2024年4月10日发(作者：贰寻冬)
Ｇｕｉｈａｉａ
Ａｕｇ.２０２１ꎬ４１(８):１２１９
－
１２２５
ＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１９１２０２０
ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ
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ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
武丽霞ꎬ韩丽ꎬ赵宜婷ꎬ等.生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位[Ｊ].广西植物ꎬ２０２１ꎬ４１(８):
１２１９
－
１２２５.
ＷＵＬＸꎬＨＡＮＬꎬＺＨＡＯＹＴꎬｅｔａｌ.ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎＰＩＮ１ｉｎｃｒｏｐｒｏｏｔａｎｄｅｍｂｒｙｏ[Ｊ].
Ｇｕｉｈａｉａꎬ２０２１ꎬ４１(８):１２１９
－
１２２５.
生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位
武丽霞
１ꎬ２ꎬ３
ꎬ韩 丽
１ꎬ２ꎬ３
ꎬ赵宜婷
１ꎬ２ꎬ３
ꎬ周 璇
１ꎬ２ꎬ３
ꎬ杜云龙
１ꎬ２ꎬ３∗
(１.云南农业大学植物保护学院ꎬ昆明６５０２０１ꎻ２.云南生物资源保护与利用国家重点实验室ꎬ云南农业大学
昆明６５０２０１ꎻ３.云南农业大学农业生物多样性与病害控制教育部重点实验室ꎬ昆明６５０２０１)
摘 要:生长素输出载体在植物发育中起非常重要的作用ꎮ然而ꎬ生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在农作物水
稻、小麦、玉米和大豆的根和胚中的亚细胞定位尚不清楚ꎮ该研究首先分析了ＯｓＰＩＮ１ｂ和它的同源物的氨
基酸序列特征ꎬ发现小麦(ＴａＰＩＮ１)、玉米(ＺｍＰＩＮ１ｂ)和大豆(ＧｍＰＩＮ１ｂ)中的ＰＩＮ１序列与水稻的ＯｓＰＩＮ１ｂ
序列分别具有６１.５％、６２.５％、６１.９％的相似性ꎮ然后根据水稻‘日本晴’(‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’)的ＯｓＰＩＮ１ｂ的氨基
酸序列ꎬ人工合成ＯｓＰＩＮ１ｂ多肽并注射健康的新西兰白兔获得了抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体ꎬ在通过免疫
印迹方法检测抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体的有效性后ꎬ发现可以利用该抗体有效检测到水稻叶片及根中
ＯｓＰＩＮ１ｂ的表达ꎮ为检测ＯｓＰＩＮ１及其同源物在不同作物胚根和胚中子叶细胞的定位ꎬ利用制备的抗兔的
ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体并通过免疫组化实验ꎬ发现水稻的ＯｓＰＩＮ１ｂ、小麦的ＴａＰＩＮ１和玉米的ＺｍＰＩＮ１ｂ非极性
定位在早期的胚根和胚中子叶表皮细胞的细胞质膜上ꎬ大豆中的ＧｍＰＩＮ１ｂ非极性定位在胚根表皮细胞的
质膜上ꎬ而在胚的子叶细胞中是胞质定位ꎮ为进一步检测水稻中ＯｓＰＩＮ１ｂ的亚细胞定位ꎬ对水稻根分生区
表皮细胞用蛋白质转运抑制剂ＢＦＡ(ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ)及抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体处理后ꎬ进行免疫组化实
验ꎬ结果发现水稻中的ＯｓＰＩＮ１ｂ可以通过胞吞转运途径从水稻根表皮细胞膜进入细胞质中ꎮ该研究利用抗
兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体有效检测了ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物在水稻、小麦、玉米和大豆的胚根表皮细胞及胚
中子叶表皮细胞的亚细胞定位ꎬ这将有助于进一步揭示生长素输出载体ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物通过调控生长
素极性运输而参与作物发育的作用机制ꎮ
关键词:生长素输出载体ꎬＰＩＮ１ꎬ水稻ꎬ小麦ꎬ玉米ꎬ大豆
中图分类号:Ｑ９４３ 文献标识码:Ａ 文章编号:１０００￣３１４２(２０２１)０８￣１２１９￣０７
Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎ
ＰＩＮ１ｉｎｃｒｏｐｒｏｏｔａｎｄｅｍｂｒｙｏ
ＷＵＬｉｘｉａ
１ꎬ２ꎬ３
ꎬＨＡＮＬｉ
１ꎬ２ꎬ３
ꎬＺＨＡＯＹｉｔｉｎｇ
１ꎬ２ꎬ３
ꎬＺＨＯＵＸｕａｎ
１ꎬ２ꎬ３
ꎬＤＵＹｕｎｌｏｎｇ
１ꎬ２ꎬ３∗
收稿日期:２０２０
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０２
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０５
基金项目:国家自然科学基金(３１４６０４５３ꎬ３１６６０５０１ꎬ３１８６００６４)ꎻ云南省教育厅重大科研专项计划(ＺＤ２０１５００５)ꎻ教育部留学回
国人员科研启动基金([２０１３]１７９２)ꎻ云南省应用基础研究计划的重点项目(２０１７ＦＡ０１８)[ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌ
ＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ(３１４６０４５３ꎬ３１６６０５０１ꎬ３１８６００６４)ꎻＭａｊｏｒＳｐｅｃｉａｌＰｒｏｇｒａｍｆｏｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈꎬＥｄｕｃａｔｉｏｎＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆＹｕｎｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ(ＺＤ２０１５００５)ꎻＰｒｏｊｅｃｔｏｆＳＲＦｆｏｒＲＯＣＳꎬＳＥＭ([２０１３]１７９２)ꎻＫｅｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢａｓｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＰｌａｎｏｆ
ＹｕｎｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ(２０１７ＦＡ０１８)]ꎮ
作者简介:武丽霞(１９９４
－
)ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为水稻根系发育ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)２４１６２０６２４８＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ
∗
通信作者:杜云龙ꎬ博士ꎬ教授ꎬ博士研究生导师ꎬ研究方向为激素与根系发育ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙｕｎｌｏｎｇｄｕ＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍꎮ
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(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆＢｉｏ￣ＲｅｓｏｕｒｃｅｓꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏ￣Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄ
ＰｅｓｔＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＣｈｉｎａꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａ)
１２２０
广 西 植 物４１卷
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒｐｌａｙｓａｎｅｘｔｒｅｍｅｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ
ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒＰＩＮ１ｉｎｔｈｅｒｏｏｔｓａｎｄｅｍｂｒｙｏｓｏｆｃｒｏｐｓｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔꎬｍａｉｚｅａｎｄｓｏｙｂｅａｎｒｅｍａｉｎｓ
ｕｎｃｌｅａｒ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄꎬａｎｄｉｔ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＰＩＮ１ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｗｈｅａｔ(ＴａＰＩＮ１)ꎬｍａｉｚｅ(ＺｍＰＩＮ１ｂ)ａｎｄｓｏｙｂｅａｎ(ＧｍＰＩＮ１ｂ)ｓｈａｒｅｄ６１.５％ꎬ
ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＯｓＰＩＮ１ｂａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｒｉｃｅ‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’ａｎｄｉｎｊｅｃｔｅｄｉｔｉｎｔｏｈｅａｌｔｈｙＮｅｗＺｅａｌａｎｄｗｈｉｔｅｒａｂｂｉｔｓ
ｔｏｏｂｔａｉｎａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ.ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｔｈｅｐｒｅｐａｒｅｄｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＯｓＰＩＮ１ｂ
ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｅｂｌｏｔｍｅｔｈｏｄꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂｗａｓｆｏｕｎｄｔｏｂｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｒｉｃｅｌｅａｖｅｓ
ａｎｄｒｏｏｔｓ.ＦｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｉｎｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｓａｎｄｃｏｔｙｌｅｄｏｎｃｅｌｌｓ
ｏｆｅｍｂｒｙｏｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｒｏｐｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｓｓａｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｒｉｃｅＯｓＰＩＮ１ｂꎬｗｈｅａｔＴａＰＩＮ１ａｎｄｍａｉｚｅＺｍＰＩＮ１ｂａｐｏｌａｒｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｔｈｅｐｌａｓｍａ
ｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｏｆｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｓａｎｄｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏｉｎｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔａｎｄｍａｉｚｅｇｒｏｗｎｉｎｅａｒｌｙ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓꎬａｎｄｓｏｙｂｅａｎＧｍＰＩＮ１ｂａｐｏｌａｒｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｔｈｅｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓꎬ
ｂｕｔｗａｓｃｙｔｏｓｏｌｉｃｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｃｏｔｙｌｅｄｏｎｃｅｌｌｓｏｆｅｍｂｒｙｏ.ＴｏｆｕｒｔｈｅｒｄｅｔｅｃｔｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂꎬ
ｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｏｆｒｉｃｅｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｍｅｒｉｓｔｅｍｒｅｇｉｏｎｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＢＦＡ(ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ)ａｎｄ
ａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｓｓａｙ.ＩｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＯｓＰＩＮ１ｂｌｏｃａｌｉｚｅｄ
ｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｒｉｃｅｒｏｏｔｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｅｎｔｅｒｉｎｔｏｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｖｉａｅｎｄｏｃｙｔｉｃｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｍａｎｎｅｒ.Ｉｎ
ｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｉｎｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｏｆｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｓａｎｄ
ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓｏｆｅｍｂｒｙｏｓｏｆｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔꎬｍａｉｚｅａｎｄｓｏｙｂｅａｎｗｅｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂ
ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｐｏｌａｒａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｔｏｉｎｖｏｌｖｅｉｎｃｒｏｐｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒꎬＰＩＮ１ꎬｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔꎬｍａｉｚｅꎬｓｏｙｂｅａｎ
ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎬａｎｄｉｔｗｉｌｌｆａｃｉｌｉｔａｔｅｕｓｔｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓ
６２.５％ａｎｄ６１.９％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｗｉｔｈｒｉｃｅＯｓＰＩＮ１ｂꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＮｅｘｔꎬａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ
生长素输出载体蛋白在调节植物生长素极性
运输中起重要作用ꎮ生长素极性运输参与胚胎形
态发生(Ｂｌｉｌｏｕｅｔａｌ.ꎬ２００５)和侧生器官的形成
(Ｃａｓｉｍｉｒｏｅｔａｌ.ꎬ２００１)ꎮ拟南芥基因组中的ＰＩＮ
基因家族编码ＰＩＮ１
－
８的８种生长素输出载体蛋
２００８)ꎮＰＩＮ蛋白可以通过内吞作用转运到细胞
２００１)ꎮＡｔｐｉｎ１突变体植株表现出针状花序并且花
１９９８)ꎮＡｔＰＩＮ１的极性定位还影响胚胎的发育
(Ｆｒｉｍｌｅｔａｌ.ꎬ２００３)ꎮＡｔＰＩＮ１分布于维管组织
(Ｇäｌｗｅｉｌｅｒｅｔａｌ.ꎬ１９９８)、木质部薄壁组织
１９９９)、根表皮和皮层细胞(Ｂｌｉｌｏｕｅｔａｌ.ꎬ２００５)、分
(Ｇäｌｗｅｉｌｅｒｅｔａｌ.ꎬ１９９８ꎻＰａｌｍｅ＆Ｇäｌｗｅｉｌｅｒꎬ
白(Ｆｒｉｍｌｅｔａｌ.ꎬ２００３ꎻＢｅｎｊａｍｉｎｓ＆Ｓｃｈｅｒｅｓꎬ
质中ꎬ并形成循环小泡返回质膜(Ｇｅｌｄｎｅｒｅｔａｌ.ꎬ
和维管组织发育表现明显缺陷(Ｇäｌｗｅｉｌｅｒｅｔａｌ.ꎬ
生组织表皮和原基表皮(Ｇｕｅｎｏｔｅｔａｌ.ꎬ２０１２)的细
胞质中ꎮ但是ꎬ目前人们对单子叶植物和双子叶
植物之间ＰＩＮ１蛋白的亚细胞定位差异仍不清楚ꎮ
２００５ꎻＬｉｅｔａｌ.ꎬ２０１９)、小麦(Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ.ꎬ２０１８)、玉
２０１５)的基因组中ꎮ在水稻的维管组织和根原基中
ＯｓＰＩＮ１以生长素依赖性的方式参与水稻根、茎、花
ＺｍＰＩＮ１ａ主要定位在玉米幼苗的上叶原基
(Ｇａｌｌａｖｏｔｔｉｅｔａｌ.ꎬ２００８)、根中的中柱鞘细胞和内皮
层细胞(Ｃａｒｒａｒｏｅｔａｌ.ꎬ２００６)、胚芽鞘(Ｋａｍａｄａｅｔ
ａｌ.ꎬ２０１８)和叶片(Ｍｏｏｎｅｔａｌ.ꎬ２０１３)的表层细胞ꎮ
此外ꎬＺｍＰＩＮ１ａ在根冠细胞中显示为胞质定位
ＡｔＰＩＮ１的同源基因可以存在于水稻(Ｘｕｅｔａｌ.ꎬ
米(Ｇａｌｌａｖｏｔｔｉｅｔａｌ.ꎬ２００８)和大豆(Ｗａｎｇｅｔａｌ.ꎬ
可以检测到ＯｓＰＩＮ１的表达(Ｘｕｅｔａｌ.ꎬ２００５)ꎬ
序和分蘖的发育(Ｘｕｅｔａｌ.ꎬ２００５ꎻＬｉｅｔａｌ.ꎬ２０１９)ꎮ
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(Ｆｏｒｅｓｔａｎｅｔａｌ.ꎬ２０１２)ꎬ在花序初生原基细胞中显
示为非极性定位(Ｓｋｉｒｐａｎｅｔａｌ.ꎬ２００９)ꎮ但是ꎬ目
前尚不清楚ＰＩＮ１在不同作物的根和胚中的亚细胞
定位ꎬ包括水稻、小麦、玉米和大豆ꎮ
在这项研究中ꎬ我们基于水稻‘日本晴’
(‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’)的ＯｓＰＩＮ１ｂ氨基酸序列ꎬ制备了抗
兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体ꎬ利用该抗体开展的免疫
组化实验发现水稻的ＯｓＰＩＮ１ｂ及小麦和玉米中的
同源蛋白可以非极性定位在根和胚中子叶表皮细
胞的细胞质膜上ꎬ而大豆的ＧｍＰＩＮ１ｂ可以非极性地
定位在根中表皮细胞的质膜上ꎬ但是ꎬ在胚的子叶
表皮细胞中是细胞质定位ꎮ此外ꎬ水稻根表皮细胞
质膜上的ＯｓＰＩＮ１ｂ可以通过内吞运输途径进入到
细胞质中ꎮ这些ＰＩＮ１定位结果将有助于我们研究
生长素极性运输在水稻、小麦、玉米和大豆作物发
育中的作用ꎮ
８期武丽霞等:生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位
(ＢＦＡ)(ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ)对不同农作物的根和胚
处理９０ｍｉｎꎬ然后使用改良的免疫组织化学分析
方法进行检测(Ｐａｃｉｏｒｅｋｅｔａｌ.ꎬ２００６)ꎮ具体如下:
首先ꎬ将样品在２５℃室温条件下用４％戊二醛溶
液固定１ｈꎻ然后ꎬ３７℃条件下用２％崩溃酶处理１
ｈꎻ最后ꎬ用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体(１∶２００)
和二抗[驴抗兔的ＩｇＧ(Ｈ
＋
Ｌ)￣Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８抗体
(１∶５００)](ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ)进行免疫组
Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ)观察ＯｓＰＩＮ１ｂ的定位ꎮ
从ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)获得
ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源蛋白的氨基酸序列ꎬ通过在线网
站(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｕｎｉｐｒｏｔ.ｏｒｇ/)分析ＯｓＰＩＮ１ｂ的跨膜
结构域ꎬ使用软件ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＳｕｉｔｅ６进行氨基酸序
列比对ꎬ所有图片均使用Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ软件处理ꎮ
化检测ꎮ使用ＬｅｉｃａＳＰ５激光共聚焦显微镜(Ｌｅｉｃａ
１２２１
１.４生物信息学分析
１ 材料与方法
１.１植物材料
植物材料为水稻品种‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’和‘丽江新
团黑谷’(‘ＬＴＨ’)(Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａｓｕｂｓｐ.ｊａｐｏｎｉｃａ)、
小麦(Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ‘Ｃｈｕａｎｍａｉ１０７’)、玉米
(Ｚｅａｍａｙｓ‘Ｂ７３’)和大豆(Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ
‘Ｗｉｌｌｉａｍｓ’)ꎬ各作物种子置于２８℃条件下水培萌
发ꎬ使用生长了７ｄ的胚根分生区细胞和１ｄ的子
叶胚来检测ＯｓＰＩＮ１ｂ及同源物的亚细胞定位ꎮ
１.２抗体的制备和检测
根据水稻‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’的生长素输出载体
ＯｓＰＩＮ１ｂ(Ｏｓ０２ｇ０７４３４００)的氨基酸序列人工合成
多肽ＱＳＳＲＮＰＴＰＲＧＳＳＦＮＣꎬ并将其注入新西兰兔
体内ꎮ通过ＥＬＩＳＡ方法检测到纯化的抗兔
ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体ꎬ其浓度为０.５１ｍｇ
2024年4月10日发(作者：贰寻冬)
Ｇｕｉｈａｉａ
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武丽霞ꎬ韩丽ꎬ赵宜婷ꎬ等.生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位[Ｊ].广西植物ꎬ２０２１ꎬ４１(８):
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ＷＵＬＸꎬＨＡＮＬꎬＺＨＡＯＹＴꎬｅｔａｌ.ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎＰＩＮ１ｉｎｃｒｏｐｒｏｏｔａｎｄｅｍｂｒｙｏ[Ｊ].
Ｇｕｉｈａｉａꎬ２０２１ꎬ４１(８):１２１９
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生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位
武丽霞
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ꎬ韩 丽
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ꎬ赵宜婷
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ꎬ周 璇
１ꎬ２ꎬ３
ꎬ杜云龙
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(１.云南农业大学植物保护学院ꎬ昆明６５０２０１ꎻ２.云南生物资源保护与利用国家重点实验室ꎬ云南农业大学
昆明６５０２０１ꎻ３.云南农业大学农业生物多样性与病害控制教育部重点实验室ꎬ昆明６５０２０１)
摘 要:生长素输出载体在植物发育中起非常重要的作用ꎮ然而ꎬ生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在农作物水
稻、小麦、玉米和大豆的根和胚中的亚细胞定位尚不清楚ꎮ该研究首先分析了ＯｓＰＩＮ１ｂ和它的同源物的氨
基酸序列特征ꎬ发现小麦(ＴａＰＩＮ１)、玉米(ＺｍＰＩＮ１ｂ)和大豆(ＧｍＰＩＮ１ｂ)中的ＰＩＮ１序列与水稻的ＯｓＰＩＮ１ｂ
序列分别具有６１.５％、６２.５％、６１.９％的相似性ꎮ然后根据水稻‘日本晴’(‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’)的ＯｓＰＩＮ１ｂ的氨基
酸序列ꎬ人工合成ＯｓＰＩＮ１ｂ多肽并注射健康的新西兰白兔获得了抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体ꎬ在通过免疫
印迹方法检测抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体的有效性后ꎬ发现可以利用该抗体有效检测到水稻叶片及根中
ＯｓＰＩＮ１ｂ的表达ꎮ为检测ＯｓＰＩＮ１及其同源物在不同作物胚根和胚中子叶细胞的定位ꎬ利用制备的抗兔的
ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体并通过免疫组化实验ꎬ发现水稻的ＯｓＰＩＮ１ｂ、小麦的ＴａＰＩＮ１和玉米的ＺｍＰＩＮ１ｂ非极性
定位在早期的胚根和胚中子叶表皮细胞的细胞质膜上ꎬ大豆中的ＧｍＰＩＮ１ｂ非极性定位在胚根表皮细胞的
质膜上ꎬ而在胚的子叶细胞中是胞质定位ꎮ为进一步检测水稻中ＯｓＰＩＮ１ｂ的亚细胞定位ꎬ对水稻根分生区
表皮细胞用蛋白质转运抑制剂ＢＦＡ(ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ)及抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体处理后ꎬ进行免疫组化实
验ꎬ结果发现水稻中的ＯｓＰＩＮ１ｂ可以通过胞吞转运途径从水稻根表皮细胞膜进入细胞质中ꎮ该研究利用抗
兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体有效检测了ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物在水稻、小麦、玉米和大豆的胚根表皮细胞及胚
中子叶表皮细胞的亚细胞定位ꎬ这将有助于进一步揭示生长素输出载体ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物通过调控生长
素极性运输而参与作物发育的作用机制ꎮ
关键词:生长素输出载体ꎬＰＩＮ１ꎬ水稻ꎬ小麦ꎬ玉米ꎬ大豆
中图分类号:Ｑ９４３ 文献标识码:Ａ 文章编号:１０００￣３１４２(２０２１)０８￣１２１９￣０７
Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎ
ＰＩＮ１ｉｎｃｒｏｐｒｏｏｔａｎｄｅｍｂｒｙｏ
ＷＵＬｉｘｉａ
１ꎬ２ꎬ３
ꎬＨＡＮＬｉ
１ꎬ２ꎬ３
ꎬＺＨＡＯＹｉｔｉｎｇ
１ꎬ２ꎬ３
ꎬＺＨＯＵＸｕａｎ
１ꎬ２ꎬ３
ꎬＤＵＹｕｎｌｏｎｇ
１ꎬ２ꎬ３∗
收稿日期:２０２０
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０２
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０５
基金项目:国家自然科学基金(３１４６０４５３ꎬ３１６６０５０１ꎬ３１８６００６４)ꎻ云南省教育厅重大科研专项计划(ＺＤ２０１５００５)ꎻ教育部留学回
国人员科研启动基金([２０１３]１７９２)ꎻ云南省应用基础研究计划的重点项目(２０１７ＦＡ０１８)[ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌ
ＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ(３１４６０４５３ꎬ３１６６０５０１ꎬ３１８６００６４)ꎻＭａｊｏｒＳｐｅｃｉａｌＰｒｏｇｒａｍｆｏｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈꎬＥｄｕｃａｔｉｏｎＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆＹｕｎｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ(ＺＤ２０１５００５)ꎻＰｒｏｊｅｃｔｏｆＳＲＦｆｏｒＲＯＣＳꎬＳＥＭ([２０１３]１７９２)ꎻＫｅｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢａｓｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＰｌａｎｏｆ
ＹｕｎｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ(２０１７ＦＡ０１８)]ꎮ
作者简介:武丽霞(１９９４
－
)ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为水稻根系发育ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)２４１６２０６２４８＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ
∗
通信作者:杜云龙ꎬ博士ꎬ教授ꎬ博士研究生导师ꎬ研究方向为激素与根系发育ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙｕｎｌｏｎｇｄｕ＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍꎮ
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(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆＢｉｏ￣ＲｅｓｏｕｒｃｅｓꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏ￣Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄ
ＰｅｓｔＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＣｈｉｎａꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａ)
１２２０
广 西 植 物４１卷
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒｐｌａｙｓａｎｅｘｔｒｅｍｅｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ
ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒＰＩＮ１ｉｎｔｈｅｒｏｏｔｓａｎｄｅｍｂｒｙｏｓｏｆｃｒｏｐｓｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔꎬｍａｉｚｅａｎｄｓｏｙｂｅａｎｒｅｍａｉｎｓ
ｕｎｃｌｅａｒ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄꎬａｎｄｉｔ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＰＩＮ１ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｗｈｅａｔ(ＴａＰＩＮ１)ꎬｍａｉｚｅ(ＺｍＰＩＮ１ｂ)ａｎｄｓｏｙｂｅａｎ(ＧｍＰＩＮ１ｂ)ｓｈａｒｅｄ６１.５％ꎬ
ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＯｓＰＩＮ１ｂａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｒｉｃｅ‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’ａｎｄｉｎｊｅｃｔｅｄｉｔｉｎｔｏｈｅａｌｔｈｙＮｅｗＺｅａｌａｎｄｗｈｉｔｅｒａｂｂｉｔｓ
ｔｏｏｂｔａｉｎａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ.ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｔｈｅｐｒｅｐａｒｅｄｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＯｓＰＩＮ１ｂ
ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｅｂｌｏｔｍｅｔｈｏｄꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂｗａｓｆｏｕｎｄｔｏｂｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｒｉｃｅｌｅａｖｅｓ
ａｎｄｒｏｏｔｓ.ＦｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｉｎｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｓａｎｄｃｏｔｙｌｅｄｏｎｃｅｌｌｓ
ｏｆｅｍｂｒｙｏｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｒｏｐｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｓｓａｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｒｉｃｅＯｓＰＩＮ１ｂꎬｗｈｅａｔＴａＰＩＮ１ａｎｄｍａｉｚｅＺｍＰＩＮ１ｂａｐｏｌａｒｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｔｈｅｐｌａｓｍａ
ｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｏｆｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｓａｎｄｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏｉｎｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔａｎｄｍａｉｚｅｇｒｏｗｎｉｎｅａｒｌｙ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓꎬａｎｄｓｏｙｂｅａｎＧｍＰＩＮ１ｂａｐｏｌａｒｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｔｈｅｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓꎬ
ｂｕｔｗａｓｃｙｔｏｓｏｌｉｃｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｃｏｔｙｌｅｄｏｎｃｅｌｌｓｏｆｅｍｂｒｙｏ.ＴｏｆｕｒｔｈｅｒｄｅｔｅｃｔｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂꎬ
ｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｏｆｒｉｃｅｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｍｅｒｉｓｔｅｍｒｅｇｉｏｎｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＢＦＡ(ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ)ａｎｄ
ａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｓｓａｙ.ＩｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＯｓＰＩＮ１ｂｌｏｃａｌｉｚｅｄ
ｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｒｉｃｅｒｏｏｔｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｅｎｔｅｒｉｎｔｏｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｖｉａｅｎｄｏｃｙｔｉｃｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｍａｎｎｅｒ.Ｉｎ
ｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｉｎｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｏｆｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｓａｎｄ
ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓｏｆｅｍｂｒｙｏｓｏｆｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔꎬｍａｉｚｅａｎｄｓｏｙｂｅａｎｗｅｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂ
ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｐｏｌａｒａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｔｏｉｎｖｏｌｖｅｉｎｃｒｏｐｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒꎬＰＩＮ１ꎬｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔꎬｍａｉｚｅꎬｓｏｙｂｅａｎ
ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎬａｎｄｉｔｗｉｌｌｆａｃｉｌｉｔａｔｅｕｓｔｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓ
６２.５％ａｎｄ６１.９％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｗｉｔｈｒｉｃｅＯｓＰＩＮ１ｂꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＮｅｘｔꎬａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ
生长素输出载体蛋白在调节植物生长素极性
运输中起重要作用ꎮ生长素极性运输参与胚胎形
态发生(Ｂｌｉｌｏｕｅｔａｌ.ꎬ２００５)和侧生器官的形成
(Ｃａｓｉｍｉｒｏｅｔａｌ.ꎬ２００１)ꎮ拟南芥基因组中的ＰＩＮ
基因家族编码ＰＩＮ１
－
８的８种生长素输出载体蛋
２００８)ꎮＰＩＮ蛋白可以通过内吞作用转运到细胞
２００１)ꎮＡｔｐｉｎ１突变体植株表现出针状花序并且花
１９９８)ꎮＡｔＰＩＮ１的极性定位还影响胚胎的发育
(Ｆｒｉｍｌｅｔａｌ.ꎬ２００３)ꎮＡｔＰＩＮ１分布于维管组织
(Ｇäｌｗｅｉｌｅｒｅｔａｌ.ꎬ１９９８)、木质部薄壁组织
１９９９)、根表皮和皮层细胞(Ｂｌｉｌｏｕｅｔａｌ.ꎬ２００５)、分
(Ｇäｌｗｅｉｌｅｒｅｔａｌ.ꎬ１９９８ꎻＰａｌｍｅ＆Ｇäｌｗｅｉｌｅｒꎬ
白(Ｆｒｉｍｌｅｔａｌ.ꎬ２００３ꎻＢｅｎｊａｍｉｎｓ＆Ｓｃｈｅｒｅｓꎬ
质中ꎬ并形成循环小泡返回质膜(Ｇｅｌｄｎｅｒｅｔａｌ.ꎬ
和维管组织发育表现明显缺陷(Ｇäｌｗｅｉｌｅｒｅｔａｌ.ꎬ
生组织表皮和原基表皮(Ｇｕｅｎｏｔｅｔａｌ.ꎬ２０１２)的细
胞质中ꎮ但是ꎬ目前人们对单子叶植物和双子叶
植物之间ＰＩＮ１蛋白的亚细胞定位差异仍不清楚ꎮ
２００５ꎻＬｉｅｔａｌ.ꎬ２０１９)、小麦(Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ.ꎬ２０１８)、玉
２０１５)的基因组中ꎮ在水稻的维管组织和根原基中
ＯｓＰＩＮ１以生长素依赖性的方式参与水稻根、茎、花
ＺｍＰＩＮ１ａ主要定位在玉米幼苗的上叶原基
(Ｇａｌｌａｖｏｔｔｉｅｔａｌ.ꎬ２００８)、根中的中柱鞘细胞和内皮
层细胞(Ｃａｒｒａｒｏｅｔａｌ.ꎬ２００６)、胚芽鞘(Ｋａｍａｄａｅｔ
ａｌ.ꎬ２０１８)和叶片(Ｍｏｏｎｅｔａｌ.ꎬ２０１３)的表层细胞ꎮ
此外ꎬＺｍＰＩＮ１ａ在根冠细胞中显示为胞质定位
ＡｔＰＩＮ１的同源基因可以存在于水稻(Ｘｕｅｔａｌ.ꎬ
米(Ｇａｌｌａｖｏｔｔｉｅｔａｌ.ꎬ２００８)和大豆(Ｗａｎｇｅｔａｌ.ꎬ
可以检测到ＯｓＰＩＮ１的表达(Ｘｕｅｔａｌ.ꎬ２００５)ꎬ
序和分蘖的发育(Ｘｕｅｔａｌ.ꎬ２００５ꎻＬｉｅｔａｌ.ꎬ２０１９)ꎮ
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(Ｆｏｒｅｓｔａｎｅｔａｌ.ꎬ２０１２)ꎬ在花序初生原基细胞中显
示为非极性定位(Ｓｋｉｒｐａｎｅｔａｌ.ꎬ２００９)ꎮ但是ꎬ目
前尚不清楚ＰＩＮ１在不同作物的根和胚中的亚细胞
定位ꎬ包括水稻、小麦、玉米和大豆ꎮ
在这项研究中ꎬ我们基于水稻‘日本晴’
(‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’)的ＯｓＰＩＮ１ｂ氨基酸序列ꎬ制备了抗
兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体ꎬ利用该抗体开展的免疫
组化实验发现水稻的ＯｓＰＩＮ１ｂ及小麦和玉米中的
同源蛋白可以非极性定位在根和胚中子叶表皮细
胞的细胞质膜上ꎬ而大豆的ＧｍＰＩＮ１ｂ可以非极性地
定位在根中表皮细胞的质膜上ꎬ但是ꎬ在胚的子叶
表皮细胞中是细胞质定位ꎮ此外ꎬ水稻根表皮细胞
质膜上的ＯｓＰＩＮ１ｂ可以通过内吞运输途径进入到
细胞质中ꎮ这些ＰＩＮ１定位结果将有助于我们研究
生长素极性运输在水稻、小麦、玉米和大豆作物发
育中的作用ꎮ
８期武丽霞等:生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位
(ＢＦＡ)(ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ)对不同农作物的根和胚
处理９０ｍｉｎꎬ然后使用改良的免疫组织化学分析
方法进行检测(Ｐａｃｉｏｒｅｋｅｔａｌ.ꎬ２００６)ꎮ具体如下:
首先ꎬ将样品在２５℃室温条件下用４％戊二醛溶
液固定１ｈꎻ然后ꎬ３７℃条件下用２％崩溃酶处理１
ｈꎻ最后ꎬ用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体(１∶２００)
和二抗[驴抗兔的ＩｇＧ(Ｈ
＋
Ｌ)￣Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８抗体
(１∶５００)](ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ)进行免疫组
Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ)观察ＯｓＰＩＮ１ｂ的定位ꎮ
从ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)获得
ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源蛋白的氨基酸序列ꎬ通过在线网
站(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｕｎｉｐｒｏｔ.ｏｒｇ/)分析ＯｓＰＩＮ１ｂ的跨膜
结构域ꎬ使用软件ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＳｕｉｔｅ６进行氨基酸序
列比对ꎬ所有图片均使用Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ软件处理ꎮ
化检测ꎮ使用ＬｅｉｃａＳＰ５激光共聚焦显微镜(Ｌｅｉｃａ
１２２１
１.４生物信息学分析
１ 材料与方法
１.１植物材料
植物材料为水稻品种‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’和‘丽江新
团黑谷’(‘ＬＴＨ’)(Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａｓｕｂｓｐ.ｊａｐｏｎｉｃａ)、
小麦(Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ‘Ｃｈｕａｎｍａｉ１０７’)、玉米
(Ｚｅａｍａｙｓ‘Ｂ７３’)和大豆(Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ
‘Ｗｉｌｌｉａｍｓ’)ꎬ各作物种子置于２８℃条件下水培萌
发ꎬ使用生长了７ｄ的胚根分生区细胞和１ｄ的子
叶胚来检测ＯｓＰＩＮ１ｂ及同源物的亚细胞定位ꎮ
１.２抗体的制备和检测
根据水稻‘Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ’的生长素输出载体
ＯｓＰＩＮ１ｂ(Ｏｓ０２ｇ０７４３４００)的氨基酸序列人工合成
多肽ＱＳＳＲＮＰＴＰＲＧＳＳＦＮＣꎬ并将其注入新西兰兔
体内ꎮ通过ＥＬＩＳＡ方法检测到纯化的抗兔
ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体ꎬ其浓度为０.５１ｍｇ