2024年4月25日发(作者：陶骊雪)
中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ
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３７·
ｄｏｉ：１０．１１７５１／ＩＳＳＮ．１００２－１２８０．２０１８．０４．０７
氮源、碳源影响红色糖多胞菌发酵的研究
张萍，师文飞，黄文福，牛春
（宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川７５０１００）
［收稿日期］２０１７－１０—１３［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２—１２８０ Ｉ ２０１８）０４—００３７－０９［中图分类号］￥８５９．７９６
［摘 要］ 为进一步提高红色糖多胞菌发酵水平，采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ法、最陡爬坡实验和
Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设计，针对不同氮源、碳源进行摇瓶发酵研究，并利用Ｍｉｎｉｔａｂ １５软件进行二次回归分
析。结果表明，淀粉、糊精、玉米浆和黄豆饼粉对红霉素发酵效价影响较大，通过响应面法得到优化
发酵培养基最佳组成为：淀粉５２．３ Ｌ、糊精１４．０ ｇ／Ｌ、黄豆饼粉４５．３ ｇ／Ｌ、玉米浆１４．６ ｇ／Ｌ。在最优
培养基下，红霉素的产量达到７７６４ Ｕ／ｍＬ，比优化前提高了１２％。
［关键词］ 红色糖多胞菌；发酵培养基；响应面法
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｏｕｒｃｅｓ
ｏｎ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ
ＺＨＡＮＧ Ｐｉｎｇ，ＳＨＩ Ｗｅｎ—ｆｅｉ，ＨＵＡＮＧ Ｗｅｎ—ｆｕ，ＮＩＵ Ｃｈｕｎ
（ＮｉｎｇＸｉａ ＴａｉＲｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｃｏ Ｌｔｄ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５０１００，Ｃｈｉｎａ）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＮＩＵ Ｃｈｕｎ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｎｉｕｃｈｕｎ１９７４＠１６３．ｃｏｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｆｅｒｍｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒａｅａ，Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ，
ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ ｄｅｓｉｇｎ ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｂｏｎ
ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔ ｔｉｔｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｈａｋｉｎｇ ｆｌａｓｋ ｆｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｍｉｎｉｔａｂ一１ ５ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｗａｓ
ｕｓｅｄ ｆｏｒ ａ ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｔａｒｃｈ，ｄｅｘｔｒｉｎ，ＣＯＩＴ｜ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ａｎｄ ｓｏｙｂｅａｎ
ｍｅａｌ ｈａｖｅ ｇｒｅａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｅｉｎ．ｏｐｔｉｍｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ，ｄｅｘｔｉｒｎ，ｓｏｙｂｅａｎ
作者简介：张萍，兽医师，从事微生物发酵研究。
通讯作者：牛春。Ｅ—ｍａｉｌ：ｎｉｕｅｈｕｎ１９７４＠１６３．ｃｏｎ
Ｈｕ Ｂ Ｚ，Ｃａｉ Ｈ Ｊ，Ｓｏｎｇ Ｗ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｉｉｇｈｔ
ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｔｅａ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｔａｎｄｅｍ ｉｉｌａｓｓ
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ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
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Ｚｈｕ Ｆ Ｌ，Ｍａ Ｙ Ｈ，Ｚｈｏｕ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ
ｏｆ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ．Ｓｃｉ．
（编辑：侯向辉）
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３８ 中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ
ｍｅａｌ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ）ｗｅｒｅ ５２．３，１４．０，４５．３ ａｎｄ １４．６ ｇ／Ｌ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｗａｓ ７７６４ Ｕ／ｍＬ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ．Ａｂｏｕｔ １２％ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ
ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｔ ｏｐｔｉｍｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｅｎｖｉｓａｇｅ ｂｙ ＲＳＭ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
红霉素（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，Ｅｒ）是由红色糖多孢菌
（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）合成的１４元大环内酯
类抗生素，又被称为ｒｏｂｉｍｙｃｉｎ或ｅ—ｍｙｃｉｎ．包括
ＥｒＡ～ＥｒＦ １］
，
其中ＥｒＡ的抑菌活性最高。红霉素具
有广谱抗菌作用。其抗菌谱与青霉素相似ｌ２］，对革
兰阳性菌尤其敏感，对葡萄球菌、化脓性链球菌、绿
色链球菌、肺炎链球菌、梭状芽孢杆菌、白喉杆菌等
有较强的抑制作用，是治疗耐药性金黄色葡萄球菌
和溶血性链球菌感染而引起疾病的首选药物。临床
上可用于治疗对青霉素过敏的患者。近几年红霉素
衍生物的兴起，大大刺激了母体红霉素的需求［３ ］。
我国红霉素发酵水平属低水平重复操作，与发
达国家相比差距较大。目前国外发酵单位己达
８０００～１２０００ Ｕ／ｍＬ，而国内大多企业红霉素发酵水
平却一直在４０００～５０００ Ｕ／ｍＬｌ５］。红霉素发酵水平
主要受工作菌种、培养基组成、发酵条件控制以及
后期的分离提纯条件等多方面因素的影响，国内很
多科技工作者从红霉素发酵相关参数和调控人手，
希望提高红霉素发酵水平。对前期选育的一株高
产红霉素红色糖多孢菌菌株培养基进行了响应面
法优化，以使其更好的发挥菌株的生长特性，进一
步提高发酵液中红霉素产量。
１材料与方法
１．１ 材料
１．１．１供试菌株红色糖多孢菌，由宁夏泰瑞制药
股份有限公司技术研发中心菌种研究室选育、保藏
的高产菌株ＥＭ１５—１５。
１．１．２培养基及培养条件［６］ 种子培养基：含淀
粉、糊精、蛋白胨、葡萄糖、黄豆饼粉、ＮａＣ１、
（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、ＣａＣＯ３和油，
ｐＨ７．００。２５０ ｍＬ摇瓶装种子培养基３０ ｍＬ。２８℃，
２００ ｒ／ｍｉｎ培养４８～５２ ｈ。发酵培养基：含正丙醇、
（ＮＨ４）２ＳＯ 、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＣａＣＯ３、淀粉、糊精、黄
豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、葡萄糖和油，ｐＨ７．００。
２５０ ｍＬ摇瓶装发酵培养基３０ ｍＬ，接种量１０％．
２８℃。２２０ ｒ／ｍｉｎ培养７ ｄ
１．１－３主要试剂及原料玉米浆购自华北制药康
欣股份有限公司；（ＮＨ ） ＳＯ 、ＭｇＳＯ ·７Ｈ Ｏ、
ＫＨ ＰＯ 、糊精、蛋白陈和葡萄糖等，均为分析纯；红
霉素对照品，中国兽医药品监察所，批号：１３０３０７，
含量：８８３ Ｕ／ｍｇ。
１．２ 方法
１．２．１发酵液化学效价检测方法硫酸水解法 ．
发酵液经离心后，根据确定好的倍数吸取一定量
的滤液，用０．３５％碳酸钾液稀释。然后，取稀释液
２０ ｍＬ于分液漏斗中，加入醋酸丁醋２０ ｍＬ，振摇
３０ ｍｉｎ，放置分层，弃去下层水液，于丁醋液中加入
无水硫酸钠１ｇ左右（可酌量多加使丁醋液澄清），
振荡至透明。准确吸取其上层脱水液１０ ｍＬ于另
一
干燥的分液漏斗中，精确加入盐酸（０．１ ｍｏｌ／Ｌ）
１０ ｍＬ，振荡３０ ｍｉｎ，放置分层，把下层盐酸水液放
人试管中，从中吸取５ ｍＬ放人另一试管中，加人硫酸
（８ ｍｏｌ／Ｌ）５ ｍＬ，摇匀，放入５０℃水浴中，保温３０ ｍｉｎ
取出冷却，于４８３ ｎｍ测定吸光度值，以红霉素标准
品绘制标准曲线，计算发酵液红霉素的化学效价。
１．２．２ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计 选取
（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、ＣａＣＯ３、淀粉、
糊精、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、葡萄糖和正丙
醇１ １个因素，应用Ｍｉｎｉｔａｂ １５进行Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ
设计，从而筛选出影响红霉素效价的主要因素。
１．２．３最陡爬坡实验（ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ） 根
据Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验结果中各显著影响因素效
中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ ·３９·
２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ｍ ｕ
应的大小设定步长及变化方向，以快速逼近最佳响
应区域。而其他因素的取值则根据各因素效应的
正负和大小确定，正效应的因素均取较高值．负效
应的因素均取较低值。
１．２．４响应面法（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）
合度失拟（Ｌａｃｋ ｏｆ Ｆｉｔ）以Ｐ＞Ｏ．０５判定为失拟不显
著，说明回归模型与数据拟合较好。最后在一定的
● ●
水平范围内求取各因素的最佳值。
２结果与分析
●
２．１ 红霉素发酵效价主要氮源、碳源影响因子的
●
依据Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验和最陡爬坡实验确定的
实验因素与水平，采用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ实验设计发酵
培养基进行４因素３水平的响应面分析实验。每
个因素取三个水平，以（一１，０，１）编码，根据相应的
实验表进行实验后。对实验数据进行方差分析及多
元回归分析，方差分析及回归方程的显著性检验采
用Ｆ检验，以Ｐ＜０．０５判定为显著。多元回归模型
拟合度采用Ｒ－Ｓｑ表示，以Ｒ—Ｓｑ＞０．９判定为优：拟
确定在前期单因素试验的基础上选用Ｎ＝２０的
。 ●
Ｐｌａｃｋｅｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计，对淀粉（Ａ）、糊精（Ｂ）、
玉米浆（Ｃ）、棉籽饼粉（Ｄ）、黄豆饼粉（Ｅ）、葡萄糖
（Ｆ）、（ＮＨ ） ＳＯ （Ｇ）、ＭｇＳＯ ·７Ｈ：Ｏ（Ｈ）、ＣａＣＯ，
●
（Ｊ）、油（Ｋ）和正丙醇（Ｌ）１１个因素进行了考察，每个
因素取高（＋）、低（一）两水平，高水平约为低水平的
１．２５倍，响应值为红霉素的效价（Ｙ），试验设计及结
果见表１，因素水平取值、效应及显著性分析见表２。
● ，
表１ Ｎ＝２０的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ试验设计及结果
Ｔａｂ １ Ｎ＝２０ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ
●
试验号 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｊ Ｋ Ｌ 效价／（Ｕ．ｍＬ一 ）
６３Ｏ４
５５７８
● ●
５８５３
● ●
７１２０
５８６３
６３８５
６５３３
５８８８
７１０４
５８４９
７２０８
６８８ｌ
７１８４
６６４４
６３５０
６４２８
６４ｌ３
７５９５
６２３８
７４３４
‘
４０。 中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ０ｆ Ｖｅｔｅｆｉｎ￣Ｄｒａｇ
由表２可知淀粉、糊精、黄豆饼粉、玉米浆发酵
液中红霉素的效价有显著性影响，其中糊精和黄豆
饼粉影响极显著。选出具有显著性影响的４个因
素做最陡爬坡试验。这４个因素都有显著负效应，
因此在以后的实验中应减少加量。
实情形，要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响
应面拟合方程。根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验结果。
确定不显著因素的水平，表现为正效应的因素取高
水平。表现为负效应的因素取低水平。显著因素的
变化步长及方向的实验设计及结果表明（表３），第
２．２ 最陡爬坡实验接近最大响应面区域，响应
３组效价最高，因此以第３组的水平作为响应面实
验的中心点。
面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真
表３最陡爬坡试验设计及结果
Ｔａｂ ３ Ｔｈｅ ｓｔｅｅｐｅｓｔ ｓｌｏｐｅ ｔｅｓｔ ｄｅｓｉ￣ａｎｄ ｒｅｓｕｌ￣
２．３ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设计及分析结果根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ— 作为中心点，以红霉素效价为响应值（Ｙ），利用
Ｍｉｎｉｔａｂ １５响应面分析中的Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设计， Ｂｕｒｍａｎ实验和最陡爬坡实验得出淀粉５２．０ Ｌ，
糊精１４．０ Ｌ，黄豆饼粉４８．０ ｇ／Ｌ，玉米浆１５．０ Ｌ 设计４因素３水平的实验．各因素水平见表４，
中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ ‘４１‘
Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ实验设计及结果见表５。通过对数据
进行二次多元回归拟合，得到二次多项式方程：
Ｙ＝一３０６８０６＋５１６７．８１Ａ＋６７７７．１７Ｂ一３５２．２５０Ｅ
＋１９０８８．６Ｃ一４４．３９８４Ａ 一３ １０．３７５Ｂ 一１６．１７１９Ｅ 一
４９５．２５０Ｃ ＋５２．６２５０ＡＢ＋２１．５０００ＡＥ一１５２．６２５ＡＣ一
２３．６２５０ＢＥ＋１７．００００ＢＣ＋６９．９３７５ＣＥ
表４因素水平编码表
Ｔａｂ ４ Ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌ ｃｏｄｉｎｇ ｔａｂｌｅ
表５ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计及结果
Ｔａｂ ５ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ
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４２。 ＩＩ１同兽药杂志２０Ｉ ８年４月第５２卷第４期 ｃｈｉｎｅｓｅ ＪＯｉｌｌ＇ｌｌａ｜０ｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａ Ｄ ｒＬＪｇ
通过Ｍｉｎｉｔａｂ １５软件对试验数据和模型进行分
Ｒ—Ｓｑ＝９４．０４％，说明模型可以解释９４．０４％试验所
析，采川置信度为９５％，结果见表６。可以看出．该
二次 Ｕ Ｉ模型极为 蔷（Ｐ＝０．０００），失拟项不 著
（， ０．１７３１），说明模 与试验拟合良好．町以用于
红镌索效价的分忻和预测。方程的决定系数
得发酵效价的变化，进一步说明该模型拟合程度
良好。
依据回归方程，利用Ｍｉｎｉｔａｂ １５软件绘出响应
『ｆｆＩ面图和等高线『剥，结果见图１和罔２． ．
表６二次多项式的方差分析
Ｔａｂ ６ Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌｓ
Ｒ— ｌ二９４．０４＂／￣
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图１淀粉、糊精、黄豆饼粉和玉米浆对红霉素效价交互影响的曲面图
Ｆｉｇ １ Ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ，ｄｅｘｔｒｉｎ，ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ｏｎ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｔｉｔｅｒｓ
中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期
一
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ
一
·４３·
效价／（ｕ 一 ）
效价／（Ｕ－ｍＬ一 ）
：＝＝
＼
鬻
餐
巷
辍
淀粉ｌ（ｇ·Ｉ『 ）
一
淀粉ｌ（ｇ－Ｌ－ ）
一
效价／（ｕ衄Ｌ一１）
效价／（Ｕ＿ｎｌＬ－，）
、＿，
鬃
黄豆饼粉／（ｇ－Ｌ－Ｉ） 淀粉／（ｇ·Ｌ一 ）
图２淀粉、糊精、黄豆饼粉和玉米浆对红霉素效价交互影响的等高线图
Ｆｉｇ ２ Ｃｏｎｔｏｕｒｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ，ｄｅｘｔｒｉｎ，ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ｏｎ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｔｉｔｅｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
等高线的形状可以反映因素问交互作用的强
弱大小，圆形表示交互作用不显著。椭圆形表示交
互作用显著［８］。淀粉一糊精的交互作用、淀粉一黄
与预测值７７３４ Ｕ／ｍＬ十分接近。同时，与原发酵培
养基比较，红霉素效价提高了１２％。
３讨论与结论
豆饼粉的交互作用、淀粉一玉米浆的交互作用以及
黄豆饼粉一玉米浆的交互作用的等高线均呈椭圆
形，表明淀粉一糊精、淀粉一黄豆饼粉、淀粉一玉米浆
以及黄豆饼粉一玉米浆的交互作用均对红霉素的效
价有显著性影响。利用Ｍｉｎｉｔａｂ １５软件中的响应优
化器对试验模型进行分析，得到淀粉含量为５２．３ ｇ／
Ｌ、糊精含量为１４．０异／Ｌ、黄豆饼粉含量为４５．３ ｇ／Ｌ
和玉米浆含量为１４．６ ｇ／Ｌ时，红霉素效价（Ｙ）预测
最大值为７７３４ Ｕ／ｍＬ
在红霉素的发酵生产中常采用的菌种为红色
糖多胞菌Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ。１９５２年从具有不同抗生素
活性的菌种中分离出Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＮＲＲＬ２３３８。起初
该菌种的红霉素产量仅为０．２５～１．０ ｇ／Ｌ。但在
２００５年有报道其产量已经达到１Ｏ～１３ Ｌ［ 。在
红霉素产量提升的过程中，菌种选育和发酵工艺优
化起着重要角色。目前，传统的紫外诱变、氯化锂
诱变、离子注入等方法仍被生产企业用来提高红霉
素产量 ｌ。。“］。工业生产菌株多为经过多次诱变后
２．４响应面优化结果的验证根据最优化结果配 的高产菌株，但“诱变疲劳”效应使传统诱变方法很
制发酵培养基，分批次（３次）发酵，红霉素发酵效
难在提高产物产量方面再有较大突破。因此，代谢
工程手段渐渐成为企业提高红霉素产量的突破口，
价分别为７８２１、７７０９和７７６２ Ｕ／ｍＬ，均值７７６４ Ｕ／ｍＬ。
·
４４‘ 中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ
红霉素发酵工艺优化已作为企业研究的重中之重。
红霉素发酵培养基的主要成份为淀粉和黄豆
饼粉［１ 。在红霉素工业生产中，降低原料成本是
提高企业效益的有效手段，所以在国内出现了较多
的采用廉价氮源替代昂贵氮源的报道。王晓磊等
采用玉米粉水解物作为碳源在３０吨发酵罐规模上
使发酵单位提高了５．８％．综合成本降低了
２６．０％ｌ１引
。
张金国等采用廉价Ａ粉和Ｂ粉替代淀
粉、葡萄糖和黄豆饼粉后在ｌ０吨罐规模下产量提
高了６．１１％［１４］。Ｚｏｕ等在初始培养基中添加玉米浆
促进了菌体的前期生长，最终红霉素效价提高了
２２．２％Ｉ１
。
Ｅ１一Ｅｎｓｈａｓｙ等采用甘蔗糖蜜替代葡萄
糖后结合补加正丙醇工艺使红霉素产量提高了
３３．Ｏ％［
研究采用响应面法对红霉素发酵培养基中氮
源和碳源进行了优化。首先．用Ｐｌａｅｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ
试验设计法选出了对红霉素效价有显著性影响的４
个因素，分别是淀粉、糊精、玉米浆和黄豆饼粉；然
后用最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域：最后通过
Ｆａｃｔｏｒｓ＝４。Ｒｕｎ＝２７的Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设计进行优化。
得出红霉素最佳发酵培养基配方：淀粉５２．３ ｇ／Ｌ、糊
精１４．０ ｇ／Ｌ、黄豆饼粉４５．３ Ｌ、玉米浆１４．６ ｇ／Ｌ、
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ８．０ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３
５．４ ｇ／Ｌ、棉籽饼粉２０．０ ｇ／Ｌ、葡萄糖２０．０ ｇ／Ｌ、正丙
醇１０．０ ｍＬ／Ｌ、油２Ｏ ｍＬ／Ｌ，与华承伟等 ６ 做的优化
结果基本一致。优化后的配方经过发酵之后测得
红霉素效价为７７６４ Ｕ／ｍＬ，比原配方提高了１２％。
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（编辑：李文平）
2024年4月25日发(作者：陶骊雪)
中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ
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３７·
ｄｏｉ：１０．１１７５１／ＩＳＳＮ．１００２－１２８０．２０１８．０４．０７
氮源、碳源影响红色糖多胞菌发酵的研究
张萍，师文飞，黄文福，牛春
（宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川７５０１００）
［收稿日期］２０１７－１０—１３［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２—１２８０ Ｉ ２０１８）０４—００３７－０９［中图分类号］￥８５９．７９６
［摘 要］ 为进一步提高红色糖多胞菌发酵水平，采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ法、最陡爬坡实验和
Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设计，针对不同氮源、碳源进行摇瓶发酵研究，并利用Ｍｉｎｉｔａｂ １５软件进行二次回归分
析。结果表明，淀粉、糊精、玉米浆和黄豆饼粉对红霉素发酵效价影响较大，通过响应面法得到优化
发酵培养基最佳组成为：淀粉５２．３ Ｌ、糊精１４．０ ｇ／Ｌ、黄豆饼粉４５．３ ｇ／Ｌ、玉米浆１４．６ ｇ／Ｌ。在最优
培养基下，红霉素的产量达到７７６４ Ｕ／ｍＬ，比优化前提高了１２％。
［关键词］ 红色糖多胞菌；发酵培养基；响应面法
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｏｕｒｃｅｓ
ｏｎ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ
ＺＨＡＮＧ Ｐｉｎｇ，ＳＨＩ Ｗｅｎ—ｆｅｉ，ＨＵＡＮＧ Ｗｅｎ—ｆｕ，ＮＩＵ Ｃｈｕｎ
（ＮｉｎｇＸｉａ ＴａｉＲｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｃｏ Ｌｔｄ，Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５０１００，Ｃｈｉｎａ）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＮＩＵ Ｃｈｕｎ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｎｉｕｃｈｕｎ１９７４＠１６３．ｃｏｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｆｅｒｍｅｎｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒａｅａ，Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ，
ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ ｄｅｓｉｇｎ ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｂｏｎ
ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔ ｔｉｔｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｈａｋｉｎｇ ｆｌａｓｋ ｆｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｍｉｎｉｔａｂ一１ ５ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｗａｓ
ｕｓｅｄ ｆｏｒ ａ ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｔａｒｃｈ，ｄｅｘｔｒｉｎ，ＣＯＩＴ｜ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ａｎｄ ｓｏｙｂｅａｎ
ｍｅａｌ ｈａｖｅ ｇｒｅａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｅｉｎ．ｏｐｔｉｍｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ，ｄｅｘｔｉｒｎ，ｓｏｙｂｅａｎ
作者简介：张萍，兽医师，从事微生物发酵研究。
通讯作者：牛春。Ｅ—ｍａｉｌ：ｎｉｕｅｈｕｎ１９７４＠１６３．ｃｏｎ
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Ｚｈｕ Ｆ Ｌ，Ｍａ Ｙ Ｈ，Ｚｈｏｕ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ
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（编辑：侯向辉）
·
３８ 中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ
ｍｅａｌ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ）ｗｅｒｅ ５２．３，１４．０，４５．３ ａｎｄ １４．６ ｇ／Ｌ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｗａｓ ７７６４ Ｕ／ｍＬ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｄｉｕｍ．Ａｂｏｕｔ １２％ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ
ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｔ ｏｐｔｉｍｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｅｎｖｉｓａｇｅ ｂｙ ＲＳＭ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
红霉素（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，Ｅｒ）是由红色糖多孢菌
（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）合成的１４元大环内酯
类抗生素，又被称为ｒｏｂｉｍｙｃｉｎ或ｅ—ｍｙｃｉｎ．包括
ＥｒＡ～ＥｒＦ １］
，
其中ＥｒＡ的抑菌活性最高。红霉素具
有广谱抗菌作用。其抗菌谱与青霉素相似ｌ２］，对革
兰阳性菌尤其敏感，对葡萄球菌、化脓性链球菌、绿
色链球菌、肺炎链球菌、梭状芽孢杆菌、白喉杆菌等
有较强的抑制作用，是治疗耐药性金黄色葡萄球菌
和溶血性链球菌感染而引起疾病的首选药物。临床
上可用于治疗对青霉素过敏的患者。近几年红霉素
衍生物的兴起，大大刺激了母体红霉素的需求［３ ］。
我国红霉素发酵水平属低水平重复操作，与发
达国家相比差距较大。目前国外发酵单位己达
８０００～１２０００ Ｕ／ｍＬ，而国内大多企业红霉素发酵水
平却一直在４０００～５０００ Ｕ／ｍＬｌ５］。红霉素发酵水平
主要受工作菌种、培养基组成、发酵条件控制以及
后期的分离提纯条件等多方面因素的影响，国内很
多科技工作者从红霉素发酵相关参数和调控人手，
希望提高红霉素发酵水平。对前期选育的一株高
产红霉素红色糖多孢菌菌株培养基进行了响应面
法优化，以使其更好的发挥菌株的生长特性，进一
步提高发酵液中红霉素产量。
１材料与方法
１．１ 材料
１．１．１供试菌株红色糖多孢菌，由宁夏泰瑞制药
股份有限公司技术研发中心菌种研究室选育、保藏
的高产菌株ＥＭ１５—１５。
１．１．２培养基及培养条件［６］ 种子培养基：含淀
粉、糊精、蛋白胨、葡萄糖、黄豆饼粉、ＮａＣ１、
（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、ＣａＣＯ３和油，
ｐＨ７．００。２５０ ｍＬ摇瓶装种子培养基３０ ｍＬ。２８℃，
２００ ｒ／ｍｉｎ培养４８～５２ ｈ。发酵培养基：含正丙醇、
（ＮＨ４）２ＳＯ 、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＣａＣＯ３、淀粉、糊精、黄
豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、葡萄糖和油，ｐＨ７．００。
２５０ ｍＬ摇瓶装发酵培养基３０ ｍＬ，接种量１０％．
２８℃。２２０ ｒ／ｍｉｎ培养７ ｄ
１．１－３主要试剂及原料玉米浆购自华北制药康
欣股份有限公司；（ＮＨ ） ＳＯ 、ＭｇＳＯ ·７Ｈ Ｏ、
ＫＨ ＰＯ 、糊精、蛋白陈和葡萄糖等，均为分析纯；红
霉素对照品，中国兽医药品监察所，批号：１３０３０７，
含量：８８３ Ｕ／ｍｇ。
１．２ 方法
１．２．１发酵液化学效价检测方法硫酸水解法 ．
发酵液经离心后，根据确定好的倍数吸取一定量
的滤液，用０．３５％碳酸钾液稀释。然后，取稀释液
２０ ｍＬ于分液漏斗中，加入醋酸丁醋２０ ｍＬ，振摇
３０ ｍｉｎ，放置分层，弃去下层水液，于丁醋液中加入
无水硫酸钠１ｇ左右（可酌量多加使丁醋液澄清），
振荡至透明。准确吸取其上层脱水液１０ ｍＬ于另
一
干燥的分液漏斗中，精确加入盐酸（０．１ ｍｏｌ／Ｌ）
１０ ｍＬ，振荡３０ ｍｉｎ，放置分层，把下层盐酸水液放
人试管中，从中吸取５ ｍＬ放人另一试管中，加人硫酸
（８ ｍｏｌ／Ｌ）５ ｍＬ，摇匀，放入５０℃水浴中，保温３０ ｍｉｎ
取出冷却，于４８３ ｎｍ测定吸光度值，以红霉素标准
品绘制标准曲线，计算发酵液红霉素的化学效价。
１．２．２ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计 选取
（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、ＣａＣＯ３、淀粉、
糊精、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、葡萄糖和正丙
醇１ １个因素，应用Ｍｉｎｉｔａｂ １５进行Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ
设计，从而筛选出影响红霉素效价的主要因素。
１．２．３最陡爬坡实验（ｓｔｅｅｐｅｓｔ ａｓｃｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ） 根
据Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验结果中各显著影响因素效
中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ ·３９·
２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ｍ ｕ
应的大小设定步长及变化方向，以快速逼近最佳响
应区域。而其他因素的取值则根据各因素效应的
正负和大小确定，正效应的因素均取较高值．负效
应的因素均取较低值。
１．２．４响应面法（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）
合度失拟（Ｌａｃｋ ｏｆ Ｆｉｔ）以Ｐ＞Ｏ．０５判定为失拟不显
著，说明回归模型与数据拟合较好。最后在一定的
● ●
水平范围内求取各因素的最佳值。
２结果与分析
●
２．１ 红霉素发酵效价主要氮源、碳源影响因子的
●
依据Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验和最陡爬坡实验确定的
实验因素与水平，采用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ实验设计发酵
培养基进行４因素３水平的响应面分析实验。每
个因素取三个水平，以（一１，０，１）编码，根据相应的
实验表进行实验后。对实验数据进行方差分析及多
元回归分析，方差分析及回归方程的显著性检验采
用Ｆ检验，以Ｐ＜０．０５判定为显著。多元回归模型
拟合度采用Ｒ－Ｓｑ表示，以Ｒ—Ｓｑ＞０．９判定为优：拟
确定在前期单因素试验的基础上选用Ｎ＝２０的
。 ●
Ｐｌａｃｋｅｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计，对淀粉（Ａ）、糊精（Ｂ）、
玉米浆（Ｃ）、棉籽饼粉（Ｄ）、黄豆饼粉（Ｅ）、葡萄糖
（Ｆ）、（ＮＨ ） ＳＯ （Ｇ）、ＭｇＳＯ ·７Ｈ：Ｏ（Ｈ）、ＣａＣＯ，
●
（Ｊ）、油（Ｋ）和正丙醇（Ｌ）１１个因素进行了考察，每个
因素取高（＋）、低（一）两水平，高水平约为低水平的
１．２５倍，响应值为红霉素的效价（Ｙ），试验设计及结
果见表１，因素水平取值、效应及显著性分析见表２。
● ，
表１ Ｎ＝２０的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ试验设计及结果
Ｔａｂ １ Ｎ＝２０ Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ
●
试验号 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ Ｇ Ｈ Ｊ Ｋ Ｌ 效价／（Ｕ．ｍＬ一 ）
６３Ｏ４
５５７８
● ●
５８５３
● ●
７１２０
５８６３
６３８５
６５３３
５８８８
７１０４
５８４９
７２０８
６８８ｌ
７１８４
６６４４
６３５０
６４２８
６４ｌ３
７５９５
６２３８
７４３４
‘
４０。 中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ０ｆ Ｖｅｔｅｆｉｎ￣Ｄｒａｇ
由表２可知淀粉、糊精、黄豆饼粉、玉米浆发酵
液中红霉素的效价有显著性影响，其中糊精和黄豆
饼粉影响极显著。选出具有显著性影响的４个因
素做最陡爬坡试验。这４个因素都有显著负效应，
因此在以后的实验中应减少加量。
实情形，要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响
应面拟合方程。根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验结果。
确定不显著因素的水平，表现为正效应的因素取高
水平。表现为负效应的因素取低水平。显著因素的
变化步长及方向的实验设计及结果表明（表３），第
２．２ 最陡爬坡实验接近最大响应面区域，响应
３组效价最高，因此以第３组的水平作为响应面实
验的中心点。
面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真
表３最陡爬坡试验设计及结果
Ｔａｂ ３ Ｔｈｅ ｓｔｅｅｐｅｓｔ ｓｌｏｐｅ ｔｅｓｔ ｄｅｓｉ￣ａｎｄ ｒｅｓｕｌ￣
２．３ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设计及分析结果根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ— 作为中心点，以红霉素效价为响应值（Ｙ），利用
Ｍｉｎｉｔａｂ １５响应面分析中的Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设计， Ｂｕｒｍａｎ实验和最陡爬坡实验得出淀粉５２．０ Ｌ，
糊精１４．０ Ｌ，黄豆饼粉４８．０ ｇ／Ｌ，玉米浆１５．０ Ｌ 设计４因素３水平的实验．各因素水平见表４，
中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ ‘４１‘
Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ实验设计及结果见表５。通过对数据
进行二次多元回归拟合，得到二次多项式方程：
Ｙ＝一３０６８０６＋５１６７．８１Ａ＋６７７７．１７Ｂ一３５２．２５０Ｅ
＋１９０８８．６Ｃ一４４．３９８４Ａ 一３ １０．３７５Ｂ 一１６．１７１９Ｅ 一
４９５．２５０Ｃ ＋５２．６２５０ＡＢ＋２１．５０００ＡＥ一１５２．６２５ＡＣ一
２３．６２５０ＢＥ＋１７．００００ＢＣ＋６９．９３７５ＣＥ
表４因素水平编码表
Ｔａｂ ４ Ｆａｃｔｏｒ ｌｅｖｅｌ ｃｏｄｉｎｇ ｔａｂｌｅ
表５ Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计及结果
Ｔａｂ ５ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ
·
４２。 ＩＩ１同兽药杂志２０Ｉ ８年４月第５２卷第４期 ｃｈｉｎｅｓｅ ＪＯｉｌｌ＇ｌｌａ｜０ｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａ Ｄ ｒＬＪｇ
通过Ｍｉｎｉｔａｂ １５软件对试验数据和模型进行分
Ｒ—Ｓｑ＝９４．０４％，说明模型可以解释９４．０４％试验所
析，采川置信度为９５％，结果见表６。可以看出．该
二次 Ｕ Ｉ模型极为 蔷（Ｐ＝０．０００），失拟项不 著
（， ０．１７３１），说明模 与试验拟合良好．町以用于
红镌索效价的分忻和预测。方程的决定系数
得发酵效价的变化，进一步说明该模型拟合程度
良好。
依据回归方程，利用Ｍｉｎｉｔａｂ １５软件绘出响应
『ｆｆＩ面图和等高线『剥，结果见图１和罔２． ．
表６二次多项式的方差分析
Ｔａｂ ６ Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌｓ
Ｒ— ｌ二９４．０４＂／￣
。５０，０
一￥００
目
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图１淀粉、糊精、黄豆饼粉和玉米浆对红霉素效价交互影响的曲面图
Ｆｉｇ １ Ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ，ｄｅｘｔｒｉｎ，ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ｏｎ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｔｉｔｅｒｓ
中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期
一
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ
一
·４３·
效价／（ｕ 一 ）
效价／（Ｕ－ｍＬ一 ）
：＝＝
＼
鬻
餐
巷
辍
淀粉ｌ（ｇ·Ｉ『 ）
一
淀粉ｌ（ｇ－Ｌ－ ）
一
效价／（ｕ衄Ｌ一１）
效价／（Ｕ＿ｎｌＬ－，）
、＿，
鬃
黄豆饼粉／（ｇ－Ｌ－Ｉ） 淀粉／（ｇ·Ｌ一 ）
图２淀粉、糊精、黄豆饼粉和玉米浆对红霉素效价交互影响的等高线图
Ｆｉｇ ２ Ｃｏｎｔｏｕｒｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ，ｄｅｘｔｒｉｎ，ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ ｏｎ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｔｉｔｅｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
等高线的形状可以反映因素问交互作用的强
弱大小，圆形表示交互作用不显著。椭圆形表示交
互作用显著［８］。淀粉一糊精的交互作用、淀粉一黄
与预测值７７３４ Ｕ／ｍＬ十分接近。同时，与原发酵培
养基比较，红霉素效价提高了１２％。
３讨论与结论
豆饼粉的交互作用、淀粉一玉米浆的交互作用以及
黄豆饼粉一玉米浆的交互作用的等高线均呈椭圆
形，表明淀粉一糊精、淀粉一黄豆饼粉、淀粉一玉米浆
以及黄豆饼粉一玉米浆的交互作用均对红霉素的效
价有显著性影响。利用Ｍｉｎｉｔａｂ １５软件中的响应优
化器对试验模型进行分析，得到淀粉含量为５２．３ ｇ／
Ｌ、糊精含量为１４．０异／Ｌ、黄豆饼粉含量为４５．３ ｇ／Ｌ
和玉米浆含量为１４．６ ｇ／Ｌ时，红霉素效价（Ｙ）预测
最大值为７７３４ Ｕ／ｍＬ
在红霉素的发酵生产中常采用的菌种为红色
糖多胞菌Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ。１９５２年从具有不同抗生素
活性的菌种中分离出Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ ＮＲＲＬ２３３８。起初
该菌种的红霉素产量仅为０．２５～１．０ ｇ／Ｌ。但在
２００５年有报道其产量已经达到１Ｏ～１３ Ｌ［ 。在
红霉素产量提升的过程中，菌种选育和发酵工艺优
化起着重要角色。目前，传统的紫外诱变、氯化锂
诱变、离子注入等方法仍被生产企业用来提高红霉
素产量 ｌ。。“］。工业生产菌株多为经过多次诱变后
２．４响应面优化结果的验证根据最优化结果配 的高产菌株，但“诱变疲劳”效应使传统诱变方法很
制发酵培养基，分批次（３次）发酵，红霉素发酵效
难在提高产物产量方面再有较大突破。因此，代谢
工程手段渐渐成为企业提高红霉素产量的突破口，
价分别为７８２１、７７０９和７７６２ Ｕ／ｍＬ，均值７７６４ Ｕ／ｍＬ。
·
４４‘ 中国兽药杂志２０１８年４月第５２卷第４期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ
红霉素发酵工艺优化已作为企业研究的重中之重。
红霉素发酵培养基的主要成份为淀粉和黄豆
饼粉［１ 。在红霉素工业生产中，降低原料成本是
提高企业效益的有效手段，所以在国内出现了较多
的采用廉价氮源替代昂贵氮源的报道。王晓磊等
采用玉米粉水解物作为碳源在３０吨发酵罐规模上
使发酵单位提高了５．８％．综合成本降低了
２６．０％ｌ１引
。
张金国等采用廉价Ａ粉和Ｂ粉替代淀
粉、葡萄糖和黄豆饼粉后在ｌ０吨罐规模下产量提
高了６．１１％［１４］。Ｚｏｕ等在初始培养基中添加玉米浆
促进了菌体的前期生长，最终红霉素效价提高了
２２．２％Ｉ１
。
Ｅ１一Ｅｎｓｈａｓｙ等采用甘蔗糖蜜替代葡萄
糖后结合补加正丙醇工艺使红霉素产量提高了
３３．Ｏ％［
研究采用响应面法对红霉素发酵培养基中氮
源和碳源进行了优化。首先．用Ｐｌａｅｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ
试验设计法选出了对红霉素效价有显著性影响的４
个因素，分别是淀粉、糊精、玉米浆和黄豆饼粉；然
后用最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域：最后通过
Ｆａｃｔｏｒｓ＝４。Ｒｕｎ＝２７的Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ设计进行优化。
得出红霉素最佳发酵培养基配方：淀粉５２．３ ｇ／Ｌ、糊
精１４．０ ｇ／Ｌ、黄豆饼粉４５．３ Ｌ、玉米浆１４．６ ｇ／Ｌ、
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ８．０ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３
５．４ ｇ／Ｌ、棉籽饼粉２０．０ ｇ／Ｌ、葡萄糖２０．０ ｇ／Ｌ、正丙
醇１０．０ ｍＬ／Ｌ、油２Ｏ ｍＬ／Ｌ，与华承伟等 ６ 做的优化
结果基本一致。优化后的配方经过发酵之后测得
红霉素效价为７７６４ Ｕ／ｍＬ，比原配方提高了１２％。
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ｍｏｌａｓｓｅｓ ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｔｂｒｏｕｇｈ ｃｕｌｔｉｖａｔｏｒ ｍｅｄｉｕｍ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
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（编辑：李文平）