2024年5月16日发(作者：柏小蕊)
2021
年
3
月
湖南师范大学自然科学学报
Journal
of
Natural
Science
of
Hunan
Normal
University
Vol.44
No.2
第
44
卷
第
2
期
Mar.
,
2021
DOI
：
10T612/j4ssnT096T281.2021.02.007
先天性心脏病突变体小鼠模型的建立
尹梓豪
a
,
孙一兵
a
,
向寿莲
a
，
张健
a
，
丁小凤
a
,
李立民
b
*
*
(
湖南师范大学
a
生命科学学院
；
b.
工程设计学院
，
中国长沙
410081
)
摘
要
为研究
AP-2
%
在发育过程中的特定调控作用
，
利用
AP-2a-LacZ
转基因小鼠
FX18
研究
AP-2
%
与先天
性心脏病的相关性
。
在
FX18
小鼠繁殖过程中，
发现该小鼠稳定遗传的突变体,鉴定其基因型
，
测量体质量与心脏
质量,
HE
染色和心电图观察其表型和检测心脏功能
。
研究结果表明
：突变体小鼠在出生后
4
周左右即死亡
，
且在
胚胎期就表现出明显的发育迟缓
，
出生后的体质量和心脏质量均仅为正常
FX18
小鼠的
40%~60%
，
同时,
HE
染色
和心电图检测结果显示
，
小鼠表现出较明显的左心室肥大和室性早搏
，
符合先天性心脏病中动脉导管未闭的特征
。
因此，
成功发现和建立的该突变体小鼠可作为一个较好的研究先天性心脏病小鼠模型
。
关键词
转基因小鼠
FX18
；
AP-2
a
；
突变体小鼠;先天性心脏病
中图分类号
R541.1
；
R-332
文献标识码
A
文章编号
2096-5281
(
2021
)
02-0048-06
Generetion
ot
Congenital
Heart
Disease
Mutant
Mouse
Model
YIN
Zi-Uao"
，
SUN
Yi-bing"
，
XIANG
Shou-Uan"
，
ZHANG
a
，
DING
Xiao-feng"
，
LI
Li-min
*
(
of
Life
Sciences
；
b.
College
of
Engineering
and
Design
，
Hunan
Normal
University
，
Changsha
410081
，
China
)
Abstract
To
study
the
speciPc
regulatore
role
of
AP-2%
duing
development
，
AP-2%-CacZ
transoenic
mica
FX18
were
obtained
to
investigate
the
cafelation
between
AP-2%
and
congenital
heai
disease.
Duing
the
reproduc
tion
of
FX18
mica
,
stable
genetic
mutants
were
found.
FX18
mica
were
genotyped.
Mouse
body
weight
and
heart
weight
were
measured
-
Their
phenotypes
were
observed
by
HE
staining
,
and
electrocardioaram
was
performed
to
ex
amine
the
heai
function.
Our
results
revealed
that
mutant
mica
died
about
4
weeks
after
birth
and
showed
signifi
cant
developmental
retardation
at
the
embryonic
stage.
Both
postnatal
body
weight
and
heai
weight
of
mutant
mica
were
only
40%
—
60%
of
normal
FX18
mice.
At
the
same
1
—
,
the
results
of
HE
staining
and
electrocardioaram
indicated
that
the
mica
had
obvious
left
vvntPcular
hypeirophy
and
vvntPcular
premature
beat
,
which
were
char-
acteistics
of
patent
ductus
aieiosus
in
congenital
heart
disease.
Therefore
,
in
this
work
,
we
successfully
inenp-
fied
and
established
this
mutant
mouse
,
which
could
serve
as
a
better
model
for
studying
congenital
heart
disease
on
moce.
Key
wordt
FX18
transeenic
mica
；
AP-2
%
；
mutant
mica
；
congenpal
heart
disease
先天性心脏病
(
congenital
heart
disease
,
CHD)
是小儿最常见的心脏病
，
多出现因胚胎发育早期心脏及
大血管的形成障碍引起的局部结构异常
，
或出生后心脏应自动关闭的通道未能闭合
。
先天性心脏病通常根
据左右两侧及大血管之间的分流情况分为左向右分流型
(
潜伏青紫型
，
主要类型有室间隔缺损
VSD
、
房间隔
缺损
ASD
和动脉导管未闭
PDA
)
、
右向左分流型
(
青紫型
，
主要类型为法洛四联症
TOF
和完全性大动脉转位
收稿日期
：
2020-09-10
基金项目
:
国家自然科学基金项目(
81872256
);湖南省教育厅重点项目
(
19A310
)
*
通信作者
:
cityulilimin@
hotmail.
com
第
2
期
尹梓豪等
:
先天性心脏病突变体小鼠模型的建立
49
TGA
）
、
无分流型
（
无青紫型
，
主要类型为肺动脉狭窄
PS
）
三大类
［
1
］
，
是具有严重危害的先天畸形
，
且可有两
种以上畸形并存
。
先天性心脏病的相关影响因素比较复杂
，
目前尚未完全明确其确切的病因
，
但大多数研究
认为先天性心脏病是由遗传
［
2
］
与环境因素⑶共同作用而引起的
,
其中遗传因素包括基因异常和染色体异常
等
［
4
,
5
］
o
在母亲妊娠的早期尤为关键
，
其中孕期营养不足
、
妊娠早期服用药物或者妊娠早期病毒感染等⑷因
素都可能会造成小儿先天性心脏病
。
AP-2
家族包括
AP-2
%
,
AP-2
0
,
AP-2
）
,
AP-2d
和
AP-2v
,
是一类分子量为
52
000
的转录因子
，
有其独
特的蛋白质结构
，其
N
端是富含脯氨酸和谷氨酸的转录激活域
，
中间是
DNA
结合结构域
,
C
端的
helo
span
helio
结构可以形成二聚体
［
7,8］
O
AP-2
基因家族在脊椎动物的胚胎发育过程中起重要的调控作
用
［
9
］
，
有研究表明
Tfap2a
在发育的小鼠胚胎中显著表达
［
10
］
，
缺乏转录因子
Tfap2a
的小鼠胚胎可以存活下
来
，
但
Tfap2a
基因缺失的小鼠可能存在神经管
、
肢体间充质细胞
、
颅面部发育障碍
,
严重时使小鼠在围产
期由于无脑畸形
、
心脏形态异常且发育迟缓
、
脏器缺陷
、
体壁缺乏等严重畸形而死亡
［11,12
］
,
体现了
AP-2
%
在胚胎发育中的重要作用
。
笔者在利用基因打靶构建的
AP-2
%
QacZ
转基因小鼠
FX18
［
13
］
的基础上
，
继续
繁殖该小鼠
，
偶然发现了该转基因小鼠的一种突变体
，
此小鼠突变体心脏发育异常
，
为研究提供了一种先
天性心脏病小鼠模型
。
1
材料与方法
1.1
材料
FX18
小鼠由实验室构建
，
琼脂糖购于
Invitrogen
公司
。
DNA
上样缓冲液
，
DNA
Marker
购于
Thermo
公
司
；
二甲苯
，
多聚甲醛,
20xPBS
，
漠化乙锭
,
Tween-20
,
EDTA
,
SDS
,
NaCl
,
NaOH
及蛋白酶
K
等均购于上海生工
公司
;
其它常规试剂均为国产分析纯
。
心电图仪单导程全自动
ECG-11A
型购自广东东江电子仪器厂
，
频响
范围为
0~90
H
z
,
纸速为
50
mm-s-
1
，
自制针状电极
。
恒温烘箱购自上海精宏实验设备有限公司
。
病理切片
机
RM2016
购自上海
！
卡仪器有限公司
。
1.2
方法
1.2.1
小鼠的饲养与繁殖
将已构建的
FX18
小鼠置于
SPF
级动物房饲养
，
鼠房内温度控制在
18-26
U
,
光照控制为
12/12
,
饲养笼盒
、
饮水瓶
、
垫料
、
各种实验用具和衣服采用高压蒸汽灭菌器消毒
，
小鼠饲料采取
紫外消毒
，
进入动物房内的实验物品通过紫外消毒经传递窗单向传入
。
将雄性小鼠和雌性小鼠以
1
：
2
的比
例进行交配繁殖
。
所有实验经过湖南师范大学动物伦理委员会许可
。
1.2.2
转基因小鼠的鉴定
将通过基因打靶和显微注射已经建立的
FX18
转基因小鼠
,
生长至
3
周
,
剪取约
0.5
cm
小鼠尾巴
，
提取基因组
DNA
,
提取后的基因组
DNA
使用正向引物
LacZ-F1
（
5
'
-TACAACGTCGTGACT-
GGGAA-3
'
）
和反向引物
LacZ-R1
（
5
'
-CCAGATAACTGCCGTCACTC-3
'
）
进行
PCR
扩增
，
PCR
条件为预变性
94
u
,
1
min
20
S
,
再经
94
u
45
s
,
60
°C
45
s
,
72
U
2
mi
,
32
个循环
;
然后
72
°C
延伸
10
min
。
最后得到
PCR
产物片段大小为
562
bp
。
123
小鼠胚胎与心脏的包埋
、
切片和
HE
染色
包埋切片
:
分别取一窝
E13.5
小鼠整个胚胎和
4
周龄小鼠
的整个心脏
，
置于预先配好的固定液
（
4%
多聚甲醛
）
中于
4
U
下固定
24
h
。
将组织块放入烧杯中
，
流水冲洗
24
h
,
不要让组织块沉积在烧杯底部
。
按
50
%
乙醇
1
h
,
70%
乙醇
2
h
,
80%
乙醇
2
h
,
95%
乙醇
2
h
,
95%
乙醇
2
h
,
无水乙醇
2h
,
无水乙醇
2
h
对组织块进行梯度脱水
。
将组织块转入无水乙醇与二甲苯等体积混合的溶液
中处理
30
min
,
再将组织块浸泡在二甲苯中
30
min
,
使组织块透明
。
融化石蜡
，
置于
60
U
烘箱
。
配置二甲苯
与石蜡等体积混合液
，
处理组织块
30
min
,
将处理后的组织块放入融化后的石蜡进行包埋
。
使用切片机对包
埋后的组织块进行切片
。
HE
染色
:
依次将切片放入二甲苯
15
min
两次
，
无水乙醇
5
min
两次
,
85%
酒精
5
min
,
75%
酒精
5
min
,
蒸
馏水洗
，
放入苏木精水溶液中染色
5
min
后
,
依次入
1%
盐酸乙醇
30
s
,
流水冲洗
30
s
,
蒸馏水冲洗
5
s
。
置于
0.5%
酒精伊红染色液染色
1~3
min
,
蒸馏水洗
30
s
,
75%
酒精
5
min
,
85%
酒精
5
min
,
无水乙醇
5
min
两次，
再
经二甲苯
15
min
两次使切片透明
。
将已透明的切片滴上加拿大树胶
（
国药集团化学试剂有限公司
）
，
盖上盖
玻片封片固定
。
50
湖南师范大学自然科学学报第
44
卷
1.2.4
小鼠心电图的检测
使用
4%
的水合氯醛按
04
mL/10g
体质量的剂量麻醉
3~4
周龄小鼠
，
电极连线
分为红色
（
R
）
右上肢
、
黄色
（
L
）
左上肢
、
黑色
（
RF
）
右下肢
、
绿色
（
LF
）
左下肢
，
将针电极分别刺入其四肢皮下
,
记录标准导联和单极加压肢体导联的心电图
。
1-2.5
数据统计与分析
采用
Graph
Pad
Pvsm7
软件
，
计量资料用"土
s
表示
。
两组间比较采用
t
检验
。
%
<
0.05
为有差异统计学意义
。
2
结果
2.1
FX18
突变体小鼠体质量和心脏质量明显减少
，
且在
4
周龄左右死亡
为了研究
AP-2
%
在发育过程中特定的调控作用
，
笔者通过基因打靶和显微注射获得了
FX18
转基因小
鼠
,
并提取
3
周龄小鼠尾巴基因组
，
使用
PCR
鉴定
,
获得了
562
bp
的
LacZ
条带
,
证明该转基因小鼠构建成功
（
图
1a
）
[
13
]
o
在
FX18
小鼠繁殖过程中发现了
FX18
小鼠的突变体
，
与正常小鼠相比
，
FX18
突变体小鼠明显发育迟缓
，
非常瘦小
,
体型较
同胎的正常或杂合子小鼠偏小
40%~60%
,
并
在
4
周龄左右时死亡
,
而正常小鼠和
FX18
杂
合子小鼠外形和大小无差别
（
图
1b
）
。
突变体
小鼠的体质量和心脏质量均为同胎出生的正
AP-2a
genomic
9(FX18)
20
kb
■
3.5 kb
LacZ
561
bp
24
kb
4
kb
常或杂合子
FX18
小鼠
40%~60%
（
图
1c
,
d
）
,
这说明突变体小鼠的发育受到了严重的影
响
，
而心脏质量的异常提示
FX18
突变体小鼠
可能与心脏结构异常及功能障碍有关
。
black
boxes:
exons
Gray
boxes:
5'
and
3
'untranslated
regions
20
kb
of
genomic
sequences
5'
to
the
start
site
of
human
AP-2alpha
24
kb
of
genomic
DNA
extending
downstream
from
exon
five
of
human
AP-2alplia
2.2
FX18
突变体小鼠
E13.5
胚胎发育异常
为了研究
FX18
突变体小鼠和杂合子小
鼠的发育缺陷
，
将雌性
FX18
杂合子小鼠与雄
性
FX18
杂合子小鼠按
2
：
1
的比例合笼
，
下午
5
点交配
，
第二天上午
9
点左右检查精栓
，
若
发现阴栓则定为
E0.5
天
,
然后于
E13.5
天颈
椎脱臼法处死孕鼠
,
剖腹暴露子宫
，
在体视显
+/+
or
+/-
微镜下解剖
，
获取
E13.5
天的全部胚胎
。
观察
胚胎形态
，
发现
2
号胚胎较其它胚胎体型小
，
胚胎整体偏白色
，
结构模糊不清
，
发育滞后
（
图
2a
）
，
该胚胎的尾椎不完全
,
并没有出现明
显的手指分化
，
发育比正常胚胎延迟
2
天左
右
，
心脏形态发育不明显
。
3
号和
4
号胚胎则
表现为颅骨裂的严重神经管缺陷
，
头部异常
图
1
FX18
转基因小鼠的构建和突变体小鼠的发现
！
a
)
FX18
小鼠
的构建策略
)(
b
)
亲本小鼠
(
空心箭头
)
与突变体小鼠
(
实心
形态
,
躯干大小缩小
，
心脏形态异常
。
提取胚
胎组织基因组
DNA
,
证明
2
号胚胎的基因型
为
-/-
,
3
号和
4
号胚胎的基因型为
+/-
,
其余
箭头
)
体型图
)(
i
正常小鼠与突变体小鼠的体质量比较
)
(
d)
正常小鼠与突变体小鼠心脏质量的比较
Fig.
1
ConstmcZon
cf
FX1
8
transoenic
mice
and
disccverg
V
mutanf
mice
(
a
)
正常胚胎均为
+/+
。
这些结果提示
FX18
突变
体小鼠在胚胎时期出现了发育落后
、
尾椎发
ConstmcZon
strategy
cf
FX18
mice
；
(
b)
Figums
cf
Wild-type
and
mutanf
mice
,
parenf
mice
(
hollow
arrow)
and
muWnf
mice
(
solid
arrcv)
；
(
c)
育不全
、
手指分化不明显且体积偏小
、
心脏形
态异常的现象
。
Weigh-
comparison
cf
Wiiy-type
and
muWnf
mice
；
(
d
)
Cardiac
weigh
comparison
cf
Wild-Wpe
and
mutanf
mice
第
2
期
尹梓豪等
:
先天性心脏病突变体小鼠模型的建立
51
8
000
5
000
3
000
2
000
Ht:Heart
Li:
Liver
In:
Intestine
So:Somite
Mb:Midbrain
Hb:Hindbrain
Lu:
Lung
图
2
FX18
突变型小鼠胚胎的观察和鉴定
（
a
）
正常小鼠
、
杂合子小鼠与
2
号突变体小鼠胚胎的对比
；
（
b
）
正
常小鼠与
FX18
突变体小鼠的基因型鉴定
Fig.
2
Observation
and
identification
of
FX18
mutant
mice
embryos
（
a
）
Comparison
of
Wild-type
and
No.
2
mutant
mouse
embryC
os
；
（
b
）
Genotypic
identification
of
Wild-type
mice
and
FX18
mutant
mice
2.3
突变体小鼠室性早搏且伴有左心室肥厚
对
3~4
周龄的正常小鼠和突变体小鼠分别进行心电图检测
，
如图
3
所示
,
正常小鼠的心电图为窦性心
律
,
P
波波形
aVR
导联为倒置
,
其余为直立
。
QRS
波除
aVR
主波向下
，
其余导联呈
Qrs
,
qR
,
qRs
,
Rs
和
rS
等
,
无明显
ST
段
。
P
波
、
QRS
波的时间
、
振幅等均与文献
［
14
］
中报道的类似
。
与之对比
，
突变体小鼠
（
FX18
--
）
的心电图中
,
aVR
导联的
P
波与
QRS
主波出现了正置
，
且
QRS
波群提前发生
，
宽大畸形
，
为完全性代偿间
歇
，
属于较典型的室性早搏
，
同时
QRS
波群电压较正常小鼠有显著增高
。
观察小鼠的心脏纵切片发现
，
突变
体小鼠的左心室肥厚
，
为正常小鼠厚度的
3~4
倍
;
横切片显示突变体小鼠的左心室室腔变小
，
约为正常小鼠
容积的
1/4
,
提示突变体小鼠发生了先天性心脏疾病
。
+/+
(b)
I
_
Ml
图
3
正常小鼠
（
a
,c
）
和突变体小鼠
（
b
,
d
）
的心电图及心脏切片
Fig.
3
(
a)
Electrocardiogram
of
Wild-type
mice
#
(
b)
Electroca^dioT
a
m
of
mutant
mice,
indicative
abnormal
waves
(
box)
,
(
c)
Heart
sections
of
WildCype
mice
,
(
d)
Heart
sections
cf
mutant
mice
,
ventPculci
hypertrophy
(
arrow)
and
ventPculci
cavity
ntrowing
(
asterisk
)
52
湖南师范大学自然科学学报
第
44
卷
3
讨论
先天性心脏病的最常见临床类型包括房室间隔缺损
(
AVSD
)
、
大动脉易位
(
dTGA
)、
圆锥动脉干畸形
(
CTD
)
、
法洛四联症
!
TOF
)
、
动脉导管未闭
(
PDA
)
等
，
而这些常见的临床类型大多有相应的易感基因
+
15
朋
。
AP-2
基因家族是人类发现的第一个与动脉导管未闭相关的遗传基因
。
之前的研究表明
，
神经嵴细胞对心脑
血管疾病的发生起了重要的作用
,
动脉导管未闭
(
PDA
)
可能是神经嵴细胞发育异常的结果
,
而该基因家族
在神经外胚层衍生细胞的分化中也扮演着重要的角色
,
尤其是
AP-2
0
在胚胎发育的过程中与神经嵴细胞表
达的位置一致
，
且该基因的突变以显性负调控机制的方式改变神经嵴细胞的迁移和分化
+25]
，
进而可能在导
管中产生异常
，
来诱发动脉导管未闭
[26]
'
AP-2
0
基因缺失也可能会导致内皮素
-
及
Hif2a
在动脉导管平滑
肌水平表达缺失
，
影响平滑肌层组织的特异性发育
，
从而导致动脉导管未闭合
。
同时
,
AP-2
0
可以刺激某些
影响神经嵴细胞发育的基因信号通路中断
，
从而在胚胎期导致最终会发育为动脉导管的第
6
主动脉弓发育
异常
+
27]
O
因此
,
AP-2
0
的突变或表达量降低可能影响了动脉导管未闭
。
本研究构建的
FX18
转基因小鼠
，
是通过基因打靶构建的
AP-2
%
报告基因小鼠
，
在繁殖过程中出现了突
变体
，
可能由于基因打靶的非特异性引起某功能基因突变从而出现了异常小鼠表型
。
笔者研究发现突变体
小鼠的心脏有明显的左心室肥厚
。
左心室肥厚是动脉导管未闭的症状之一
，
也是引发左心室流出道阻塞的
危险因素之一
+2
讥有研究表明
,
AP-2
%
在胚胎发育和心脏发育中起重要作用
,
AP-2
%
可能通过参与咽下区
神经嵴与周围组织的相互作用
，
促进正常心脏流出道形态发生
。
AP-2
%
缺陷的小鼠胚胎中出现明显的心脏
流出道发育畸形
[29]
，
故突变体小鼠可能是
AP-2
%
基因出现了错义突变
。
由于
AP-2
0
在胚胎发育的过程中
与神经嵴细胞表达的位置一致
，
对神经嵴细胞的迁移分化产生了影响
+
25]
，
并且突变小鼠的表型符合动脉导
管未闭的特征
，
暗示该突变也可能影响了
AP-2
%
与
AP-2
0
之间的异源二聚体相互作用
。
该突变体小鼠的详
细作用机理
、
可能的突变基因或者其它先天性心脏病易感基因之间的相互影响等尚有待进一步研究
。
总之
，
笔者发现了一类突变体小鼠
,
该小鼠从胚胎阶段即出现了明显的发育滞后和心脏异常
，
其与先天
性心脏病之间可能存在重要关联
，
其详细的调控机制还有待后续进行深入研究
。
本研究也说明
FX18
转基
因小鼠的突变体具有先天性心脏病研究小鼠模型的潜力
。
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J
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P
M
,
HEBERT
J
M
,
&t
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Transcription
factor
AP-2
is
expressed
in
neural
crest
cell
lineaecs
dur
第
2
期
尹梓豪等
:
先天性心脏病突变体小鼠模型的建立
ing
mouse
embryogenesis
[
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Genes
Dev
,
1991
,
5
(
1
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53
+
11
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KOUSA
Y
A
,
ZHU
H
,
FAKHOURI
W
D
,
ee
al
The
TFAP2A-IRF6-GRHL3
genetic
pathway
is
conserved
in
neurulation
f
J
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Moi
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10
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12
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ZHANG
J
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HAGOPIDN-DONALDSON
S
,
SERBEDZIJA
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tube
,
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and
body
wall
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transcripPon
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isolated
patent
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arteriosus
suggests
hapdinsu
伍
ciency
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successfully
treated
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（
编辑
WJ
）
2024年5月16日发(作者：柏小蕊)
2021
年
3
月
湖南师范大学自然科学学报
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Science
of
Hunan
Normal
University
Vol.44
No.2
第
44
卷
第
2
期
Mar.
,
2021
DOI
：
10T612/j4ssnT096T281.2021.02.007
先天性心脏病突变体小鼠模型的建立
尹梓豪
a
,
孙一兵
a
,
向寿莲
a
，
张健
a
，
丁小凤
a
,
李立民
b
*
*
(
湖南师范大学
a
生命科学学院
；
b.
工程设计学院
，
中国长沙
410081
)
摘
要
为研究
AP-2
%
在发育过程中的特定调控作用
，
利用
AP-2a-LacZ
转基因小鼠
FX18
研究
AP-2
%
与先天
性心脏病的相关性
。
在
FX18
小鼠繁殖过程中，
发现该小鼠稳定遗传的突变体,鉴定其基因型
，
测量体质量与心脏
质量,
HE
染色和心电图观察其表型和检测心脏功能
。
研究结果表明
：突变体小鼠在出生后
4
周左右即死亡
，
且在
胚胎期就表现出明显的发育迟缓
，
出生后的体质量和心脏质量均仅为正常
FX18
小鼠的
40%~60%
，
同时,
HE
染色
和心电图检测结果显示
，
小鼠表现出较明显的左心室肥大和室性早搏
，
符合先天性心脏病中动脉导管未闭的特征
。
因此，
成功发现和建立的该突变体小鼠可作为一个较好的研究先天性心脏病小鼠模型
。
关键词
转基因小鼠
FX18
；
AP-2
a
；
突变体小鼠;先天性心脏病
中图分类号
R541.1
；
R-332
文献标识码
A
文章编号
2096-5281
(
2021
)
02-0048-06
Generetion
ot
Congenital
Heart
Disease
Mutant
Mouse
Model
YIN
Zi-Uao"
，
SUN
Yi-bing"
，
XIANG
Shou-Uan"
，
ZHANG
a
，
DING
Xiao-feng"
，
LI
Li-min
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(
of
Life
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；
b.
College
of
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Design
，
Hunan
Normal
University
，
Changsha
410081
，
China
)
Abstract
To
study
the
speciPc
regulatore
role
of
AP-2%
duing
development
，
AP-2%-CacZ
transoenic
mica
FX18
were
obtained
to
investigate
the
cafelation
between
AP-2%
and
congenital
heai
disease.
Duing
the
reproduc
tion
of
FX18
mica
,
stable
genetic
mutants
were
found.
FX18
mica
were
genotyped.
Mouse
body
weight
and
heart
weight
were
measured
-
Their
phenotypes
were
observed
by
HE
staining
,
and
electrocardioaram
was
performed
to
ex
amine
the
heai
function.
Our
results
revealed
that
mutant
mica
died
about
4
weeks
after
birth
and
showed
signifi
cant
developmental
retardation
at
the
embryonic
stage.
Both
postnatal
body
weight
and
heai
weight
of
mutant
mica
were
only
40%
—
60%
of
normal
FX18
mice.
At
the
same
1
—
,
the
results
of
HE
staining
and
electrocardioaram
indicated
that
the
mica
had
obvious
left
vvntPcular
hypeirophy
and
vvntPcular
premature
beat
,
which
were
char-
acteistics
of
patent
ductus
aieiosus
in
congenital
heart
disease.
Therefore
,
in
this
work
,
we
successfully
inenp-
fied
and
established
this
mutant
mouse
,
which
could
serve
as
a
better
model
for
studying
congenital
heart
disease
on
moce.
Key
wordt
FX18
transeenic
mica
；
AP-2
%
；
mutant
mica
；
congenpal
heart
disease
先天性心脏病
(
congenital
heart
disease
,
CHD)
是小儿最常见的心脏病
，
多出现因胚胎发育早期心脏及
大血管的形成障碍引起的局部结构异常
，
或出生后心脏应自动关闭的通道未能闭合
。
先天性心脏病通常根
据左右两侧及大血管之间的分流情况分为左向右分流型
(
潜伏青紫型
，
主要类型有室间隔缺损
VSD
、
房间隔
缺损
ASD
和动脉导管未闭
PDA
)
、
右向左分流型
(
青紫型
，
主要类型为法洛四联症
TOF
和完全性大动脉转位
收稿日期
：
2020-09-10
基金项目
:
国家自然科学基金项目(
81872256
);湖南省教育厅重点项目
(
19A310
)
*
通信作者
:
cityulilimin@
hotmail.
com
第
2
期
尹梓豪等
:
先天性心脏病突变体小鼠模型的建立
49
TGA
）
、
无分流型
（
无青紫型
，
主要类型为肺动脉狭窄
PS
）
三大类
［
1
］
，
是具有严重危害的先天畸形
，
且可有两
种以上畸形并存
。
先天性心脏病的相关影响因素比较复杂
，
目前尚未完全明确其确切的病因
，
但大多数研究
认为先天性心脏病是由遗传
［
2
］
与环境因素⑶共同作用而引起的
,
其中遗传因素包括基因异常和染色体异常
等
［
4
,
5
］
o
在母亲妊娠的早期尤为关键
，
其中孕期营养不足
、
妊娠早期服用药物或者妊娠早期病毒感染等⑷因
素都可能会造成小儿先天性心脏病
。
AP-2
家族包括
AP-2
%
,
AP-2
0
,
AP-2
）
,
AP-2d
和
AP-2v
,
是一类分子量为
52
000
的转录因子
，
有其独
特的蛋白质结构
，其
N
端是富含脯氨酸和谷氨酸的转录激活域
，
中间是
DNA
结合结构域
,
C
端的
helo
span
helio
结构可以形成二聚体
［
7,8］
O
AP-2
基因家族在脊椎动物的胚胎发育过程中起重要的调控作
用
［
9
］
，
有研究表明
Tfap2a
在发育的小鼠胚胎中显著表达
［
10
］
，
缺乏转录因子
Tfap2a
的小鼠胚胎可以存活下
来
，
但
Tfap2a
基因缺失的小鼠可能存在神经管
、
肢体间充质细胞
、
颅面部发育障碍
,
严重时使小鼠在围产
期由于无脑畸形
、
心脏形态异常且发育迟缓
、
脏器缺陷
、
体壁缺乏等严重畸形而死亡
［11,12
］
,
体现了
AP-2
%
在胚胎发育中的重要作用
。
笔者在利用基因打靶构建的
AP-2
%
QacZ
转基因小鼠
FX18
［
13
］
的基础上
，
继续
繁殖该小鼠
，
偶然发现了该转基因小鼠的一种突变体
，
此小鼠突变体心脏发育异常
，
为研究提供了一种先
天性心脏病小鼠模型
。
1
材料与方法
1.1
材料
FX18
小鼠由实验室构建
，
琼脂糖购于
Invitrogen
公司
。
DNA
上样缓冲液
，
DNA
Marker
购于
Thermo
公
司
；
二甲苯
，
多聚甲醛,
20xPBS
，
漠化乙锭
,
Tween-20
,
EDTA
,
SDS
,
NaCl
,
NaOH
及蛋白酶
K
等均购于上海生工
公司
;
其它常规试剂均为国产分析纯
。
心电图仪单导程全自动
ECG-11A
型购自广东东江电子仪器厂
，
频响
范围为
0~90
H
z
,
纸速为
50
mm-s-
1
，
自制针状电极
。
恒温烘箱购自上海精宏实验设备有限公司
。
病理切片
机
RM2016
购自上海
！
卡仪器有限公司
。
1.2
方法
1.2.1
小鼠的饲养与繁殖
将已构建的
FX18
小鼠置于
SPF
级动物房饲养
，
鼠房内温度控制在
18-26
U
,
光照控制为
12/12
,
饲养笼盒
、
饮水瓶
、
垫料
、
各种实验用具和衣服采用高压蒸汽灭菌器消毒
，
小鼠饲料采取
紫外消毒
，
进入动物房内的实验物品通过紫外消毒经传递窗单向传入
。
将雄性小鼠和雌性小鼠以
1
：
2
的比
例进行交配繁殖
。
所有实验经过湖南师范大学动物伦理委员会许可
。
1.2.2
转基因小鼠的鉴定
将通过基因打靶和显微注射已经建立的
FX18
转基因小鼠
,
生长至
3
周
,
剪取约
0.5
cm
小鼠尾巴
，
提取基因组
DNA
,
提取后的基因组
DNA
使用正向引物
LacZ-F1
（
5
'
-TACAACGTCGTGACT-
GGGAA-3
'
）
和反向引物
LacZ-R1
（
5
'
-CCAGATAACTGCCGTCACTC-3
'
）
进行
PCR
扩增
，
PCR
条件为预变性
94
u
,
1
min
20
S
,
再经
94
u
45
s
,
60
°C
45
s
,
72
U
2
mi
,
32
个循环
;
然后
72
°C
延伸
10
min
。
最后得到
PCR
产物片段大小为
562
bp
。
123
小鼠胚胎与心脏的包埋
、
切片和
HE
染色
包埋切片
:
分别取一窝
E13.5
小鼠整个胚胎和
4
周龄小鼠
的整个心脏
，
置于预先配好的固定液
（
4%
多聚甲醛
）
中于
4
U
下固定
24
h
。
将组织块放入烧杯中
，
流水冲洗
24
h
,
不要让组织块沉积在烧杯底部
。
按
50
%
乙醇
1
h
,
70%
乙醇
2
h
,
80%
乙醇
2
h
,
95%
乙醇
2
h
,
95%
乙醇
2
h
,
无水乙醇
2h
,
无水乙醇
2
h
对组织块进行梯度脱水
。
将组织块转入无水乙醇与二甲苯等体积混合的溶液
中处理
30
min
,
再将组织块浸泡在二甲苯中
30
min
,
使组织块透明
。
融化石蜡
，
置于
60
U
烘箱
。
配置二甲苯
与石蜡等体积混合液
，
处理组织块
30
min
,
将处理后的组织块放入融化后的石蜡进行包埋
。
使用切片机对包
埋后的组织块进行切片
。
HE
染色
:
依次将切片放入二甲苯
15
min
两次
，
无水乙醇
5
min
两次
,
85%
酒精
5
min
,
75%
酒精
5
min
,
蒸
馏水洗
，
放入苏木精水溶液中染色
5
min
后
,
依次入
1%
盐酸乙醇
30
s
,
流水冲洗
30
s
,
蒸馏水冲洗
5
s
。
置于
0.5%
酒精伊红染色液染色
1~3
min
,
蒸馏水洗
30
s
,
75%
酒精
5
min
,
85%
酒精
5
min
,
无水乙醇
5
min
两次，
再
经二甲苯
15
min
两次使切片透明
。
将已透明的切片滴上加拿大树胶
（
国药集团化学试剂有限公司
）
，
盖上盖
玻片封片固定
。
50
湖南师范大学自然科学学报第
44
卷
1.2.4
小鼠心电图的检测
使用
4%
的水合氯醛按
04
mL/10g
体质量的剂量麻醉
3~4
周龄小鼠
，
电极连线
分为红色
（
R
）
右上肢
、
黄色
（
L
）
左上肢
、
黑色
（
RF
）
右下肢
、
绿色
（
LF
）
左下肢
，
将针电极分别刺入其四肢皮下
,
记录标准导联和单极加压肢体导联的心电图
。
1-2.5
数据统计与分析
采用
Graph
Pad
Pvsm7
软件
，
计量资料用"土
s
表示
。
两组间比较采用
t
检验
。
%
<
0.05
为有差异统计学意义
。
2
结果
2.1
FX18
突变体小鼠体质量和心脏质量明显减少
，
且在
4
周龄左右死亡
为了研究
AP-2
%
在发育过程中特定的调控作用
，
笔者通过基因打靶和显微注射获得了
FX18
转基因小
鼠
,
并提取
3
周龄小鼠尾巴基因组
，
使用
PCR
鉴定
,
获得了
562
bp
的
LacZ
条带
,
证明该转基因小鼠构建成功
（
图
1a
）
[
13
]
o
在
FX18
小鼠繁殖过程中发现了
FX18
小鼠的突变体
，
与正常小鼠相比
，
FX18
突变体小鼠明显发育迟缓
，
非常瘦小
,
体型较
同胎的正常或杂合子小鼠偏小
40%~60%
,
并
在
4
周龄左右时死亡
,
而正常小鼠和
FX18
杂
合子小鼠外形和大小无差别
（
图
1b
）
。
突变体
小鼠的体质量和心脏质量均为同胎出生的正
AP-2a
genomic
9(FX18)
20
kb
■
3.5 kb
LacZ
561
bp
24
kb
4
kb
常或杂合子
FX18
小鼠
40%~60%
（
图
1c
,
d
）
,
这说明突变体小鼠的发育受到了严重的影
响
，
而心脏质量的异常提示
FX18
突变体小鼠
可能与心脏结构异常及功能障碍有关
。
black
boxes:
exons
Gray
boxes:
5'
and
3
'untranslated
regions
20
kb
of
genomic
sequences
5'
to
the
start
site
of
human
AP-2alpha
24
kb
of
genomic
DNA
extending
downstream
from
exon
five
of
human
AP-2alplia
2.2
FX18
突变体小鼠
E13.5
胚胎发育异常
为了研究
FX18
突变体小鼠和杂合子小
鼠的发育缺陷
，
将雌性
FX18
杂合子小鼠与雄
性
FX18
杂合子小鼠按
2
：
1
的比例合笼
，
下午
5
点交配
，
第二天上午
9
点左右检查精栓
，
若
发现阴栓则定为
E0.5
天
,
然后于
E13.5
天颈
椎脱臼法处死孕鼠
,
剖腹暴露子宫
，
在体视显
+/+
or
+/-
微镜下解剖
，
获取
E13.5
天的全部胚胎
。
观察
胚胎形态
，
发现
2
号胚胎较其它胚胎体型小
，
胚胎整体偏白色
，
结构模糊不清
，
发育滞后
（
图
2a
）
，
该胚胎的尾椎不完全
,
并没有出现明
显的手指分化
，
发育比正常胚胎延迟
2
天左
右
，
心脏形态发育不明显
。
3
号和
4
号胚胎则
表现为颅骨裂的严重神经管缺陷
，
头部异常
图
1
FX18
转基因小鼠的构建和突变体小鼠的发现
！
a
)
FX18
小鼠
的构建策略
)(
b
)
亲本小鼠
(
空心箭头
)
与突变体小鼠
(
实心
形态
,
躯干大小缩小
，
心脏形态异常
。
提取胚
胎组织基因组
DNA
,
证明
2
号胚胎的基因型
为
-/-
,
3
号和
4
号胚胎的基因型为
+/-
,
其余
箭头
)
体型图
)(
i
正常小鼠与突变体小鼠的体质量比较
)
(
d)
正常小鼠与突变体小鼠心脏质量的比较
Fig.
1
ConstmcZon
cf
FX1
8
transoenic
mice
and
disccverg
V
mutanf
mice
(
a
)
正常胚胎均为
+/+
。
这些结果提示
FX18
突变
体小鼠在胚胎时期出现了发育落后
、
尾椎发
ConstmcZon
strategy
cf
FX18
mice
；
(
b)
Figums
cf
Wild-type
and
mutanf
mice
,
parenf
mice
(
hollow
arrow)
and
muWnf
mice
(
solid
arrcv)
；
(
c)
育不全
、
手指分化不明显且体积偏小
、
心脏形
态异常的现象
。
Weigh-
comparison
cf
Wiiy-type
and
muWnf
mice
；
(
d
)
Cardiac
weigh
comparison
cf
Wild-Wpe
and
mutanf
mice
第
2
期
尹梓豪等
:
先天性心脏病突变体小鼠模型的建立
51
8
000
5
000
3
000
2
000
Ht:Heart
Li:
Liver
In:
Intestine
So:Somite
Mb:Midbrain
Hb:Hindbrain
Lu:
Lung
图
2
FX18
突变型小鼠胚胎的观察和鉴定
（
a
）
正常小鼠
、
杂合子小鼠与
2
号突变体小鼠胚胎的对比
；
（
b
）
正
常小鼠与
FX18
突变体小鼠的基因型鉴定
Fig.
2
Observation
and
identification
of
FX18
mutant
mice
embryos
（
a
）
Comparison
of
Wild-type
and
No.
2
mutant
mouse
embryC
os
；
（
b
）
Genotypic
identification
of
Wild-type
mice
and
FX18
mutant
mice
2.3
突变体小鼠室性早搏且伴有左心室肥厚
对
3~4
周龄的正常小鼠和突变体小鼠分别进行心电图检测
，
如图
3
所示
,
正常小鼠的心电图为窦性心
律
,
P
波波形
aVR
导联为倒置
,
其余为直立
。
QRS
波除
aVR
主波向下
，
其余导联呈
Qrs
,
qR
,
qRs
,
Rs
和
rS
等
,
无明显
ST
段
。
P
波
、
QRS
波的时间
、
振幅等均与文献
［
14
］
中报道的类似
。
与之对比
，
突变体小鼠
（
FX18
--
）
的心电图中
,
aVR
导联的
P
波与
QRS
主波出现了正置
，
且
QRS
波群提前发生
，
宽大畸形
，
为完全性代偿间
歇
，
属于较典型的室性早搏
，
同时
QRS
波群电压较正常小鼠有显著增高
。
观察小鼠的心脏纵切片发现
，
突变
体小鼠的左心室肥厚
，
为正常小鼠厚度的
3~4
倍
;
横切片显示突变体小鼠的左心室室腔变小
，
约为正常小鼠
容积的
1/4
,
提示突变体小鼠发生了先天性心脏疾病
。
+/+
(b)
I
_
Ml
图
3
正常小鼠
（
a
,c
）
和突变体小鼠
（
b
,
d
）
的心电图及心脏切片
Fig.
3
(
a)
Electrocardiogram
of
Wild-type
mice
#
(
b)
Electroca^dioT
a
m
of
mutant
mice,
indicative
abnormal
waves
(
box)
,
(
c)
Heart
sections
of
WildCype
mice
,
(
d)
Heart
sections
cf
mutant
mice
,
ventPculci
hypertrophy
(
arrow)
and
ventPculci
cavity
ntrowing
(
asterisk
)
52
湖南师范大学自然科学学报
第
44
卷
3
讨论
先天性心脏病的最常见临床类型包括房室间隔缺损
(
AVSD
)
、
大动脉易位
(
dTGA
)、
圆锥动脉干畸形
(
CTD
)
、
法洛四联症
!
TOF
)
、
动脉导管未闭
(
PDA
)
等
，
而这些常见的临床类型大多有相应的易感基因
+
15
朋
。
AP-2
基因家族是人类发现的第一个与动脉导管未闭相关的遗传基因
。
之前的研究表明
，
神经嵴细胞对心脑
血管疾病的发生起了重要的作用
,
动脉导管未闭
(
PDA
)
可能是神经嵴细胞发育异常的结果
,
而该基因家族
在神经外胚层衍生细胞的分化中也扮演着重要的角色
,
尤其是
AP-2
0
在胚胎发育的过程中与神经嵴细胞表
达的位置一致
，
且该基因的突变以显性负调控机制的方式改变神经嵴细胞的迁移和分化
+25]
，
进而可能在导
管中产生异常
，
来诱发动脉导管未闭
[26]
'
AP-2
0
基因缺失也可能会导致内皮素
-
及
Hif2a
在动脉导管平滑
肌水平表达缺失
，
影响平滑肌层组织的特异性发育
，
从而导致动脉导管未闭合
。
同时
,
AP-2
0
可以刺激某些
影响神经嵴细胞发育的基因信号通路中断
，
从而在胚胎期导致最终会发育为动脉导管的第
6
主动脉弓发育
异常
+
27]
O
因此
,
AP-2
0
的突变或表达量降低可能影响了动脉导管未闭
。
本研究构建的
FX18
转基因小鼠
，
是通过基因打靶构建的
AP-2
%
报告基因小鼠
，
在繁殖过程中出现了突
变体
，
可能由于基因打靶的非特异性引起某功能基因突变从而出现了异常小鼠表型
。
笔者研究发现突变体
小鼠的心脏有明显的左心室肥厚
。
左心室肥厚是动脉导管未闭的症状之一
，
也是引发左心室流出道阻塞的
危险因素之一
+2
讥有研究表明
,
AP-2
%
在胚胎发育和心脏发育中起重要作用
,
AP-2
%
可能通过参与咽下区
神经嵴与周围组织的相互作用
，
促进正常心脏流出道形态发生
。
AP-2
%
缺陷的小鼠胚胎中出现明显的心脏
流出道发育畸形
[29]
，
故突变体小鼠可能是
AP-2
%
基因出现了错义突变
。
由于
AP-2
0
在胚胎发育的过程中
与神经嵴细胞表达的位置一致
，
对神经嵴细胞的迁移分化产生了影响
+
25]
，
并且突变小鼠的表型符合动脉导
管未闭的特征
，
暗示该突变也可能影响了
AP-2
%
与
AP-2
0
之间的异源二聚体相互作用
。
该突变体小鼠的详
细作用机理
、
可能的突变基因或者其它先天性心脏病易感基因之间的相互影响等尚有待进一步研究
。
总之
，
笔者发现了一类突变体小鼠
,
该小鼠从胚胎阶段即出现了明显的发育滞后和心脏异常
，
其与先天
性心脏病之间可能存在重要关联
，
其详细的调控机制还有待后续进行深入研究
。
本研究也说明
FX18
转基
因小鼠的突变体具有先天性心脏病研究小鼠模型的潜力
。
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RAO
J
S
,
RAPOPORT
S
I
,
BOSETTI
F.
Decrease
in
the
AP-2
DNA-bindine
activity
and
in
the
protein
expression
ol
AP-2
%
and
AP-20
in
frontal
cortex
of
rats
treated
with
lithium
for
6
weeks]
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Neuropsychopharmaccloey
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MARNEROS
A
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aaainst
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MUCHELL
P
J
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TIMMONS
P
M
,
HEBERT
J
M
,
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Transcription
factor
AP-2
is
expressed
in
neural
crest
cell
lineaecs
dur
第
2
期
尹梓豪等
:
先天性心脏病突变体小鼠模型的建立
ing
mouse
embryogenesis
[
J
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.
Genes
Dev
,
1991
,
5
(
1
)
:
105-119.
53
+
11
]
KOUSA
Y
A
,
ZHU
H
,
FAKHOURI
W
D
,
ee
al
The
TFAP2A-IRF6-GRHL3
genetic
pathway
is
conserved
in
neurulation
f
J
]
.
Hum
Moi
Genet
,
2019
,
28
(
10
)
：
1726-1737.
+
12
]
ZHANG
J
,
HAGOPIDN-DONALDSON
S
,
SERBEDZIJA
G
,
et
al
Neural
tube
,
skeletal
and
body
wall
defects
in
mice
lacking
transcripPon
factor
AP-2[
J]
.
Nature,
1996,381(6579)
：
238-241.
+
13
]
ZHANG
J
,
WILLIDMS
T.
Identification
and
regulation
of
tissue-specific
cis-ocZng
elements
associated
with
the
human
AP-2
al
pha
gene
[
J
]
.
Dee
Dyn
,
2003
,
228
(
2
)
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194-207.
+
14
]
崔小岱
，
许
峥
,
马连华
，
等.
312
例正常小鼠心电图分析
[
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2002
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12
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2
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15
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LID
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ZHAO
L
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YUAN
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heart
disease
markers
and
GO
functional
analysis
of
the
association
between
its
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markers
and
susceptibility
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G
,
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M
A
,
SABRY
D
,
el
al
Association
of
NKX2-5
,
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,
and
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polymorphtmc
with con-
genitm
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disease
in
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f
J
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l
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are
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suggests
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伍
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after
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due
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编辑
WJ
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