马铃薯PIF 家族成员鉴定及其对高温胁迫的响应分析-USB迷|专注于互联网分享

2024年3月26日发(作者：贲理全)

作物学报

ACTA

AGRONOMICA

SINICA 2022, 48(1): 8698

ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9

E-mail:***************

DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.04285

马铃薯PIF家族成员鉴定及其对高温胁迫的响应分析

荐红举

1,2,3,**

尚丽娜

1,2,3,**

金中辉

1,2,3

丁艺

李燕

1,3

王季春

1,2,3

Khassanov

吕典秋

1,2,3,*

胡柏耿

Vadim

西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400715;

南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400715;

薯类生物学与遗传育种重庆市

重点实验室, 重庆 400715;

国家马铃薯工程技术研究中心, 山东德州 253600;

S. Seifullin Kazakh Agrotechnical University, Zhenis

Avenue 010011, Astana, Republic of Kazakhstan

摘要: 植物光敏色素作用因子(phytochrome interacting factors, PIFs)属于碱性-螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,

bHLH)转录因子家族, 通过将光和温度等外部环境信号与植物体内源信号途径相整合, 进而形成复杂的信号转导网

络来精密调控植物的生长发育进程。目前, 关于马铃薯PIF家族基因的研究较少, 鉴定和分析StPIF家族成员有助于

进一步提高马铃薯的产量和品质。本研究运用生物信息学方法, 以拟南芥PIF家族成员蛋白序列作为源序列, 通过在

马铃薯基因组数据库中进行BlastP分析鉴定出7个StPIFs家族成员, 并对其进行系统进化、染色体分布、复制事件、

蛋白理化性质、基因结构、Motif预测、启动子顺式作用元件、基因表达模式以及对高温胁迫的响应分析。结果显示,

StPIF家族所有成员均含有Motif 1 (bHLH结构域)、Motif 2 (APB结构域)基序; 在StPIF基因的启动子区域预测到多

个参与光响应、激素、干旱、低温、昼夜节律以及防御和应激反应调控元件; 基因表达模式和现蕾期高温胁迫响应

分析表明, 家族成员具有明显的组织表达特异性, 基因存在功能分化, 且大部分StPIF成员对生物胁迫和高温等非生

物胁迫具有明显响应。以上研究结果极大丰富了我们对StPIF家族的认识, 为进一步探究StPIF基因在马铃薯生长期

应对生物胁迫以及在结薯期应对高温等非生物胁迫中发挥的功能奠定了理论基础。

关键词: 马铃薯(Solanum tuberosum L.); PIF家族; 生物信息学; 高温; 表达模式分析

Genome-wide identification and characterization of PIF genes and their

response to high temperature stress in potato

JIAN Hong-Ju

1,2,3,**

, SHANG Li-Na

1,2,3,**

, JIN Zhong-Hui

1,2,3

, DING Yi

, LI Yan

1,3

, WANG Ji-Chun

1,2,3

, HU

Bai-Geng

, Vadim Khassanov

, and LYU Dian-Qiu

1,2,3,*

College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;

State Cultivation Base of Crop Stress Biology for

Southern Mountainous Land of Southwest University, Chongqing 400715, China;

Chongqing Key Laboratory of Biology and Genetic Breeding for

Tuber and Root Crops, Chongqing 400715, China;

National Engineering Research Center for Potato, Dezhou 253600, Shandong, China;

S. Seiful-

lin Kazakh Agrotechnical University, Zhenis Avenue 010011, Astana, Republic of Kazakhstan

Abstract: Phytochrome interacting factors (PIFs) belong to the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor family, which

integrates external environmental signals such as light and temperature with plant endogenous signal pathways, and then form a

complex signal transduction network to precisely regulate the growth and development of plants. Up to now, there are few studies

of PIF family genes in potato. Identification and analysis of StPIF family members will help to further improve the yield and qua-

lity of potatoes. In this study, BlastP analysis was performed in the potato genome database using Arabidopsis PIFs family

本研究由国家自然科学基金资助项目(32101659), 科技部科技伙伴计划项目(KY201904016), 国家重点研发计划项目(2018YFE0127900)和西

南大学人才引进项目(SWU019008, SWU020009)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32101659), the Science and Technology Partnership Program, Minis-

try of Science and Technology of China (KY201904016), the National Key Research and Development Program of China (2018YFE0127900), and

the Talent Introduction Program of Southwest University Project (SWU019008, SWU020009).

通信作者(Corresponding author): 吕典秋,E-mail:*********************

同等贡献(Contributed equally to this work)

第一作者联系方式: 荐红举,E-mail:*****************.cn;尚丽娜,E-mail:*********************

Received (收稿日期): 2020-12-29; Accepted (接受日期): 2021-04-14; Published online (网络出版日期): 2021-05-20.

URL: /kcms/detail/

第

期

荐红举等: 马铃薯PIF家族成员鉴定及其对高温胁迫的响应分析

member protein sequences as source sequences and seven StPIFs family members were identified. Systemic evolution,

chromosome distribution, replication events, protein physicochemical properties, gene structure, motif prediction, promoter

cis-acting elements, gene expression pattern, and the response to high temperature stress were also conducted. These results

showed that all members of the StPIFs gene family contain Motif 1 (bHLH domain) and Motif 2 (APB domain); multiple

cis-regulatory elements involved in light response, hormones, drought, low temperature, and circadian rhythm as well as defense

and stress response regulatory elements were predicted in the promoter regions of the StPIF genes. Results of gene expression

patterns and high temperature stress response at budding stage revealed that StPIFs family members had obvious tissue expression

specificity, indicating their functional differentiation, and most StPIFs members had obvious responses to biotic stress and abiotic

stresses including high temperature. In conclusion, these foundlings greatly enriched the understanding of the members of the

StPIF family, and laid a theoretical foundation for further exploring the functions of StPIFs genes in responses to biotic stress and

abiotic stress during potato growth period including high temperature at tuber stage.

Keywords: potato (Solanum tuberosum L.); PIF family; bioinformatics; high temperature; the relative expression pattern

植物光敏色素作用因子(plant phytochrome inter-

acting factors, PIF)是连接植物体内外信号的桥梁, 通

过将植物体外部光、温度、胁迫等环境信号与激素、

生物钟等内部信号整合, 在调控植物种子萌发

[1]

、开

花

[2]

、庇荫反应

[3]

、抗逆

[4-7]

等途径发挥重要功能。

PIFs家族成员有保守的N端APB结构域(active

phytochrome B-binding Motif)和C端bHLH (basic

helix-loop-helix)结构域, 部分成员N端还含有1个

APA结构域(active phytochrome A-binding Motif)

[8]

。

PIF家族成员通过APB或APA结构域分别与光敏色

A (phyto-

chrome A, phyA)相结合来调控植物形态建成

[9]

。

在水稻中, 过表达玉米ZmPIF3基因能提高转

基因水稻对干旱和盐的抵抗能力, 进一步研究发现,

ZmPIF3在胁迫条件下通过促进气孔的闭合来减少

水分的蒸发, 从而提高转基因植物的抗逆性

[4,6]

。与

ZmPIF3功能相似, ZmPIF1也能通过调控气孔的关

闭来提高转基因水稻的抗旱能力

[7]

。AtPIF3能够直

接结合在CBF (CREPEAT BINDING FACTOR)基因

的启动子区, 抑制CBF及其下游低温响应基因表达,

负调控植株的抗冻性

[5]

。拟南芥突变体pif4在高温

条件下出现晚开花的表型, 进一步研究发现, 温度

升高促进PIF4的表达, PIF4通过结合开花相关的正

调控因子FT (FLOWERING LOCUS T)基因的启动子,

调节FT基因的表达促进开花

[2]

。PIF4在响应高温环

境时, 能够激活生长素生物合成基因YUC8、TAA1,

促进生长素应答基因IAA19、IAA29的表达, 调节植

物下胚轴和叶柄伸长, 从而使植物提高对热环境的

抵抗能力

[10-11]

。高温还能够诱导PIF4在气孔前体细

胞中积累, 并与SPEECHLESS (SPCH)基因启动子结

合抑制该基因的表达, 从而限制高温下气孔的产生,

提高植物的耐热性

[12]

。在棉花中, GhPIF4参与调控

油菜中, BnaPIF4和BnaBZR1高温下的花药败育

[13]

。

基因通过相互拮抗作用来调控甘蓝型油菜弱光光

效

[14]

。拟南芥PIF5能够与2个编码DELLA蛋白的

基因RGA1和GAI的启动子结合并激活其表达, 进

而抑制黑暗中种子萌发

[1]

。AtPIF7在昼夜节律的作

用下负调控DREB1的表达

[15]

。然而, 在马铃薯中,

仅有报道StPIF3参与光周期调控马铃薯块茎形成

[16]

并对StPIF4基因进行克隆和初步分析

[17]

, 关于马铃

薯中PIFs基因家族成员鉴定的研究, 以及其他成员

是否能够整合外部环境信号来调控马铃薯植株的生

长发育以及块茎形成仍未可知。

本研究运用生物信息学方法, 以拟南芥PIF家

族成员蛋白序列作为源序列, 在马铃薯基因组数据

库中进行BlastP分析, 鉴定出7个StPIF家族成员,

并对其进行系统进化、染色体分布、复制事件、蛋

白理化性质、基因结构、Motif预测、启动子顺式作

用元件、基因表达模式以及高温胁迫后不同组织部

位的响应分析, 以期为进一步探究StPIF基因在马

铃薯生长期应对生物胁迫以及在结薯期应对高温等

非生物胁迫中发挥的功能奠定理论基础。

素B (phytochrome B, phyB)或光敏色素

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用马铃薯‘中薯20号’在光照培养箱中进行盆

栽试验(塑料盆直径24 cm), 培养箱温度22℃/18℃

(白天/黑夜), 光周期16 h/8 h, 光照强度270 μmol

2

1

, 相对湿度60%±5%, 将生长至现蕾期的马铃

薯植株分别置于35℃/30℃和22℃/18℃进行不同温

度处理(其他条件保持一致), 并对不同组织部位进

行取材, 液氮速冻后保存于80℃冰箱, 备用。

1.2 马铃薯PIF家族成员的鉴定

从拟南芥数据库TAIR (opsis.

org//)下载拟南芥PIFs蛋白序列, 并以此为

源序列分别在Phytozome数据库(phytozome.

88 作物学报

第48卷

/pz//)和EnsemblPlants数据库

(//)进行BlastP分

析, 阈值E<10

, 且序列相似性得分最高, 从而获

取候选马铃薯PIFs蛋白序列。为进一步验证候选

成员的可靠性, 从马铃薯基因组蛋白文件中提取候

选PIFs成员的蛋白序列, 比对Pfam数据库

(/Tools/pfa/pfamscan/), 确认

马铃薯PIFs成员核心结构域的完整性。将获得马

铃薯PIFs成员的氨基酸序列、等电点和分子量等

理化性质在网站ExPASy (/

protparam/)上进行预测。

1.3 多序列比对

为明确PIF基因家族成员的蛋白保守结构域,

利用软件MEGA7.0和Jalview对拟南芥、马铃薯和

番茄的PIFs蛋白序列进行多序列比对并展示。

1.4 马铃薯PIF家族成员的系统进化分析

利用MEGA7.0软件采用邻接法(Neighbor-

Joining, NJ)对鉴定出的7条马铃薯PIF蛋白序列和

通过ClustalW (v1.81)比对得到的7条拟南芥PIF蛋

白序列、8条番茄PIF蛋白序列、7条水稻PIF蛋白

序列以及6条玉米PIF蛋白序列构建系统发育进化

树。设置参数为: Passion model、partial deletion以及

1000 bootstrap replications。

1.5 马铃薯PIF家族成员的基因结构、保守基序

分析

从马铃薯数据库PGSC (-

/)中下载马铃薯基因组注释文件, 利

用TBtools (/content/10.1101/

289660v1)提取马铃薯PIF基因家族成员的结构信息

并绘制基因结构图。将马铃薯PIF蛋白序列提交到

在线工具MEME (/)进行Motif

预测, 参数设置: 氨基酸长度为6~100 aa, 数目最大

为10个, 其余参数默认, 分析结果用TBtools绘图

展示。

1.6 马铃薯PIFs基因家族共线性分析

从马铃薯数据库PGSC (solanaceae.

/)下载马铃薯基因组序列文件

和基因结构注释文件, 然后运用TBtools对马铃薯

全基因组序列自身比对, 进行马铃薯PIF基因家族

复制分析并展示。从EnsemblPlants数据库

(/info/website/ftp/)

获取拟南芥、番茄的全基因组序列文件和基因结构注

释信息文件, 将马铃薯全基因组序列通过TBtools分

别比对拟南芥、番茄全基因组序列, 得到马铃薯与

拟南芥、番茄的基因共线性关系。

1.7 启动子顺式作用元件分析

通过TBtools提取StPIF基因起始密码子上游

2000 bp的序列在PlantCARE网站(

/webtools/plantcare/html/)

进行启动子顺式作用元件预测分析, 在PlantPAN网

站(/)对启动子顺式作

用元件可能结合的转录因子进行分析

[18]

, 利用

MEME在线工具对启动子进行Motif预测, 最后将

调控元件筛选归纳后利用TBtools进行可视化。

1.8 不同胁迫下的表达模式分析

从马铃薯数据库PGSC (solanaceae.

/)中下载转录组数据。其中生物

胁迫包括晚疫病(Phytophthora infestans infected leaves,

PIL)、β-氨基丁酸(β-Aminobutyric Acid, BABA)以及

诱导因子苯并噻二唑(Benzothiadiazole, BTH); 非生物

胁迫有3种, 分别为盐渍(NaCl, 150 mmol L

1

, 24 h)、

高温(35℃, 24 h)和干旱(Mannitol, 260 μmol L

1

, 24 h)。

外源激素处理包括脱落酸(ABA, 50 μmol L

1

, 24 h)、生

长素(IAA, 10 μmol L

1

, 24 h)、赤霉素(GA

, 50 μmol L

1

24 h)和细胞分裂素(BAP, 10 μmol L

1

, 24 h)。将转录组

数据利用TBtools进行热图展示, 其中将FPKM值进

行log

(FPKM+0.1)的转换。

1.9 高温胁迫后不同组织部位RNA的提取与转

录水平分析

分别提取现蕾期马铃薯的根、茎、叶、匍匐茎

全长、匍匐茎尖、小薯等不同组织部位RNA, 总RNA

提取纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限

公司, 反转录试剂盒Hifair II 1st Strand cDNA Syn-

thesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)购自

重庆沐生生物科技有限公司。在CFX Connect

Real-time PCR仪(成都百乐科技有限公司)上进行

qRT-PCR, 程序如下: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s,

39个循环; 95℃ 5 s; 60℃ 1 min; 熔解曲线60~95℃,

增量0.5℃。以elongation factor 1-α (ef1α)基因为内

参基因, 按2

–ΔΔCt

方法分析基因的相对表达量, 每个

样品重复3次。由生工生物工程(上海)股份有限公司

合成qRT-PCR相关引物, 序列如表1。

2 结果与分析

2.1 马铃薯PIF家族成员的鉴定与分析

本研究以确定的拟南芥PIF蛋白序列作为源序

第

期

荐红举等: 马铃薯PIF家族成员鉴定及其对高温胁迫的响应分析

列, 通过BlastP分析, 获得7个马铃薯PIF基因家族

成员(表2)。基于马铃薯PIF蛋白序列与拟南芥、番

茄、水稻和玉米的PIF蛋白序列的聚类分析, 可将马

铃薯PIF基因分别命名为StPIF1a

、

StPIF1b

、

StPIF3

、

StPIF4

、

StPIF7a

、

StPIF7b

、

StPIF8。对马铃薯PIFs

家族成员的序列长度、分子量、等电点以及在染色

体上的位置等基本特性的分析表明, 7个StPIFs成员

表1 本研究所用引物

Table 1 Primers used in this study

引物

Primer

ef1α

StPIF1a

StPIF1b

StPIF3

StPIF4

StPIF8

正向序列

Forward sequence (5'–3')

ATTGGAAACGGATATGCTCCA

GTTTCACACGTACCCGATAATG

GTACTTCGACTGTAGAGATCCG

GAGTTTAGGTATGGGTATGGGG

TGAACTTCCTGTTCCACATCAA

AATCAGTGTGTACCGAGTTG

共分布在5条染色体上。其中, StPIF3和StPIF8共

同分布在染色体ch01上, StPIF7a在染色体ch03上,

StPIF1b和StPIF7b同在染色体ch06上, StPIF4在染

色体ch07上, StPIF1a在染色体ch09上。其分子量

在46.81~75.83 kD之间, 氨基酸大小在416~708 aa

之间, 等电点介于5.13~8.71。每条StPIF蛋白序列

上都含有bHLH保守结构域。

反向序列

Reverse sequence (5'–3')

TCCTTACCTGAACGCCTGTCA

GAAATGTCACATGTAGTCGTCG

TTTGAATCCACAATCGTCGATG

TACAGCTATTCCTGGATAAGCG

TTCATTAGGATCATAGCCTGGC

CTAACCCATGCATTGCTAAC

表2 马铃薯PIFs家族成员的序列特性

Table 2 Sequence characteristics of PIFs family members in potato

基因

Gene

基因编号

Gene ID

氨基酸数目

Number of amino

acids (aa)

分子量

Molecular

weight (kD)

等电点

Isoelectric

point (pI)

位置

Location

功能域

Functional domains

(Start-End, bp)

StPIF1a PGSC0003DMG400018950 578

StPIF1b

StPIF3

StPIF4

StPIF7a

StPIF7b

StPIF8

PGSC0003DMG400014705 515

PGSC0003DMG400018280 708

PGSC0003DMG401015926 517

PGSC0003DMG400024554 437

PGSC0003DMG400033087 416

PGSC0003DMG400025976 464

62.94 6.42 ch09:45450532–45460120 343–406/bHLH

56.41 5.13 ch06:2038519–2047215 309–372/bHLH

75.83 7.26 ch01:79007967–79013234 450–512/bHLH

57.44 7.09 ch07:42074703–42078252 331–394/bHLH

48.17 6.79 ch03:55395567–55398080 237–298/bHLH

46.81 8.71 ch06:51466651–51468759 195–252/bHLH

50.75 7.62 ch01:70077080–70081427 281–344/bHLH

2.2 拟南芥、马铃薯、番茄PIF蛋白序列比对

对拟南芥、马铃薯和番茄PIF蛋白序列进行比

对(图1)发现, 所有马铃薯PIF成员均含有保守的

APB结构域和bHLH结构域, PIF1和PIF3成员还同

时含有APA结构域。结构域中的保守区段存在个别

氨基酸的差异。

员; 第V亚家族不仅包括马铃薯和番茄的PIF4, 拟

南芥的PIF4、PIF5成员, 还包括OsPIL11、OsPIL12、

OsPIL13、OsPIL14以及ZmPIF4、ZmPIF5、ZmPIF6。

其中第I和第IV亚家族类是双子叶特有的, 第III

和第V亚家族类是单、双子叶共有的。PIF4和PIF5

在拟南芥和玉米中聚在一起, 在马铃薯和番茄中只

发现了PIF4成员。马铃薯PIF家族成员与拟南芥和

番茄的同源性明显大于单子叶植物水稻和玉米。

2.3 马铃薯PIFs家族成员的系统进化分析

对马铃薯StPIF蛋白序列与拟南芥、番茄、水

稻和玉米中的PIF蛋白序列进行系统进化分析有助

于预测其在马铃薯中发挥的功能。分析结果表明,

PIF家族成员大致可以分为5个亚家族(图2)。第I

亚家族中包括拟南芥、马铃薯和番茄的PIF7和PIF8

成员; 第II亚家族中只有拟南芥的PIF6成员; 第III

亚家族包括拟南芥、马铃薯、番茄和玉米的PIF3成

员, 以及OsPIL16、OsPIL15、ZmPIF1和ZmPIF2; 第

IV亚家族中包括拟南芥、马铃薯和番茄的PIF1成

2.4 马铃薯PIFs家族成员的基因结构、保守基

序及结构域分析

编码区的差异, 特别是可以改变基因功能的差

异, 可能是由基因结构上氨基酸的变化引起的

[19]

。

对马铃薯StPIF家族成员基因结构分析发现(图3), 7

个StPIF基因均含有5'UTR和3'UTR, 除StPIF7a

、

StPIF7b

、

StPIF8含有6个外显子外, 其余4个基因

均含有7个外显子。结合进化分析发现, 在同一分

作物学报

第48卷

图1 拟南芥、马铃薯和番茄PIF氨基酸多序列比对

Fig. 1 Alignment of PIFs amino acid sequences from Arabidopsis thaliana, Solanum tubersum, and Solanum lycopersicum

A: APB结构域; B: APA结构域; C: bHLH结构域。

A: active phytochrome B-binding (APB) domain; B: active phytochrome A-binding (APA) domain; C: basic helix-loop-helix (bHLH)

DNA-binding domain.

支的StPIF基因结构相似, 且外显子区段的大小和

分布基本相近。

利用MEME在线网站对马铃薯PIF蛋白序列进

行保守基序分析(图3)发现, Motif 1、Motif 2、Motif

4和Motif 5在所有StPIF蛋白中均存在, 其中Motif

1对应bHLH结构域, Motif 2对应APB结构域(图4),

说明马铃薯PIF基因家族的基序具有高度保守性。

除此之外, 7个成员中, 有4个StPIF序列含有Motif

3, 2个StPIF序列含有Motif 6, 4个StPIF序列含有

Motif 7, 5个StPIF序列含有Motif 8, 5个StPIF序列

含有Motif 9, 3个StPIF序列含有Motif 10。

图2 PIF基因家族系统发育进化树

Fig. 2 Phylogenic tree of PIFs gene family

At: 拟南芥; St: 马铃薯; Sl: 番茄; Os: 水稻; Zm: 玉米。

At: Arabidopsis thaliana; St: Solanum tubersum; Sl: Solanum ly-

copersicum; Os: Oryza sativa; Zm: Zea mays.

2.5 马铃薯PIFs家族成员共线性分析

基因复制在生物进化过程中起着关键的作用,

为研究马铃薯PIF基因间可能的关系和潜在的基因

重复, 运用TBtools鉴定的马铃薯PIF家族成员中只

有StPIF7a和StPIF7b存在部分重复(图5)。

第

期

荐红举等: 马铃薯PIF家族成员鉴定及其对高温胁迫的响应分析

图3 马铃薯PIF基因结构和保守基序

Fig. 3 Structure and conserved motif of PIFs gene in potato

Motif: 保守基序; UTR: 非翻译区; CDS: 编码区序列。

Motif: conservative base sequence; UTR: untranslated region; CDS: coding region sequence.

图4 马铃薯PIFs家族成员保守基序

Fig. 4 Conserved motifs of PIFs family members in potato

为研究马铃薯PIF基因的进化起源和过程, 利

用TBtools对马铃薯、拟南芥和番茄的PIF基因进

行共线性分析并绘图(图6)。分析结果表明, 4个配对

的AtPIF-StPIF基因(AtPIF1-StPIF1b

、

AtPIF1-

StPIF1a

、

AtPIF7-StPIF7b

、

AtPIF8-StPIF8)位于拟南

芥和马铃薯基因组之间具有共线性的基因组区域。8

个配对的StPIF-SlPIF基因(StPIF1a-SlPIF1a、

StPIF1b-SlPIF1b、StPIF7a-SlPIF7a、StPIF7b-

StPIF7b-SlPIF7b

、

StPIF8-

SlPIF7a、StPIF7a-SlPIF7b

、

SlPIF8a

、

StPIF8-SlPIF8b)位于马铃薯和番茄基因组

之间具有共线性的基因组区域。

2.6 启动子顺式作用元件分析

为研究StPIF家族成员潜在的调控机制, 进一

步对起始密码子上游2000 bp的序列进行顺式作用

元件分析。结果表明, 马铃薯StPIF家族基因启动子

区域除了有TATA-box和CAAT-box等一些基本的保

守区外, 还有很多光响应元件以及与胁迫、激素和

植物生长发育相关等共137个(16种)重要顺式作用

元件(图7)。分别为分生组织表达元件(3个

CAT-box)、昼夜节律调控元件(4个circadian)、防御

和胁迫响应元件(1个TC-rich repeats)、低温应答元

件(3个LTR)、受伤应答元件(7个WUN-Motif)、缺

作物学报

第48卷

图5 马铃薯PIF基因家族共线性分析

Fig. 5 Collinearity analysis of the PIFs gene family in potato

图6 马铃薯、拟南芥和番茄PIF基因的共线性分析

Fig. 6 Collinearity analysis of PIFs genes among Solanum tubersum, Arabidopsis thaliana, and Solanum lycopersicum

图7 马铃薯StPIF基因启动子中与胁迫反应和植物发育相关的顺式作用元件

Fig. 7 Cis-elements in the promoter of StPIFs genes in responses to various stresses and plant development in potato

第

期

荐红举等: 马铃薯PIF家族成员鉴定及其对高温胁迫的响应分析

氧诱导响应元件(6个ARE)、干旱应答元件(21个

MYC、15个MYB和6个MBS)以及生长素应答元

件(1个TGA-element和3个AuxRR-core)、脱落酸

应答元件(6个ABRE)、乙烯应答元件(16个ERE)、

茉莉酸甲酯应答元件(11个CGTCA-Motif、11个

TGACG-Motif和11个as-1)、赤霉素应答元件(5个

P-box、1个TATC-box和1个GARE-Motif)和水杨

酸应答元件(5个TCA-element)。

利用MEME在线网站对马铃薯PIFs家族成员

启动子序列进行保守基序分析(图8和图9)表明,

StPIF1a启动子序列含有Motif 1~9; StPIF1b启动子

序列含有Motif 2、Motif 3、Motif 6; StPIF3启动子

序列含有Motif 1~3、Motif 4、Motif 8; StPIF4启动

子序列含有

Motif 1~3、Motif 5、Motif 6、Motif 8,

StPIF7a启动子序列含有Motif 1~8、Motif 10,

StPIF7b启动子序列含有Motif 1、Motif 3、Motif 5~6,

Motif 8~10, StPIF8启动子序列含有Motif 1~3和

Motif 8。

利用PlantPAN对马铃薯PIF家族成员启动子序

列可能结合的转录因子进行分析(图10)表明, StPIF

家族成员启动子顺式作用元件能结合包含bZIP、

NAC、NF-YB等31种类型的转录因子。其中StPIF1a

的启动子区含有可以被MYB、G2-like、WRKY、SBP

等14种转录因子结合的顺式作用元件; StPIF1b的

启动子区含有可以被ARID、AP2/ERF、TCP等14

种转录因子结合的顺式作用元件; StPIF3 的启动子

区含有可以被SBP、NF-Y、bHLH等14种转录因子

结合的顺式作用元件; StPIF4的启动子区含有可以被

图8 马铃薯PIF启动子序列保守基序

Fig. 8 Conserved motif of PIFs promoter sequence in potato

图9 马铃薯PIF家族成员启动子保守基序

Fig. 9 Conserved motifs of promoters of PIFs family in potato

作物学报

第48卷

MYB、bZIP等13种转录因子结合的顺式作用元件;

StPIF7a的启动子区含有可以被HSF、WRKY等11

种转录因子结合的顺式作用元件; StPIF7b的启动子

区含有可以被EIN3、WRKY等16种转录因子结合

的顺式作用元件; StPIF8的启动子区含有可以被

MADS box、WRKY、NF-Y等14种转录因子结合的

顺式作用元件。

对高温有明显响应, 对盐渍和干旱响应不明显;

StPIF4对高温有强烈响应, 对盐渍和干旱有明显响

应; StPIF7a和StPIF7b对高温、盐渍和干旱均有明

显响应, 但本体表达量较低, 几乎不表达(不进行

后续分析); StPIF8对干旱有明显响应, 但对高温和

盐渍响应不明显。对马铃薯晚疫病的响应过程中,

StPIF4响应最强烈, StPIF1a、StPIF1b、StPIF3和

StPIF8均有不同程度响应; 对苯并噻二唑和β-氨基

丁酸的响应过程中, StPIF3响应最强烈, StPIF1a、

StPIF1b、StPIF4和StPIF8均有不同程度响应。外

源施加激素的响应分析表明, 该家族成员对激素均

有不同程度响应, 其中StPIF1a、StPIF1b和StPIF4

对细胞分裂素有明显响应, StPIF3对细胞分裂素和

脱落酸响应强烈, StPIF8对脱落酸和赤霉素有明显

响应。

2.7 不同胁迫下的表达模式分析

基于从马铃薯PGSC数据库中下载的转录组数

据, 对StPIFs家族成员在6种环境胁迫(高温、盐渍、

干旱、晚疫病以及诱导因子苯并噻二唑和β-氨基丁

酸)和4种外源激素(脱落酸、生长素、赤霉素和细

胞分裂素)处理后进行表达模式分析(图11)。结果显

示, 在环境胁迫中, StPIF1a本体表达水平较高, 对

高温、盐渍和干旱响应不明显; StPIF1b和StPIF3

图10 马铃薯PIF启动子序列结合转录因子

Fig. 10 PIFs promoter sequence binding transcription factor in potato

图11 马铃薯PIF基因对环境胁迫的响应

Fig. 11 Heat map of PIFs genes in response to environmental stress in potato

第

期

荐红举等: 马铃薯PIF家族成员鉴定及其对高温胁迫的响应分析

2.8 高温胁迫下不同组织部位的转录水平分析

温度是影响马铃薯后期结薯的较为关键的不可

控因素之一。为分析StPIF家族成员在马铃薯后期应

对非生物胁迫中的作用, 结合家族基因在转录组数

据中不同胁迫下的表达模式, 进一步对StPIF1a、

StPIF1b、StPIF3、StPIF4和StPIF8进行35℃高温胁

迫下不同组织部位的转录水平分析(图12), 其中

StPIF7a、StPIF7b在不同组织部位表达量均较低, 数

据未显示; 现蕾期植株在22℃下生长10 d后, 部分

匍匐茎尖膨大成小薯, 而在35℃高温处理10 d后, 匍

匐茎尖未见膨大。StPIF整个家族成员在马铃薯的根

中几乎不表达, StPIF1a、StPIF1b、StPIF3、StPIF4和

StPIF8在叶片和茎中均高表达, 且StPIF1a

、

StPIF1b

、

StPIF3和StPIF4在匍匐茎中均有表达。经35℃高温

处理10 d后, StPIF1a、StPIF3、StPIF4和StPIF8表

达量均明显下调, 无论叶片、茎还是匍匐茎中,

StPIF4、StPIF8表达下调均较为明显; 然而, StPIF1b

在叶片等地上部位及匍匐茎中表达均发生上调。

3 讨论

PIF家族成员在植物的生长发育中发挥着重要的

作用, 不同物种中PIF家族成员的数量也不相同。单

子叶植物水稻

[21]

和玉米

[22]

中均为6个, 葡萄

[25]

、拟南

芥

[20]

、番茄

[23]

、杨树

[24]

中分别有4、7、8、10个, 然

而, 对于马铃薯PIF家族成员功能知之甚少。

本研究运用生物信息学方法, 对马铃薯PIF蛋

白序列与拟南芥、番茄、水稻和玉米中的PIF蛋白

序列比对, 在基因组数据库中共鉴定出7个StPIF成

员, 归为5个亚家族, 分别将其命名为StPIF1a、

StPIF1b、StPIF3、StPIF4、StPIF7a、StPIF7b、StPIF8。

基因结构与保守结构域的差异是遗传变异的基础,

对StPIF家族成员基因结构与进化分析表明, 同一

分支上StPIF基因结构相似, 外显子区段大小和分

布基本相近; 蛋白序列保守基序分析, StPIF成员均

图12 高温胁迫下StPIF家族基因在不同组织部位的表达分析

Fig. 12 Relative expression level of StPIFs genes in different tissues under high temperature stress

96 作物学报

第48卷

含有bHLH和APB结构域, 部分成员含有APA结构

域。表明该家族成员在进化过程和功能上具有高度

保守性。

启动子顺式作用元件分析有助于预测基因潜

在的功能, 转录因子通过与下游靶基因启动子中的

顺式作用元件结合, 进而对靶基因起到转录调控作

用

[26]

。研究表明, 油菜BnaPIF4和BnaBZR1基因通

过相互拮抗作用来调控甘蓝型油菜的弱光光效

[14]

。

过表达ZmPIF3能提高转基因水稻对干旱和盐的抵

抗能力

[4,6]

; AtPIF3通过抑制CBF及其下游低温响应

基因表达, 负调控植株的抗冻性

[5]

; AtPIF7在昼夜节

律的作用下负调控DREB1的表达

[15]

; 拟南芥PIF5

能够与RGA1和GAI的启动子结合并激活其表达,

进而抑制黑暗中种子萌发

[1]

。启动子顺式作用元件

分析表明, StPIF家族7个成员中均含有多个光响应

和干旱应答元件, StPIF4和StPIF8中含有低温应答

元件, StPIF1a、StPIF1b、StPIF7b、StPIF8含有时钟

响应元件, StPIF3中含有防御和胁迫应答元件,

StPIF1a、StPIF1b、StPIF4、StPIF8中含有赤霉素应

答元件, StPIF1b、StPIF3、StPIF4、StPIF7a、StPIF8

中含有多个乙烯应答元件, StPIF4、StPIF7b、StPIF8

含有生长素响应元件。StPIF不同家族成员中含有多

个胁迫响应元件, 表明该家族成员可能对调控植物

的生长发育发挥着重要作用。对启动子区域可能结

合的转录因子进行预测分析发现, StPIF家族成员启

动子区域含有多个bZIP、NAC、WARKY、TCP等

转录因子结合位点, 已知在胁迫条件下, bZIP转录

因子可以与ABA诱导基因启动子区域的ABRE结合

来调节下游靶基因的表达

[27]

; NAC转录因子直接或

间接参与干旱、高盐、冷害应答基因的表达, 在植

物抗干旱、高盐等非生物逆境胁迫中起重要作用

[28]

;

WRKY转录因子通过调控植物细胞壁的合成、开花

时间、种子储藏、物质代谢、种子萌发、植物衰老

等过程参与植物生长发育的各个阶段

[29]

; TCP家族

转录因子不仅影响细胞增殖的定位模式, 控制叶

形、茎分枝等形态特征, 还能够参与激素的合成和

昼夜节律调控

[30]

。因此, 推测StPIF家族可能参与植

物对外界环境的响应, 与启动子区域顺式作用元件

预测相一致。

PGSC数据库表达数据显示, StPIF家族成员对

温度、干旱等非生物胁迫以及晚疫病等生物胁迫有

着明显的响应, 其中, StPIF1b、StPIF3、StPIF4、

StPIF7a、StPIF7b在高温处理24 h后明显下调。马

铃薯植株对高温较为敏感

[31]

, 若在生长前期遭遇高

温天气会推迟块茎的发生, 缩短膨大时间, 进而降

低净同化率, 导致产量明显下降

[32]

。据预测, 由于气

候变化带来的生物和非生物胁迫, 到2055年马铃薯

产量将大幅度下降

[33]

, 预计2040—2069年世界马铃

薯产量将下降18%~32%

[34]

。因此, 研究高温对马铃

薯产量及品质的影响具有重要意义。结合组织表达

分析表明, StPIF家族基因在马铃薯的根中几乎不表

达, StPIF1a、StPIF1b、StPIF3、StPIF4和StPIF8在

叶片和茎中高表达, 但不同家族成员之间存在明显

的表达差异(StPIF7a、StPIF7b在不同组织部位表达

量均较低, 数据未显示)。对现蕾期的马铃薯植株

35℃高温处理10 d后, StPIF1a、StPIF3、StPIF4和

StPIF8表达量在叶片、茎及匍匐茎中均明显下调, 然

而, StPIF1b在叶片等地上部位及匍匐茎中表达明显

上调。在StPIF家族启动子元件中未预测到与高温

响应相关元件, 但是存在与胁迫相关转录因子的结

合位点。因此, 在StPIF家族启动子区域是否存在新

的高温响应元件, StPIF家族是否通过其他转录因子

对高温的应答间接响应温度的变化, 以及不同成员

之间对高温条件下结薯调控机制是否一致, 值得我

们进一步深入探究。

4 结论

本研究鉴定出7个马铃薯PIF家族成员, 分属

于5个亚家族, 所有StPIF成员均含有保守的APB

结构域和bHLH结构域, 部分成员同时含有APA结

构域。基因表达分析表明StPIF家族成员具有明显

的组织特异性, 35℃高温处理后StPIF成员有不同

的应答模式。

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