2024年3月23日发(作者：青慧云)
维普资讯
第４７卷第２期
厦门大学学报（自然科学版）
Ｖｏ１．４７ Ｎｏ．２
２００８年３月
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
Ｍａｒ．２００８
ＯｓＣＨＸ１基因克隆及转基因植株获得
张红心，杨晓坡，苏勇波，陈 亮
（厦门大学生命科学学院，福建厦门３６１００５）
摘要：利用ＲＴ—ＰＣＲ扩增水稻的Ｎａ＋、Ｋ＋／Ｈ＋反向转运蛋白（ＯｓＣＨＸ１）基因全序列，将其与３５Ｓ启动子连接后，插入
到ｐ１３０１中，构建植物过量表达载体ｐ１３０１—３５＆ＯｓＣＨＸ１一ＮＯＳ．将该质粒转化农杆菌ＥＨＡ１０５，并对水稻愈伤组织进行
转化，获得了再生植株．对再生植株进行ＧＵＳ和ＰＣＲ鉴定，发现超过８５ 的再生植株为阳性植株．此研究结果为进一步
探讨 ＣＨｘ１基因功能提供了实验材料．
关键词：Ｎａ＋、Ｋ ／Ｈ 反向转运蛋白；植物表达载体；转基因
中图分类号：Ｑ ７８５ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３８—０４７９（２００８）０２—０２４４—０４
植物体中Ｎａ 、Ｋ ／Ｈ 反向转运蛋白存在于细
终获得了１００多株转化株系．
胞质膜或液泡膜等细胞器膜上，通常含有１Ｏ～１２个保
守的跨膜区域，主要包括ＣＰＡ１和ＣＰＡ２两个家族 ］，
１材料和方法
ＣＰＡ１与细菌的ＮｈａＰ具有很高的同源性［２］，主要包
１．１ ＲＴ—ＰＣＲ克隆ＯｓＣＨＸ１基因
括拟南芥的ＡｔＮＨＸ１～ＡｔＮＨＸ８ ］．与ＣＰＡ１家族
的Ｎａ （Ｋ ）／Ｈ 反向转运蛋白不同，ＣＰＡ２家族Ｎａ
以水稻（品种为日本晴）三叶期幼苗为材料，取生
长旺盛的叶片，放入液氮中研磨使组织充分破碎．采用
（Ｋ ）／Ｈ 反向转运蛋白（ＣＨＸ）则与酵母ＫＨＡ１及
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ的ＮｈａＳ４具有很高的同源性［２］，迄今
Ｔｒｉｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）提取总ＲＮＡ（具体方法参
为止有关ＣＰＡ２家族中ＣＨＸ的研究主要以
见说明书）．用ＤＮａｓｅ Ｉ处理总ＲＮＡ后，在４２℃下进
ＡｔＣＨＸ１７和ＡｔＣＨＸ２３为主，ＡｔＣＨＸ１７主要受Ｋ
行逆转录，逆转录完成后产物储存在一２Ｏ℃冰箱中待
饥饿胁迫，低ｐＨ值及ＡＢＡ诱导，主要起着Ｋ 摄取
用．
及维持细胞中离子平衡的功能［６］．ＡｔＣＨＸ２３定位于
根据ＮＣＢＩ上的全长ｃＤＮＡ序列设计两套引物，
叶绿体膜上，其功能主要为维持叶绿体基质中较高的
引物序列为Ｐｌ ５ ＣＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＡＴＡＡＴ一
３ ，Ｐ２ ５＇－ＴＧＴＴＣＴＡＴＧＣＡＴＧＧＣＧＣ一３ ，Ｐ３ ５＇－ＣＣＡＡ
ｐＨ值，调控叶绿体的发育［７］．
ＧＣＡＴＡＡＴＣＴＣＧＣＡＣ－３ ，Ｐ ５ 一ｔｇｇｔｃｔｔａｇＴＴＧＣＣＧＴ
水稻是重要的粮食作物之一，也是禾本科的模式
植物．水稻基因组中有不少的核酸序列含有Ｎａ
ＣＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧ－３ ．取逆转录产物１．５ Ｌ作
模板，以Ｐ。和Ｐｚ为引物进行第一轮ＰＣＲ，反应条件
（Ｋ ）／Ｈ 反向转运蛋白保守域．有关水稻Ｎａ
（Ｋ ）／Ｈ 反向转运蛋白的研究，Ｆｕｋｕｄａ等［８ ０＝发现
为：９４℃３５ Ｓ，５８℃３５ Ｓ，７２℃，２．５ ｍｉｎ ３０个循环．第
一
轮ＰＣＲ完成后，将其产物稀释１００倍，然后取１
ＯｓＮＨＸ１， ＮＨＸ２表达受盐胁迫诱导，和水稻的耐
盐性相关．有关属于ＣＰＡ２家族的ＯｓＣＨＸ功能研究，
Ｌ，以Ｐ。和Ｐ 为引物进行第二轮ＰＣＲ，反应条件为：
９４℃３５ Ｓ，５０℃３５ Ｓ，７２℃２．５ ｍｉｎ，３０个循环．
特别是ＯｓＣＨＸ与细胞的渗透调节、离子平衡及组织
和器官发育相关性的研究还未见报道，在有关Ｏｓ－
１．２ ｐ１３０１－３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１＝ＮＯＳ植物表达载体
ＣＨＸ研究中，我们克隆了属于ＣＰＡ２家族的 一
的构建
ＣＨＸ１基因，并发现此基因的表达特性与（）ｓＮＨＸ１，
将ＰＣＲ产物纯化和浓缩后取约５００ ｎｇ用Ｘｂａ Ｉ
ＯｓＮＨＸ２不同．为了探讨ＯｓＣＨＸ１功能，我们构建了
作单酶切，回收酶切产物并与中间载体ｐＢＰＦ（经Ｘｂａ
ＣＨＸ１的表达载体，并对水稻进行了遗传转化，最
Ｉ酶切，并去磷酸化）连接，连接产物转化ＤＨ５ａ后得
重组子ｐＢＰＦ一０ｓＣＨＸ１，并进行ＰＣＲ酶切鉴定以及测
序确定阅读框无误．用Ｈｉｎｄ ＩＩＩ单酶切ｐＢＰＦ—Ｏｓ—
收稿日期：２００７—０６—１８
ＣＨＸ１，得到约５ ｋｂ左右的酶切片段，回收此核酸片
基金项目：福建省青年人才创新项目（２ｏｏ５Ｊｏｏ４）资助
段，并与ｐｌ３０１（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ单酶切，并去磷酸化）相连
＊通讯作者：ｃｈｅｎｌ＠２６３．ｎｅｔ
接．连接产物转化ＤＨ５ａ后挑选重组子并进行ＰＣＲ、
维普资讯
第２期 张红心等：ＯｓＣＨＸ１基因克隆及转基因植株获得 ・２４５・
５Ｏｏｏ
２５ｏｏ
ｌＯｏｏ
图１ ＯｓＣＨＸ１基因的克隆
Ｆｉｇ．１ Ｃｌｏｎｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｏｆ ＯｓＣＨＸ１
１．ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；２．ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ
ＰＣＲ；３．Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ １５ ０００
酶切鉴定．获得阳性重组子ｐ１３０１—３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１一
Ｎ０Ｓ．
１．３水稻未成熟胚组织培养、遗传转化及植株
再生
用于组织培养和遗传转化的步骤主要参考张文惠
等方法［１ｌ 引，其培养基主要包括：诱导和继代培养基
ＭＳ＋２，４一Ｄ ２ ｍｇ／Ｌ￣共培养培养基ＭＳ＋２，４一Ｄ ４
ｍｇ／Ｌ＋ＡＳ １００／ｌｍｏｌ／Ｌ；筛选培养基ＮＢ＋２，４一Ｄ ２
ｍｇ／Ｌ＋Ｃｂ ５００ ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ １００ ｍｇ／Ｌ；预分化培养
基ＮＢ＋ＡＢＡ ２ ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ ３ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ １ ｍｇ／Ｌ
＋Ｃｂ ２５０ ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ ２５ ｍｇ／Ｌ；分化培养基ＮＢ＋６一
ＢＡ ３ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ １ ｍｇ／Ｌ＋Ｓｏｒｂｉｔｏｌ １３ ｇ／Ｌ＋
Ｃｂ２５０ ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ ２５ ｍｇ／Ｌ．
挑选新鲜愈伤组织，放入共培养基（具体制备方法
参见文献Ｅｌｌ一１２－］）中浸泡２Ｏ ｒａｉｎ后，将愈伤组织转
移到共培养基中培养，３ ｄ后转移到筛选培养基上，筛
选和促进抗性愈伤组织生长．６Ｏ ｄ后，挑取抗性愈伤
组织，并将其放人预分化、分化培养基中诱导分化和植
株再生．
１．４愈伤组织和再生植株的ＧＵＳ和ＰＣＲ检
测
将共培养后愈伤组织块及再生植株的叶片，放人
Ｘ－Ｇｌｕｅ反应缓冲液中，３７℃下放置过夜，肉眼观察
ＧＵＳ的染色情况．用ＣＴＡＢ法提取再生植株叶片
ＤＮＡ，利用特异于潮霉素抗性基因引物Ｐ。５ －ＣＴ—
ＴＡＴＣＴＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＣＡＣＡＣＡ一３ 和Ｐ６ ５＇－ＡＴ—
ＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣ一３ 进行ＰＣＲ反
应，反应条件为：９４℃５ ｒａｉｎ，９４℃４５ Ｓ，５８～６０℃４５
ｓ，７２℃１ ｒａｉｎ，３４个循环；７２℃５ ｒａｉｎ．
２ 结 果
图２质粒ｐＢＰＦ－ＯｓＣＨＸ１酶切鉴定
● ＝—ｉ１器ｏ８０
Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＢＰＦ－ＯｓＣＨＸ１ ｗｉｔｈ
ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
１．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；
２．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥｃｏＲ Ｉ；
３．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｓｔｌ Ｉ；
４．Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ １５ ０００
图３质粒ｐ１３０１－３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１－ＮＯＳ酶切鉴定
Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐ１３０１－３５Ｓ－Ｏｓ－
ＣＨｘ１－ＮｏＳ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
１．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｘ６口Ｉ；
２．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨ Ｉ：
３．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｓｔ Ｉ ａｎｄ
Ｋｐｎ Ｉ；
４．Ｍａｒｋｅｒ ＥｃｏＴ１４ Ｉ ｄｉｇｅｓｔ
２．１ ＯｓＣＨＸ１基因的克隆及植物表达载体的
构建
水稻叶片总ＲＮＡ逆转录后获得ｅＤＮＡ，以此ｃＤ—
ＮＡ为模板进行两轮巢式ＰＣＲ，得到一条约２．５ ｋｂ的
扩增带（图１），与预期片断大小接近．将此条带酶切、
回收并连接到ｐＢＰＦ后，进行酶切鉴定，获得ｐＢＰＦ—
ＯｓＣＨＸ１（图２），用Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切ｐＢＰＦ－ＯｓＣＨＸ１，回
收５．０ ｋｂ左右的片段，然后将此片段与ｐ１３０１相连接
后，成功构建了ｐ１３０１—３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１一ＮＯＳ植物表达
载体（图３），测序结果确证了 ＣＨＸ１阅读框准确无
误．
２．２ 组织培养、遗传转化及植株再生
未成熟胚在诱导培养基培养４ ｄ，就可见明显的愈
伤组织，挑取愈伤组织，转移至继代培养基上继续培养
２周后，愈伤组织就呈现淡黄，半松散状颗粒．挑取质
量较好的愈伤组织，与农杆菌进行共培养后，随机挑取
５块愈伤组组织，进行ＧＵＳ活性检测，发现在ＧＵＳ染
维普资讯
厦门大学学报（自然科学版）
图４ ＧＵＳ在共培养后的愈伤组织中瞬时表达
Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｕｓ ｉｎ Ｃａｌｌｉ
图６ ＧＵＳ在再生苗中稳定表达
Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＵＳ ｉｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
Ｌ．ｒｏｏｔｓ；Ｒ．１ｅａｖｅｓ
色液中过夜后，愈伤块出现蓝色斑点（图４），说明ＧＵＳ
在愈伤组织中得到了瞬时表达．
将共培养后愈伤组织转移至筛选培养基上，一周
后发现愈伤组织逐渐变褐，随后在一部分褐化的组织
上长出乳白色、松散、生长相对旺盛的抗性愈伤，挑取
抗性愈伤，转移至预分化培养基上培养，待出现绿点
后，将愈伤转移到分化培养基上进行分化，一周后就可
见绿苗分化（图５）．
２．３再生植株ＧＵＳ表达检测
剪取再生幼苗的叶片和幼根，经组织化学染色后，
有蓝色出现，说明ＧＵＳ在植株中稳定表达（图６）．
随机挑取８株再生植株，提取其叶片ＤＮＡ以Ｐ
和Ｐ 为引物进行ＰＣＲ鉴定．结果发现７株为阳性，阳
性率为８７．５％（图７）．
３ 讨 论
迄今为止，已从拟南芥，番茄，棉花，水稻，大麦，
ｍｏｒｎｉｎｇ ｇｌｏｒｙ，Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉ，Ａｔｒｉｐｌｅｘ ｇｍｅｌｉｎｉ等植
物中克隆到属于ＣＰＡ１家族的Ｎａ （Ｋ ）／Ｈ 反向转
运蛋白基因，拟南芥的ＡｔＮＨＸ１和ＡｔＮＨＸ５存在于
植物的液泡膜上，主要调控细胞中Ｎａ ，Ｋ 等离子的
图５再生苗
Ｆｉｇ．５ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｆｒｏｍ Ｈｙｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃａｌｌｉ
图７部分再生植株的ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ．７ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｅｎｒｅｔａｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
１．ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；２．ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；３～９．ｒｅ—
ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ １，６，１９，２１，２３，２８，５１；
Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２ ０００
区域化分布，能够部分补偿酵母突变体△ｎｈｘ对Ｎａ 、
Ｌｉ 及潮霉素的敏感性Ｌ５］．ｍｏｒｎｉｎｇ ｇｌｏｒｙ的Ｊ ＮＨＸ
基因与ＡｔＮＨＸ１同源，主要调控花瓣细胞液泡ｐＨ
值．ＩｎＮＨＸ突变体花瓣细胞液泡的ｐＨ值显著上升，
从而导致花瓣颜色由紫变蓝［１引．
水稻是重要的粮食作物之一，水稻基因组中含有
诸多编码Ｎａ 、Ｋ ／Ｈ 反向转运蛋白的核酸序列，Ｈ．
Ｓｚｅ等［１ ］曾预测水稻中含有ｌ７个ＣＡＰ２家族的Ｎａ＋、
Ｋ ／Ｈ 反向转运蛋白基因．目前有关水稻Ｎａ 、Ｋ ／
Ｈ 反向转运蛋白功能研究报道还较少，迄今为止，在
水稻中仅分析了两个Ｎａ （Ｋ ）／Ｈ 反向转运蛋白
ＯｓＮＨＸ１，ＯｓＮＨＸ２．这些蛋白属于ＣＰＡ１家族、其基
因表达受盐胁迫诱导，能够提高酵母突变体△ｎｈｘ对
Ｎａ ，Ｌｉ 以及潮霉素的耐受性￣ｓ－ｉｏ］．我们在进行水稻
耐盐功能基因分析时，发现了一个推定的Ｎａ 、Ｋ ／
Ｈ 反向转运蛋白基因、而且此基因在水稻体内的表
达特性与 ＮＨＸ１， ＮＨＸ２差异明显．这些结果提
示ＯｓＣＨＸ１是一个新功能基因．
在进行Ｎａ 、Ｋ ／Ｈ 反向转运蛋白基因功能研
究时，组成型表达是研究和分析基因功能的一种有效
手段．如Ａｐｓｅ Ｍ Ｐ Ｌ１ ５］和Ｚｈａｎｇ等ｎ ］通过分析转
Ａ ＮＨＸｌ基因的拟南芥和番茄，证实了该基因具有调
维普资讯
第２期 张红心等：ＯｓＣＨＸ１基因克隆及转基因植株获得 ・２４７・
控植物耐盐性的功能，转Ａ ＮＨｘ１基因拟南芥和番
ｐＨ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ａｒａｂｉ—
茄可以耐受２００ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１，并能正常生长、开
ｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０００，９７：
花和结实．ＯｓＮＨＸ１基因在水稻中组成型表达后，转
６８９６—６９０１．
基因水稻的耐盐性也有提高．为了探讨ＯｓＣＨＸ１在植
［８］ Ｆｕｋｕｄａ Ａ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ａ，Ｔａｎａｋａ Ｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａ ｉ Ｈ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉ—
物的抗性以及生长发育中的作用，我们首先获得了一
定数量的转基因群体，现正筛选高效表达的株系，为进
ｖａ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１９９９，１４４６：１４９—１５５．
［９］Ｆｕｋｕｄａ Ａ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ａ，Ｔａｇｉｒｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｉｎｔｒａ—
一
步研究 ＣＨｘ１的功能提供研究材料．
ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ
ａ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｎａ ／Ｈ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
参考文献：
Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，４５：１４６——１５９．
［１］ Ｍａｓｅｒ Ｐ，Ｔｈｏｍｉｎｅ Ｓ，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｊ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅ—
［１ｏ］ Ｆｕｋｕｄａ Ａ，Ｙａｚａｋｉ Ｙ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｎａ ／Ｈ ａｎｔｉ—
ｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｉｔｈｉｎ ｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐ—
ｐｏｒｔｅｒ ｉｎ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ｒｏｏｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
ｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２６：１６４６—１６６７．
Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，３９：１９６—２０１．
［２］Ｃｈａｎｇ Ａ Ｂ。Ｌｉｎ Ｒ，Ｓｔｕｄｌｅｙ Ｗ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ａｓ ａ
［１１］ 张文惠，张红心林涛，等．水稻耐盐相关基因ＺＲＰ・的克
ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
隆及其植物表达载体的构建［Ｊ］．西北农林科技大学学
ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ，２００４，２１：１７１—１８１．
报，２００６，３４（７）：１３４—１３８．
［３］ Ｓｈｉ Ｈ，Ｉｓｈｉｔａｎｉ Ｍ。Ｋｉｍ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
［１２］张文惠，林涛，张红心，等．红树林耐盐相关基因转化水
ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｇｅｎｅ ＳＯＳ１ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｎａ ／Ｈ ａｎ—
稻的研究［Ｊ］．西北植物学报，２００６，２６（６）：１１０５—
ｔｉｐｏｒｔｅｒ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０００，９７：６８９６—
１１０９．
６９０１．
［１３］Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｔ，Ｆｕｋａｄａ Ｔａｎａｋａ Ｓ，Ｉｎａｇａｋｉ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｓ
［４］Ｓｈｉ Ｈ，Ｑｕｉｎｔｅｒｏ Ｆ Ｊ，Ｐａｒｄｏ Ｊ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｌａｓｍａ
ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｎａ ｜Ｈ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ａｎｄ ｆｌｏｗｅｒ
ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｎａ ／Ｈ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ＳＯＳ１ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｌｏｎｇ—ｄｉｓ—
ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，４２：４５１—４６１．
ｔａｎｃｅ Ｎａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００２，１４：４６５
［１４］ Ｓｚｅ Ｈ，Ｐａｄｍａｎａｂａｎ Ｓ，Ｃｅｌｌｉｅｒ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔ—
—
４７７．
ｔｅｒｎｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＡｔＣＨＸ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
［５］Ｙｏｋｏｉ Ｓ，Ｑｕｉｎｔｅｒｏ Ｆ Ｊ，Ｃｕｂｅｒｏ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓ—
ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｏｓｍｏｔｉｃ ａａｊ ｕｓｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｋ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｐｏｌ—
ｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｎａ ／Ｈ ａｎｔｉ—
ｌｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，１３６：１—１６．
ｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００２，３０：
［１５］Ａｐｓｅ Ｍ Ｐ，Ａｈａｒｏｎ Ｇ Ｓ，Ｓｎｅｄｄｅｎ Ｗ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒ—
５２９—５３９．
ａｎｔｅ ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｂｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｎａ＋／Ｈ＋
［６］Ｃｅｌｌｉｅｒ Ｒ，Ｃｏｎｅｊｅｒｏ Ｇ，Ｒｉｃａｕｄ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｎｔｉｐｏｒｔ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８５：１２５６—
ＡｔＣＨＸ１７，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔｉｏｎ／Ｈ ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ，ＣＨＸ
１２５８．
ｆａｍｉｌｙ．ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ Ｋ
［１６］Ｚｈａｎｇ Ｈ Ｘ，Ｂｌｕｍｗａｌｄ Ｅ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｔｏｍａ—
ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００４，３９：８３４—８４６． ｔｏ ｐｌａｎｔｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｓａｌｔ ｉｎ ｆｏｌｉａｇｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｆｒｕｉｔ［Ｊ］．
［７］Ｓｏｎｇ Ｃ Ｐ，Ｇｕｏ Ｙ。Ｑｉｕ Ｑ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ａ ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎａ （Ｋ ）／
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００ｌ，ｌ９：７６５—７６８．
Ｈ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｃｌｏｎｅ ｏｆ ＯｓＣＨＸ１ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｍｅｄｉａｔｅｄ
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ Ｒｉｃｅ
ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｘｉｎ，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ＿ｂｏ，ＳＵ Ｙｏｎｇ＿ｂｏ，ＣＨＥＮ Ｌｉａｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ ３６１００５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＯｓＣＨＸ１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ｐＢＰＦ－３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｌｉｇａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ
ｏｆ ＯｓＣＨＸ１ ｗｉｔｈ ｐＢＰＦ．Ｔｈｅ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐＢＰＦ－３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐ１３０１ ａｎｄ ｐ１３０１－３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１一
ＮＯＳ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＯｓＣＨＸ１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ Ｓａｔｉｖａ Ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｎｐｐｏｎｂａｒｅ）ｂｙ Ａｇｏｒｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅ—
ｄｉａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １００ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ａｆｔｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＧＵＳ ｓｔａｉｎ ａｎｄ ＰＣＲ ｉｔ ｗａｓ
ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ＯｓＣＨＸ１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｒｉｃｅ ｇｅｎｏｍｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＯｓＣＨＸ１；ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ；ｒｉｃｅ
2024年3月23日发(作者：青慧云)
维普资讯
第４７卷第２期
厦门大学学报（自然科学版）
Ｖｏ１．４７ Ｎｏ．２
２００８年３月
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
Ｍａｒ．２００８
ＯｓＣＨＸ１基因克隆及转基因植株获得
张红心，杨晓坡，苏勇波，陈 亮
（厦门大学生命科学学院，福建厦门３６１００５）
摘要：利用ＲＴ—ＰＣＲ扩增水稻的Ｎａ＋、Ｋ＋／Ｈ＋反向转运蛋白（ＯｓＣＨＸ１）基因全序列，将其与３５Ｓ启动子连接后，插入
到ｐ１３０１中，构建植物过量表达载体ｐ１３０１—３５＆ＯｓＣＨＸ１一ＮＯＳ．将该质粒转化农杆菌ＥＨＡ１０５，并对水稻愈伤组织进行
转化，获得了再生植株．对再生植株进行ＧＵＳ和ＰＣＲ鉴定，发现超过８５ 的再生植株为阳性植株．此研究结果为进一步
探讨 ＣＨｘ１基因功能提供了实验材料．
关键词：Ｎａ＋、Ｋ ／Ｈ 反向转运蛋白；植物表达载体；转基因
中图分类号：Ｑ ７８５ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３８—０４７９（２００８）０２—０２４４—０４
植物体中Ｎａ 、Ｋ ／Ｈ 反向转运蛋白存在于细
终获得了１００多株转化株系．
胞质膜或液泡膜等细胞器膜上，通常含有１Ｏ～１２个保
守的跨膜区域，主要包括ＣＰＡ１和ＣＰＡ２两个家族 ］，
１材料和方法
ＣＰＡ１与细菌的ＮｈａＰ具有很高的同源性［２］，主要包
１．１ ＲＴ—ＰＣＲ克隆ＯｓＣＨＸ１基因
括拟南芥的ＡｔＮＨＸ１～ＡｔＮＨＸ８ ］．与ＣＰＡ１家族
的Ｎａ （Ｋ ）／Ｈ 反向转运蛋白不同，ＣＰＡ２家族Ｎａ
以水稻（品种为日本晴）三叶期幼苗为材料，取生
长旺盛的叶片，放入液氮中研磨使组织充分破碎．采用
（Ｋ ）／Ｈ 反向转运蛋白（ＣＨＸ）则与酵母ＫＨＡ１及
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ的ＮｈａＳ４具有很高的同源性［２］，迄今
Ｔｒｉｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）提取总ＲＮＡ（具体方法参
为止有关ＣＰＡ２家族中ＣＨＸ的研究主要以
见说明书）．用ＤＮａｓｅ Ｉ处理总ＲＮＡ后，在４２℃下进
ＡｔＣＨＸ１７和ＡｔＣＨＸ２３为主，ＡｔＣＨＸ１７主要受Ｋ
行逆转录，逆转录完成后产物储存在一２Ｏ℃冰箱中待
饥饿胁迫，低ｐＨ值及ＡＢＡ诱导，主要起着Ｋ 摄取
用．
及维持细胞中离子平衡的功能［６］．ＡｔＣＨＸ２３定位于
根据ＮＣＢＩ上的全长ｃＤＮＡ序列设计两套引物，
叶绿体膜上，其功能主要为维持叶绿体基质中较高的
引物序列为Ｐｌ ５ ＣＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＣＡＴＡＡＴ一
３ ，Ｐ２ ５＇－ＴＧＴＴＣＴＡＴＧＣＡＴＧＧＣＧＣ一３ ，Ｐ３ ５＇－ＣＣＡＡ
ｐＨ值，调控叶绿体的发育［７］．
ＧＣＡＴＡＡＴＣＴＣＧＣＡＣ－３ ，Ｐ ５ 一ｔｇｇｔｃｔｔａｇＴＴＧＣＣＧＴ
水稻是重要的粮食作物之一，也是禾本科的模式
植物．水稻基因组中有不少的核酸序列含有Ｎａ
ＣＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧ－３ ．取逆转录产物１．５ Ｌ作
模板，以Ｐ。和Ｐｚ为引物进行第一轮ＰＣＲ，反应条件
（Ｋ ）／Ｈ 反向转运蛋白保守域．有关水稻Ｎａ
（Ｋ ）／Ｈ 反向转运蛋白的研究，Ｆｕｋｕｄａ等［８ ０＝发现
为：９４℃３５ Ｓ，５８℃３５ Ｓ，７２℃，２．５ ｍｉｎ ３０个循环．第
一
轮ＰＣＲ完成后，将其产物稀释１００倍，然后取１
ＯｓＮＨＸ１， ＮＨＸ２表达受盐胁迫诱导，和水稻的耐
盐性相关．有关属于ＣＰＡ２家族的ＯｓＣＨＸ功能研究，
Ｌ，以Ｐ。和Ｐ 为引物进行第二轮ＰＣＲ，反应条件为：
９４℃３５ Ｓ，５０℃３５ Ｓ，７２℃２．５ ｍｉｎ，３０个循环．
特别是ＯｓＣＨＸ与细胞的渗透调节、离子平衡及组织
和器官发育相关性的研究还未见报道，在有关Ｏｓ－
１．２ ｐ１３０１－３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１＝ＮＯＳ植物表达载体
ＣＨＸ研究中，我们克隆了属于ＣＰＡ２家族的 一
的构建
ＣＨＸ１基因，并发现此基因的表达特性与（）ｓＮＨＸ１，
将ＰＣＲ产物纯化和浓缩后取约５００ ｎｇ用Ｘｂａ Ｉ
ＯｓＮＨＸ２不同．为了探讨ＯｓＣＨＸ１功能，我们构建了
作单酶切，回收酶切产物并与中间载体ｐＢＰＦ（经Ｘｂａ
ＣＨＸ１的表达载体，并对水稻进行了遗传转化，最
Ｉ酶切，并去磷酸化）连接，连接产物转化ＤＨ５ａ后得
重组子ｐＢＰＦ一０ｓＣＨＸ１，并进行ＰＣＲ酶切鉴定以及测
序确定阅读框无误．用Ｈｉｎｄ ＩＩＩ单酶切ｐＢＰＦ—Ｏｓ—
收稿日期：２００７—０６—１８
ＣＨＸ１，得到约５ ｋｂ左右的酶切片段，回收此核酸片
基金项目：福建省青年人才创新项目（２ｏｏ５Ｊｏｏ４）资助
段，并与ｐｌ３０１（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ单酶切，并去磷酸化）相连
＊通讯作者：ｃｈｅｎｌ＠２６３．ｎｅｔ
接．连接产物转化ＤＨ５ａ后挑选重组子并进行ＰＣＲ、
维普资讯
第２期 张红心等：ＯｓＣＨＸ１基因克隆及转基因植株获得 ・２４５・
５Ｏｏｏ
２５ｏｏ
ｌＯｏｏ
图１ ＯｓＣＨＸ１基因的克隆
Ｆｉｇ．１ Ｃｌｏｎｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｏｆ ＯｓＣＨＸ１
１．ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；２．ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ
ＰＣＲ；３．Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ １５ ０００
酶切鉴定．获得阳性重组子ｐ１３０１—３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１一
Ｎ０Ｓ．
１．３水稻未成熟胚组织培养、遗传转化及植株
再生
用于组织培养和遗传转化的步骤主要参考张文惠
等方法［１ｌ 引，其培养基主要包括：诱导和继代培养基
ＭＳ＋２，４一Ｄ ２ ｍｇ／Ｌ￣共培养培养基ＭＳ＋２，４一Ｄ ４
ｍｇ／Ｌ＋ＡＳ １００／ｌｍｏｌ／Ｌ；筛选培养基ＮＢ＋２，４一Ｄ ２
ｍｇ／Ｌ＋Ｃｂ ５００ ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ １００ ｍｇ／Ｌ；预分化培养
基ＮＢ＋ＡＢＡ ２ ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ ３ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ １ ｍｇ／Ｌ
＋Ｃｂ ２５０ ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ ２５ ｍｇ／Ｌ；分化培养基ＮＢ＋６一
ＢＡ ３ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ １ ｍｇ／Ｌ＋Ｓｏｒｂｉｔｏｌ １３ ｇ／Ｌ＋
Ｃｂ２５０ ｍｇ／Ｌ＋Ｈｙｇ ２５ ｍｇ／Ｌ．
挑选新鲜愈伤组织，放入共培养基（具体制备方法
参见文献Ｅｌｌ一１２－］）中浸泡２Ｏ ｒａｉｎ后，将愈伤组织转
移到共培养基中培养，３ ｄ后转移到筛选培养基上，筛
选和促进抗性愈伤组织生长．６Ｏ ｄ后，挑取抗性愈伤
组织，并将其放人预分化、分化培养基中诱导分化和植
株再生．
１．４愈伤组织和再生植株的ＧＵＳ和ＰＣＲ检
测
将共培养后愈伤组织块及再生植株的叶片，放人
Ｘ－Ｇｌｕｅ反应缓冲液中，３７℃下放置过夜，肉眼观察
ＧＵＳ的染色情况．用ＣＴＡＢ法提取再生植株叶片
ＤＮＡ，利用特异于潮霉素抗性基因引物Ｐ。５ －ＣＴ—
ＴＡＴＣＴＧＧＧＡＡＣＴＡＣＴＣＡＣＡＣＡ一３ 和Ｐ６ ５＇－ＡＴ—
ＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣ一３ 进行ＰＣＲ反
应，反应条件为：９４℃５ ｒａｉｎ，９４℃４５ Ｓ，５８～６０℃４５
ｓ，７２℃１ ｒａｉｎ，３４个循环；７２℃５ ｒａｉｎ．
２ 结 果
图２质粒ｐＢＰＦ－ＯｓＣＨＸ１酶切鉴定
● ＝—ｉ１器ｏ８０
Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＢＰＦ－ＯｓＣＨＸ１ ｗｉｔｈ
ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
１．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；
２．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥｃｏＲ Ｉ；
３．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｓｔｌ Ｉ；
４．Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ １５ ０００
图３质粒ｐ１３０１－３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１－ＮＯＳ酶切鉴定
Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐ１３０１－３５Ｓ－Ｏｓ－
ＣＨｘ１－ＮｏＳ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
１．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｘ６口Ｉ；
２．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨ Ｉ：
３．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｓｔ Ｉ ａｎｄ
Ｋｐｎ Ｉ；
４．Ｍａｒｋｅｒ ＥｃｏＴ１４ Ｉ ｄｉｇｅｓｔ
２．１ ＯｓＣＨＸ１基因的克隆及植物表达载体的
构建
水稻叶片总ＲＮＡ逆转录后获得ｅＤＮＡ，以此ｃＤ—
ＮＡ为模板进行两轮巢式ＰＣＲ，得到一条约２．５ ｋｂ的
扩增带（图１），与预期片断大小接近．将此条带酶切、
回收并连接到ｐＢＰＦ后，进行酶切鉴定，获得ｐＢＰＦ—
ＯｓＣＨＸ１（图２），用Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切ｐＢＰＦ－ＯｓＣＨＸ１，回
收５．０ ｋｂ左右的片段，然后将此片段与ｐ１３０１相连接
后，成功构建了ｐ１３０１—３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１一ＮＯＳ植物表达
载体（图３），测序结果确证了 ＣＨＸ１阅读框准确无
误．
２．２ 组织培养、遗传转化及植株再生
未成熟胚在诱导培养基培养４ ｄ，就可见明显的愈
伤组织，挑取愈伤组织，转移至继代培养基上继续培养
２周后，愈伤组织就呈现淡黄，半松散状颗粒．挑取质
量较好的愈伤组织，与农杆菌进行共培养后，随机挑取
５块愈伤组组织，进行ＧＵＳ活性检测，发现在ＧＵＳ染
维普资讯
厦门大学学报（自然科学版）
图４ ＧＵＳ在共培养后的愈伤组织中瞬时表达
Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｕｓ ｉｎ Ｃａｌｌｉ
图６ ＧＵＳ在再生苗中稳定表达
Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＵＳ ｉｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
Ｌ．ｒｏｏｔｓ；Ｒ．１ｅａｖｅｓ
色液中过夜后，愈伤块出现蓝色斑点（图４），说明ＧＵＳ
在愈伤组织中得到了瞬时表达．
将共培养后愈伤组织转移至筛选培养基上，一周
后发现愈伤组织逐渐变褐，随后在一部分褐化的组织
上长出乳白色、松散、生长相对旺盛的抗性愈伤，挑取
抗性愈伤，转移至预分化培养基上培养，待出现绿点
后，将愈伤转移到分化培养基上进行分化，一周后就可
见绿苗分化（图５）．
２．３再生植株ＧＵＳ表达检测
剪取再生幼苗的叶片和幼根，经组织化学染色后，
有蓝色出现，说明ＧＵＳ在植株中稳定表达（图６）．
随机挑取８株再生植株，提取其叶片ＤＮＡ以Ｐ
和Ｐ 为引物进行ＰＣＲ鉴定．结果发现７株为阳性，阳
性率为８７．５％（图７）．
３ 讨 论
迄今为止，已从拟南芥，番茄，棉花，水稻，大麦，
ｍｏｒｎｉｎｇ ｇｌｏｒｙ，Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉ，Ａｔｒｉｐｌｅｘ ｇｍｅｌｉｎｉ等植
物中克隆到属于ＣＰＡ１家族的Ｎａ （Ｋ ）／Ｈ 反向转
运蛋白基因，拟南芥的ＡｔＮＨＸ１和ＡｔＮＨＸ５存在于
植物的液泡膜上，主要调控细胞中Ｎａ ，Ｋ 等离子的
图５再生苗
Ｆｉｇ．５ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｆｒｏｍ Ｈｙｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃａｌｌｉ
图７部分再生植株的ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ．７ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｅｎｒｅｔａｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
１．ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；２．ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；３～９．ｒｅ—
ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ １，６，１９，２１，２３，２８，５１；
Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２ ０００
区域化分布，能够部分补偿酵母突变体△ｎｈｘ对Ｎａ 、
Ｌｉ 及潮霉素的敏感性Ｌ５］．ｍｏｒｎｉｎｇ ｇｌｏｒｙ的Ｊ ＮＨＸ
基因与ＡｔＮＨＸ１同源，主要调控花瓣细胞液泡ｐＨ
值．ＩｎＮＨＸ突变体花瓣细胞液泡的ｐＨ值显著上升，
从而导致花瓣颜色由紫变蓝［１引．
水稻是重要的粮食作物之一，水稻基因组中含有
诸多编码Ｎａ 、Ｋ ／Ｈ 反向转运蛋白的核酸序列，Ｈ．
Ｓｚｅ等［１ ］曾预测水稻中含有ｌ７个ＣＡＰ２家族的Ｎａ＋、
Ｋ ／Ｈ 反向转运蛋白基因．目前有关水稻Ｎａ 、Ｋ ／
Ｈ 反向转运蛋白功能研究报道还较少，迄今为止，在
水稻中仅分析了两个Ｎａ （Ｋ ）／Ｈ 反向转运蛋白
ＯｓＮＨＸ１，ＯｓＮＨＸ２．这些蛋白属于ＣＰＡ１家族、其基
因表达受盐胁迫诱导，能够提高酵母突变体△ｎｈｘ对
Ｎａ ，Ｌｉ 以及潮霉素的耐受性￣ｓ－ｉｏ］．我们在进行水稻
耐盐功能基因分析时，发现了一个推定的Ｎａ 、Ｋ ／
Ｈ 反向转运蛋白基因、而且此基因在水稻体内的表
达特性与 ＮＨＸ１， ＮＨＸ２差异明显．这些结果提
示ＯｓＣＨＸ１是一个新功能基因．
在进行Ｎａ 、Ｋ ／Ｈ 反向转运蛋白基因功能研
究时，组成型表达是研究和分析基因功能的一种有效
手段．如Ａｐｓｅ Ｍ Ｐ Ｌ１ ５］和Ｚｈａｎｇ等ｎ ］通过分析转
Ａ ＮＨＸｌ基因的拟南芥和番茄，证实了该基因具有调
维普资讯
第２期 张红心等：ＯｓＣＨＸ１基因克隆及转基因植株获得 ・２４７・
控植物耐盐性的功能，转Ａ ＮＨｘ１基因拟南芥和番
ｐＨ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ａｒａｂｉ—
茄可以耐受２００ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１，并能正常生长、开
ｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０００，９７：
花和结实．ＯｓＮＨＸ１基因在水稻中组成型表达后，转
６８９６—６９０１．
基因水稻的耐盐性也有提高．为了探讨ＯｓＣＨＸ１在植
［８］ Ｆｕｋｕｄａ Ａ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ａ，Ｔａｎａｋａ Ｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａ ｉ Ｈ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉ—
物的抗性以及生长发育中的作用，我们首先获得了一
定数量的转基因群体，现正筛选高效表达的株系，为进
ｖａ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１９９９，１４４６：１４９—１５５．
［９］Ｆｕｋｕｄａ Ａ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ａ，Ｔａｇｉｒｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｉｎｔｒａ—
一
步研究 ＣＨｘ１的功能提供研究材料．
ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ
ａ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｎａ ／Ｈ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
参考文献：
Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，４５：１４６——１５９．
［１］ Ｍａｓｅｒ Ｐ，Ｔｈｏｍｉｎｅ Ｓ，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｊ Ｉ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅ—
［１ｏ］ Ｆｕｋｕｄａ Ａ，Ｙａｚａｋｉ Ｙ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｎａ ／Ｈ ａｎｔｉ—
ｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｉｔｈｉｎ ｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐ—
ｐｏｒｔｅｒ ｉｎ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ｒｏｏｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
ｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２６：１６４６—１６６７．
Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，３９：１９６—２０１．
［２］Ｃｈａｎｇ Ａ Ｂ。Ｌｉｎ Ｒ，Ｓｔｕｄｌｅｙ Ｗ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ａｓ ａ
［１１］ 张文惠，张红心林涛，等．水稻耐盐相关基因ＺＲＰ・的克
ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
隆及其植物表达载体的构建［Ｊ］．西北农林科技大学学
ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ，２００４，２１：１７１—１８１．
报，２００６，３４（７）：１３４—１３８．
［３］ Ｓｈｉ Ｈ，Ｉｓｈｉｔａｎｉ Ｍ。Ｋｉｍ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
［１２］张文惠，林涛，张红心，等．红树林耐盐相关基因转化水
ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｇｅｎｅ ＳＯＳ１ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｎａ ／Ｈ ａｎ—
稻的研究［Ｊ］．西北植物学报，２００６，２６（６）：１１０５—
ｔｉｐｏｒｔｅｒ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０００，９７：６８９６—
１１０９．
６９０１．
［１３］Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｔ，Ｆｕｋａｄａ Ｔａｎａｋａ Ｓ，Ｉｎａｇａｋｉ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｓ
［４］Ｓｈｉ Ｈ，Ｑｕｉｎｔｅｒｏ Ｆ Ｊ，Ｐａｒｄｏ Ｊ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｌａｓｍａ
ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｎａ ｜Ｈ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ａｎｄ ｆｌｏｗｅｒ
ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｎａ ／Ｈ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ ＳＯＳ１ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｌｏｎｇ—ｄｉｓ—
ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，４２：４５１—４６１．
ｔａｎｃｅ Ｎａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００２，１４：４６５
［１４］ Ｓｚｅ Ｈ，Ｐａｄｍａｎａｂａｎ Ｓ，Ｃｅｌｌｉｅｒ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔ—
—
４７７．
ｔｅｒｎｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＡｔＣＨＸ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
［５］Ｙｏｋｏｉ Ｓ，Ｑｕｉｎｔｅｒｏ Ｆ Ｊ，Ｃｕｂｅｒｏ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓ—
ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｏｓｍｏｔｉｃ ａａｊ ｕｓｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｋ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｐｏｌ—
ｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｎａ ／Ｈ ａｎｔｉ—
ｌｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，１３６：１—１６．
ｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００２，３０：
［１５］Ａｐｓｅ Ｍ Ｐ，Ａｈａｒｏｎ Ｇ Ｓ，Ｓｎｅｄｄｅｎ Ｗ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒ—
５２９—５３９．
ａｎｔｅ ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｂｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｎａ＋／Ｈ＋
［６］Ｃｅｌｌｉｅｒ Ｒ，Ｃｏｎｅｊｅｒｏ Ｇ，Ｒｉｃａｕｄ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｎｔｉｐｏｒｔ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８５：１２５６—
ＡｔＣＨＸ１７，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔｉｏｎ／Ｈ ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ，ＣＨＸ
１２５８．
ｆａｍｉｌｙ．ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ Ｋ
［１６］Ｚｈａｎｇ Ｈ Ｘ，Ｂｌｕｍｗａｌｄ Ｅ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｔｏｍａ—
ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００４，３９：８３４—８４６． ｔｏ ｐｌａｎｔｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｓａｌｔ ｉｎ ｆｏｌｉａｇｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｆｒｕｉｔ［Ｊ］．
［７］Ｓｏｎｇ Ｃ Ｐ，Ｇｕｏ Ｙ。Ｑｉｕ Ｑ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ａ ｐｒｏｂａｂｌｅ Ｎａ （Ｋ ）／
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００ｌ，ｌ９：７６５—７６８．
Ｈ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｃｌｏｎｅ ｏｆ ＯｓＣＨＸ１ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｍｅｄｉａｔｅｄ
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ Ｒｉｃｅ
ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｘｉｎ，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ＿ｂｏ，ＳＵ Ｙｏｎｇ＿ｂｏ，ＣＨＥＮ Ｌｉａｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ ３６１００５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＯｓＣＨＸ１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ｐＢＰＦ－３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｌｉｇａｔｉｎｇ ｇｅｎｅ
ｏｆ ＯｓＣＨＸ１ ｗｉｔｈ ｐＢＰＦ．Ｔｈｅ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐＢＰＦ－３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐ１３０１ ａｎｄ ｐ１３０１－３５Ｓ－ＯｓＣＨＸ１一
ＮＯＳ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＯｓＣＨＸ１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ Ｓａｔｉｖａ Ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｎｐｐｏｎｂａｒｅ）ｂｙ Ａｇｏｒｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅ—
ｄｉａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １００ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ａｆｔｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＧＵＳ ｓｔａｉｎ ａｎｄ ＰＣＲ ｉｔ ｗａｓ
ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ＯｓＣＨＸ１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｒｉｃｅ ｇｅｎｏｍｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＯｓＣＨＸ１；ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ；ｒｉｃｅ