2024年5月24日发(作者：麴紫易)
:
/
doi
.0366-6964.2023.10.019
j
ActaVeterinariaetZootechnicaSinica
():
畜牧兽医学报
2023
,
54104209-4219
开放科学
(
资源服务
)
:
标识码
(
OSID
)
CYP19A1
对兔卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响
杨安琪
,
李嘉诚
,
宋
颖
,
陈
欣
,
靳荣帅
,
赵博昊
,
吴信生
,
陈
阳
*
()
扬州大学动物科学与技术学院
,
扬州
225009
摘
要
:
旨在探究
P
对兔
450
芳香化酶基因
(
ctochromeP450
,
famil9
,
subfamiloletide1
,
CYP
19A1
)
yy
1
y
A
,
pypp
,)
卵巢颗粒细胞
(
增殖和凋亡的影响
。
本研究选择健康状况良好的
8
月龄新西兰白兔母兔
,
采集
ranulosacellsGCs
g
/
分析
C
PCR
、
CCK8
、
FITCPI
等技术与方法
,
YP
19A1
基因过表达和干扰对类固醇激素合成相关基因及
GCs
增殖
,
和凋亡的影响
。
利用
F
鉴定分离的原代细胞是
GSHR
免疫荧光染色
,
CsFSHR
表达呈阳性
。
克隆
CYP
19A1
基
,
因
,
发现其
c
编码
5DNA
全长为
1512b03
个氨基酸
。
经生物信息学预测发现
,
CYP19A1
蛋白是一种稳定的亲水
p
;
卵巢组织
,
分离并鉴定
G
利用一步克隆法获得兔
C
进行生物信息学分析
;
利用
q
Cs
YP
19A1
基因全长序列
,
RT-
性蛋白
,
含有一个
P
与其它物种同源性较高
。
在
G450
家族结构域
,
Cs
中
,
CYP
19A1
基因表达量的改变显著或极显
。
著影响了类固醇激素合成相关基因
IGF
1R
、
CYP
1B1
、
CYP
1A1
、
BMP
6
、
CYP
17A1
的表达
(
P
<0.05
或
P
<0.01
)
抑制
G
调控类固醇激素合成相关基因的表达
,
进而参与母兔卵泡发育
CYP19A1
可以促进
GCs
增殖
,
Cs
凋亡
,
进程
。
;
关键词
:
兔
;
卵巢
G
增殖
;
凋亡
CYP19A1
;
Cs
。
综上所述
,
过表达
/
干扰
C
极显著上调
/
下调
G
极显著抑制
/
促进
G
YP
19A1
后
,
Cs
增殖
,
Cs
凋亡水平
(
P
<0.01
)
()
中图分类号
:
S829.1
文献标志码
:
A
文章编号
:
10-4209-11
EffectsofCYP19A1onProliferationandAotosisofRabbitOvarranulosaCells
ppy
G
(
ColleeonimalScienceandTechnoloYanzhouUniversitYanzhou
225009
,
China
)
gf
A
gy
,
gy
,
g
,,,,,
YANGAniLIJiachenSONGYinCHENXinJINRonshuai
qggg
*
,
WUX
,
ZHAOBohaoinshenCHENYan
gg
)
ranulosacells
(
-month-oldNewZealandwhitefemalerabbitswereselectedto
gy
8
,
l-lenthseuenceofrabbit
CYP
19A1
g
ene
y
G
gq
:
Abstract
ThestudimedtoinvestiatetheeffectofP450aromatase
(
ctochromeP450
,
famil
y
a
gyy
19
,
subfamiloletide1
,
CYP19A1
)
onthe
p
roliferationandaotosisofrabbitovarian
y
A
,
pypppp
/
liferationandaotosisofovarianGCswereanalzedusinRT-PCR
,
CCK8andFITCPImeth-
ppygq
,
Rimmunofluorescencestaininisolated
p
rimarellswereidentifiedasGCs
g
F
gy
c
ectsof
y
o
p
c
g
m
yy
b
,
CYP
19A1
g
eneoverexressionandinterferenceonsteroidhormonesnthesis-related
g
enesro-
pyp
with
p
CYP
19A1
g
enewasclonedandthefulllenthofcDNAwas
pg
,
ormatics
p
redictionrevealedthatCYP19A1
p
rotein
pg
5
,
wasastablehdrohilic
p
roteincontainin450familtructuraldomainwithhihhomolo
ypg
aP
y
s
ggy
收稿日期
:
2023-03-15
;;
基金项目
:
扬州大学大学生科创基金
(
扬州大学青蓝工程项目
(
财政部和农业农村部
:
国家现代农业产业技术体系资助
X20220635
)
2022
)
),:
作者简介
:
杨安琪
(
女
,
江苏常州人
,
本科生
,
主要从事动物遗传育种与繁殖研究
,
2002-E-mail1683847892@
q
.com
q
()
CARS-43-A-1
:
陈
阳
,
主要从事动物遗传育种与繁殖研究
,
*
通信作者
:
E-mailanc@
y
yg
4210
,
hechaneofexressionof
CYP
19A1
g
enesinificantlrextremel
pgpgy
o
y
sinificantlffectedtheexressionofsteroidhormonesnthesis-related
g
enes
IGF
1R
,
gy
a
py
畜
牧
兽
医
学
报
54
卷
/
CYP
1B1
,
CYP
1A1
,
BMP
6
,
CYP
17A1
(
P
<0.05
or
P
<0.01
)
.Overexressionknockdownof
p
/,
CYP
19A1
extremelinificantlreulateddownreulatedthe
p
roliferationlevelofGCsand
y
s
gy
u
pgg
steroidhormonesnthesis-related
g
enesto
p
articiateinthefolliculardeveloment
p
rocessinfe-
ypp
/,
hihlinificantlnhibitedromotedtheaotosislevelofGCs
(
P
<0.01
)
.Inconclusion
gy
s
gy
i
ppp
,,
CYP19A1can
p
romoteGCs
p
roliferationinhibitGCsaotosisandreulatetheexressionof
ppgp
malerabbits.
:;;;
Keords
CYP19A1
;
rabbitovarianGCsroliferationaotosis
ppp
y
w
:,:
*Corresondin
uthor
CHENYanE-mailanc@
y
gyg
pg
a
,)
对卵母细胞的
颗粒细胞
(
ranulosacellsGCs
g
生长与成熟起着重要的调节作用
,
GCs
参与维持成
熟分裂的阻断和诱导排卵
,
调节卵母细胞成熟分
1-3
]
。
在所有哺乳动物中
,
裂
[
GCs
的增殖率会随着
3
]
。
在原始卵泡中
,
卵泡大小的变化而改变
[
GCs
增
课题组前期通过转录组测序筛选了多个参与母
兔繁殖周期调控的基因
,
其中关键差异表达基因
卵巢类固醇生成
CYP
19A1
在甾类激素生物合成
、
等信号通路中都有所富集
,
由此推测
CYP19A1
可
本研究计划克隆
C
利用生物信息学
YP
19A1
基因
,
,
鉴定兔卵巢
G
构建
p
CscDNA3.1-CYP19A1
过表
,
以探究
达载体和
s
分别转染卵巢
GiRNA
,
Cs
殖率低
,
但随着卵泡腔的生长和卵泡的增大
,
细胞由
分裂逐步向分化转变
,
限制了正在分化的
GCs
增
3
]
。
G
殖
[
Cs
的增殖和凋亡受到许多基因的控制
。
11-13
]
。
能对母兔繁殖周期的调控也起着重要的作用
[
预测分析其蛋白质结构和理化性能
。
进一步分离并
促进
SMAD
7
基因抑制山羊卵巢颗粒细胞的增殖
,
4
]
。
I
其凋亡
[
GF
1R
基因表达下调
,
使
AKT
/
进而抑制卵巢
GmTOR
信号通路下调
,
Cs
增殖及
[]
6
通路来抑制卵巢
GCs
的增殖及促进凋亡
。
外源
以及对类固
CYP19A1
对
GCs
增殖和凋亡的影响
,
醇激素合成相关基因表达的影响
,
为进一步了解母
兔卵泡发育和繁殖周期调控的分子机制提供理论
依据
。
5
]
。
抑制
WNT
5
促进其凋亡
[
a
基因的表达
,
使
//
从而调控
WnBAXBCL-2
的比值上调
,
t-Catenin
β
[]
7
BMP6
对鸡卵泡
GCs
体外增殖有显著影响
。
在
母兔卵巢卵泡发育过程中
,
哪些因子发挥了重要作
1
材料与方法
1.1
卵巢
GCs
的分离和培养
采集
8
月龄健康新西兰白兔母兔的卵巢
,
置于
低速离
GCs
释放到培养基中
。
将
GCs
混合液过滤
、
心后弃上清液
。
加入
2m
轻吹混
L
红细胞裂解液
,
,
C
芳香化酶
(
是细胞色素
aromataseYP19
)
P450
酶系中的一种
,
P450
芳香化酶
(
ctochrome
y
P450
,
famil9
,
subfamiloletide1
,
y
1
y
A
,
pypp
用
,
还有待进一步挖掘
。
含有
DMEM
培养基的无菌培养皿中
,
刺破卵泡
,
使
,
匀后裂解
5m
再次放入离心机低速离心后弃去
in
)
是芳香化酶的编码基因
。
研究发现
,
CYP19A1
也是猪
CYP19A1
是猪卵巢
GCs
中的抗凋亡因子
,
]
8
。
牦牛卵丘
卵巢
G
合成必需的
[
Cs
中雌二醇
(
E
2
)
)
卵母细胞复合体
(
成熟过程中
CCOCsYP19A1
上
调内源性
E
使早期卵母细胞的发育水平得
2
水平
,
9
]
。
G
到提升
[
Cs
中
CYP
19A1
mRNA
水平与
E
2
水
制成细胞悬液后接种到
6
孔板中
,
在
DMEM-F12
,
5%CO37℃
的条件下培养
。
2
,
上清液
。
加入含有
10%
胎牛血清和
1%
双抗的
平呈正比例关系
,
在一定范围内
,
CYP
19A1
mRNA
表达量越高
,
分泌的
E
说明
CYP19A1
可以
2
越多
,
mRNA
表达量的变化与卵泡发育的数量密切相
]
10
。
而
C
关
[
YP
19A1
基因对兔卵巢
GCs
增殖和凋
亡的调控功能尚不明确
。
通过调控激素水平间接影响卵泡的发育
,
CYP
19A1
1.2
卵巢
GCs
的鉴定
原代
G
用
4%
多聚甲醛固定液
Cs
培养
24h
后
,
,
弃去封闭液后向其中加入一
BSA
室温封闭
60min
,
抗
(
在
4℃
环境下培养过夜
。
anti-FSHR
,
1∶250
)
,
在室温下固定
3
再用
00min.3%TritonX-100
处
,
理
6
每步完成后都需要用
P0minBS
洗
3
次
。
1%
过夜后用
P
加入
1BST
漂洗
3
次
,
∶2000
稀释过后
。
的山羊抗兔
I
二抗
,
在
3G
(
FITC
)
7℃
孵育
60min
g
,
滴加
D
在室温下染色
1PBST
漂洗
3
次
,
API0min
后
,
用荧光显微镜观察显色
,
拍照保存
。
10
期杨安琪等
:
CYP19A1
对兔卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响
4211
1.3
p
cDNA3.1-CYP19A1
质粒构建
(
以
p
质粒作为载体
,
使用
CcDNA3.1+
)
EDe-
构建
Csin
软件设计一步克隆引物
,
YP19A1
的真
g
核表达载体
。
在上游引物中加入
Xba
Ⅰ
酶切位点
ane
Ⅱ
把
CYP
19A1
CDS
扩增产物和双酶切后的
(
载体连接
。
转化后
,
测序
,
进行无内
cDNA3.1+
)
p
2024年5月24日发(作者：麴紫易)
:
/
doi
.0366-6964.2023.10.019
j
ActaVeterinariaetZootechnicaSinica
():
畜牧兽医学报
2023
,
54104209-4219
开放科学
(
资源服务
)
:
标识码
(
OSID
)
CYP19A1
对兔卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响
杨安琪
,
李嘉诚
,
宋
颖
,
陈
欣
,
靳荣帅
,
赵博昊
,
吴信生
,
陈
阳
*
()
扬州大学动物科学与技术学院
,
扬州
225009
摘
要
:
旨在探究
P
对兔
450
芳香化酶基因
(
ctochromeP450
,
famil9
,
subfamiloletide1
,
CYP
19A1
)
yy
1
y
A
,
pypp
,)
卵巢颗粒细胞
(
增殖和凋亡的影响
。
本研究选择健康状况良好的
8
月龄新西兰白兔母兔
,
采集
ranulosacellsGCs
g
/
分析
C
PCR
、
CCK8
、
FITCPI
等技术与方法
,
YP
19A1
基因过表达和干扰对类固醇激素合成相关基因及
GCs
增殖
,
和凋亡的影响
。
利用
F
鉴定分离的原代细胞是
GSHR
免疫荧光染色
,
CsFSHR
表达呈阳性
。
克隆
CYP
19A1
基
,
因
,
发现其
c
编码
5DNA
全长为
1512b03
个氨基酸
。
经生物信息学预测发现
,
CYP19A1
蛋白是一种稳定的亲水
p
;
卵巢组织
,
分离并鉴定
G
利用一步克隆法获得兔
C
进行生物信息学分析
;
利用
q
Cs
YP
19A1
基因全长序列
,
RT-
性蛋白
,
含有一个
P
与其它物种同源性较高
。
在
G450
家族结构域
,
Cs
中
,
CYP
19A1
基因表达量的改变显著或极显
。
著影响了类固醇激素合成相关基因
IGF
1R
、
CYP
1B1
、
CYP
1A1
、
BMP
6
、
CYP
17A1
的表达
(
P
<0.05
或
P
<0.01
)
抑制
G
调控类固醇激素合成相关基因的表达
,
进而参与母兔卵泡发育
CYP19A1
可以促进
GCs
增殖
,
Cs
凋亡
,
进程
。
;
关键词
:
兔
;
卵巢
G
增殖
;
凋亡
CYP19A1
;
Cs
。
综上所述
,
过表达
/
干扰
C
极显著上调
/
下调
G
极显著抑制
/
促进
G
YP
19A1
后
,
Cs
增殖
,
Cs
凋亡水平
(
P
<0.01
)
()
中图分类号
:
S829.1
文献标志码
:
A
文章编号
:
10-4209-11
EffectsofCYP19A1onProliferationandAotosisofRabbitOvarranulosaCells
ppy
G
(
ColleeonimalScienceandTechnoloYanzhouUniversitYanzhou
225009
,
China
)
gf
A
gy
,
gy
,
g
,,,,,
YANGAniLIJiachenSONGYinCHENXinJINRonshuai
qggg
*
,
WUX
,
ZHAOBohaoinshenCHENYan
gg
)
ranulosacells
(
-month-oldNewZealandwhitefemalerabbitswereselectedto
gy
8
,
l-lenthseuenceofrabbit
CYP
19A1
g
ene
y
G
gq
:
Abstract
ThestudimedtoinvestiatetheeffectofP450aromatase
(
ctochromeP450
,
famil
y
a
gyy
19
,
subfamiloletide1
,
CYP19A1
)
onthe
p
roliferationandaotosisofrabbitovarian
y
A
,
pypppp
/
liferationandaotosisofovarianGCswereanalzedusinRT-PCR
,
CCK8andFITCPImeth-
ppygq
,
Rimmunofluorescencestaininisolated
p
rimarellswereidentifiedasGCs
g
F
gy
c
ectsof
y
o
p
c
g
m
yy
b
,
CYP
19A1
g
eneoverexressionandinterferenceonsteroidhormonesnthesis-related
g
enesro-
pyp
with
p
CYP
19A1
g
enewasclonedandthefulllenthofcDNAwas
pg
,
ormatics
p
redictionrevealedthatCYP19A1
p
rotein
pg
5
,
wasastablehdrohilic
p
roteincontainin450familtructuraldomainwithhihhomolo
ypg
aP
y
s
ggy
收稿日期
:
2023-03-15
;;
基金项目
:
扬州大学大学生科创基金
(
扬州大学青蓝工程项目
(
财政部和农业农村部
:
国家现代农业产业技术体系资助
X20220635
)
2022
)
),:
作者简介
:
杨安琪
(
女
,
江苏常州人
,
本科生
,
主要从事动物遗传育种与繁殖研究
,
2002-E-mail1683847892@
q
.com
q
()
CARS-43-A-1
:
陈
阳
,
主要从事动物遗传育种与繁殖研究
,
*
通信作者
:
E-mailanc@
y
yg
4210
,
hechaneofexressionof
CYP
19A1
g
enesinificantlrextremel
pgpgy
o
y
sinificantlffectedtheexressionofsteroidhormonesnthesis-related
g
enes
IGF
1R
,
gy
a
py
畜
牧
兽
医
学
报
54
卷
/
CYP
1B1
,
CYP
1A1
,
BMP
6
,
CYP
17A1
(
P
<0.05
or
P
<0.01
)
.Overexressionknockdownof
p
/,
CYP
19A1
extremelinificantlreulateddownreulatedthe
p
roliferationlevelofGCsand
y
s
gy
u
pgg
steroidhormonesnthesis-related
g
enesto
p
articiateinthefolliculardeveloment
p
rocessinfe-
ypp
/,
hihlinificantlnhibitedromotedtheaotosislevelofGCs
(
P
<0.01
)
.Inconclusion
gy
s
gy
i
ppp
,,
CYP19A1can
p
romoteGCs
p
roliferationinhibitGCsaotosisandreulatetheexressionof
ppgp
malerabbits.
:;;;
Keords
CYP19A1
;
rabbitovarianGCsroliferationaotosis
ppp
y
w
:,:
*Corresondin
uthor
CHENYanE-mailanc@
y
gyg
pg
a
,)
对卵母细胞的
颗粒细胞
(
ranulosacellsGCs
g
生长与成熟起着重要的调节作用
,
GCs
参与维持成
熟分裂的阻断和诱导排卵
,
调节卵母细胞成熟分
1-3
]
。
在所有哺乳动物中
,
裂
[
GCs
的增殖率会随着
3
]
。
在原始卵泡中
,
卵泡大小的变化而改变
[
GCs
增
课题组前期通过转录组测序筛选了多个参与母
兔繁殖周期调控的基因
,
其中关键差异表达基因
卵巢类固醇生成
CYP
19A1
在甾类激素生物合成
、
等信号通路中都有所富集
,
由此推测
CYP19A1
可
本研究计划克隆
C
利用生物信息学
YP
19A1
基因
,
,
鉴定兔卵巢
G
构建
p
CscDNA3.1-CYP19A1
过表
,
以探究
达载体和
s
分别转染卵巢
GiRNA
,
Cs
殖率低
,
但随着卵泡腔的生长和卵泡的增大
,
细胞由
分裂逐步向分化转变
,
限制了正在分化的
GCs
增
3
]
。
G
殖
[
Cs
的增殖和凋亡受到许多基因的控制
。
11-13
]
。
能对母兔繁殖周期的调控也起着重要的作用
[
预测分析其蛋白质结构和理化性能
。
进一步分离并
促进
SMAD
7
基因抑制山羊卵巢颗粒细胞的增殖
,
4
]
。
I
其凋亡
[
GF
1R
基因表达下调
,
使
AKT
/
进而抑制卵巢
GmTOR
信号通路下调
,
Cs
增殖及
[]
6
通路来抑制卵巢
GCs
的增殖及促进凋亡
。
外源
以及对类固
CYP19A1
对
GCs
增殖和凋亡的影响
,
醇激素合成相关基因表达的影响
,
为进一步了解母
兔卵泡发育和繁殖周期调控的分子机制提供理论
依据
。
5
]
。
抑制
WNT
5
促进其凋亡
[
a
基因的表达
,
使
//
从而调控
WnBAXBCL-2
的比值上调
,
t-Catenin
β
[]
7
BMP6
对鸡卵泡
GCs
体外增殖有显著影响
。
在
母兔卵巢卵泡发育过程中
,
哪些因子发挥了重要作
1
材料与方法
1.1
卵巢
GCs
的分离和培养
采集
8
月龄健康新西兰白兔母兔的卵巢
,
置于
低速离
GCs
释放到培养基中
。
将
GCs
混合液过滤
、
心后弃上清液
。
加入
2m
轻吹混
L
红细胞裂解液
,
,
C
芳香化酶
(
是细胞色素
aromataseYP19
)
P450
酶系中的一种
,
P450
芳香化酶
(
ctochrome
y
P450
,
famil9
,
subfamiloletide1
,
y
1
y
A
,
pypp
用
,
还有待进一步挖掘
。
含有
DMEM
培养基的无菌培养皿中
,
刺破卵泡
,
使
,
匀后裂解
5m
再次放入离心机低速离心后弃去
in
)
是芳香化酶的编码基因
。
研究发现
,
CYP19A1
也是猪
CYP19A1
是猪卵巢
GCs
中的抗凋亡因子
,
]
8
。
牦牛卵丘
卵巢
G
合成必需的
[
Cs
中雌二醇
(
E
2
)
)
卵母细胞复合体
(
成熟过程中
CCOCsYP19A1
上
调内源性
E
使早期卵母细胞的发育水平得
2
水平
,
9
]
。
G
到提升
[
Cs
中
CYP
19A1
mRNA
水平与
E
2
水
制成细胞悬液后接种到
6
孔板中
,
在
DMEM-F12
,
5%CO37℃
的条件下培养
。
2
,
上清液
。
加入含有
10%
胎牛血清和
1%
双抗的
平呈正比例关系
,
在一定范围内
,
CYP
19A1
mRNA
表达量越高
,
分泌的
E
说明
CYP19A1
可以
2
越多
,
mRNA
表达量的变化与卵泡发育的数量密切相
]
10
。
而
C
关
[
YP
19A1
基因对兔卵巢
GCs
增殖和凋
亡的调控功能尚不明确
。
通过调控激素水平间接影响卵泡的发育
,
CYP
19A1
1.2
卵巢
GCs
的鉴定
原代
G
用
4%
多聚甲醛固定液
Cs
培养
24h
后
,
,
弃去封闭液后向其中加入一
BSA
室温封闭
60min
,
抗
(
在
4℃
环境下培养过夜
。
anti-FSHR
,
1∶250
)
,
在室温下固定
3
再用
00min.3%TritonX-100
处
,
理
6
每步完成后都需要用
P0minBS
洗
3
次
。
1%
过夜后用
P
加入
1BST
漂洗
3
次
,
∶2000
稀释过后
。
的山羊抗兔
I
二抗
,
在
3G
(
FITC
)
7℃
孵育
60min
g
,
滴加
D
在室温下染色
1PBST
漂洗
3
次
,
API0min
后
,
用荧光显微镜观察显色
,
拍照保存
。
10
期杨安琪等
:
CYP19A1
对兔卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响
4211
1.3
p
cDNA3.1-CYP19A1
质粒构建
(
以
p
质粒作为载体
,
使用
CcDNA3.1+
)
EDe-
构建
Csin
软件设计一步克隆引物
,
YP19A1
的真
g
核表达载体
。
在上游引物中加入
Xba
Ⅰ
酶切位点
ane
Ⅱ
把
CYP
19A1
CDS
扩增产物和双酶切后的
(
载体连接
。
转化后
,
测序
,
进行无内
cDNA3.1+
)
p