2024年4月10日发(作者：锐良骏)

生态毒理学报

DOI:10.7524/AJE.1673-5897.2

AsianJournalofEcotoxicology

第18卷第2期2023年4月

Vol.18,No.2Apr.2023

崔庆奎,韩典峰,丁玉竹,等.短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应[J].生态毒理学报,2023,18(2):53-63

CuiQK,HanDF,DingYZ,ffectsofshortchainchlorinatedparaffinsondevelopmentof

Paralichthysolivaceus

embryos[J].AsianJournal

ofEcotoxicology,2023,18(2):53-63(inChinese)

短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应

崔庆奎

1

,韩典峰

1

,丁玉竹

1

,任传博

1

,张信泽

1

,赵军强

2

,崔艳梅

1

,姜芳

1

,

李佳蔚

1

,孙琰晴

1

,王景

1

,宫向红

1

,徐英江

1,*

1.山东省海洋资源与环境研究院,山东省海洋生态修复重点实验室,烟台市海珍品质量安全控制与精深加工重点实验室,烟

台264006

2.上海海洋大学食品学院,上海201306

收稿日期

:

2022-10-19　　录用日期

:

2022-12-12

摘要:氯化石蜡(chlorinatedparaffins,CPs)是一系列多氯正构烷烃的复杂混合物,其中短链氯化石蜡(shortchainchlorinatedpar-

affins,SCCPs)因具有持久性有机污染物(persistentorganicpollutants,POPs)的诸多特性而被国内外学者广泛关注,但目前关于

SCCPs毒性效应的报道仍然较少。因此本研究基于SCCPs的海洋污染现状,以褐牙鲆胚胎为实验对象,通过132h的暴露实

验探究了SCCPs的毒性效应。结果表明,SCCPs具有显著的胚胎发育毒性,能够导致胚胎-仔鱼存活率降低,且具有时间效应-

剂量效应;能够导致胚胎孵化延迟,高浓度(≥1000μg·L

-

1

)还会导致孵化率降低;能够引起胚胎-仔鱼发育畸形,如脊柱弯曲、

心包水肿等;能够抑制仔鱼生长等。此外,SCCPs还能诱导胚-仔鱼发生氧化应激反应,实验组仔鱼的超氧化物歧化酶活性、过

氧化氢酶活性及丙二醛的含量均显著高于对照组(

P

<0.05),抗氧化酶基因

sod

、

cat

的相对表达量也要高于对照组。随着SCCPs

浓度增加,实验组仔鱼超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性呈下降趋势,清除活性氧自由基的能力逐渐下降,导致机体发生严重

的脂质过氧化作用,10000μg·L

-

1

实验组仔鱼中观察到丙二醛含量接近于对照组的3倍。研究结果揭示了SCCPs对海洋生

物早期发育阶段的生态毒性,将为SCCPs的环境风险评估提供理论依据。

关键词:短链氯化石蜡;褐牙鲆胚胎;发育毒性;氧化应激

文章编号:1673-5897(2023)2-053-11　　中图分类号:X171.5　　文献标识码:A

ToxicEffectsofShortChainChlorinatedParaffinsonDevelopmentof

ParalichthysolivaceusEmbryos

CuiQingkui

1

,HanDianfeng

1

,DingYuzhu

1

,RenChuanbo

1

,ZhangXinze

1

,ZhaoJunqiang

2

,Cui

Yanmei

1

,JiangFang

1

,LiJiawei

1

,SunYanqing

1

,WangJing

1

,GongXianghong

1

,XuYingjiang

1,*

ngMarineResourceandEnvironmentResearchInstitute,ShandongProvincialKeyLaboratoryofRestorationforMarineE-

cology,YantaiKeyLaboratoryofQualityandSafetyControlandDeepProcessingofMarineFood,Yantai264006,China

eofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China

Received19October2022　　accepted12December2022

Abstract:Chlorinatedparaffins(CPs)e,

　　基金项目:山东省农业重大应用技术创新项目(SF1805301301);山东省藻类产业技术体系(SDAIT-26-05);烟台市科技创新发展计划基础研

究类项目(2022JCYJ035)

　　第一作者:崔庆奎(1994—),男,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E-mail:*****************

　　*通信作者(Correspondingauthor),E-mail:********************

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　54

生态毒理学报第18卷

shortchainchlorinatedparaffins(SCCPs)receivedawideinterestfromdomesticandinternationalscholarsfortheir

numerouspropertiesaspersistentorganicpollutants(POPs),butfewreportsonthetoxiceffectsofSCCPshave

study,thetoxiceffectsofSCCPswereinvestigatedin

Paralichthysolivaceus

embryos

through132hexposureexperiment,ultsshowedthatSCCPs

hadsignificantembryonicdevelopmentaltoxicity,includinglowerembryo-larvaesurvivalwithatime-doseeffect;a

delayinembryohatchingandadecreaseinhatchingrateathighconcentrations(≥1000μg·L

-

1

);developmental

malformationsofembryo-larvae,suchasspinalcurvatureandpericardialedema;

addition,eroxidedismutase(SOD)ac-

tivity,catalaseactivity(CAT)andmalondialdehyde(MDA)contentweresignificantlyhigher(

P

<0.05)andtherela-

tiveexpressionofantioxidantenzymegenes

sod

and

cat

werealsorelativelyhigherintheexperimentalgroupof

eincreasingconcentrationofSCCPs,theSODandCATactivitiesof

theexperimentalgroupwereonadecreasingtrend,indicatingagradualdecreaseintheabilitytoscavengereactive

dtoseverelipidperoxidationintheorganism,andtheMDAcontentobservedinthe10000

μg·L

-

1

experimeultsrevealthe

ecotoxicityinducedbySCCPsontheearlydevelopmentalstagesofmarineorganisms,whichwillprovideatheo-

reticalbasisfortheenvironmentalriskassessmentofSCCPs.

Keywords:shortchainchlorinatedparaffins;

Paralichthysolivaceus

embryo;developmentaltoxicity;oxidative

stress

　　氯化石蜡(chlorinatedparaffins,CPs)是一系列多

氯正构烷烃的复杂混合物,由正构烷烃和分子氯在

紫外线、高温或高压条件下发生自由取代反应产生,

一般氯含量(质量分数)在30%~70%之间

[1]

。根据

碳链长度CPs通常被分为三大类,C10~13的为短

链氯化石蜡(shortchainchlorinatedparaffins,SC-

CPs);C14~17的为中链氯化石蜡(mediumchain

chlorinatedparaffins,MCCPs);C≥18的为长链氯化

石蜡(longchainchlorinatedparaffins,LCCPs)。此

外,还存在C6~9的超短链氯化石蜡(veryshort

chainchlorinatedparaffins,vSCCPs),被认为是SC-

CPs的加工副产品

[2]

,或是由SCCPs和MCCPs降

解而产生

[3]

。

20世纪30年代,CPs已经在全球范围内开始生

icpollutants,POPs)的汇,CPs作为POPs之一,加之

其主要产区和消费区分布在东部沿海

[6]

,使得我国

海洋环境更易受到CPs的污染。有报道称,山东半

岛渤海湾沿岸海水中SCCPs浓度为572.6~1978

SCCPs浓度为370.0~543.3ng·L

-

1

,平均值为449.3

·L

-

1[9]

;辽东湾海水中SCCPs浓度相对较低,为4.10

物(203.17ng·g

-

1

,干质量)和海洋表层沉积物(259.64

ng·L

-

1

,平均值为1256ng·L

-

1[3]

;黄海沿岸海水中

ng·L

-

1[3]

;珠江口海水中SCCPs浓度为180~460ng

岸的陆地土壤(120.31ng·g

-

1

,干质量)、潮间带沉积

ng·g

-

1

,干质量)中均有SCCPs污染的报道

[11]

。CPs

不仅存在于环境中,海洋生物体中也有检出。在渤

(干质量)

[12]

;而在辽东湾鱼类体内SCCPs浓度在

ng·g

-

1

(湿质量),双壳贝类为1058~2259ng·g

-

1

(湿

质量),此外,在珠江口鱼类和甲壳类体内也有报道,

但含量相对较低

[9]

。SCCPs分布广泛,污染严重,且

学者广泛关注

[13]

,2017年SCCPs也被列入斯德哥尔

摩公约POPs清单

[14]

。

SCCPs作为新型污染物,关于其毒性的研究相

具有生物富集性、环境持久性等特征,因而被国内外

海湾沿岸软体动物中,SCCPs浓度高达5510ng·g

-

1

~13.1ng·L

-

1

,平均7.70ng·L

-

1[10]

。此外,在渤海沿

产,主要用作增塑剂、阻燃剂、金属加工液和皮革加

脂剂等

[4

-

5]

。我国自20世纪50年代末开始生产

南、山东和河北,三省占据全国总产量的49%

[6]

。随

CPs,2019年总产能已超过200万t·a

-

1

,主产区为河

着产量增加,在生产、运输和使用过程中难免会向环

境中泄漏,在废品处置过程中(如垃圾焚烧、填埋等)

也会源源不断地释放到环境中。不仅如此,CPs在

焚烧过程中还会产生多种持久性氯化芳烃,如多氯

联苯、多氯萘等,带来了一系列环境问题

[7

-

8]

。

海洋是各类持久性有机污染物(persistentorgan-

428~2896ng·g

-

1

(湿质量),甲壳类为243~1053

对较少。现有研究表明,SCCPs具有致死性、致癌性

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第2期

崔庆奎等:短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应　55

和发育毒性,导致内分泌系统紊乱和代谢功能异

实验中发现,SCCPs主要损伤肝脏、肾脏,并具有致

死性、致癌性

[16

-

17]

;对于内分泌系统的影响,主要是

降低甲状腺素总T4浓度,引起促甲状腺素(TSH)和

尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(UDPGT)水平升高,导致

甲状腺功能紊乱

。在非洲爪蟾(

Xenopuslaevis

)的

[7]

常

[15]

。在哺乳动物小鼠(

Musmusculus

)的经口暴露

SO浓度均为0.02%(

V

∶

V

),此外设置溶剂对照组,

1.2　褐牙鲆胚胎的暴露实验

仅添加相同剂量的DMSO。

褐牙鲆胚胎购自烟台天源水产有限公司,待亲

鱼产卵受精后,立即收集受精卵运回实验室进行随

机分组。暴露实验在外径120mm的培养皿中进

行,按照实验浓度分成了0、0.1、1、10、100、1000和

10000μg·L

-

1

组(0.1、1和10μg·L

-

1

组用于探究目

前海水污染水平的毒性效应;100、1000和10000

μg·L

-

1

组用于评估严重污染时的毒性效应)和溶剂

对照组(0.02%的DMSO),每组3个平行,每个平行

100粒胚胎,其中0、1、100和10000μg·L

-

1

组和

DMSO组额外多设置6个平行,用于测定胚胎抗氧

化酶活性及相关抗氧化基因的表达情况。分组完成

后待受精率发育至桑椹胚时(约受精后4h,4hpf),

开始暴露实验。

±1)℃、盐度(33±1)‰、溶解氧(7.0±0.5)mg·L

-

1

。

整个暴露期间保持光周期14L∶10D、水温(18

实验中发现SCCPs能够导致胚胎生长缓慢、发育畸

形,并诱导了谷胱甘肽转移酶活性增加

[18]

。对于鱼

类而言,SCCPs能够引起虹鳟幼鱼(

Oncorhynchus

mykiss

)肝脏纤维损伤、肝细胞坏死和炎症反应

[19]

;

能够导致斑马鱼(

Daniorerio

)胚胎死亡率增加,孵化

率降低,并影响甲状腺激素的代谢

[20

-

21]

,在Ren等

[22]

在研究中发现SCCPs对斑马鱼胚胎13d的LC

50

低

至34.4μg·L

。关于SCCPs的毒性机制,一般认为

-

1

可能是SCCPs与大分子结合,继而引起机体氧化应

激、代谢紊乱、内分泌紊乱等有关

[15]

SCCPs会引起体外培养细胞产生氧化应激反应,导

致活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)积累,超氧化

物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和过氧化氢酶

(catalase,CAT)活性增加

[23]

。现已证明,

1.3　毒性终点统计和显微观察

不利影响,如破坏细胞成分,导致DNA损伤和基因

突变等,因此,氧化应激可能是SCCPs毒性作用的

基础

[24

-

25]

,而氧化应激会产生诸多

实验中采用显微镜(LEICA-DM2500,德国)观察

胚胎的发育情况,拍照记录畸形个体,判别畸形类型

等,部分测量指标采用解剖镜(OLYMPUS-SZ61TR,

日本)及其自带软件(OlympuscellSens)直接测量。

1.4　抗氧化酶活性测定及相关抗氧化基因表达情况

统计的各毒性终点如表1所示。

损伤的原因。

,这也是本研究中重点关注鱼类胚胎氧化

海洋是SCCPs污染的重灾区,但目前并没有关

于SCCPs对海洋生物毒性效应的报道。褐牙鲆

(

Paralichthysolivaceus

)是我国北方重要的经济鱼类

和增殖放流的主要品种,其健康状况与人类息息相

关,同时,褐牙鲆具有洄游习性,每年春季洄游至近

岸产卵,受人类活动影响,近岸的底泥及海水中SC-

[3]

实验结束后,0、1、100和10000μg·L

-

1

组和

DMSO组各取3个平行测定SOD(WST-1法)、CAT

(钼酸铵法)的活性以及MDA(TBA法)的含量,所用

试剂盒购自南京建成生物工程研究所,具体操作步

骤按试剂盒说明书进行。

另外取0、1、100和10000μg·L

-

1

组和DMSO

组剩余的3个平行,以β-

actin

为内参基因,采用

2

-

ΔΔ

C

t

法测定抗氧化基因

sod

和

cat

的表达水平。首

先取0.1g样品充分匀浆后使用Trizol试剂盒(生工

生物工程股份有限公司)提取总RNA,使用超微分

光光度计(NanoDropOne,Thermo,美国)测定总RNA

的浓度和判断RNA的质量;随后使用MightyScript

Plus第一链合成试剂盒(生工生物工程股份有限公

司)合成cDNA;再用PowerUpSYBRGreenMaster

Mix试剂盒(赛默飞世尔科技公司)进行cDNA的

扩增。反应体系为20μL,反应程序和条件为:95

℃下预变性2min,95℃变性15s,53℃退火15s,

CPs污染更为严重

,加之其胚胎、仔鱼的生理功能

尚未发育完善,受SCCPs的影响可能更为严重。因

此,本实验以褐牙鲆胚胎、仔鱼为研究对象,探究

SCCPs对海洋鱼类的毒性效应。通过本研究,有助

于进一步了解SCCPs的生态毒性,为制定和完善相

关环境评价标准提供理论依据。

1　材料与方法(Materialsandmethods)

1.1　SCCPs溶液配制

实验中的SCCPs(CAS号85535-84-8,纯度≥

99%)购自山东嘉颖化工科技有限公司。SCCPs用

二甲基亚砜(DMSO,分析纯,中国国药有限公司)助

溶后,按照实验分组配成相应的浓度,各组中DM-

72℃延伸1min,重复40个循环。引物相关信息

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　56

生态毒理学报第18卷

1.5　数据统计与分析

见表2。小于对照组,表明SCCPs推迟了褐牙鲆胚胎的孵

化,其中1、1000和10000μg·L

-

1

组的孵化率分别

为(7.7±5.8)%、(7.3±1.5)%和(7.0±1.0)%,与对照组

(14.7±2.1)%存在显著差异(

P

<0.05)。在受精后72h

1000μg·L

-

1

组和10000μg·L

-

1

组分别为(90.3±

2.1)%、(91.0±4.4)%,均与对照组存在显著差异(

P

<

0.05),此时其他低浓度(0.1、1、10和100μg·L

-

1

)实

验组的孵化率与对照组无显著差异(

P

>0.05),这表

明高浓度的SCCPs胁迫会导致褐牙鲆胚胎孵化率下

降,但低浓度胁迫时对胚胎孵化率没有影响。此外,

在10000μg·L

-

1

组还发现了部分出膜困难的胚胎(胚

胎存活,但未孵化出膜),在受精后84h和108h时

仍未出膜,如图2(e)、图2(i),可见这些胚胎表面粗

糙,附有大量颗粒杂质。

时,对照组胚胎的孵化率达到了(96.3±0.5)%,而

利用SPSS25软件对数据进行Kolmogorov-

Smirnow正态分布检验和Levene方差齐性检验,满

足2种检验条件后进行one-wayANOVA分析。利

用Tukeytest进行组间多重比较,在DMSO组与对

照组无显著差异(

P

<0.05时表示差异显著)的基础

上,以DMSO组为对照与各实验组进行比较。半致

死浓度(LC

50

)通过Probit模型进行确定。数值结果

以Mean±SD表示。

2　结果(Results)

2.1　SCCPs对褐牙鲆胚胎孵化的影响

本研究统计了胚胎60hpf、72hpf的孵化率,结

果如图1(a)所示。可见各实验组60hpf的孵化率均

表1　胚胎发育中各毒性终点及其说明

Table1　Toxicendpointsanddescriptioninembryonicdevelopment

毒性终点

Toxicityendpoints

自主运动

Spontaneousmovement

孵化率

Hatchingrate

仔鱼体长

Larvallength

畸形率

Malformationrate

死亡率

Mortalityrate

卵黄囊面积

Yolksacarea

评价时间/hpf

Hourspost-fertilization/hpf

说明

Description

胚胎尾部每分钟内自发地从一边摆动到另一边的次数;每组统计15枚

42Numberofspontaneoustailmovementsperminute

perembryo;15embryoswerescoredpergroup

60、72

累积孵化胚胎数/总卵数

Cumulativehatchedembryos/totalnumberofembryos

解剖镜下测量体长,每组统计15尾

132Measurementofbodylengthunderdissectingmicroscope,

with15individualspergroup

132

132

畸形仔鱼数/存活仔鱼总数

Umberofmalformedlarvae/totalnumberofsurvivinglarvae

累计死亡数/总卵数

Cumulativemortality/totalnumberofembryos

解剖镜下测量仔鱼卵黄囊面积,每组统计15尾

132Measurementofyolksacareainlarvaeunderdissecting

microscope,with15individualspergroup

表2　内参基因和目的基因引物信息

Table2　Primerinformationofinternalreferencegenesandtargetgenes

名称

Name

序列5’~3’

Sequence5’~3’

GGCAAGAATCATGCTGGTCCTA

TCGTCAGCCTTCTCGTGGAT

AACGGCTACGGCTCTCACA

CGCTCTGCCTCCTCTACCAA

ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAA

AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGG

GenBank登录号

GenBankaccessionno.

EF681883.1

sod

-F

sod

-R

cat

-F

cat

-R

β-

actin

-F

β-

actin

-R

XM_020079314.1

XM_020109620.1

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第2期

崔庆奎等:短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应　57

图1　短链氯化石蜡(SCCPs)对褐牙鲆胚胎化率和自主运动的影响

注:(a)各组60hpf和72hpf的孵化率;(b)各组胚胎42hpf自主运动情况;*代表示实验组与

对照组间

P

<0.05,**代表

P

<0.01,***

P

<0.001;下同

Fig.1　Theeffectofshortchainchlorinatedparaffins(SCCPs)onembryohatchingrateandautonomousmovement

Note:(a)Hatchingrateofembryosat60hpfand72hpf;(b)Autonomousmovementofembryosat42hpf;asterisksdenote

significantdifferencebetweentreatmentsandcontrol,*

P

<0.05,**

P

<0.01,***

P

<0.01;thesamebelow.

图2　SCCPs诱导褐牙鲆胚胎-仔鱼产生的畸形类型

注:(a)、(b)、(c)和(d)为对照组36hpf、48hpf、72hpf和108hpf的胚胎或仔鱼;(e)、(i)分别为实验组84hpf、108hpf未孵化出膜的胚胎(HF);

(f)为实验组48hpf卵黄囊水肿(YSE)的仔鱼;(g)、(h)分别为实验组96hpf、108hpf脊柱弯曲(SC)、鳍膜损伤(FD)的仔鱼;

(j)为实验组60hpf仔鱼(YSE、FD);(k)、(l)为实验组108hpf心包水肿(PE)、SC和YSE的仔鱼。

Fig.2　TypesofmalformationsinducedbySCCPsinthe

Paralichthysolivaceus

embryos

Note:(a),(b),(c),(d)Thecontrolgroupembryosat24,48,72and96hpf,respectively;(e),(i)Hatchfailure(HF)embryosinthe

treatmentsat84hpf,108hpf,respectively;(f)Embryowithyolksacedema(YSE)at48hpf;(g),(h)Larvae

withspinalcurvature(SC),finmembranedamage(FD)inthetreatmentsat96hpf,108hpf,respectively;(j)LarvaewithYSE

andFDinthetreatmentsat60hpf;(k),(l)Larvaewithpericardialedema(PE),SCandYSEinthetreatmentsat108hpf.

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　58

生态毒理学报第18卷

2.2　SCCPs对褐牙鲆胚胎致畸、致死作用

著差异(

P

<0.05),其他各浓度实验组则与对照无显

著差异(

P

>0.05)。可见随着暴露浓度增加,存活率

逐渐下降,表现出剂量效应。随着暴露时间增长,

各实验组存活率逐渐降低,尤其是96~132h高浓

度实验组(100、1000和10000μg·L

-

1

组)仔鱼的

存活率急速下降,时间效应明显。此外,通过

Probit模型估算的SCCPs对褐牙鲆胚胎132h-LC

50

2.3　SCCPs对胚胎-仔鱼生长和卵黄吸收的影响

为49743.34μg·L

-

1

。

研究发现SCCPs对褐牙鲆胚胎具有致畸作用,

100、1000和10000μg·L

-

1

组的畸形率分别为(8.2±

1.3)%、(10.6±4.3)%和(14.1±2.7)%,与对照组(3.8±

1.4)%均有显著差异(

P

<0.05),但0.1、1和10μg·L

-

1

且存在明显的剂量效应。如图3(a)所示,120hpf时

各组与对照组相比差异不显著(

P

>0.05)。在畸形个

体中,畸形类型主要为脊柱弯曲(图2(g)、图2(h)、图2

(k)、图2(l))、卵黄囊水肿(图2(f)、图2(j)、图2(l))、心包

水肿(图2(k)、图2(l))、鳍膜损伤(图2(g)、图2(h)、图2

(j)),同时发现随着暴露时间延长,畸形个体一般会同

时表现出多种畸形类型,其中水肿现象较为普遍。

各组存活率的统计结果如图3(b)所示,在实验

100、1000和10000μg·L

-

1

组的分别为(68.7±

结束时(132hpf),对照组存活率为(78.3±2.1)%,而

2.9)%、(58.7±5.7)%和(52.3±2.8)%,与对照组均有显

实验中SCCPs对褐牙鲆仔鱼表现出了生长抑

制作用,如图4(a)所示,实验结束时(132hpf)对照组

仔鱼体长为(34.0±2.9)mm,高于各浓度的实验组,

并与1、10、100、1000和10000μg·L

-

1

组差异显著

(

P

<0.05)。如图4(b)所示,实验结束时(132hpf)对照

组卵黄囊面积要大于各实验组,且与各实验组均有

显著差异(

P

<0.05)。

图3　SCCPs对褐牙鲆胚胎-仔鱼畸形率和存活率的影响

Fig.3　EffectofSCCPsonembryonicmalformationandsurvivalrateof

Paralichthysolivaceus

图4　SCCPs对褐牙鲆胚胎-仔鱼体长和卵黄囊面积的影响

Fig.4　EffectofSCCPsonlarvaebodylengthandyolksacareain

Paralichthysolivaceus

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第2期

崔庆奎等:短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应　59

2.4　SCCPs对仔鱼抗氧化系统的影响

SCCPs对褐牙鲆抗氧化酶SOD、CAT的活性及

(0.78±0.09)U·mg

-

1

和(0.73±0.19)U·mg

-

1

。仔鱼

脂质过氧化产物MDA含量的影响如图5和图6所

示。与对照组相比,SCCPs诱导了褐牙鲆仔鱼SOD

活性增加,其中1μg·L

-

1

组的SOD活性为(95.53±

3.32)U·mg

-

1

,较对照组显著增加了192.3%(

P

<

mg

-

1

,较对照组显著增加了65.53%(

P

<0.05);10000

CAT活性也高于对照组(0.42±0.09)U·mg

-

1

,1、100

0.05);100μg·L

-

1

组的SOD活性为(54.10±8.52)U·

μg·L

-

1

组的SOD活性为(40.12±3.06)U·mg

-

1

,较对

照组显著增加了22.8%(

P

<0.05)。同样,实验组

和10000μg·L

-

1

组分别为(1.27±0.30)U·mg

-

1

、

sod

、

cat

基因表达情况如图5(b)、5(d)所示,各实验组

两基因的表达量均高于对照组,且随着实验浓度增

加,基因表达情况有所抑制,这一规律也与抗氧化酶

活力的变化相对应。

对于MDA而言,本研究中1μg·L

-

1

组MDA含

量为(13.32±0.24)nmol·mg

-

1

,100μg·L

-

1

为(12.95±

1.79)nmol·mg

-

1

,10000μg·L

-

1

组为(25.61±0.12)

nmol·mg

-

1

,均显著高于对照组的(8.86±1.44)nmol·

mg

-

1

(

P

<0.05),特别是10000μg·L

-

1

组,MDA含量

接近于对照组的3倍,表明机体已发生了严重的氧

化应激反应。

图5　SCCPs诱导褐牙鲆仔鱼产生的氧化应激

Fig.5　SCCPsinducedoxidativestressin

Paralichthysolivaceus

3　讨论(Discussion)

SCCPs暴露会引起胚胎孵化延迟,高浓度胁迫

时还会导致孵化率降低,如图1(a)所示。这一现象

在斑马鱼中也有报道

[21

-

22]

,但对其他水生生物孵化

的影响还需要进一步研究。孵化是鱼类早期发育阶

段的重要一环,一般包括2个过程,一是孵化腺分泌

孵化酶、绒毛膜酶,引起卵膜膨胀、降解

[26

-

27]

,二是胚

胎机械运动使卵膜破裂

[28

-

29]

。本研究中发现SCCPs

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　60

生态毒理学报第18卷

能够影响褐牙鲆胚胎的孵化,这与以上过程可能有

关,遗憾的是本研究并没有对孵化酶进行研究。但

关于胚胎的机械运动,我们发现在42h时1、1000

和10000μg·L

-

1

组胚胎的自主运动次数要低于对

照组(图1(b)),均在4次·min

-

1

以下,由于这些胚胎

自主运动的强度减弱,很难突破卵膜,使得实验组

60hpf的孵化率低于对照组,表现出孵化延迟的现

象。而对于高浓度组出现胚胎出膜困难的现象,一

方面可能是SCCPs抑制了胚胎的自主运动,使得胚

胎出膜困难;另一方面可能是由于SCCPs具有亲脂

性,大量附着在卵膜表面,呈现出颗粒状态(图2(e)、

图2(i)),阻塞了气孔造成胚胎缺氧

[30]

;早期研究,缺

氧能够抑制胚胎发育,导致孵化延迟或死亡

[31]

。

发育畸形

[20,22,33

-

34]

。本研究发现SCCPs对褐牙鲆胚

胎同样具有致畸作用,且存在明显的剂量效应。Liu

等

[20]

研究发现,SCCPs对斑马鱼胚胎发育毒性也具

有低浓度致畸作用不明显、高浓度致畸作用显著的

规律。值得注意的是,在畸形类型中水肿发生率较

高,污染物导致鱼类水肿的发生可能与膜的通透性

有关

[35]

。MDA作为脂质过氧化物,其含量能够反

映生物膜受损程度,研究中观察到实验组仔鱼MDA

含量显著高于对照组(图6),表明仔鱼体内生物膜发

生了严重的脂质过氧化作用,生物膜结构和功能的

实验组大量水肿个体产生。此外,在实验结束时存

活仔鱼中畸形个体仍占有一定量比例,对于畸形胚

胎而言大多数最终会走向死亡

[23]

,存活率会进一步

降低。

体长是衡量仔鱼生长发育状况最直观的指标。

由于整个实验过程处于内源性营养阶段,卵黄提供

了胚胎生长发育所需的所有能量,卵黄囊面积在一

定程度上能够反映胚胎-仔鱼能量利用的情况。我

们结合体长规律发现,实验组胚胎-仔鱼消耗的能量

多反而生长较慢(图4),这一现象在斑马鱼胚胎中也

有发现

[20]

,这可能是由于胚胎-仔鱼面临SCCPs的

给生长的能量减少,因而生长缓慢。

毒性胁迫,消耗了大量的能量用于解毒

[37]

,导致分配

正常情况下,机体内ROS处于动态平衡状态,

损伤势必会影响其功能,改变通透性

[36]

,最终导致了

诸多研究表明,环境污染物能够导致鱼类胚胎

图6　SCCPs诱导褐牙鲆仔鱼产生的丙二醛(MDA)

Fig.6　SCCPsinducedmalonaldehyde(MDA)

in

Paralichthysolivaceus

当受到污染物胁迫致使ROS积累时,机体的抗氧化

系统会发挥作用,维持ROS代谢平衡,避免细胞遭

受氧化损伤,影响组织、器官的功能。SOD和CAT

是机体抗氧化防御系统的第一道防线

[38]

,ROS过量

-

时会诱导其活性增加,SOD能够催化O

2

·生成毒性

　　SCCPs对褐牙鲆胚胎-仔鱼具有明显致死作用,

这在非洲爪蟾

[18]

、虹鳟鱼

[19]

和斑马鱼

[20]

中均有报

道。本实验中观察到SCCPs对褐牙鲆胚胎132h的

LC

50

为49743.34μg·L

-

1

,而刘丽华等

[21]

发现SC-

-

1

较低的H

2

O

2

,而CAT负责催化H

2

O

2

分解成H

2

O

和O

2

[39]

,因此,SOD和CAT的活性能够间接反映机

体的氧化损伤情况,也被广泛地用于评价污染物的

毒性效应中

[40

-

42]

。本研究中褐牙鲆仔鱼SOD、CAT

活性及

sod

、

cat

基因的表达情况均显著高于对照组,

表明SCCPs诱导机体发生了氧化应激反应,进而导

致细胞损伤、凋亡,最终影响着生物体的代谢和免疫

调节等

[43]

。研究发现,青鳉鱼幼鱼

[44]

、热带爪蛙胚

胎

[45]

随着SCCPs暴露浓度的增加,机体SOD、CAT

都呈下降趋势。原因可能是低浓度处理时,仔鱼产

生适应性反应,通过提升抗氧化酶活性来消除

ROS,保护机体免受氧化损伤;但随着SCCPs暴露

CPs对斑马鱼胚胎96h的LC

50

为1~10mg·L

,

Fisk等

[32]

在日本青鳉鱼(

Oryziaslatipes

)胚胎中发现

其LC

50

值2.7~9.6mg·L

-

1

,相比较均低于本实验观

察到的结果,这可能是物种耐受性不同引起的。值

得注意的是Ren等

[22]

同样采用斑马鱼作为受试动

物,在13d的慢性毒性实验中发现SCCPs的LC

50

低至34.4μg·L

-

1

,可见暴露时间越长,其水生生物

毒性越大,特别是对水生生物长期暴露的影响还需

进一步深入研究。

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第2期

崔庆奎等:短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应

International,2021,28(8):9020-9028

　61

浓度增加,机体产生的ROS大量积累,超过了抗氧

化防御系统清除能力,过量ROS损伤抗氧化系统,

此外,由于MDA依赖于SOD进行清除,随着SC-

致使抗氧化酶活性下降、相关抗氧化酶基因下调

[46]

。

CPs浓度增加,SOD的活性逐渐下降,使得体内

MDA含量增加,实验中SOD和MDA的变化规律

也对应了起来。综上所述,我们认为SCCPs引起的

氧化应激可能是导致褐牙鲆胚胎-仔鱼发育异常(畸

形、死亡等)的主要原因,而这种氧化损伤即使在环

境浓度(1μg·L

)下也会存在,结合其他毒性终点观

察到的结果,我们认为短期环境浓度的SCCPs胁迫

虽未导致鱼类存活率显著下降,但对鱼类的正常发

育已产生影响。长期来看,这种影响可能会打破近

海生态系统的稳定,导致鱼类资源量进一步下降。

通信作者简介:徐英江(1979—),男,硕士,研究员,主要研究

方向为生态毒理学。

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2024年4月10日发(作者：锐良骏)

生态毒理学报

DOI:10.7524/AJE.1673-5897.2

AsianJournalofEcotoxicology

第18卷第2期2023年4月

Vol.18,No.2Apr.2023

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ofEcotoxicology,2023,18(2):53-63(inChinese)

短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应

崔庆奎

1

,韩典峰

1

,丁玉竹

1

,任传博

1

,张信泽

1

,赵军强

2

,崔艳梅

1

,姜芳

1

,

李佳蔚

1

,孙琰晴

1

,王景

1

,宫向红

1

,徐英江

1,*

1.山东省海洋资源与环境研究院,山东省海洋生态修复重点实验室,烟台市海珍品质量安全控制与精深加工重点实验室,烟

台264006

2.上海海洋大学食品学院,上海201306

收稿日期

:

2022-10-19　　录用日期

:

2022-12-12

摘要:氯化石蜡(chlorinatedparaffins,CPs)是一系列多氯正构烷烃的复杂混合物,其中短链氯化石蜡(shortchainchlorinatedpar-

affins,SCCPs)因具有持久性有机污染物(persistentorganicpollutants,POPs)的诸多特性而被国内外学者广泛关注,但目前关于

SCCPs毒性效应的报道仍然较少。因此本研究基于SCCPs的海洋污染现状,以褐牙鲆胚胎为实验对象,通过132h的暴露实

验探究了SCCPs的毒性效应。结果表明,SCCPs具有显著的胚胎发育毒性,能够导致胚胎-仔鱼存活率降低,且具有时间效应-

剂量效应;能够导致胚胎孵化延迟,高浓度(≥1000μg·L

-

1

)还会导致孵化率降低;能够引起胚胎-仔鱼发育畸形,如脊柱弯曲、

心包水肿等;能够抑制仔鱼生长等。此外,SCCPs还能诱导胚-仔鱼发生氧化应激反应,实验组仔鱼的超氧化物歧化酶活性、过

氧化氢酶活性及丙二醛的含量均显著高于对照组(

P

<0.05),抗氧化酶基因

sod

、

cat

的相对表达量也要高于对照组。随着SCCPs

浓度增加,实验组仔鱼超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性呈下降趋势,清除活性氧自由基的能力逐渐下降,导致机体发生严重

的脂质过氧化作用,10000μg·L

-

1

实验组仔鱼中观察到丙二醛含量接近于对照组的3倍。研究结果揭示了SCCPs对海洋生

物早期发育阶段的生态毒性,将为SCCPs的环境风险评估提供理论依据。

关键词:短链氯化石蜡;褐牙鲆胚胎;发育毒性;氧化应激

文章编号:1673-5897(2023)2-053-11　　中图分类号:X171.5　　文献标识码:A

ToxicEffectsofShortChainChlorinatedParaffinsonDevelopmentof

ParalichthysolivaceusEmbryos

CuiQingkui

1

,HanDianfeng

1

,DingYuzhu

1

,RenChuanbo

1

,ZhangXinze

1

,ZhaoJunqiang

2

,Cui

Yanmei

1

,JiangFang

1

,LiJiawei

1

,SunYanqing

1

,WangJing

1

,GongXianghong

1

,XuYingjiang

1,*

ngMarineResourceandEnvironmentResearchInstitute,ShandongProvincialKeyLaboratoryofRestorationforMarineE-

cology,YantaiKeyLaboratoryofQualityandSafetyControlandDeepProcessingofMarineFood,Yantai264006,China

eofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China

Received19October2022　　accepted12December2022

Abstract:Chlorinatedparaffins(CPs)e,

　　基金项目:山东省农业重大应用技术创新项目(SF1805301301);山东省藻类产业技术体系(SDAIT-26-05);烟台市科技创新发展计划基础研

究类项目(2022JCYJ035)

　　第一作者:崔庆奎(1994—),男,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E-mail:*****************

　　*通信作者(Correspondingauthor),E-mail:********************

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　54

生态毒理学报第18卷

shortchainchlorinatedparaffins(SCCPs)receivedawideinterestfromdomesticandinternationalscholarsfortheir

numerouspropertiesaspersistentorganicpollutants(POPs),butfewreportsonthetoxiceffectsofSCCPshave

study,thetoxiceffectsofSCCPswereinvestigatedin

Paralichthysolivaceus

embryos

through132hexposureexperiment,ultsshowedthatSCCPs

hadsignificantembryonicdevelopmentaltoxicity,includinglowerembryo-larvaesurvivalwithatime-doseeffect;a

delayinembryohatchingandadecreaseinhatchingrateathighconcentrations(≥1000μg·L

-

1

);developmental

malformationsofembryo-larvae,suchasspinalcurvatureandpericardialedema;

addition,eroxidedismutase(SOD)ac-

tivity,catalaseactivity(CAT)andmalondialdehyde(MDA)contentweresignificantlyhigher(

P

<0.05)andtherela-

tiveexpressionofantioxidantenzymegenes

sod

and

cat

werealsorelativelyhigherintheexperimentalgroupof

eincreasingconcentrationofSCCPs,theSODandCATactivitiesof

theexperimentalgroupwereonadecreasingtrend,indicatingagradualdecreaseintheabilitytoscavengereactive

dtoseverelipidperoxidationintheorganism,andtheMDAcontentobservedinthe10000

μg·L

-

1

experimeultsrevealthe

ecotoxicityinducedbySCCPsontheearlydevelopmentalstagesofmarineorganisms,whichwillprovideatheo-

reticalbasisfortheenvironmentalriskassessmentofSCCPs.

Keywords:shortchainchlorinatedparaffins;

Paralichthysolivaceus

embryo;developmentaltoxicity;oxidative

stress

　　氯化石蜡(chlorinatedparaffins,CPs)是一系列多

氯正构烷烃的复杂混合物,由正构烷烃和分子氯在

紫外线、高温或高压条件下发生自由取代反应产生,

一般氯含量(质量分数)在30%~70%之间

[1]

。根据

碳链长度CPs通常被分为三大类,C10~13的为短

链氯化石蜡(shortchainchlorinatedparaffins,SC-

CPs);C14~17的为中链氯化石蜡(mediumchain

chlorinatedparaffins,MCCPs);C≥18的为长链氯化

石蜡(longchainchlorinatedparaffins,LCCPs)。此

外,还存在C6~9的超短链氯化石蜡(veryshort

chainchlorinatedparaffins,vSCCPs),被认为是SC-

CPs的加工副产品

[2]

,或是由SCCPs和MCCPs降

解而产生

[3]

。

20世纪30年代,CPs已经在全球范围内开始生

icpollutants,POPs)的汇,CPs作为POPs之一,加之

其主要产区和消费区分布在东部沿海

[6]

,使得我国

海洋环境更易受到CPs的污染。有报道称,山东半

岛渤海湾沿岸海水中SCCPs浓度为572.6~1978

SCCPs浓度为370.0~543.3ng·L

-

1

,平均值为449.3

·L

-

1[9]

;辽东湾海水中SCCPs浓度相对较低,为4.10

物(203.17ng·g

-

1

,干质量)和海洋表层沉积物(259.64

ng·L

-

1

,平均值为1256ng·L

-

1[3]

;黄海沿岸海水中

ng·L

-

1[3]

;珠江口海水中SCCPs浓度为180~460ng

岸的陆地土壤(120.31ng·g

-

1

,干质量)、潮间带沉积

ng·g

-

1

,干质量)中均有SCCPs污染的报道

[11]

。CPs

不仅存在于环境中,海洋生物体中也有检出。在渤

(干质量)

[12]

;而在辽东湾鱼类体内SCCPs浓度在

ng·g

-

1

(湿质量),双壳贝类为1058~2259ng·g

-

1

(湿

质量),此外,在珠江口鱼类和甲壳类体内也有报道,

但含量相对较低

[9]

。SCCPs分布广泛,污染严重,且

学者广泛关注

[13]

,2017年SCCPs也被列入斯德哥尔

摩公约POPs清单

[14]

。

SCCPs作为新型污染物,关于其毒性的研究相

具有生物富集性、环境持久性等特征,因而被国内外

海湾沿岸软体动物中,SCCPs浓度高达5510ng·g

-

1

~13.1ng·L

-

1

,平均7.70ng·L

-

1[10]

。此外,在渤海沿

产,主要用作增塑剂、阻燃剂、金属加工液和皮革加

脂剂等

[4

-

5]

。我国自20世纪50年代末开始生产

南、山东和河北,三省占据全国总产量的49%

[6]

。随

CPs,2019年总产能已超过200万t·a

-

1

,主产区为河

着产量增加,在生产、运输和使用过程中难免会向环

境中泄漏,在废品处置过程中(如垃圾焚烧、填埋等)

也会源源不断地释放到环境中。不仅如此,CPs在

焚烧过程中还会产生多种持久性氯化芳烃,如多氯

联苯、多氯萘等,带来了一系列环境问题

[7

-

8]

。

海洋是各类持久性有机污染物(persistentorgan-

428~2896ng·g

-

1

(湿质量),甲壳类为243~1053

对较少。现有研究表明,SCCPs具有致死性、致癌性

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第2期

崔庆奎等:短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应　55

和发育毒性,导致内分泌系统紊乱和代谢功能异

实验中发现,SCCPs主要损伤肝脏、肾脏,并具有致

死性、致癌性

[16

-

17]

;对于内分泌系统的影响,主要是

降低甲状腺素总T4浓度,引起促甲状腺素(TSH)和

尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(UDPGT)水平升高,导致

甲状腺功能紊乱

。在非洲爪蟾(

Xenopuslaevis

)的

[7]

常

[15]

。在哺乳动物小鼠(

Musmusculus

)的经口暴露

SO浓度均为0.02%(

V

∶

V

),此外设置溶剂对照组,

1.2　褐牙鲆胚胎的暴露实验

仅添加相同剂量的DMSO。

褐牙鲆胚胎购自烟台天源水产有限公司,待亲

鱼产卵受精后,立即收集受精卵运回实验室进行随

机分组。暴露实验在外径120mm的培养皿中进

行,按照实验浓度分成了0、0.1、1、10、100、1000和

10000μg·L

-

1

组(0.1、1和10μg·L

-

1

组用于探究目

前海水污染水平的毒性效应;100、1000和10000

μg·L

-

1

组用于评估严重污染时的毒性效应)和溶剂

对照组(0.02%的DMSO),每组3个平行,每个平行

100粒胚胎,其中0、1、100和10000μg·L

-

1

组和

DMSO组额外多设置6个平行,用于测定胚胎抗氧

化酶活性及相关抗氧化基因的表达情况。分组完成

后待受精率发育至桑椹胚时(约受精后4h,4hpf),

开始暴露实验。

±1)℃、盐度(33±1)‰、溶解氧(7.0±0.5)mg·L

-

1

。

整个暴露期间保持光周期14L∶10D、水温(18

实验中发现SCCPs能够导致胚胎生长缓慢、发育畸

形,并诱导了谷胱甘肽转移酶活性增加

[18]

。对于鱼

类而言,SCCPs能够引起虹鳟幼鱼(

Oncorhynchus

mykiss

)肝脏纤维损伤、肝细胞坏死和炎症反应

[19]

;

能够导致斑马鱼(

Daniorerio

)胚胎死亡率增加,孵化

率降低,并影响甲状腺激素的代谢

[20

-

21]

,在Ren等

[22]

在研究中发现SCCPs对斑马鱼胚胎13d的LC

50

低

至34.4μg·L

。关于SCCPs的毒性机制,一般认为

-

1

可能是SCCPs与大分子结合,继而引起机体氧化应

激、代谢紊乱、内分泌紊乱等有关

[15]

SCCPs会引起体外培养细胞产生氧化应激反应,导

致活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)积累,超氧化

物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和过氧化氢酶

(catalase,CAT)活性增加

[23]

。现已证明,

1.3　毒性终点统计和显微观察

不利影响,如破坏细胞成分,导致DNA损伤和基因

突变等,因此,氧化应激可能是SCCPs毒性作用的

基础

[24

-

25]

,而氧化应激会产生诸多

实验中采用显微镜(LEICA-DM2500,德国)观察

胚胎的发育情况,拍照记录畸形个体,判别畸形类型

等,部分测量指标采用解剖镜(OLYMPUS-SZ61TR,

日本)及其自带软件(OlympuscellSens)直接测量。

1.4　抗氧化酶活性测定及相关抗氧化基因表达情况

统计的各毒性终点如表1所示。

损伤的原因。

,这也是本研究中重点关注鱼类胚胎氧化

海洋是SCCPs污染的重灾区,但目前并没有关

于SCCPs对海洋生物毒性效应的报道。褐牙鲆

(

Paralichthysolivaceus

)是我国北方重要的经济鱼类

和增殖放流的主要品种,其健康状况与人类息息相

关,同时,褐牙鲆具有洄游习性,每年春季洄游至近

岸产卵,受人类活动影响,近岸的底泥及海水中SC-

[3]

实验结束后,0、1、100和10000μg·L

-

1

组和

DMSO组各取3个平行测定SOD(WST-1法)、CAT

(钼酸铵法)的活性以及MDA(TBA法)的含量,所用

试剂盒购自南京建成生物工程研究所,具体操作步

骤按试剂盒说明书进行。

另外取0、1、100和10000μg·L

-

1

组和DMSO

组剩余的3个平行,以β-

actin

为内参基因,采用

2

-

ΔΔ

C

t

法测定抗氧化基因

sod

和

cat

的表达水平。首

先取0.1g样品充分匀浆后使用Trizol试剂盒(生工

生物工程股份有限公司)提取总RNA,使用超微分

光光度计(NanoDropOne,Thermo,美国)测定总RNA

的浓度和判断RNA的质量;随后使用MightyScript

Plus第一链合成试剂盒(生工生物工程股份有限公

司)合成cDNA;再用PowerUpSYBRGreenMaster

Mix试剂盒(赛默飞世尔科技公司)进行cDNA的

扩增。反应体系为20μL,反应程序和条件为:95

℃下预变性2min,95℃变性15s,53℃退火15s,

CPs污染更为严重

,加之其胚胎、仔鱼的生理功能

尚未发育完善,受SCCPs的影响可能更为严重。因

此,本实验以褐牙鲆胚胎、仔鱼为研究对象,探究

SCCPs对海洋鱼类的毒性效应。通过本研究,有助

于进一步了解SCCPs的生态毒性,为制定和完善相

关环境评价标准提供理论依据。

1　材料与方法(Materialsandmethods)

1.1　SCCPs溶液配制

实验中的SCCPs(CAS号85535-84-8,纯度≥

99%)购自山东嘉颖化工科技有限公司。SCCPs用

二甲基亚砜(DMSO,分析纯,中国国药有限公司)助

溶后,按照实验分组配成相应的浓度,各组中DM-

72℃延伸1min,重复40个循环。引物相关信息

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　56

生态毒理学报第18卷

1.5　数据统计与分析

见表2。小于对照组,表明SCCPs推迟了褐牙鲆胚胎的孵

化,其中1、1000和10000μg·L

-

1

组的孵化率分别

为(7.7±5.8)%、(7.3±1.5)%和(7.0±1.0)%,与对照组

(14.7±2.1)%存在显著差异(

P

<0.05)。在受精后72h

1000μg·L

-

1

组和10000μg·L

-

1

组分别为(90.3±

2.1)%、(91.0±4.4)%,均与对照组存在显著差异(

P

<

0.05),此时其他低浓度(0.1、1、10和100μg·L

-

1

)实

验组的孵化率与对照组无显著差异(

P

>0.05),这表

明高浓度的SCCPs胁迫会导致褐牙鲆胚胎孵化率下

降,但低浓度胁迫时对胚胎孵化率没有影响。此外,

在10000μg·L

-

1

组还发现了部分出膜困难的胚胎(胚

胎存活,但未孵化出膜),在受精后84h和108h时

仍未出膜,如图2(e)、图2(i),可见这些胚胎表面粗

糙,附有大量颗粒杂质。

时,对照组胚胎的孵化率达到了(96.3±0.5)%,而

利用SPSS25软件对数据进行Kolmogorov-

Smirnow正态分布检验和Levene方差齐性检验,满

足2种检验条件后进行one-wayANOVA分析。利

用Tukeytest进行组间多重比较,在DMSO组与对

照组无显著差异(

P

<0.05时表示差异显著)的基础

上,以DMSO组为对照与各实验组进行比较。半致

死浓度(LC

50

)通过Probit模型进行确定。数值结果

以Mean±SD表示。

2　结果(Results)

2.1　SCCPs对褐牙鲆胚胎孵化的影响

本研究统计了胚胎60hpf、72hpf的孵化率,结

果如图1(a)所示。可见各实验组60hpf的孵化率均

表1　胚胎发育中各毒性终点及其说明

Table1　Toxicendpointsanddescriptioninembryonicdevelopment

毒性终点

Toxicityendpoints

自主运动

Spontaneousmovement

孵化率

Hatchingrate

仔鱼体长

Larvallength

畸形率

Malformationrate

死亡率

Mortalityrate

卵黄囊面积

Yolksacarea

评价时间/hpf

Hourspost-fertilization/hpf

说明

Description

胚胎尾部每分钟内自发地从一边摆动到另一边的次数;每组统计15枚

42Numberofspontaneoustailmovementsperminute

perembryo;15embryoswerescoredpergroup

60、72

累积孵化胚胎数/总卵数

Cumulativehatchedembryos/totalnumberofembryos

解剖镜下测量体长,每组统计15尾

132Measurementofbodylengthunderdissectingmicroscope,

with15individualspergroup

132

132

畸形仔鱼数/存活仔鱼总数

Umberofmalformedlarvae/totalnumberofsurvivinglarvae

累计死亡数/总卵数

Cumulativemortality/totalnumberofembryos

解剖镜下测量仔鱼卵黄囊面积,每组统计15尾

132Measurementofyolksacareainlarvaeunderdissecting

microscope,with15individualspergroup

表2　内参基因和目的基因引物信息

Table2　Primerinformationofinternalreferencegenesandtargetgenes

名称

Name

序列5’~3’

Sequence5’~3’

GGCAAGAATCATGCTGGTCCTA

TCGTCAGCCTTCTCGTGGAT

AACGGCTACGGCTCTCACA

CGCTCTGCCTCCTCTACCAA

ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAA

AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGG

GenBank登录号

GenBankaccessionno.

EF681883.1

sod

-F

sod

-R

cat

-F

cat

-R

β-

actin

-F

β-

actin

-R

XM_020079314.1

XM_020109620.1

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第2期

崔庆奎等:短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应　57

图1　短链氯化石蜡(SCCPs)对褐牙鲆胚胎化率和自主运动的影响

注:(a)各组60hpf和72hpf的孵化率;(b)各组胚胎42hpf自主运动情况;*代表示实验组与

对照组间

P

<0.05,**代表

P

<0.01,***

P

<0.001;下同

Fig.1　Theeffectofshortchainchlorinatedparaffins(SCCPs)onembryohatchingrateandautonomousmovement

Note:(a)Hatchingrateofembryosat60hpfand72hpf;(b)Autonomousmovementofembryosat42hpf;asterisksdenote

significantdifferencebetweentreatmentsandcontrol,*

P

<0.05,**

P

<0.01,***

P

<0.01;thesamebelow.

图2　SCCPs诱导褐牙鲆胚胎-仔鱼产生的畸形类型

注:(a)、(b)、(c)和(d)为对照组36hpf、48hpf、72hpf和108hpf的胚胎或仔鱼;(e)、(i)分别为实验组84hpf、108hpf未孵化出膜的胚胎(HF);

(f)为实验组48hpf卵黄囊水肿(YSE)的仔鱼;(g)、(h)分别为实验组96hpf、108hpf脊柱弯曲(SC)、鳍膜损伤(FD)的仔鱼;

(j)为实验组60hpf仔鱼(YSE、FD);(k)、(l)为实验组108hpf心包水肿(PE)、SC和YSE的仔鱼。

Fig.2　TypesofmalformationsinducedbySCCPsinthe

Paralichthysolivaceus

embryos

Note:(a),(b),(c),(d)Thecontrolgroupembryosat24,48,72and96hpf,respectively;(e),(i)Hatchfailure(HF)embryosinthe

treatmentsat84hpf,108hpf,respectively;(f)Embryowithyolksacedema(YSE)at48hpf;(g),(h)Larvae

withspinalcurvature(SC),finmembranedamage(FD)inthetreatmentsat96hpf,108hpf,respectively;(j)LarvaewithYSE

andFDinthetreatmentsat60hpf;(k),(l)Larvaewithpericardialedema(PE),SCandYSEinthetreatmentsat108hpf.

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　58

生态毒理学报第18卷

2.2　SCCPs对褐牙鲆胚胎致畸、致死作用

著差异(

P

<0.05),其他各浓度实验组则与对照无显

著差异(

P

>0.05)。可见随着暴露浓度增加,存活率

逐渐下降,表现出剂量效应。随着暴露时间增长,

各实验组存活率逐渐降低,尤其是96~132h高浓

度实验组(100、1000和10000μg·L

-

1

组)仔鱼的

存活率急速下降,时间效应明显。此外,通过

Probit模型估算的SCCPs对褐牙鲆胚胎132h-LC

50

2.3　SCCPs对胚胎-仔鱼生长和卵黄吸收的影响

为49743.34μg·L

-

1

。

研究发现SCCPs对褐牙鲆胚胎具有致畸作用,

100、1000和10000μg·L

-

1

组的畸形率分别为(8.2±

1.3)%、(10.6±4.3)%和(14.1±2.7)%,与对照组(3.8±

1.4)%均有显著差异(

P

<0.05),但0.1、1和10μg·L

-

1

且存在明显的剂量效应。如图3(a)所示,120hpf时

各组与对照组相比差异不显著(

P

>0.05)。在畸形个

体中,畸形类型主要为脊柱弯曲(图2(g)、图2(h)、图2

(k)、图2(l))、卵黄囊水肿(图2(f)、图2(j)、图2(l))、心包

水肿(图2(k)、图2(l))、鳍膜损伤(图2(g)、图2(h)、图2

(j)),同时发现随着暴露时间延长,畸形个体一般会同

时表现出多种畸形类型,其中水肿现象较为普遍。

各组存活率的统计结果如图3(b)所示,在实验

100、1000和10000μg·L

-

1

组的分别为(68.7±

结束时(132hpf),对照组存活率为(78.3±2.1)%,而

2.9)%、(58.7±5.7)%和(52.3±2.8)%,与对照组均有显

实验中SCCPs对褐牙鲆仔鱼表现出了生长抑

制作用,如图4(a)所示,实验结束时(132hpf)对照组

仔鱼体长为(34.0±2.9)mm,高于各浓度的实验组,

并与1、10、100、1000和10000μg·L

-

1

组差异显著

(

P

<0.05)。如图4(b)所示,实验结束时(132hpf)对照

组卵黄囊面积要大于各实验组,且与各实验组均有

显著差异(

P

<0.05)。

图3　SCCPs对褐牙鲆胚胎-仔鱼畸形率和存活率的影响

Fig.3　EffectofSCCPsonembryonicmalformationandsurvivalrateof

Paralichthysolivaceus

图4　SCCPs对褐牙鲆胚胎-仔鱼体长和卵黄囊面积的影响

Fig.4　EffectofSCCPsonlarvaebodylengthandyolksacareain

Paralichthysolivaceus

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第2期

崔庆奎等:短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应　59

2.4　SCCPs对仔鱼抗氧化系统的影响

SCCPs对褐牙鲆抗氧化酶SOD、CAT的活性及

(0.78±0.09)U·mg

-

1

和(0.73±0.19)U·mg

-

1

。仔鱼

脂质过氧化产物MDA含量的影响如图5和图6所

示。与对照组相比,SCCPs诱导了褐牙鲆仔鱼SOD

活性增加,其中1μg·L

-

1

组的SOD活性为(95.53±

3.32)U·mg

-

1

,较对照组显著增加了192.3%(

P

<

mg

-

1

,较对照组显著增加了65.53%(

P

<0.05);10000

CAT活性也高于对照组(0.42±0.09)U·mg

-

1

,1、100

0.05);100μg·L

-

1

组的SOD活性为(54.10±8.52)U·

μg·L

-

1

组的SOD活性为(40.12±3.06)U·mg

-

1

,较对

照组显著增加了22.8%(

P

<0.05)。同样,实验组

和10000μg·L

-

1

组分别为(1.27±0.30)U·mg

-

1

、

sod

、

cat

基因表达情况如图5(b)、5(d)所示,各实验组

两基因的表达量均高于对照组,且随着实验浓度增

加,基因表达情况有所抑制,这一规律也与抗氧化酶

活力的变化相对应。

对于MDA而言,本研究中1μg·L

-

1

组MDA含

量为(13.32±0.24)nmol·mg

-

1

,100μg·L

-

1

为(12.95±

1.79)nmol·mg

-

1

,10000μg·L

-

1

组为(25.61±0.12)

nmol·mg

-

1

,均显著高于对照组的(8.86±1.44)nmol·

mg

-

1

(

P

<0.05),特别是10000μg·L

-

1

组,MDA含量

接近于对照组的3倍,表明机体已发生了严重的氧

化应激反应。

图5　SCCPs诱导褐牙鲆仔鱼产生的氧化应激

Fig.5　SCCPsinducedoxidativestressin

Paralichthysolivaceus

3　讨论(Discussion)

SCCPs暴露会引起胚胎孵化延迟,高浓度胁迫

时还会导致孵化率降低,如图1(a)所示。这一现象

在斑马鱼中也有报道

[21

-

22]

,但对其他水生生物孵化

的影响还需要进一步研究。孵化是鱼类早期发育阶

段的重要一环,一般包括2个过程,一是孵化腺分泌

孵化酶、绒毛膜酶,引起卵膜膨胀、降解

[26

-

27]

,二是胚

胎机械运动使卵膜破裂

[28

-

29]

。本研究中发现SCCPs

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　60

生态毒理学报第18卷

能够影响褐牙鲆胚胎的孵化,这与以上过程可能有

关,遗憾的是本研究并没有对孵化酶进行研究。但

关于胚胎的机械运动,我们发现在42h时1、1000

和10000μg·L

-

1

组胚胎的自主运动次数要低于对

照组(图1(b)),均在4次·min

-

1

以下,由于这些胚胎

自主运动的强度减弱,很难突破卵膜,使得实验组

60hpf的孵化率低于对照组,表现出孵化延迟的现

象。而对于高浓度组出现胚胎出膜困难的现象,一

方面可能是SCCPs抑制了胚胎的自主运动,使得胚

胎出膜困难;另一方面可能是由于SCCPs具有亲脂

性,大量附着在卵膜表面,呈现出颗粒状态(图2(e)、

图2(i)),阻塞了气孔造成胚胎缺氧

[30]

;早期研究,缺

氧能够抑制胚胎发育,导致孵化延迟或死亡

[31]

。

发育畸形

[20,22,33

-

34]

。本研究发现SCCPs对褐牙鲆胚

胎同样具有致畸作用,且存在明显的剂量效应。Liu

等

[20]

研究发现,SCCPs对斑马鱼胚胎发育毒性也具

有低浓度致畸作用不明显、高浓度致畸作用显著的

规律。值得注意的是,在畸形类型中水肿发生率较

高,污染物导致鱼类水肿的发生可能与膜的通透性

有关

[35]

。MDA作为脂质过氧化物,其含量能够反

映生物膜受损程度,研究中观察到实验组仔鱼MDA

含量显著高于对照组(图6),表明仔鱼体内生物膜发

生了严重的脂质过氧化作用,生物膜结构和功能的

实验组大量水肿个体产生。此外,在实验结束时存

活仔鱼中畸形个体仍占有一定量比例,对于畸形胚

胎而言大多数最终会走向死亡

[23]

,存活率会进一步

降低。

体长是衡量仔鱼生长发育状况最直观的指标。

由于整个实验过程处于内源性营养阶段,卵黄提供

了胚胎生长发育所需的所有能量,卵黄囊面积在一

定程度上能够反映胚胎-仔鱼能量利用的情况。我

们结合体长规律发现,实验组胚胎-仔鱼消耗的能量

多反而生长较慢(图4),这一现象在斑马鱼胚胎中也

有发现

[20]

,这可能是由于胚胎-仔鱼面临SCCPs的

给生长的能量减少,因而生长缓慢。

毒性胁迫,消耗了大量的能量用于解毒

[37]

,导致分配

正常情况下,机体内ROS处于动态平衡状态,

损伤势必会影响其功能,改变通透性

[36]

,最终导致了

诸多研究表明,环境污染物能够导致鱼类胚胎

图6　SCCPs诱导褐牙鲆仔鱼产生的丙二醛(MDA)

Fig.6　SCCPsinducedmalonaldehyde(MDA)

in

Paralichthysolivaceus

当受到污染物胁迫致使ROS积累时,机体的抗氧化

系统会发挥作用,维持ROS代谢平衡,避免细胞遭

受氧化损伤,影响组织、器官的功能。SOD和CAT

是机体抗氧化防御系统的第一道防线

[38]

,ROS过量

-

时会诱导其活性增加,SOD能够催化O

2

·生成毒性

　　SCCPs对褐牙鲆胚胎-仔鱼具有明显致死作用,

这在非洲爪蟾

[18]

、虹鳟鱼

[19]

和斑马鱼

[20]

中均有报

道。本实验中观察到SCCPs对褐牙鲆胚胎132h的

LC

50

为49743.34μg·L

-

1

,而刘丽华等

[21]

发现SC-

-

1

较低的H

2

O

2

,而CAT负责催化H

2

O

2

分解成H

2

O

和O

2

[39]

,因此,SOD和CAT的活性能够间接反映机

体的氧化损伤情况,也被广泛地用于评价污染物的

毒性效应中

[40

-

42]

。本研究中褐牙鲆仔鱼SOD、CAT

活性及

sod

、

cat

基因的表达情况均显著高于对照组,

表明SCCPs诱导机体发生了氧化应激反应,进而导

致细胞损伤、凋亡,最终影响着生物体的代谢和免疫

调节等

[43]

。研究发现,青鳉鱼幼鱼

[44]

、热带爪蛙胚

胎

[45]

随着SCCPs暴露浓度的增加,机体SOD、CAT

都呈下降趋势。原因可能是低浓度处理时,仔鱼产

生适应性反应,通过提升抗氧化酶活性来消除

ROS,保护机体免受氧化损伤;但随着SCCPs暴露

CPs对斑马鱼胚胎96h的LC

50

为1~10mg·L

,

Fisk等

[32]

在日本青鳉鱼(

Oryziaslatipes

)胚胎中发现

其LC

50

值2.7~9.6mg·L

-

1

,相比较均低于本实验观

察到的结果,这可能是物种耐受性不同引起的。值

得注意的是Ren等

[22]

同样采用斑马鱼作为受试动

物,在13d的慢性毒性实验中发现SCCPs的LC

50

低至34.4μg·L

-

1

,可见暴露时间越长,其水生生物

毒性越大,特别是对水生生物长期暴露的影响还需

进一步深入研究。

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第2期

崔庆奎等:短链氯化石蜡对褐牙鲆胚胎发育的毒性效应

International,2021,28(8):9020-9028

　61

浓度增加,机体产生的ROS大量积累,超过了抗氧

化防御系统清除能力,过量ROS损伤抗氧化系统,

此外,由于MDA依赖于SOD进行清除,随着SC-

致使抗氧化酶活性下降、相关抗氧化酶基因下调

[46]

。

CPs浓度增加,SOD的活性逐渐下降,使得体内

MDA含量增加,实验中SOD和MDA的变化规律

也对应了起来。综上所述,我们认为SCCPs引起的

氧化应激可能是导致褐牙鲆胚胎-仔鱼发育异常(畸

形、死亡等)的主要原因,而这种氧化损伤即使在环

境浓度(1μg·L

)下也会存在,结合其他毒性终点观

察到的结果,我们认为短期环境浓度的SCCPs胁迫

虽未导致鱼类存活率显著下降,但对鱼类的正常发

育已产生影响。长期来看,这种影响可能会打破近

海生态系统的稳定,导致鱼类资源量进一步下降。

通信作者简介:徐英江(1979—),男,硕士,研究员,主要研究

方向为生态毒理学。

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