%。同时
对发酵液的成分进行了测定，结果为发酵液粗蛋白为0.128
g
/
L
,总
糖含量为1.363
g
/
L
，还原糖为0.769
g
/
L
，灰分为0.093
g
/
L
。
以上结果表明，羊肚菌液体发酵液成分多样，具有一定的营养
价值，且发酵液本身具有香味和甜味，口感较好。且有研究证明，羊
肚菌和香菇、灰树花、灵芝等食药用真菌一样,发酵液中除我们测定
的物质外，还含有丰富的氨基酸[11]，因此，该发酵液可用于研制新型
的保健饮品,其中含有的多糖可提取出来，用于新型药物的研发，具
有一定的社会意义。
参考文献
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