2024年7月11日发(作者：纵晨蓓)
20
天 津 化 工
2000
年第
3
期
Sevag
法去除白及多糖中蛋白的研究
3
齐慧玲
1
,
魏绍云
1
,
王继伦
1
,
高波
2
,
鲁格
2
,
苏同芳
2
(
1.
天津市职工化工学院 天津
300221
2.
南开大学分子生物学研究所 天津
300071
)
摘要
:
本文采用
Sevag
法对白及多糖中的游离蛋白进行去除
,
并根据不同条件时的去除效
果进行分析
,
找出了
Sevag
法在白及多糖游离蛋白去除中的实际应用条件。
关键词
:
Sevag
法、白及多糖、游离蛋白、吸光度
中图分类号
:TQ028.3
文献标识码
:B
文章编号
:1008-1267
(
2000
)
03-0020-02
Ξ
1
前言
2.2
实验步骤
2.2.1
准确称取白及粗多糖样品
0.0370g,
室温
白及是一种药材
,
具有收敛止血
,
消肿生肌的
效能。近年来又发现了白及具有抗肿瘤的作用。
因此对白及有效成分进行研究
,
开发其在医学上的
应用价值是很有意义的。对白及多糖的研究就是
其中之一。要对白及多糖的结构、组成等项目进行
测定分析
,
须先将白及粗多糖进行纯化。但粗多糖
中含有游离蛋白
,
影响多糖的分离提纯
,
因此在提
纯前需将游离蛋白除去。
Sevag
法是去除游离蛋白
的有效方法。在白及粗多糖溶液中加入氯仿—正
丁醇混合溶液进行充分振摇
,
将游离蛋白变性成为
不溶性物质
,
经离心分离去除
,
可达到去除的目
[1]
的。本文采用
Sevag
法对白及粗多糖中的游离蛋
下加入少量去离子水溶解
,
转置于
25ml
容量瓶中
稀释至刻度
,
摇匀。
2.2.2
取粗多糖溶液
4ml,
氯仿—正丁醇
(
预先配
制成体积比为
4
∶
1
混合液
)
溶液
1ml,
置于具塞试
管中
,
充分振摇
30min
后
,
经离心机离心
1min,
然
后将水相与氯仿相分开。
2.2.3
取
3ml
水相溶液置于比色皿中
,
用
751
紫
外分光光度计测定
280nm
处吸收值
A,
[2]
用去离
子水做空白溶液。测毕将溶液倒回试管中。
2.2.4
将水相再加入相当于其体积
1/4
的氯仿—
正丁醇溶液
,
重复上述过程
,
共计重复二次。
2.2.5
将样品溶液与氯仿—正丁醇溶液体积比改
为
3
∶
1
、
2
∶
1
、
1
∶
1,
重复前面操作。
白进行去除
,
发现经过一次氯仿—正丁醇溶液处理
后的多糖溶液中的含有游离蛋白
,
而去除中所用的
氯仿相中经检测含有一定量的多糖。针对所发现
的问题
,
通过各种条件的试验并对结果进行分析
,
找出了
Sevag
法在白及多糖游离蛋白去除的实际
应用条件。
3
结果讨论
3.1
数据处理与分析
2
实验
2.1
仪器及试剂
800
型离心沉淀器
(
4000r/min,
济南市医疗器
械厂
)
、
751G
型紫外分光光度计
(
上海分析仪器
厂
)
。
白及粗多糖
(
南开大学分子生物学研究所提
供
)
、氯仿
(
AR,
天津市化学试剂一厂
)
、正丁醇
(
AR,
天津天泰精细化学品有限公司进口分装
)
。
实验数据见表
1
。
由表
1
数据得出结论
:
(
1
)
在试剂用量达到样品溶液体积的
1/3
时
,
再增加试剂用量对去除结果无明显影响。
(
2
)
原液需经两次氯仿处理
,
方可达到去除终
点
(
终点
A=0.053
)
。
(
3
)
几种去除比例结果比较
,
以
3
∶
1
为最佳。
Ξ
收稿日期
:1999-10-29
基金项目
:
国家自然科学基金资助
(
资助号
:59773020
)
2000
年第
3
期天 津 化 工
表
1
测定数据
(
原样
A=0.154
)
21
样品体积∶氯仿—正丁醇
去除次数
A
1
30
4
∶
1
2
30
3
30
1
30
3
∶
1
2
30
3
30
1
30
2
∶
1
2
30
3
30
1
30
1
∶
1
2
30
3
30
0.0650.0570.0530.0550.0530.0530.0570.0530.0530.0550.0530.053
振摇时间
(
min
)
(
4
)
去除终点的
A
值是白及多糖结合蛋白的吸在蛋白去除中
,
要尽量缩短去除时间
,
同时还要
收
,
且结合蛋白不受
Sevag
法影响
,
可据此进行结合达到去除的目的
,
关键在于选择适当的振摇时间。
蛋白的定量检测。表
2
是不同振摇时间的去除数据
(
样品
:
氯仿—正丁
3.2
振摇时间对去除蛋白的影响
醇
3
∶
1
、原液
A=0.154
)
。
表
2
不同振摇时间对
A
值的影响
振摇时间
(
min
)
去除次数
A
1
20
231
30
231
40
23
0.0680.0580.0530.0560.0530.0530.0550.0530.053
由试验数据可知
,
每次振摇时间为
30min
时
,
时间将两次去除分离的氯仿相合并
,
加少量水洗涤
,
与效果的综合性最好。离心分离后
,
其水相用苯酚—硫酸法
[3]
进行
490nm
3.3
氯仿—正丁醇对测糖的影响
显色测定。经多次洗涤测定
,
数据见表
3
。
表
3
洗涤液在
490nm
时
A
值
(
原液
A=1.53
)
样品体积∶氯仿—正丁醇
氯仿相洗涤次数
洗涤水用量
(
mL
)
A
1
2
2
2
3
∶
1
3
2
4
2
1
2
2
2
2
∶
1
3
2
4
2
1
2
2
2
1
∶
1
3
2
4
2
0.1080.0760.0140.0090.2310.1000.0450.0230.3940.3040.1220.080
由上表看出
,
试剂用量大
,
溶在其中的糖越多
,
洗涤水用量越大。如将这部分糖损失掉
,
会影响糖
的定量测定和纯多糖的收率
,
但洗涤回收的溶液体
积过大
,
又会影响多糖的分离提纯
[4]
,
因此在选择
适当的去除比例时
,
不能忽略这个因素的影响。由
上面数据分析
,
虽然三种比例经两次处理均可达到
去除游离蛋白的目的
,
但只有
3
∶
1
比例的氯仿相经
三次洗涤后可将所含多糖基本回收
,
另外两种比例
的氯仿相经
4
次洗涤后仍有较大的吸收
,
因此
3
∶
1
比例仍是最佳选择。
上述操作。
(
3
)
将两次分离的氯仿相合并
,
加少量水洗涤
并分离
,
共洗涤三次。洗涤液与
(
2
)
中水相合并
,
即
可进行进一步提纯。
(
4
)
Sevag
法与紫外吸收法结合可进行游离蛋
白和结合蛋白的测定。
综上所述
,Sevag
法操作简便
,
去除速度快
,
损
失小
,
适用于对白及多糖游离蛋白的去除。
参考文献
:
[1]
吴东儒主编
.
糖类的生物化学
[M].
北京
:
高教出版
4
结论
综合以上分析
,
确定
Sevag
法去除白及多糖游
离蛋白的应用条件是
:
(
1
)
样品溶液与氯仿—正丁醇体积比为
3
∶
1
。
(
2
)
振摇
30min,
离心
1min,
然后将两相分开。
社
,1987.
[2]
郭勇主编
.
现代生化技术
[M].
广州
:
华南理工大学出
版社
,1982.
[3]
张惟杰主编
.
复合多糖生化研究技术
[M].
上海
:
上海
科技出版社
,1987.
[4]
鲁子贤主编
.
蛋白质和酶学研究方法
[M].
北京
:
科学
再向水相中加入其体积
1/3
的氯仿—正丁醇
,
重复
出版社
,1989.
2024年7月11日发(作者：纵晨蓓)
20
天 津 化 工
2000
年第
3
期
Sevag
法去除白及多糖中蛋白的研究
3
齐慧玲
1
,
魏绍云
1
,
王继伦
1
,
高波
2
,
鲁格
2
,
苏同芳
2
(
1.
天津市职工化工学院 天津
300221
2.
南开大学分子生物学研究所 天津
300071
)
摘要
:
本文采用
Sevag
法对白及多糖中的游离蛋白进行去除
,
并根据不同条件时的去除效
果进行分析
,
找出了
Sevag
法在白及多糖游离蛋白去除中的实际应用条件。
关键词
:
Sevag
法、白及多糖、游离蛋白、吸光度
中图分类号
:TQ028.3
文献标识码
:B
文章编号
:1008-1267
(
2000
)
03-0020-02
Ξ
1
前言
2.2
实验步骤
2.2.1
准确称取白及粗多糖样品
0.0370g,
室温
白及是一种药材
,
具有收敛止血
,
消肿生肌的
效能。近年来又发现了白及具有抗肿瘤的作用。
因此对白及有效成分进行研究
,
开发其在医学上的
应用价值是很有意义的。对白及多糖的研究就是
其中之一。要对白及多糖的结构、组成等项目进行
测定分析
,
须先将白及粗多糖进行纯化。但粗多糖
中含有游离蛋白
,
影响多糖的分离提纯
,
因此在提
纯前需将游离蛋白除去。
Sevag
法是去除游离蛋白
的有效方法。在白及粗多糖溶液中加入氯仿—正
丁醇混合溶液进行充分振摇
,
将游离蛋白变性成为
不溶性物质
,
经离心分离去除
,
可达到去除的目
[1]
的。本文采用
Sevag
法对白及粗多糖中的游离蛋
下加入少量去离子水溶解
,
转置于
25ml
容量瓶中
稀释至刻度
,
摇匀。
2.2.2
取粗多糖溶液
4ml,
氯仿—正丁醇
(
预先配
制成体积比为
4
∶
1
混合液
)
溶液
1ml,
置于具塞试
管中
,
充分振摇
30min
后
,
经离心机离心
1min,
然
后将水相与氯仿相分开。
2.2.3
取
3ml
水相溶液置于比色皿中
,
用
751
紫
外分光光度计测定
280nm
处吸收值
A,
[2]
用去离
子水做空白溶液。测毕将溶液倒回试管中。
2.2.4
将水相再加入相当于其体积
1/4
的氯仿—
正丁醇溶液
,
重复上述过程
,
共计重复二次。
2.2.5
将样品溶液与氯仿—正丁醇溶液体积比改
为
3
∶
1
、
2
∶
1
、
1
∶
1,
重复前面操作。
白进行去除
,
发现经过一次氯仿—正丁醇溶液处理
后的多糖溶液中的含有游离蛋白
,
而去除中所用的
氯仿相中经检测含有一定量的多糖。针对所发现
的问题
,
通过各种条件的试验并对结果进行分析
,
找出了
Sevag
法在白及多糖游离蛋白去除的实际
应用条件。
3
结果讨论
3.1
数据处理与分析
2
实验
2.1
仪器及试剂
800
型离心沉淀器
(
4000r/min,
济南市医疗器
械厂
)
、
751G
型紫外分光光度计
(
上海分析仪器
厂
)
。
白及粗多糖
(
南开大学分子生物学研究所提
供
)
、氯仿
(
AR,
天津市化学试剂一厂
)
、正丁醇
(
AR,
天津天泰精细化学品有限公司进口分装
)
。
实验数据见表
1
。
由表
1
数据得出结论
:
(
1
)
在试剂用量达到样品溶液体积的
1/3
时
,
再增加试剂用量对去除结果无明显影响。
(
2
)
原液需经两次氯仿处理
,
方可达到去除终
点
(
终点
A=0.053
)
。
(
3
)
几种去除比例结果比较
,
以
3
∶
1
为最佳。
Ξ
收稿日期
:1999-10-29
基金项目
:
国家自然科学基金资助
(
资助号
:59773020
)
2000
年第
3
期天 津 化 工
表
1
测定数据
(
原样
A=0.154
)
21
样品体积∶氯仿—正丁醇
去除次数
A
1
30
4
∶
1
2
30
3
30
1
30
3
∶
1
2
30
3
30
1
30
2
∶
1
2
30
3
30
1
30
1
∶
1
2
30
3
30
0.0650.0570.0530.0550.0530.0530.0570.0530.0530.0550.0530.053
振摇时间
(
min
)
(
4
)
去除终点的
A
值是白及多糖结合蛋白的吸在蛋白去除中
,
要尽量缩短去除时间
,
同时还要
收
,
且结合蛋白不受
Sevag
法影响
,
可据此进行结合达到去除的目的
,
关键在于选择适当的振摇时间。
蛋白的定量检测。表
2
是不同振摇时间的去除数据
(
样品
:
氯仿—正丁
3.2
振摇时间对去除蛋白的影响
醇
3
∶
1
、原液
A=0.154
)
。
表
2
不同振摇时间对
A
值的影响
振摇时间
(
min
)
去除次数
A
1
20
231
30
231
40
23
0.0680.0580.0530.0560.0530.0530.0550.0530.053
由试验数据可知
,
每次振摇时间为
30min
时
,
时间将两次去除分离的氯仿相合并
,
加少量水洗涤
,
与效果的综合性最好。离心分离后
,
其水相用苯酚—硫酸法
[3]
进行
490nm
3.3
氯仿—正丁醇对测糖的影响
显色测定。经多次洗涤测定
,
数据见表
3
。
表
3
洗涤液在
490nm
时
A
值
(
原液
A=1.53
)
样品体积∶氯仿—正丁醇
氯仿相洗涤次数
洗涤水用量
(
mL
)
A
1
2
2
2
3
∶
1
3
2
4
2
1
2
2
2
2
∶
1
3
2
4
2
1
2
2
2
1
∶
1
3
2
4
2
0.1080.0760.0140.0090.2310.1000.0450.0230.3940.3040.1220.080
由上表看出
,
试剂用量大
,
溶在其中的糖越多
,
洗涤水用量越大。如将这部分糖损失掉
,
会影响糖
的定量测定和纯多糖的收率
,
但洗涤回收的溶液体
积过大
,
又会影响多糖的分离提纯
[4]
,
因此在选择
适当的去除比例时
,
不能忽略这个因素的影响。由
上面数据分析
,
虽然三种比例经两次处理均可达到
去除游离蛋白的目的
,
但只有
3
∶
1
比例的氯仿相经
三次洗涤后可将所含多糖基本回收
,
另外两种比例
的氯仿相经
4
次洗涤后仍有较大的吸收
,
因此
3
∶
1
比例仍是最佳选择。
上述操作。
(
3
)
将两次分离的氯仿相合并
,
加少量水洗涤
并分离
,
共洗涤三次。洗涤液与
(
2
)
中水相合并
,
即
可进行进一步提纯。
(
4
)
Sevag
法与紫外吸收法结合可进行游离蛋
白和结合蛋白的测定。
综上所述
,Sevag
法操作简便
,
去除速度快
,
损
失小
,
适用于对白及多糖游离蛋白的去除。
参考文献
:
[1]
吴东儒主编
.
糖类的生物化学
[M].
北京
:
高教出版
4
结论
综合以上分析
,
确定
Sevag
法去除白及多糖游
离蛋白的应用条件是
:
(
1
)
样品溶液与氯仿—正丁醇体积比为
3
∶
1
。
(
2
)
振摇
30min,
离心
1min,
然后将两相分开。
社
,1987.
[2]
郭勇主编
.
现代生化技术
[M].
广州
:
华南理工大学出
版社
,1982.
[3]
张惟杰主编
.
复合多糖生化研究技术
[M].
上海
:
上海
科技出版社
,1987.
[4]
鲁子贤主编
.
蛋白质和酶学研究方法
[M].
北京
:
科学
再向水相中加入其体积
1/3
的氯仿—正丁醇
,
重复
出版社
,1989.