2024年10月26日发(作者：泉怀桃)
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２００８年４月
保定学院学报
Ａｐｒ．２００８
第２１卷第２期
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＯＤＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
Ｖｏ１＿２ｌ Ｎｏ．２
【生物学研究】
棉花黄萎病拮抗细菌ＨＭＢ一１ ００５菌株的产芽孢条件
李术娜
（河北农业大学生命科学学院，河北保定０７１００１）
摘要：为提高棉花黄萎病拮抗细菌ＨＭＢ一１００５的芽孢形成率及芽孢数量，分析摇瓶发酵对芽孢形
成的主要影响因素．通过单因素试验和正交试验对ＨＭＢ一１００５菌株产芽孢条件进行分析，确定最佳摇瓶发
酵条件为：蔗糖１％、玉米粉２％、ＣａＣ１２・２Ｈ２０ ０．０２％和ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０ ０．２％、ｐＨ值为７．０、温度为３０℃、转速
为２００ ｒ／ｍｉｎ、接种量１０％、种龄２４ ｈ。在此优化条件下，发酵液中拮抗菌出芽率达到９０％以上．
关键词：棉花黄萎病；拮抗细菌；芽孢；发酵条件
中图分类号：Ｓ４３５、６２１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４—２４９４【２００８）０２—００３１－０４
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ）￣ｌ起的一种真菌性病害【１】，是对棉花危害最大的世界性
病害之一［２１．它发病面积广，造成的经济损失巨大，已成为影响棉花产量和品质的主要因素【３１．目前生物防治被认为
是最具有发展潜力的重要防治方法．随着环境保护要求的日益严格，以高效、低毒、低残留的环境合理型生物农药逐
步代替传统的高毒化学农药是农药发展的必然趋势．微生物农药作为生物合理型农药的一个重要组成部分，越来越
受到人们的重视［３－１１］．
芽孢是细菌在生长后期的细胞内形成的一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体，具有极强的抗热、抗辐射、抗化学
药物和抗静水压等一些特殊的性质，因此对芽孢形成条件的研究是极具意义的．由于芽孢较其营养体细胞易保藏，
复活率高，是制备生防菌制剂的理想存在形式，而获得高浓度、高活性的芽孢是关键．
本试验的目的就是在前期已筛选到对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌具有较高拮抗活性菌株ＨＭＢ一１００５的基础
上，通过对培养基成分、ｐＨ值、温度、转速等发酵条件的研究提高该菌的芽孢形成率，以提高其对恶劣的环境因素的
抗性，延长拮抗菌剂保存期和稳定活性，为该菌剂的商品化奠定理论基础．
１材料和方法
１．１试验菌株
试材为棉花黄萎病高活性拮抗菌ＨＭＢ一１００５菌株，由河北农业大学生命科学学院制药工程系实验室筛选并保存．
１．２试验试剂
ｃ源：葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、麦芽糖、Ｄ一果糖、麦芽糊精．
Ｎ源：蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、大豆饼粉、酪蛋白、玉米粉、黄豆饼粉．
无机盐：ＫＨ２Ｐ０４＂２Ｈ２０、ＮａＨ２Ｐ０４＂２Ｈ２０、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、ＣＨＳＯ４＊５Ｈ２０、ＭｇＳ０４＂７Ｈ２０、ＣａＣ１２＂２Ｈ２Ｏ、ＺｎＣ１２．
草酸铵结晶紫染液，０．５％番红染色液，加路哥氏碘液，９５％乙醇，香柏油．
１．３培养基种类
细菌培养基：蛋白胨１０ ｇ，牛肉膏５ ｇ，ＮａＣ１ ５ ｇ，琼Ｊ］￣１５ ｇ，蒸馏水１ ｏｏｏ ｍＬ，ＰＨ ７．２～７．４．ＮＢ培养基为ＮＡ的液体
形式．
种子培养基：蛋白胨１％，葡萄糖１％，ＮａＨ２Ｐ０４＂２Ｈ２０ ０．２％，ＭｇＳ０４￣７Ｈ２０ ０．０５％，ｐＨ ７．２～７．４．
基础培养基：蛋白胨２％，葡萄糖２％，ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２％，Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２０ ０．４％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％，ＣａＣ１２
收稿日期：２００８—０３—２０
基金项目：河北省自然科学基金（３９８１５２）
作者简介：李术娜（１９７２一），女，河北保定人，讲师
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３２
０．０２％．ｐＨ ７．２一 ７．４．
保定学院学报 ２００８年第２期
表１正交试验设计
发酵培养基：根据试验需要配制培养基或在基础培养基中添
加ｃ源、Ｎ源或无机盐配制培养基．
１．４ ＨＭＢ一１００５菌株种子培养
将斜面培养的供试菌株接种于装有种子培养基的三角瓶中，
于２００ｄｍｉｎ，３０℃，摇床培养１８ ｈ后使用，摇瓶容量为５００ｍＬ，装量
为１００ｍＬ．
１．５ ＨＭＢ一１００５菌株发酵培养
根据试验需要配制发酵培养基置于２５０ ｍＬＪ．角瓶中，装液量
为５０ ｍＬ，单因素改变ｃ源、Ｎ源、无机盐等条件进行培养基配方的正
交试验．液体菌种按１０％的接种量接种于发酵培养基，于２００ ｒ／ｍｉｎ，
３０℃，摇床培养４８ ｈ．
１．６测定方法
表２不同Ｃ源对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
血球计数板直接计数法和芽孢染色法测定芽
孢数【ｌｌＪ．
１．７正交试验
’ 配制不同浓度的发酵液，进行发酵培养．配方
见表１．
２结果与分析
以下试验每处理重复３次，芽孢生成率的数值
表示为：均数 ±标准差ｓ．
２．１不同Ｃ源对ＨＭＢ一１００５菌株发酵产芽孢的影响
分别以２％的葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、可
溶性淀粉、麦芽糖、Ｄ一果糖、麦芽糊精作为发酵培
养基的ｃ源，摇床培养．在不同时间取样观察芽孢
的生成情况，计算芽孢生成率，结果见表２．从表２
表３不同Ｎ源对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
可看出，培养９６ ｈ，各发酵液中芽孢生成率均较低，
可见Ｃ源对供试菌芽孢形成的影响不是主要的．试
验结果表明，蔗糖为最佳ｃ源．
２．２不同Ｎ源对ＨＭＢ一１００５菌株发酵产芽孢的影响
分别以２％的蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛
肉浸膏、大豆饼粉、酪蛋白、玉米粉、黄豆饼粉作为
发酵培养基的Ｎ源，摇床培养．在不同时间取样观
察芽孢的生成情况，计算芽孢生成率，结果见表３．
可看出，Ｎ源对芽孢形成的影响较大，培养７２ ｈ，玉
米粉发酵液中芽孢生成率达到９８．６９％．可见玉米
表４不同类型无机盐对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
粉为拮抗菌ＨＭＢ一１００５的最佳Ｎ源．
２．３不同无机盐对ＨＭＢ一１００５菌株
发酵产芽孢的影响
分别以０．０５％的ＫＨ２ＰＯ ・２Ｈ２０、ＮａＨ２ＰＯ ・
２Ｈ２０、ＭｎＳＯ４・Ｈ２０、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、
ＣａＣＩ：・２Ｈ：Ｏ、ＺｎＣＩ：作为发酵培养基的无机盐，摇床
培养．不同时间取样观察芽孢的生成情况，计算芽
孢生成率，结果见表４．可看出，单盐对供试菌的芽
注：一为无芽孢产生
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李术娜：棉花黄萎病拮抗细菌ＨＭＢ一１００５菌株的产芽孢条件 ３３
孢形成影响较大，且不同无机盐的芽孢形成差异较大．培养６０ ｈ，钙盐培养基中芽孢生成率达到８６．８４％，但铜盐与
锌盐几乎没有芽孢形成．结果表明，钙盐有利于芽孢形成．由于无机盐对菌体的形态和代谢等有很大影响，故培养
基中的无机盐采用复合盐，以ＮａＨ２ＰＯ ・
２Ｈ２０和ＣａＣ１２・２Ｈ２０作为拮抗菌ＨＭＢ一１００５
的最佳无机盐．
２．４正交检验
对发酵培养基进行优化，分别以不同
浓度组合的最适Ｃ源、Ｎ源、无机盐及ｐＨ值
配制培养基，分装５０ ｍＬ培养基于２５０ ｍＬ
表５不同浓度组合对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
三角瓶中，进行摇床培养．考察ｃ源、Ｎ源、
无机盐的浓度对拮抗菌芽孢形成的影响，
结果见表５．可以看出，４８ ｈ芽孢率较高，故
以４８ ｈ的结果进行方差分析，如表６．从表６
中可以看出，Ａ。Ｂ，ｃ。Ｄ：为最佳组合．因此，
优化后培养基为：蔗糖１％、玉米粉２％、
ＣａＣ１２・２Ｈ２０ ０．０２％和ＮａＨ２ ＰＯ４・２Ｈ２０ ０．２％．
表６正交检验
２．５不同ｐＨ值对ＨＭＢ一１００５菌株
发酵产芽孢的影响
以最适Ｃ源、Ｎ源、无机盐配制培养基，
接种前用ＮａＯＨ或ＨＣＩ调整起始ｐＨ值分别
为６．０、６．５、７．０、７．５、８．０，分装５０ ｍＬ培养基
于２５０ ｍＬ三角瓶，进行摇床培养．考察起始
ｐＨ值对拮抗菌芽孢形成的影响，结果见表
７．结果表明，起始ｐＨ值７．０时拮抗菌的芽孢
形成率最高．故ｐＨ值７．０是最适宜的起始
ｐＨ值．
２．６不同温度对ＨＭＢ一１００５菌株
发酵产芽孢的影响
以最适Ｃ源、Ｎ源、无机盐配制培养
基，分装５０ｍＬ培养基于２５０ｍＬ三角瓶，进
行摇床培养．调整摇床的温度分别为２０℃、
２５℃、３０℃、３７℃．考察温度对拮抗菌芽孢
形成的影响，结果见表８．结果表明，３０℃时
注：Ｋ代表均值，Ｒ代表极差．
表７ ｐＨ对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
拮抗菌的芽孢形成率最高，４８ ｈ芽孢产率
达到１００％．因此，３０℃为拮抗菌出芽的最
适温度。
２．７不同转速对ＨＭＢ一１００５菌株
发酵产芽孢的影响
以最适Ｃ源、Ｎ源、无机盐配制培养基，
表８温度对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
分装培养基５０ ｍＬ于２５０ ｍＬ三角瓶，进行摇
床培养．调整摇床的转速分别为１２０ ｒ／ｍｉｎ、
１８０ ｒ／ｍｉｎ、２００ ｒ／ｍｉｎ、２６０ ｒ／ｍｉｎ．由于摇床转
速能改变培养基的溶氧度，故摇床转速能
影响芽孢的形成．考察摇床转速对拮抗菌
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保定学院学报 ２００８年第２期
芽孢形成的影响，结果见表９．结果表明，２００ ｄｍｉｎ
时拮抗菌的芽孢形成率最高，７２ ｈ达￣１１９８．７ １％．因
此，２００ ｒ／ｍｉｎ为拮抗菌出芽的最适转速．
表９摇床转速（溶氧量）对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
３讨论
芽孢的形成并不是细菌生活史中的一个必要
过程，其形成与菌种本身有关，不同菌种形成条件
不同；同时芽孢形成还受到营养物质及环境因素
的影响．
本试验通过比较供试菌的出芽率，从而确定了棉花黄萎病拮抗菌产芽孢的最佳培养条件：培养基的Ｃ源为蔗
糖、Ｎ源为玉米粉、无机盐为ＣａＣＩ ・２Ｈ Ｏ、ｐＨ值为７．０、温度为３０℃、转速为２００ｄｍｉｎ、接种量１０％、种龄２４ ｈ．同时采用
正交试验对其发酵培养基进行了优化，优化后的培养基为：蔗糖１％、玉米粉２％、ＣａＣＩ ・２Ｈ Ｏ ０．０２％和ＮａＨ２ＰＯ ・
２Ｈ２０ ０．２％．在此优化条件下，发酵液中拮抗菌的出芽率达到９０％以上，最终生物量为６ｘ１０ ￣ｉ＂／ｍＬ．
培养基成分是影响芽孢形成的重要因素．培养基中ｃ源、Ｎ源、无机盐的种类和浓度均对芽孢形成有一定作用．
此外，氧气及ｐＨ值的不同、培养液中加入固态介质都可能对芽孢的生成产生影响．
本试验通过优化培养基组成使出芽率和最终生物量大大提高．为棉花黄萎病ＨＭＢ一１００５生防菌剂的大规模生
产奠定了基础．
参考文献：
［１］马平．棉花黄萎病生物防治研究进展［Ｊ］．河北农业科学，２００３，７（３）：３８２—３８５．
［２］李社增，马平，刘杏忠，等．利用拮抗细菌防治棉花黄萎病［Ｊ］．华中农业大学学报，２００１，２０（５）：４２２－－４２５．
［３］贾士荣．我国棉花基因工程的研究进展［Ｊ］．中国农业科技导报，２０００（２）：１８—２２．
［４］ＫＬ０ＥＰＰＥＲ Ｊ Ｗ，ＬＥＯＮＧ Ｊ，ＴＥＩＮＴＺＥ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ：Ａｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｅｘｐｌａｉｎｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｓｏｉｌｓ
［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，１９８０，４（５）：３１７—３２０．
［５］李术娜，杜红方，袁洪水，等．棉花黄萎病拮抗细菌Ｌｃ一０４菌株的抗菌蛋白产生条件研究［Ｊ］．棉花学报，２００６，１８（４）：２３３—２３７．
［６］周艳芬，杜红方，袁洪水，等．棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化［Ｊ］．棉花学报，２００７，１９（２）：９８—１０１．
［７］孙瑶，马平，朱宝成，等．棉花黄萎病菌拮抗细菌ＢＤＴ一２５的特性［Ｊ］．华北农学报，２００６，２１（６）：１１９—１２３．
平，王蔚，等．蜡质芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｓ ｕｃｅｒｅｕｓ）芽孢的形成与ＰＨＢ的关系［Ｊ］．山东大学学报（自然科学版），
［８］ＢＹＵＮＧ Ｃ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｐｏｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｕｒｉｎｇｇｉｅｎｓｉｓ ｂｙ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９２，１４（８）：７２１－７２６．
［９］郭秀君，郑
１９９４．２９（１）：１０１—１０８．
［１０１武汉大学，复旦大学．微生物学［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９８７．
［１１］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９９９．
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｐｏｒｅ ｏｆ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＭＢ－１００５
ａｇａｉｎｓｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ
ＬＩ Ｓｈｕ－ｎａ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＨｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｓｐｏｒｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎ ＨＭＢ一１００５ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｄａｈｌｉａｅ．Ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｈａｋｅ－ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ
ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｈａｋｉｎｇ ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｉｔｏｎ Ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗ：ｍｅｄｉａ
ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ １％ｓｕｃｒｏｓｅ，２％ｍａｉｚｅｎａ，０．０２％ＣａＣ１２・２Ｈ２０ ａｎｄ ０．２％ＮａＨ２ＰＯ４‘２Ｈ２０，ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ７．０ ａｎｄ １０％ｉｎｏｃｕｌａｍ
ｖｏｌｕｍｅ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３０℃，ｒｏｔａｔｉｎｇ ｓｐｅｅｄ ２００ ｒ／ｍｉｎ，ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ２４ ｈ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ
ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｅｘｃｅｅｄｓ ９０ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ；ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｓｐｏｒｅ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｉｔｏｎｓ
2024年10月26日发(作者：泉怀桃)
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２００８年４月
保定学院学报
Ａｐｒ．２００８
第２１卷第２期
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＯＤＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
Ｖｏ１＿２ｌ Ｎｏ．２
【生物学研究】
棉花黄萎病拮抗细菌ＨＭＢ一１ ００５菌株的产芽孢条件
李术娜
（河北农业大学生命科学学院，河北保定０７１００１）
摘要：为提高棉花黄萎病拮抗细菌ＨＭＢ一１００５的芽孢形成率及芽孢数量，分析摇瓶发酵对芽孢形
成的主要影响因素．通过单因素试验和正交试验对ＨＭＢ一１００５菌株产芽孢条件进行分析，确定最佳摇瓶发
酵条件为：蔗糖１％、玉米粉２％、ＣａＣ１２・２Ｈ２０ ０．０２％和ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０ ０．２％、ｐＨ值为７．０、温度为３０℃、转速
为２００ ｒ／ｍｉｎ、接种量１０％、种龄２４ ｈ。在此优化条件下，发酵液中拮抗菌出芽率达到９０％以上．
关键词：棉花黄萎病；拮抗细菌；芽孢；发酵条件
中图分类号：Ｓ４３５、６２１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４—２４９４【２００８）０２—００３１－０４
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ）￣ｌ起的一种真菌性病害【１】，是对棉花危害最大的世界性
病害之一［２１．它发病面积广，造成的经济损失巨大，已成为影响棉花产量和品质的主要因素【３１．目前生物防治被认为
是最具有发展潜力的重要防治方法．随着环境保护要求的日益严格，以高效、低毒、低残留的环境合理型生物农药逐
步代替传统的高毒化学农药是农药发展的必然趋势．微生物农药作为生物合理型农药的一个重要组成部分，越来越
受到人们的重视［３－１１］．
芽孢是细菌在生长后期的细胞内形成的一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体，具有极强的抗热、抗辐射、抗化学
药物和抗静水压等一些特殊的性质，因此对芽孢形成条件的研究是极具意义的．由于芽孢较其营养体细胞易保藏，
复活率高，是制备生防菌制剂的理想存在形式，而获得高浓度、高活性的芽孢是关键．
本试验的目的就是在前期已筛选到对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌具有较高拮抗活性菌株ＨＭＢ一１００５的基础
上，通过对培养基成分、ｐＨ值、温度、转速等发酵条件的研究提高该菌的芽孢形成率，以提高其对恶劣的环境因素的
抗性，延长拮抗菌剂保存期和稳定活性，为该菌剂的商品化奠定理论基础．
１材料和方法
１．１试验菌株
试材为棉花黄萎病高活性拮抗菌ＨＭＢ一１００５菌株，由河北农业大学生命科学学院制药工程系实验室筛选并保存．
１．２试验试剂
ｃ源：葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、麦芽糖、Ｄ一果糖、麦芽糊精．
Ｎ源：蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、大豆饼粉、酪蛋白、玉米粉、黄豆饼粉．
无机盐：ＫＨ２Ｐ０４＂２Ｈ２０、ＮａＨ２Ｐ０４＂２Ｈ２０、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、ＣＨＳＯ４＊５Ｈ２０、ＭｇＳ０４＂７Ｈ２０、ＣａＣ１２＂２Ｈ２Ｏ、ＺｎＣ１２．
草酸铵结晶紫染液，０．５％番红染色液，加路哥氏碘液，９５％乙醇，香柏油．
１．３培养基种类
细菌培养基：蛋白胨１０ ｇ，牛肉膏５ ｇ，ＮａＣ１ ５ ｇ，琼Ｊ］￣１５ ｇ，蒸馏水１ ｏｏｏ ｍＬ，ＰＨ ７．２～７．４．ＮＢ培养基为ＮＡ的液体
形式．
种子培养基：蛋白胨１％，葡萄糖１％，ＮａＨ２Ｐ０４＂２Ｈ２０ ０．２％，ＭｇＳ０４￣７Ｈ２０ ０．０５％，ｐＨ ７．２～７．４．
基础培养基：蛋白胨２％，葡萄糖２％，ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２％，Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２０ ０．４％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％，ＣａＣ１２
收稿日期：２００８—０３—２０
基金项目：河北省自然科学基金（３９８１５２）
作者简介：李术娜（１９７２一），女，河北保定人，讲师
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３２
０．０２％．ｐＨ ７．２一 ７．４．
保定学院学报 ２００８年第２期
表１正交试验设计
发酵培养基：根据试验需要配制培养基或在基础培养基中添
加ｃ源、Ｎ源或无机盐配制培养基．
１．４ ＨＭＢ一１００５菌株种子培养
将斜面培养的供试菌株接种于装有种子培养基的三角瓶中，
于２００ｄｍｉｎ，３０℃，摇床培养１８ ｈ后使用，摇瓶容量为５００ｍＬ，装量
为１００ｍＬ．
１．５ ＨＭＢ一１００５菌株发酵培养
根据试验需要配制发酵培养基置于２５０ ｍＬＪ．角瓶中，装液量
为５０ ｍＬ，单因素改变ｃ源、Ｎ源、无机盐等条件进行培养基配方的正
交试验．液体菌种按１０％的接种量接种于发酵培养基，于２００ ｒ／ｍｉｎ，
３０℃，摇床培养４８ ｈ．
１．６测定方法
表２不同Ｃ源对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
血球计数板直接计数法和芽孢染色法测定芽
孢数【ｌｌＪ．
１．７正交试验
’ 配制不同浓度的发酵液，进行发酵培养．配方
见表１．
２结果与分析
以下试验每处理重复３次，芽孢生成率的数值
表示为：均数 ±标准差ｓ．
２．１不同Ｃ源对ＨＭＢ一１００５菌株发酵产芽孢的影响
分别以２％的葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、可
溶性淀粉、麦芽糖、Ｄ一果糖、麦芽糊精作为发酵培
养基的ｃ源，摇床培养．在不同时间取样观察芽孢
的生成情况，计算芽孢生成率，结果见表２．从表２
表３不同Ｎ源对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
可看出，培养９６ ｈ，各发酵液中芽孢生成率均较低，
可见Ｃ源对供试菌芽孢形成的影响不是主要的．试
验结果表明，蔗糖为最佳ｃ源．
２．２不同Ｎ源对ＨＭＢ一１００５菌株发酵产芽孢的影响
分别以２％的蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛
肉浸膏、大豆饼粉、酪蛋白、玉米粉、黄豆饼粉作为
发酵培养基的Ｎ源，摇床培养．在不同时间取样观
察芽孢的生成情况，计算芽孢生成率，结果见表３．
可看出，Ｎ源对芽孢形成的影响较大，培养７２ ｈ，玉
米粉发酵液中芽孢生成率达到９８．６９％．可见玉米
表４不同类型无机盐对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
粉为拮抗菌ＨＭＢ一１００５的最佳Ｎ源．
２．３不同无机盐对ＨＭＢ一１００５菌株
发酵产芽孢的影响
分别以０．０５％的ＫＨ２ＰＯ ・２Ｈ２０、ＮａＨ２ＰＯ ・
２Ｈ２０、ＭｎＳＯ４・Ｈ２０、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、
ＣａＣＩ：・２Ｈ：Ｏ、ＺｎＣＩ：作为发酵培养基的无机盐，摇床
培养．不同时间取样观察芽孢的生成情况，计算芽
孢生成率，结果见表４．可看出，单盐对供试菌的芽
注：一为无芽孢产生
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李术娜：棉花黄萎病拮抗细菌ＨＭＢ一１００５菌株的产芽孢条件 ３３
孢形成影响较大，且不同无机盐的芽孢形成差异较大．培养６０ ｈ，钙盐培养基中芽孢生成率达到８６．８４％，但铜盐与
锌盐几乎没有芽孢形成．结果表明，钙盐有利于芽孢形成．由于无机盐对菌体的形态和代谢等有很大影响，故培养
基中的无机盐采用复合盐，以ＮａＨ２ＰＯ ・
２Ｈ２０和ＣａＣ１２・２Ｈ２０作为拮抗菌ＨＭＢ一１００５
的最佳无机盐．
２．４正交检验
对发酵培养基进行优化，分别以不同
浓度组合的最适Ｃ源、Ｎ源、无机盐及ｐＨ值
配制培养基，分装５０ ｍＬ培养基于２５０ ｍＬ
表５不同浓度组合对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
三角瓶中，进行摇床培养．考察ｃ源、Ｎ源、
无机盐的浓度对拮抗菌芽孢形成的影响，
结果见表５．可以看出，４８ ｈ芽孢率较高，故
以４８ ｈ的结果进行方差分析，如表６．从表６
中可以看出，Ａ。Ｂ，ｃ。Ｄ：为最佳组合．因此，
优化后培养基为：蔗糖１％、玉米粉２％、
ＣａＣ１２・２Ｈ２０ ０．０２％和ＮａＨ２ ＰＯ４・２Ｈ２０ ０．２％．
表６正交检验
２．５不同ｐＨ值对ＨＭＢ一１００５菌株
发酵产芽孢的影响
以最适Ｃ源、Ｎ源、无机盐配制培养基，
接种前用ＮａＯＨ或ＨＣＩ调整起始ｐＨ值分别
为６．０、６．５、７．０、７．５、８．０，分装５０ ｍＬ培养基
于２５０ ｍＬ三角瓶，进行摇床培养．考察起始
ｐＨ值对拮抗菌芽孢形成的影响，结果见表
７．结果表明，起始ｐＨ值７．０时拮抗菌的芽孢
形成率最高．故ｐＨ值７．０是最适宜的起始
ｐＨ值．
２．６不同温度对ＨＭＢ一１００５菌株
发酵产芽孢的影响
以最适Ｃ源、Ｎ源、无机盐配制培养
基，分装５０ｍＬ培养基于２５０ｍＬ三角瓶，进
行摇床培养．调整摇床的温度分别为２０℃、
２５℃、３０℃、３７℃．考察温度对拮抗菌芽孢
形成的影响，结果见表８．结果表明，３０℃时
注：Ｋ代表均值，Ｒ代表极差．
表７ ｐＨ对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
拮抗菌的芽孢形成率最高，４８ ｈ芽孢产率
达到１００％．因此，３０℃为拮抗菌出芽的最
适温度。
２．７不同转速对ＨＭＢ一１００５菌株
发酵产芽孢的影响
以最适Ｃ源、Ｎ源、无机盐配制培养基，
表８温度对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
分装培养基５０ ｍＬ于２５０ ｍＬ三角瓶，进行摇
床培养．调整摇床的转速分别为１２０ ｒ／ｍｉｎ、
１８０ ｒ／ｍｉｎ、２００ ｒ／ｍｉｎ、２６０ ｒ／ｍｉｎ．由于摇床转
速能改变培养基的溶氧度，故摇床转速能
影响芽孢的形成．考察摇床转速对拮抗菌
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保定学院学报 ２００８年第２期
芽孢形成的影响，结果见表９．结果表明，２００ ｄｍｉｎ
时拮抗菌的芽孢形成率最高，７２ ｈ达￣１１９８．７ １％．因
此，２００ ｒ／ｍｉｎ为拮抗菌出芽的最适转速．
表９摇床转速（溶氧量）对ＨＭＢ一１００５芽孢生成率（％）的影响
３讨论
芽孢的形成并不是细菌生活史中的一个必要
过程，其形成与菌种本身有关，不同菌种形成条件
不同；同时芽孢形成还受到营养物质及环境因素
的影响．
本试验通过比较供试菌的出芽率，从而确定了棉花黄萎病拮抗菌产芽孢的最佳培养条件：培养基的Ｃ源为蔗
糖、Ｎ源为玉米粉、无机盐为ＣａＣＩ ・２Ｈ Ｏ、ｐＨ值为７．０、温度为３０℃、转速为２００ｄｍｉｎ、接种量１０％、种龄２４ ｈ．同时采用
正交试验对其发酵培养基进行了优化，优化后的培养基为：蔗糖１％、玉米粉２％、ＣａＣＩ ・２Ｈ Ｏ ０．０２％和ＮａＨ２ＰＯ ・
２Ｈ２０ ０．２％．在此优化条件下，发酵液中拮抗菌的出芽率达到９０％以上，最终生物量为６ｘ１０ ￣ｉ＂／ｍＬ．
培养基成分是影响芽孢形成的重要因素．培养基中ｃ源、Ｎ源、无机盐的种类和浓度均对芽孢形成有一定作用．
此外，氧气及ｐＨ值的不同、培养液中加入固态介质都可能对芽孢的生成产生影响．
本试验通过优化培养基组成使出芽率和最终生物量大大提高．为棉花黄萎病ＨＭＢ一１００５生防菌剂的大规模生
产奠定了基础．
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ａｇａｉｎｓｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ
ＬＩ Ｓｈｕ－ｎａ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＨｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｓｐｏｒｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎ ＨＭＢ一１００５ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｄａｈｌｉａｅ．Ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｈａｋｅ－ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ
ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｈａｋｉｎｇ ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｉｔｏｎ Ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗ：ｍｅｄｉａ
ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ １％ｓｕｃｒｏｓｅ，２％ｍａｉｚｅｎａ，０．０２％ＣａＣ１２・２Ｈ２０ ａｎｄ ０．２％ＮａＨ２ＰＯ４‘２Ｈ２０，ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ７．０ ａｎｄ １０％ｉｎｏｃｕｌａｍ
ｖｏｌｕｍｅ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３０℃，ｒｏｔａｔｉｎｇ ｓｐｅｅｄ ２００ ｒ／ｍｉｎ，ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ２４ ｈ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ
ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｅｘｃｅｅｄｓ ９０ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ；ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｓｐｏｒｅ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｉｔｏｎｓ