2024年6月14日发(作者：符柔蔓)
一株H5N6亚型禽流感病毒对鸭和小鼠的致病性研究
刘永法;黄玉梅;张宗尧;万红;王媚;吕嘉敏;罗开健
【摘 要】为了研究一株从鹭中分离到的禽流感病毒(AIV)
A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5 N6)对鸭和小鼠的致病力,本研究通过对鸭和
小鼠滴鼻点眼和鸡的颈静脉注射进行攻毒试验,观察其致病力和组织病理学等变化,
对其生物学特性进行初步研究.结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量(EID50)为10-
8.16/0.1 mL,静脉接种致病指数(IVPI)为2.76.对鸭的半数致死量(LD50)为10-
4.0/0.2 mL,对小鼠的LD50为10-4.67/0.05 mL.以106 EID50/只滴鼻点眼感染鸭,
主要表现为食欲下降、精神萎靡、肿头流泪等症状,大多数鸭在感染后4～7 d死亡,
感染后第7天肝脏、肺脏、肾脏仍在排毒,解剖可见心包积液、肺脏淤血、肾脏肿
大等症状,病理切片可见心脏、肝脏、脾脏、肾脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病
变.以5×l05 EID50/只滴鼻感染小鼠,主要表现为食欲下降、精神萎靡、被毛粗乱、
聚堆等症状,大部分小鼠在感染后5～7 d死亡,第7天时只有肺脏仍在排毒,各脏器
解剖学病变不明显,病理切片可见心脏、肾脏、肺脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等
病变.研究结果表明,该H5N6亚型AIV毒株对鸭和小鼠具有很强的致病力,IVPI大
于1.2,为高致病性AIV,本研究为H5N6亚型AIV研究和防控提供了理论基础.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2015(042)008
【总页数】7页(P2176-2182)
【关键词】H5N6亚型禽流感病毒;鸭;小鼠
【作 者】刘永法;黄玉梅;张宗尧;万红;王媚;吕嘉敏;罗开健
【作者单位】华南农业大学兽医学院,广州510642;华南农业大学兽医学院,广州
510642;华南农业大学兽医学院,广州510642;华南农业大学兽医学院,广州
510642;华南农业大学兽医学院,广州510642;华南农业大学兽医学院,广州
510642;华南农业大学兽医学院,广州510642
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65
高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI)是由H5亚型或H7
亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一种禽类烈性传染病。它传
播快、危害大，既可感染家禽，偶尔也可感染人，是重要的人畜共患病[1]。自
1878年在意大利首次暴发禽流感以来，研究发现AIV广泛分布在多种野鸟和家禽
中[2]，水禽感染AIV后通常情况下并不引起发病[3-4]。但近来研究发现水禽不仅
是AIV巨大的贮存库，且其本身已成为对AIV高度易感、发病甚至死亡的禽类[5]。
近年来，H5亚型HPAI对家禽业造成了严重威胁，有学者报道了不同NA亚型的
H5亚型AIV，其致病性有较大差别。如Carranza-Flores等[6]曾报道报道
H5N2(A/chicken/Mexico/2007)是低致病力毒株，Mi等[7]曾报道
H5N2(A/chicken/Jiangsu/1001/2013)是高致病力毒株，Straube等[8]曾对一株
低致病性H5N6亚型AIV的生存活力进行过研究，国内也曾有在活禽交易市场的
鸭子中分离到H5N6亚型AIV病原的报道[9]。2013年10月，华南农业大学农业
部动物疫病防控重点开放实验室在发病的鹭中分离到一株H5N6亚型AIV，临床
诊断表明该毒株对鹭具有高致病性，实验室诊断表明该毒株对鸡具有很强的致病力，
对鸡的LD50为10-4.68/0.2 mL。虽然中国至今未发现H5N6亚型AIV在国内家
禽中流行，但鉴于中国近年来H5亚型AIV流行的复杂性，研究该毒株的生物学
特性对有效防控H5亚型禽流感的流行病学研究具有重要的指导意义。
1.1 病毒
A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)由农业部动物疫病防控重点开放实验室
在发病鹭中分离、鉴定、保管和提供，该毒株对鸡的LD50是10-4.68/0.2 mL。
1.2 抗原
H5亚型禽流感血凝抑制抗原由农业部动物疫病防控重点开放实验室提供。
1.3 试验动物及SPF鸡胚
9～11日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；3周龄SPF鸭、
7周龄SPF BALB/c小鼠均购自广东省医学实验动物中心，饲养于华南农业大学生
物安全三级实验室负压隔离器内。
1.4 鸡胚半数感染量测定
取病毒尿囊液用灭菌PBS做10倍系列稀释，按0.1 mL/胚接种剂量将10-5至
10-10每稀释度接种5枚鸡胚，37 ℃孵育，孵育48 h后通过测定感染鸡胚尿囊
液的血凝活性来判断是否感染，按Reed-Muench 法计算鸡胚半数感染量(50%
embryo infectious dose，EID50)[10]。
1.5 静脉接种致病指数
收获接种病毒的SPF鸡胚的感染性尿囊液，用灭菌生理盐水稀释10倍，将此稀释
病毒液以0.1 mL/羽静脉接种10只6周龄SPF鸡，两只同样鸡接种0.1 mL稀释
液作对照。每隔24 h检查鸡群一次，共观察10 d。根据每只鸡的症状用数字方法
每天进行记录：正常鸡记为0，病鸡记为1，重病鸡记为2，死鸡记为3。记录死
亡结果，按中国生物制品操作规程的方法计算静脉接种致病指数(IVPI)。
1.6 致病性试验
1.6.1 鸭的致病性试验 将50只鸭分组前进行心脏采血检测血清禽流感H5亚型HI
抗体，取35 只平均分为7组，1～6组为试验组，第7组为对照组。将病毒用无
菌的PBS进行10-1至10-6梯度稀释，模拟自然感染，按梯度分别滴鼻点眼0.2
mL/只，感染1～6组的鸭，第7组给予相同剂量的PBS作为对照。观察记录每组
的死亡情况，按Reed-Muench法计算半数致死量(50% lethal dose，LD50)[10]。
另取15只鸭单独一组，滴鼻点眼106 EID50病毒液0.1 mL/只，分别于第3、5、
7天各剖杀3只，无菌采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胰腺器官，一部
分用于检测病毒滴度，一部分经10%中性福尔马林溶液固定后按常规包埋，制备
石蜡切片，HE染色后镜检。
1.6.2 小鼠的致病性试验 取35只小鼠平均分成7组，1～6组为试验组，第7组
为对照组，标记后称重。小鼠接种病毒液用PBS进行10-1至10-6梯度稀释，病
毒稀释在冰浴上操作。试验组小鼠经干冰麻醉后，将病毒用无菌的PBS进行10-1
至10-6梯度稀释，模拟自然感染，按梯度分别滴鼻点眼50 μL/只，感染1～6组
的小鼠，第7组以滴鼻感染50 μL PBS作对照。每天观察并称重，小鼠试验观察
期为14 d，记录每组的死亡情况，按Reed-Muench法计算LD50[10]。
另取15只小鼠用相同的方法和剂量攻毒5×105 EID50病毒液。于攻毒后第3、5、
7天各随机处死3只感染存活小鼠，无菌采集肺脏、脑、肝脏和脾脏，一部分检测
病毒在小鼠体内的复制及分布情况，一部分经10%中性福尔马林溶液固定后按常
规包埋，制备石蜡切片，HE染色后镜检。
1.7 病毒分离和滴定
分别称取1 g无菌采取的肺脏、肾脏、脑、肠和胰腺等器官，放入灭菌研磨器中，
加入含青、链霉素(青霉素103 U/mL，链霉素103 μg/mL)和庆大霉素(250
μg/mL)的PBS液，制成组织匀浆。转入灭菌离心管中，离心取上清进行10-1至
10-7梯度稀释，每个稀释度0.1 mL/胚接种3枚SPF鸡胚，孵育48 h收集尿囊
液检测其HA血凝活性计算病毒含量。
2.1 EID50和IVPI测定结果
测定结果显示，该毒株的EID50为10-8.16/0.1 mL，IVPI为2.76。
2.2 H5N6亚型AIV对鸭和小鼠的致病力
2.2.1 对鸭的致病力 攻毒后3 d，以10-1浓度攻毒组的鸭最先开始死亡，以10-
1至10-5浓度攻毒的鸭死亡集中在3～7 d，个别鸭攻毒后4～6 d出现轻微症状，
8 d后未死亡的鸭基本能耐过，以10-6浓度攻毒的鸭和对照组的鸭不会出现死亡，
鸭的死亡变化见图1。以106 EID50浓度攻毒的鸭在3～5 d出现食欲下降，体温
明显升高，饮水量增加，精神萎靡，拉白绿色稀粪，口中流出酸臭液体，大多数鸭
肿头，眼睛苍白流泪，生长缓慢，最后衰竭死亡。
2.2.2 对小鼠的致病力 以10-1至10-6浓度攻毒的小鼠死亡集中在4～7 d，9 d
后未死亡的基本能耐过，小鼠的死亡情况见图2。以10-1至10-4浓度攻毒的小
鼠从第3天开始体重下降明显，以10-4至10-6浓度攻毒小鼠体重变化不大，9 d
后耐过小鼠体重开始回升。以5×105 EID50 浓度攻毒小鼠，攻毒后3 d开始出现
临床症状，主要表现为食欲下降、蜷缩、精神不振、毛散乱无光泽、聚堆怕冷等。
2.3 鸭和小鼠病毒的分离和滴度
2.3.1 鸭各组织脏器和口腔泄殖腔的排毒 攻毒3 d后，鸭的心脏、肝脏、脾脏、
肺脏、肾脏等脏器均可检测到病毒，肺脏和脾脏中病毒滴度最高，心脏、肝脏、肺
脏、肾脏、脑在第5天病毒滴度最高。第7天时仅有肺脏、肾脏和肝脏仍可检测
到病毒(图3)。
2.3.2 小鼠各脏器的排毒 攻毒后3 d，肝脏、肺脏、脑均可检测到病毒，肺脏的病
毒滴度最高，攻毒后第5天脾脏可检测到病毒，第7天时只有肺脏可检测到病毒
(图4)。
2.4 病理学检查
2.4.1 大体剖检 以106 EID50/只剂量攻毒鸭，感染后前两天不表现明显症状，感
染后3 d急性死亡，剖检肉眼观察内脏器官无明显病理变化。剖检临床症状明显
的鸭发现其肺脏浊变、心包积液、肝脏泛黄、肾脏肿胀、胰腺苍白，个别脑有出血，
腺胃、肌胃出血溃疡。
以5×105 EID50/只剂量攻毒的小鼠3 d后出现明显症状。剖检发现其肺脏有广泛
损伤，心脏、肝脏、脑、脾脏、肾脏等脏器无肉眼可见变化。
2.4.2 组织病理学检查 感染鸭组织病理学观察：心脏，心肌间质内淋巴细胞、单
核细胞、结缔组织中炎性细胞浸润心肌梗死(图5A)；肝脏，部分区域有炎症细胞
浸润现象(图5B)；脑，组织细胞核固缩，偶见细胞核周围出现空晕现象(图5C)；
肺脏，大量炎症细胞浸润，且伴有充血症状，管腔内及其周围肺泡腔内充满炎性渗
出物(图5D)；脾脏，大量炎症细胞浸润，并伴有细胞出血现象(图5E)；肾脏，部
分肾小球内有新月体形成，伴有炎症细胞浸润(图5F)。
感染小鼠组织病理学变化：肾脏，肾小管上皮细胞可萎缩、变性，间质水肿(图
6A)；脑，锥体细胞有所增加，组织水肿，少部分神经元细胞固缩(图6B)；心脏，
心肌纤维可见明暗相间的周期性横纹，炎症细胞浸润，些许出血现象(图6C)；肺
脏，肺泡明显扩张，部分肺泡间隔未被破坏，见大量炎细胞浸润(图6D)。
近些年来，随着养殖规模的不断扩大，疫苗的盲目使用，生产中的不规范操作及
AIV流行病学特征的错综复杂等因素，导致AIV变异变幻莫测，不断有新的亚型
出现，其中有很多HPAIV出现，不仅影响家禽业的生产和农业经济，甚至许多新
变异亚型危及到人类生命安全。AIV变异和流行无不引起人们的广泛关注。本试验
结果表明，该毒株A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)对小鼠和鸭均有高致
病性，该毒株的EID50为10-8.16/0.1 mL，对鸡的LD50为10-4.68/0.2 mL，
对鸭的LD50为10-4.0/0.2 mL，对小鼠的LD50为10-4.67/0.05 mL，IVPI为
2.76，属于HPAIV[11]。
同一血清亚型AIV的致病力与毒株和宿主特异性密切相关，在自然状态下，H5N1
亚型HPAIV可感染人、猪、马和禽类等多种动物[12]。目前报道过的H5亚型
AIV主要有H5N1、H5N2、H5N8等[13]，其中H5N1亚型AIV是目前发现的
AIV中感染性最强、致死率最高、流行最广的一类病毒，该病毒已在世界上多个国
家发生流行，给禽类养殖业带来了巨大的经济损失，当前针对该病尚无高效特异的
治疗方法，但安全、高效、廉价的新型疫苗已取得了大量的研究成果[14]，且目前
市售禽流感疫苗主要针对H5N1亚型AIV，针对H5N2的D7株水禽疫苗也于
2013年由华南农大生物药品有限公司生产销售。本研究验证此株H5N6亚型AIV
属HPAIV，而且此株病毒是在自然界中分离得到，鉴于H5亚型AIV流行病学特
性，以及目前尚无确切研究表明有针对H5N6亚型AIV的疫苗，因此，对该株
H5N6亚型AIV的生物学特性研究具有先占性意义。
有学者研究发现近年来鸭感染H5N1亚型HPAIV后，内脏广泛性出血性病变减少，
主要出现以神经症状为特征的临床症状和脑炎型病理变化。HPAIV对鸭的致病性
呈减弱趋势，在试验感染鸭体内病毒排毒期延长，隐性感染比较普遍[15]。但本试
验研究发现该株H5N6亚型AIV对鸭的致病性显著增强，不仅导致心脏、肺脏、
肾脏等器官的广泛性出血，而且心脏、脑、肝脏、肺脏等脏器组织病理学变化明显，
呈典型显性感染。水禽是AIV的贮存库，目前已在水禽中分离到大量不同血清亚
型的AIV，部分毒株不仅可引起水禽自然感染发病死亡，而且水禽中的AIV还可
横向传染给鸡或火鸡等陆生禽类而成为其发生禽流感的传染源[16]。本试验结果表
明A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)不但对鸡具有很强的致病力和致死率，
而且对水禽鸭和哺乳动物小鼠也有很强的致病力。由于该株病毒是在自然发病的野
生鹭中分离到的，鉴于中国当前家禽业的养殖环境及AIV流行毒株变异的复杂性，
该毒株是否会在中国家禽中传播、流行，值得养禽业密切关注。此次对该毒株生物
学特性的基础研究，为今后对H5N6亚型AIV的研究奠定了一定的理论基础。
*通信作者：罗开健(1972-)，男，广西梧州人，博士，研究方向：禽流感病毒学，
E-mail：**************.cn
【相关文献】
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2024年6月14日发(作者：符柔蔓)
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刘永法;黄玉梅;张宗尧;万红;王媚;吕嘉敏;罗开健
【摘 要】为了研究一株从鹭中分离到的禽流感病毒(AIV)
A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5 N6)对鸭和小鼠的致病力,本研究通过对鸭和
小鼠滴鼻点眼和鸡的颈静脉注射进行攻毒试验,观察其致病力和组织病理学等变化,
对其生物学特性进行初步研究.结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量(EID50)为10-
8.16/0.1 mL,静脉接种致病指数(IVPI)为2.76.对鸭的半数致死量(LD50)为10-
4.0/0.2 mL,对小鼠的LD50为10-4.67/0.05 mL.以106 EID50/只滴鼻点眼感染鸭,
主要表现为食欲下降、精神萎靡、肿头流泪等症状,大多数鸭在感染后4～7 d死亡,
感染后第7天肝脏、肺脏、肾脏仍在排毒,解剖可见心包积液、肺脏淤血、肾脏肿
大等症状,病理切片可见心脏、肝脏、脾脏、肾脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病
变.以5×l05 EID50/只滴鼻感染小鼠,主要表现为食欲下降、精神萎靡、被毛粗乱、
聚堆等症状,大部分小鼠在感染后5～7 d死亡,第7天时只有肺脏仍在排毒,各脏器
解剖学病变不明显,病理切片可见心脏、肾脏、肺脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等
病变.研究结果表明,该H5N6亚型AIV毒株对鸭和小鼠具有很强的致病力,IVPI大
于1.2,为高致病性AIV,本研究为H5N6亚型AIV研究和防控提供了理论基础.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2015(042)008
【总页数】7页(P2176-2182)
【关键词】H5N6亚型禽流感病毒;鸭;小鼠
【作 者】刘永法;黄玉梅;张宗尧;万红;王媚;吕嘉敏;罗开健
【作者单位】华南农业大学兽医学院,广州510642;华南农业大学兽医学院,广州
510642;华南农业大学兽医学院,广州510642;华南农业大学兽医学院,广州
510642;华南农业大学兽医学院,广州510642;华南农业大学兽医学院,广州
510642;华南农业大学兽医学院,广州510642
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65
高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI)是由H5亚型或H7
亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一种禽类烈性传染病。它传
播快、危害大，既可感染家禽，偶尔也可感染人，是重要的人畜共患病[1]。自
1878年在意大利首次暴发禽流感以来，研究发现AIV广泛分布在多种野鸟和家禽
中[2]，水禽感染AIV后通常情况下并不引起发病[3-4]。但近来研究发现水禽不仅
是AIV巨大的贮存库，且其本身已成为对AIV高度易感、发病甚至死亡的禽类[5]。
近年来，H5亚型HPAI对家禽业造成了严重威胁，有学者报道了不同NA亚型的
H5亚型AIV，其致病性有较大差别。如Carranza-Flores等[6]曾报道报道
H5N2(A/chicken/Mexico/2007)是低致病力毒株，Mi等[7]曾报道
H5N2(A/chicken/Jiangsu/1001/2013)是高致病力毒株，Straube等[8]曾对一株
低致病性H5N6亚型AIV的生存活力进行过研究，国内也曾有在活禽交易市场的
鸭子中分离到H5N6亚型AIV病原的报道[9]。2013年10月，华南农业大学农业
部动物疫病防控重点开放实验室在发病的鹭中分离到一株H5N6亚型AIV，临床
诊断表明该毒株对鹭具有高致病性，实验室诊断表明该毒株对鸡具有很强的致病力，
对鸡的LD50为10-4.68/0.2 mL。虽然中国至今未发现H5N6亚型AIV在国内家
禽中流行，但鉴于中国近年来H5亚型AIV流行的复杂性，研究该毒株的生物学
特性对有效防控H5亚型禽流感的流行病学研究具有重要的指导意义。
1.1 病毒
A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)由农业部动物疫病防控重点开放实验室
在发病鹭中分离、鉴定、保管和提供，该毒株对鸡的LD50是10-4.68/0.2 mL。
1.2 抗原
H5亚型禽流感血凝抑制抗原由农业部动物疫病防控重点开放实验室提供。
1.3 试验动物及SPF鸡胚
9～11日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；3周龄SPF鸭、
7周龄SPF BALB/c小鼠均购自广东省医学实验动物中心，饲养于华南农业大学生
物安全三级实验室负压隔离器内。
1.4 鸡胚半数感染量测定
取病毒尿囊液用灭菌PBS做10倍系列稀释，按0.1 mL/胚接种剂量将10-5至
10-10每稀释度接种5枚鸡胚，37 ℃孵育，孵育48 h后通过测定感染鸡胚尿囊
液的血凝活性来判断是否感染，按Reed-Muench 法计算鸡胚半数感染量(50%
embryo infectious dose，EID50)[10]。
1.5 静脉接种致病指数
收获接种病毒的SPF鸡胚的感染性尿囊液，用灭菌生理盐水稀释10倍，将此稀释
病毒液以0.1 mL/羽静脉接种10只6周龄SPF鸡，两只同样鸡接种0.1 mL稀释
液作对照。每隔24 h检查鸡群一次，共观察10 d。根据每只鸡的症状用数字方法
每天进行记录：正常鸡记为0，病鸡记为1，重病鸡记为2，死鸡记为3。记录死
亡结果，按中国生物制品操作规程的方法计算静脉接种致病指数(IVPI)。
1.6 致病性试验
1.6.1 鸭的致病性试验 将50只鸭分组前进行心脏采血检测血清禽流感H5亚型HI
抗体，取35 只平均分为7组，1～6组为试验组，第7组为对照组。将病毒用无
菌的PBS进行10-1至10-6梯度稀释，模拟自然感染，按梯度分别滴鼻点眼0.2
mL/只，感染1～6组的鸭，第7组给予相同剂量的PBS作为对照。观察记录每组
的死亡情况，按Reed-Muench法计算半数致死量(50% lethal dose，LD50)[10]。
另取15只鸭单独一组，滴鼻点眼106 EID50病毒液0.1 mL/只，分别于第3、5、
7天各剖杀3只，无菌采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胰腺器官，一部
分用于检测病毒滴度，一部分经10%中性福尔马林溶液固定后按常规包埋，制备
石蜡切片，HE染色后镜检。
1.6.2 小鼠的致病性试验 取35只小鼠平均分成7组，1～6组为试验组，第7组
为对照组，标记后称重。小鼠接种病毒液用PBS进行10-1至10-6梯度稀释，病
毒稀释在冰浴上操作。试验组小鼠经干冰麻醉后，将病毒用无菌的PBS进行10-1
至10-6梯度稀释，模拟自然感染，按梯度分别滴鼻点眼50 μL/只，感染1～6组
的小鼠，第7组以滴鼻感染50 μL PBS作对照。每天观察并称重，小鼠试验观察
期为14 d，记录每组的死亡情况，按Reed-Muench法计算LD50[10]。
另取15只小鼠用相同的方法和剂量攻毒5×105 EID50病毒液。于攻毒后第3、5、
7天各随机处死3只感染存活小鼠，无菌采集肺脏、脑、肝脏和脾脏，一部分检测
病毒在小鼠体内的复制及分布情况，一部分经10%中性福尔马林溶液固定后按常
规包埋，制备石蜡切片，HE染色后镜检。
1.7 病毒分离和滴定
分别称取1 g无菌采取的肺脏、肾脏、脑、肠和胰腺等器官，放入灭菌研磨器中，
加入含青、链霉素(青霉素103 U/mL，链霉素103 μg/mL)和庆大霉素(250
μg/mL)的PBS液，制成组织匀浆。转入灭菌离心管中，离心取上清进行10-1至
10-7梯度稀释，每个稀释度0.1 mL/胚接种3枚SPF鸡胚，孵育48 h收集尿囊
液检测其HA血凝活性计算病毒含量。
2.1 EID50和IVPI测定结果
测定结果显示，该毒株的EID50为10-8.16/0.1 mL，IVPI为2.76。
2.2 H5N6亚型AIV对鸭和小鼠的致病力
2.2.1 对鸭的致病力 攻毒后3 d，以10-1浓度攻毒组的鸭最先开始死亡，以10-
1至10-5浓度攻毒的鸭死亡集中在3～7 d，个别鸭攻毒后4～6 d出现轻微症状，
8 d后未死亡的鸭基本能耐过，以10-6浓度攻毒的鸭和对照组的鸭不会出现死亡，
鸭的死亡变化见图1。以106 EID50浓度攻毒的鸭在3～5 d出现食欲下降，体温
明显升高，饮水量增加，精神萎靡，拉白绿色稀粪，口中流出酸臭液体，大多数鸭
肿头，眼睛苍白流泪，生长缓慢，最后衰竭死亡。
2.2.2 对小鼠的致病力 以10-1至10-6浓度攻毒的小鼠死亡集中在4～7 d，9 d
后未死亡的基本能耐过，小鼠的死亡情况见图2。以10-1至10-4浓度攻毒的小
鼠从第3天开始体重下降明显，以10-4至10-6浓度攻毒小鼠体重变化不大，9 d
后耐过小鼠体重开始回升。以5×105 EID50 浓度攻毒小鼠，攻毒后3 d开始出现
临床症状，主要表现为食欲下降、蜷缩、精神不振、毛散乱无光泽、聚堆怕冷等。
2.3 鸭和小鼠病毒的分离和滴度
2.3.1 鸭各组织脏器和口腔泄殖腔的排毒 攻毒3 d后，鸭的心脏、肝脏、脾脏、
肺脏、肾脏等脏器均可检测到病毒，肺脏和脾脏中病毒滴度最高，心脏、肝脏、肺
脏、肾脏、脑在第5天病毒滴度最高。第7天时仅有肺脏、肾脏和肝脏仍可检测
到病毒(图3)。
2.3.2 小鼠各脏器的排毒 攻毒后3 d，肝脏、肺脏、脑均可检测到病毒，肺脏的病
毒滴度最高，攻毒后第5天脾脏可检测到病毒，第7天时只有肺脏可检测到病毒
(图4)。
2.4 病理学检查
2.4.1 大体剖检 以106 EID50/只剂量攻毒鸭，感染后前两天不表现明显症状，感
染后3 d急性死亡，剖检肉眼观察内脏器官无明显病理变化。剖检临床症状明显
的鸭发现其肺脏浊变、心包积液、肝脏泛黄、肾脏肿胀、胰腺苍白，个别脑有出血，
腺胃、肌胃出血溃疡。
以5×105 EID50/只剂量攻毒的小鼠3 d后出现明显症状。剖检发现其肺脏有广泛
损伤，心脏、肝脏、脑、脾脏、肾脏等脏器无肉眼可见变化。
2.4.2 组织病理学检查 感染鸭组织病理学观察：心脏，心肌间质内淋巴细胞、单
核细胞、结缔组织中炎性细胞浸润心肌梗死(图5A)；肝脏，部分区域有炎症细胞
浸润现象(图5B)；脑，组织细胞核固缩，偶见细胞核周围出现空晕现象(图5C)；
肺脏，大量炎症细胞浸润，且伴有充血症状，管腔内及其周围肺泡腔内充满炎性渗
出物(图5D)；脾脏，大量炎症细胞浸润，并伴有细胞出血现象(图5E)；肾脏，部
分肾小球内有新月体形成，伴有炎症细胞浸润(图5F)。
感染小鼠组织病理学变化：肾脏，肾小管上皮细胞可萎缩、变性，间质水肿(图
6A)；脑，锥体细胞有所增加，组织水肿，少部分神经元细胞固缩(图6B)；心脏，
心肌纤维可见明暗相间的周期性横纹，炎症细胞浸润，些许出血现象(图6C)；肺
脏，肺泡明显扩张，部分肺泡间隔未被破坏，见大量炎细胞浸润(图6D)。
近些年来，随着养殖规模的不断扩大，疫苗的盲目使用，生产中的不规范操作及
AIV流行病学特征的错综复杂等因素，导致AIV变异变幻莫测，不断有新的亚型
出现，其中有很多HPAIV出现，不仅影响家禽业的生产和农业经济，甚至许多新
变异亚型危及到人类生命安全。AIV变异和流行无不引起人们的广泛关注。本试验
结果表明，该毒株A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)对小鼠和鸭均有高致
病性，该毒株的EID50为10-8.16/0.1 mL，对鸡的LD50为10-4.68/0.2 mL，
对鸭的LD50为10-4.0/0.2 mL，对小鼠的LD50为10-4.67/0.05 mL，IVPI为
2.76，属于HPAIV[11]。
同一血清亚型AIV的致病力与毒株和宿主特异性密切相关，在自然状态下，H5N1
亚型HPAIV可感染人、猪、马和禽类等多种动物[12]。目前报道过的H5亚型
AIV主要有H5N1、H5N2、H5N8等[13]，其中H5N1亚型AIV是目前发现的
AIV中感染性最强、致死率最高、流行最广的一类病毒，该病毒已在世界上多个国
家发生流行，给禽类养殖业带来了巨大的经济损失，当前针对该病尚无高效特异的
治疗方法，但安全、高效、廉价的新型疫苗已取得了大量的研究成果[14]，且目前
市售禽流感疫苗主要针对H5N1亚型AIV，针对H5N2的D7株水禽疫苗也于
2013年由华南农大生物药品有限公司生产销售。本研究验证此株H5N6亚型AIV
属HPAIV，而且此株病毒是在自然界中分离得到，鉴于H5亚型AIV流行病学特
性，以及目前尚无确切研究表明有针对H5N6亚型AIV的疫苗，因此，对该株
H5N6亚型AIV的生物学特性研究具有先占性意义。
有学者研究发现近年来鸭感染H5N1亚型HPAIV后，内脏广泛性出血性病变减少，
主要出现以神经症状为特征的临床症状和脑炎型病理变化。HPAIV对鸭的致病性
呈减弱趋势，在试验感染鸭体内病毒排毒期延长，隐性感染比较普遍[15]。但本试
验研究发现该株H5N6亚型AIV对鸭的致病性显著增强，不仅导致心脏、肺脏、
肾脏等器官的广泛性出血，而且心脏、脑、肝脏、肺脏等脏器组织病理学变化明显，
呈典型显性感染。水禽是AIV的贮存库，目前已在水禽中分离到大量不同血清亚
型的AIV，部分毒株不仅可引起水禽自然感染发病死亡，而且水禽中的AIV还可
横向传染给鸡或火鸡等陆生禽类而成为其发生禽流感的传染源[16]。本试验结果表
明A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)不但对鸡具有很强的致病力和致死率，
而且对水禽鸭和哺乳动物小鼠也有很强的致病力。由于该株病毒是在自然发病的野
生鹭中分离到的，鉴于中国当前家禽业的养殖环境及AIV流行毒株变异的复杂性，
该毒株是否会在中国家禽中传播、流行，值得养禽业密切关注。此次对该毒株生物
学特性的基础研究，为今后对H5N6亚型AIV的研究奠定了一定的理论基础。
*通信作者：罗开健(1972-)，男，广西梧州人，博士，研究方向：禽流感病毒学，
E-mail：**************.cn
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