2024年4月20日发(作者：独清晖)
PPARδ激动剂GW501516调节小鼠骨骼肌线粒体生物合成
和纤维类型转换的作用
方海琴;张勇;许佑君;吴英良
【摘 要】目的 观察和比较PPARδ激动剂GW501516补充和(或)耐力训练对骨骼
肌内源性PPARδ及PGC-1α表达、骨骼肌线粒体生物合成和骨骼肌肌纤维类型的
影响.方法 ♂ C57BL/6 小鼠随机分为5组:正常对照组(C)、耐力训练组(T)、低剂量
GW501516组(LG,3 mg·kg-1·d-1,po)、低剂量激动剂干预+训练组(TG)、高剂量
GW501516组(HG,10 mg·kg-1·d-1,po).15周实验期结束后,取腓肠肌以Western
blot法测定骨骼肌组织PPARδ、PGC-1α、COX Ⅳ 和MHCⅠ、MHCⅡ以及
MHCⅡa蛋白表达;骨骼肌ATP酶染色区分纤维类型以及透射电镜观察.结果 ① 与
C、T组比较,电镜下可见激动剂干预各组(LG、TG)线粒体数目明显增多,排列整
齐;② T、LG和TG组腓肠肌PPARδ、PGC-1α和COX Ⅳ蛋白表达量均较C组提
高,且激动剂和训练在3种指标变化中均有交互作用;③ 小鼠腓肠肌ATP酶染色发
现,与C组相比,T组的Ⅰ型肌纤维比例无变化;LG、TG组的Ⅰ型肌纤维增加,尤其以
TG组明显;④ T、LG、TG组的腓肠肌MHC Ⅱa蛋白表达量较C组提高,LG、TG
组腓肠肌MHC Ⅱ蛋白表达量较C组降低的同时表现出MHCI蛋白的明显增加.激
动剂和耐力训练在小鼠腓肠肌MHCs蛋白含量变化中有交互作用.结论 ① 耐力训
练与补充GW501516均可诱导骨骼肌线粒体生物合成;② GW501516补充可促进
骨骼肌纤维类型由Ⅱ型向Ⅰ型的转变,单纯运动训练未发生肌纤维类型的转变;③
GW501516补充与训练结合,在上调骨骼肌线粒体生物合成及肌纤维类型转变的过
程中有叠加作用.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2010(026)010
【总页数】6页(P1290-1295)
【关键词】PPARδ;GW501516;PGC-1α;线粒体;生物合成;肌纤维类型
【作 者】方海琴;张勇;许佑君;吴英良
【作者单位】天津体育学院天津市运动生理与运动医学重点实验室,天津,300381;
沈阳药科大学生命科学与生物制药学院,辽宁,沈阳,110016;天津体育学院天津市运
动生理与运动医学重点实验室,天津,300381;沈阳药科大学生命科学与生物制药学
院,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学生命科学与生物制药学院,辽宁,沈阳,110016
【正文语种】中 文
【中图分类】R-332;R322.74;R329.24;R977.6
骨骼肌既是执行运动及调节机体葡萄糖、脂质、蛋白质代谢的重要器官，也是一可
塑性器官。人类许多代谢疾病如糖尿病等可出现肌萎缩、肌纤维类型改变［1］。
近来的报道指出［2］，在长时间静坐、少动人群中，由于线粒体不能完全氧化体
内脂肪酸导致不完全代谢产物蓄积，代谢疾病发生。苯氧乙酸化合物GW501516
已经进入三期临床试验，是目前受到人们关注最多的选择性PPARδ受体激动剂
［3］。PPARδ受体分布在骨骼肌和棕色脂肪等多种组织中，在控制脂肪酸氧化
方面起着重要作用，运动训练能导致此受体含量的增加。Wang等［4］2004年
报道在PPARδ转基因鼠中，骨骼肌由Ⅱ型向Ⅰ型发生了转变，COXⅡ、COXⅣ等
线粒体标志性蛋白含量明显升高，且耐力运动到力竭的时间和运动距离都远远高于
野生型。这些研究提示，PPARδ可能在促进骨髂肌线粒体的生物合成和骨骼肌肌
纤维发生代谢性质的转变中具有重要调节作用。因此，本研究以C57BL/6小鼠为
对象，观察和比较GW501516补充和(或)耐力训练对线粒体生物合成和骨骼肌肌
纤维类型的影响，并探讨其分子机制，以期为其用于肌萎缩/病理性肥大相关疾病、
残疾康复、糖尿病等代谢疾病的治疗提供初步的实验依据。
1 材料
1.1 动物 ♂ C57BL/6小鼠，体质量(20±2)g，由军事医学科学院实验动物中心提
供。小鼠购入后适应性喂养1周，苦味酸编号，单只分笼饲养，自由进食，每日
记录饮水量及激动剂干预量。实验总时程16周。
1.2 主要试剂与药品 GW501516由沈阳药科大学许佑君教授馈赠。PGC-1α一抗
(Santa Cruz CA)，PPARδ、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa和 β tubline
单抗(均购自ABcam公司)，HRP标记的二抗(中杉金桥生物技术公司)，甲苯胺蓝
(Amoroso)。
1.3 仪器设备 动物电动跑台(天津运动医学研究所)，台式高速低温离心机
AvantiTM30(Beckman Co，USA)，DU800型可见-紫外分光光度计(Beckman
Co，USA)，垂直电泳槽(Bio-Rad Co，USA)，蛋白转印槽(Bio-Rad Co，USA)，
稳压电泳仪(Lab net Co，USA)，BLATER 冰冻切片机(Attenpon Co，Ger-
many)，显微镜 AVNOX(Olympus Co，Japan)，透射电子显微镜(Philips
EM208S)。
2 方法
2.1 动物分组 80只C57BL/6小鼠随机分为5个组，分别为:对照组(C)、耐力运动
训练组(T)、低剂量GW501516组(LG)、低剂量GW501516并耐力运动训练组
(TG)，高剂量GW501516组(HG)，每组16只(剂量因素本论文不做讨论)。
2.2 实验动物激动剂干预及耐力训练模型 小鼠适应性喂养1 wk后，LG、HG和
TG小鼠开始随饮水补给GW501516，逐渐增量。补充剂量从1 mg·kg-1逐渐升
高至3 mg·kg-1及10 mg·kg-1时，分别固定在3 mg·kg-1和10 mg·kg-1的低、
高两个剂量。
参考文献［5］方法，T和TG组小鼠进行无坡度跑台训练，14 m·min-1，每次
50 min，每周5次，全程监控小鼠耐力训练，共15周。
2.3 动物取材及标本制备 各组小鼠均以10%水合氯醛(400 mg·kg-1，ip)麻醉后，
迅速取出腓肠肌。按纤维走行方向取部分腓肠肌，即刻按所需截面修正为约1
mm3的立方小块，迅速以电镜固定液固定，定时1 h，取出用磷酸缓冲液冲洗干
净，重复3次。将固定标本制备超薄切片，透射电镜观察，拍照，分析。另取部
分腓肠肌，剔除肌膜，迅速放入液氮预冷的异戊烷中，保存于-70℃;按照编号取出
相应的组织，待温度回升到-25℃时OTC包埋，冰冻切片，厚度为5 μm，每例样
本按照“一对一”连续切片，分别用于肌纤维类型(异染性染料ATP酶法)检测
［6］。剩余腓肠肌，液氮速冻，-80℃冻存备用。
2.4 小鼠腓肠肌ATP酶染色及肌纤维类型分析参照文献［6］(Ogilvie RW)以异染
性染料法测定腓肠肌ATP酶活性，并在Olympus显微照像系统下观察并拍照记
录。染色片中呈阳性的I型肌纤维显深蓝色，Ⅱa型纤维显浅蓝色，Ⅱb型骨骼肌
纤维为阴性未被着色，呈白色，IPP图像系统处理，电脑格度扫描，计算出各类肌
纤维的构成比例。
2.5 骨骼肌 PPARδ、PGC-1α、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa蛋白含量
测定［7］ 取适量液氮冻存骨骼肌组织匀浆，用 RIPA法提取骨骼肌中PPARδ蛋
白，NP-40法提取骨骼肌全细胞蛋白(PGC-1α、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、
MHCⅡa)，以考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度，确定合适的上样量。蛋白电泳完毕
后，采用湿法将蛋白质电转印至PVDF膜，根据预染蛋白Marker剪取目的蛋白条
带。按各蛋白所用一抗的说明书，稀释一抗，4℃孵育过夜后，TBST洗膜，HRP
标记的二抗(中杉金桥生物技术公司)室温温育1～2 h;使用
LumiGLO®Chemiluminescent Substrate(KPL)进行发光底物孵育，曝光。使用
Quantity ONE(Bio-Rad)软件对目的蛋白进行光密度分析，以β-tubulin为内参
蛋白。目的蛋白相对含量=目的蛋白灰度值/β-tubulin蛋白灰度值。
2.6 统计学处理 激动剂补充与耐力训练为本实验涉及的两种干预因素，两个因素
既有单独效应也表现出交互作用，故采用SPSS 13.0软件中的2*2析因分析法进
行统计分析检验。实验结果以±s表示。
3 结果
3.1 小鼠腓肠肌超微结构观察 如Fig 1所示:透射电镜6 000倍下观察，小鼠骨骼
肌超微结构显示出:无激动剂干预的C组和T组，线粒体呈粒状或杆状，体积小、
数目相对较少;激动剂干预各组(LG、TG)线粒体呈椭圆形，排列整齐，数目明显增
多，提示线粒体的生物合成增加。
Fig 1 Transmission EM photos of mice’s gastrocnemius muscles(×6
000)C:Control;T:Training;LG:Low dose GW501516(3 mg·kg-1·d-
1);TG:Training and low dose GW501516(3 mg·kg-1·d-1)
3.2 GW501516及耐力训练对小鼠腓肠肌PPARδ、PGC-1α和 COXIV及 MHCs
蛋白表达的影响 如Fig 2所示:A图中，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.01)和TG组(P
＜0.05)小鼠腓肠肌PPARδ蛋白表达量均较C组提高;B图中，T组(P＜0.05)、LG
组(P＜0.05)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌PGC-1α蛋白表达量均较C组提高;C图
中，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌COXIV蛋白表
达量均较C组提高;激动剂和训练在小鼠骨骼肌以上各蛋白表达量变化中均有交互
作用(P＜0.05)。
Fig 2 The protein expression of PPARδ，PGC-1α，COXIV and MHCs in
mice’s gastrocnemiusA:PPARδ;B:PGC-1α;C:COXIV;D:MHCⅠ;E:MHC
Ⅱ;F:MHCⅡa.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 exhibited
additional enhancing effects in TG group by GW501516 and training
D图中，LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌MHCⅠ蛋白表达量均较C
组提高，T组较C组无增加;E图中LG组(P＜0.01)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌
MHCⅡ蛋白表达量均较C组降低;F图中，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.05)和TG
组(P＜0.05)小鼠腓肠肌MHCⅡa蛋白表达量均较C组提高;激动剂和训练在小鼠
腓肠肌MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa蛋白含量变化中有交互作用(P＜0.05)。
3.3 小鼠腓肠肌异染性染料ATP酶染色图片分析如Fig 3所示，T组(P＜0.05)、
LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.01)Ⅱb型肌纤维(%)均较C组降低;T组(P＜0.05)、
LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.01)Ⅱa型肌纤维(%)均较C组提高;相对于C组，T
组的Ⅰ型肌纤维比例无变化;TG组的Ⅰ型肌纤维明显增加。激动剂和训练在小鼠各
型肌纤维(%)变化中有交互作用(P＜0.01)。
Fig 3 Metachromatic staining of mice’s gastrocnemius(A)and the analysis
of muscle types(%)(B)A:TypeⅠ fibers were stained dark blue，type Ⅱa
fibers were stained light blue，and TypeⅡb fibers were white;*P ＜0.05 vs
control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 exhibited additional enhancing effects in TG
group by GW501516 and training
4 讨论
Oliver等［3］在 2003 年研发了 GW501516，此化合物对PPARδ的激动作用具
有很强的选择性，其选择性高出其它亚型1 000倍，在nmol·L-1的浓度水平就可
以激动PPARδ。Wang等［4］实验证明在服用GW501516激动剂10 d后，
C57鼠的线粒体生物合成和呼吸氧化和骨骼肌慢肌纤维的基因皆有上调。
线粒体的生物合成(mitochondrial biogenesis)，是指线粒体的种系发生也可以指
线粒体的个体发生的过程。细胞内线粒体的生物合成至少包括以下两种改变:①单
位体积组织中线粒体含量的改变，②线粒体本身成分的改变，如线粒体蛋白/磷脂
的构成比例的改变。线粒体生物合成是一个复杂的过程，包括核基因和线粒体基因
的激活、转录、翻译、蛋白质前体的运输以及进入线粒体的蛋白质的正确组装等多
个步骤。运动和电刺激引起的肌肉收缩会诱导线 粒 体 生 物 合 成 已 成 共 识［8-
9］。PGC-1α 即PPARGC-1α(PPAR γ coactivator-1α)是线粒体合成途径中一个
关键因子［10］，其属于 PGC-1家族，是PPAR γ的转录辅激活因子，也是通用
的辅激活因子，同时PGC-1α是PPAR s及甲状腺素受体(TR)的强烈转录协同刺激
因子，对线粒体的生物合成和细胞能量代谢起着关键的调控作用［11］。另有Lin
等［12］研究发现，PGC-1α是I型肌纤维的生理性调节因子，当PGC-1α在富
含Ⅱ型纤维(快肌纤维)的肌肉里表达升高时，其可导致肌肉形态、基因及功能发生
变化，促进I型肌纤维的形成。Arany等［13］曾报道PGC-1α的辅因子PGC-
1β的增多上调了线粒体生物合成，使骨骼肌纤维的Ⅱx型纤维增多。
PGC-1α的表达受很多因素影响，已明确PGC-1α可以与大多数核激素受体包括
PPARδ在内的超家族成员，以不同的方式与其发生分子对接，进而调控其生物学
功能［14］，这也提示可以考虑从激活PPARδ上调PGC-1α的表达，增加由
PGC-1α调控的线粒体生物合成分子机制的为切入点进行研究观察。
我们参考Arany等［13］的实验方法，用电镜观察骨骼肌超微结构，也发现了
GW501516补充组小鼠骨骼肌线粒体合成明显增加。从蛋白分析结果可以看出，
GW501516补充可明显增加小鼠骨骼肌PGC-1α、COXIV蛋白含量，说明伴随着
PPARδ受体的激活，诱导了小鼠骨骼肌的线粒体生物合成。
骨骼肌由慢缩肌纤维和快缩肌纤维组成。根据肌球蛋白ATP酶染色或(和)肌球蛋
白重链(myosin heavy chain，MHC)异构体的表达，成年啮齿动物骨骼肌纤维可
单纯地分为Ⅰ型(氧化型慢缩肌，线粒体极为丰富)和Ⅱa型(糖氧化型快缩肌)、Ⅱb
型(糖酵解型快缩肌)、Ⅱx型(介于Ⅱa与Ⅱb之间)。骨骼肌既是执行运动及调节机
体葡萄糖、脂质、蛋白质代谢的重要器官，也是一可塑性器官。不同的代谢功能需
求和代谢变化(如运动、饮食的改变)，骨骼肌纤维大小和类型可产生相应的适应性
改变。高果糖饮食不仅可以导致胰岛素抵抗(IR)，而且用ATP酶染色可见慢肌纤
维比例的下降［15］。IR和糖尿病显示骨骼肌慢肌比例下降［1］。
Luquet等［16］首次使用PPARδ的转基因小鼠，观察到这种小鼠骨骼肌中慢肌
纤维比例的明显增加。Wang等［4］在 PPARδ转基因小鼠的研究中，运用慢肌
肌钙蛋白以及异染性染料ATP酶染色发现，PPARδ转基因小鼠的肌纤维类型发生
了明显改变，即快肌纤维向慢肌纤维的转换。
与转基因动物研究不同，以往的研究对于运动训练能否造成骨骼肌纤维从Ⅱ型肌纤
维(快肌类型)向Ⅰ型肌纤维(慢肌纤维)类型转换的结论并不一致。Demirel等［17］
注意到SD大鼠75%强度跑台训练10周的实验中，当训练时间为每天30 min和
60 min时，没有观察到足底肌MHC蛋白组成的改变，但训练时间延长至90 min
时观察到MHCs组成的改变。Perhonen等［18］Wistar大鼠跑台训练，测得的
趾长伸肌和比目鱼肌肌纤维组成无明显改变。近年来人们通过MHCs的观察研究，
在运动对骨骼肌纤维类型的影响上持有的观点渐趋一致:即耐力运动对骨骼肌的纤
维类型影响大多局限于Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx之间的转变。
本研究中以耐力训练为运动模型，对C57鼠进行15周的跑台训练(每天50 min)，
未观察到运动小鼠骨骼肌纤维比例以及肌球蛋白重链MHCs有明显肌纤维类型上
的转换。但在GW501516激动剂的长期干预下，小鼠骨骼肌纤维表现出从快肌纤
维向慢肌纤维的转换，尤其TG组可见明显增加。
我们的研究结果结合文献［4，16］报道说明，不同于单纯运动训练，无论是转
PPARδ基因还是PPARδ激动剂干预，都可以促使实验动物骨骼肌纤维类型的转
换。
我们还发现GW501516与耐力训练存在交互作用，这可能是运动会使骨骼肌长链
不饱和脂肪酸氧化增加，而使PPARδ内源性配体增加。因此，在同剂量激动剂干
预的情况下，由于运动因素的加入，加大了受体被激活的程度。此外，运动上调了
PGC-1α，PGC-1α与PPARδ相互应答，使二者的活性与表达协调共增，作用叠
加。
综上所述，本研究用小鼠外源性补充PPARδ激动剂GW501516并辅以运动的实
验模型，证实了单纯耐力训练和GW501516补充都可诱导小鼠骨骼肌线粒体生物
发生，同时GW501516补充促进了骨骼肌纤维类型从糖酵解型向有氧氧化型转换，
而单纯耐力训练未发生肌纤维类型转变。其机制可能为GW501516激活PPARδ
受体后，与受体共激活因子PGC1α协同作用，进而上调线粒体的生物合成，并促
使小鼠骨骼肌代谢类型的转化。
参考文献:
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2024年4月20日发(作者：独清晖)
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【摘 要】目的 观察和比较PPARδ激动剂GW501516补充和(或)耐力训练对骨骼
肌内源性PPARδ及PGC-1α表达、骨骼肌线粒体生物合成和骨骼肌肌纤维类型的
影响.方法 ♂ C57BL/6 小鼠随机分为5组:正常对照组(C)、耐力训练组(T)、低剂量
GW501516组(LG,3 mg·kg-1·d-1,po)、低剂量激动剂干预+训练组(TG)、高剂量
GW501516组(HG,10 mg·kg-1·d-1,po).15周实验期结束后,取腓肠肌以Western
blot法测定骨骼肌组织PPARδ、PGC-1α、COX Ⅳ 和MHCⅠ、MHCⅡ以及
MHCⅡa蛋白表达;骨骼肌ATP酶染色区分纤维类型以及透射电镜观察.结果 ① 与
C、T组比较,电镜下可见激动剂干预各组(LG、TG)线粒体数目明显增多,排列整
齐;② T、LG和TG组腓肠肌PPARδ、PGC-1α和COX Ⅳ蛋白表达量均较C组提
高,且激动剂和训练在3种指标变化中均有交互作用;③ 小鼠腓肠肌ATP酶染色发
现,与C组相比,T组的Ⅰ型肌纤维比例无变化;LG、TG组的Ⅰ型肌纤维增加,尤其以
TG组明显;④ T、LG、TG组的腓肠肌MHC Ⅱa蛋白表达量较C组提高,LG、TG
组腓肠肌MHC Ⅱ蛋白表达量较C组降低的同时表现出MHCI蛋白的明显增加.激
动剂和耐力训练在小鼠腓肠肌MHCs蛋白含量变化中有交互作用.结论 ① 耐力训
练与补充GW501516均可诱导骨骼肌线粒体生物合成;② GW501516补充可促进
骨骼肌纤维类型由Ⅱ型向Ⅰ型的转变,单纯运动训练未发生肌纤维类型的转变;③
GW501516补充与训练结合,在上调骨骼肌线粒体生物合成及肌纤维类型转变的过
程中有叠加作用.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2010(026)010
【总页数】6页(P1290-1295)
【关键词】PPARδ;GW501516;PGC-1α;线粒体;生物合成;肌纤维类型
【作 者】方海琴;张勇;许佑君;吴英良
【作者单位】天津体育学院天津市运动生理与运动医学重点实验室,天津,300381;
沈阳药科大学生命科学与生物制药学院,辽宁,沈阳,110016;天津体育学院天津市运
动生理与运动医学重点实验室,天津,300381;沈阳药科大学生命科学与生物制药学
院,辽宁,沈阳,110016;沈阳药科大学生命科学与生物制药学院,辽宁,沈阳,110016
【正文语种】中 文
【中图分类】R-332;R322.74;R329.24;R977.6
骨骼肌既是执行运动及调节机体葡萄糖、脂质、蛋白质代谢的重要器官，也是一可
塑性器官。人类许多代谢疾病如糖尿病等可出现肌萎缩、肌纤维类型改变［1］。
近来的报道指出［2］，在长时间静坐、少动人群中，由于线粒体不能完全氧化体
内脂肪酸导致不完全代谢产物蓄积，代谢疾病发生。苯氧乙酸化合物GW501516
已经进入三期临床试验，是目前受到人们关注最多的选择性PPARδ受体激动剂
［3］。PPARδ受体分布在骨骼肌和棕色脂肪等多种组织中，在控制脂肪酸氧化
方面起着重要作用，运动训练能导致此受体含量的增加。Wang等［4］2004年
报道在PPARδ转基因鼠中，骨骼肌由Ⅱ型向Ⅰ型发生了转变，COXⅡ、COXⅣ等
线粒体标志性蛋白含量明显升高，且耐力运动到力竭的时间和运动距离都远远高于
野生型。这些研究提示，PPARδ可能在促进骨髂肌线粒体的生物合成和骨骼肌肌
纤维发生代谢性质的转变中具有重要调节作用。因此，本研究以C57BL/6小鼠为
对象，观察和比较GW501516补充和(或)耐力训练对线粒体生物合成和骨骼肌肌
纤维类型的影响，并探讨其分子机制，以期为其用于肌萎缩/病理性肥大相关疾病、
残疾康复、糖尿病等代谢疾病的治疗提供初步的实验依据。
1 材料
1.1 动物 ♂ C57BL/6小鼠，体质量(20±2)g，由军事医学科学院实验动物中心提
供。小鼠购入后适应性喂养1周，苦味酸编号，单只分笼饲养，自由进食，每日
记录饮水量及激动剂干预量。实验总时程16周。
1.2 主要试剂与药品 GW501516由沈阳药科大学许佑君教授馈赠。PGC-1α一抗
(Santa Cruz CA)，PPARδ、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa和 β tubline
单抗(均购自ABcam公司)，HRP标记的二抗(中杉金桥生物技术公司)，甲苯胺蓝
(Amoroso)。
1.3 仪器设备 动物电动跑台(天津运动医学研究所)，台式高速低温离心机
AvantiTM30(Beckman Co，USA)，DU800型可见-紫外分光光度计(Beckman
Co，USA)，垂直电泳槽(Bio-Rad Co，USA)，蛋白转印槽(Bio-Rad Co，USA)，
稳压电泳仪(Lab net Co，USA)，BLATER 冰冻切片机(Attenpon Co，Ger-
many)，显微镜 AVNOX(Olympus Co，Japan)，透射电子显微镜(Philips
EM208S)。
2 方法
2.1 动物分组 80只C57BL/6小鼠随机分为5个组，分别为:对照组(C)、耐力运动
训练组(T)、低剂量GW501516组(LG)、低剂量GW501516并耐力运动训练组
(TG)，高剂量GW501516组(HG)，每组16只(剂量因素本论文不做讨论)。
2.2 实验动物激动剂干预及耐力训练模型 小鼠适应性喂养1 wk后，LG、HG和
TG小鼠开始随饮水补给GW501516，逐渐增量。补充剂量从1 mg·kg-1逐渐升
高至3 mg·kg-1及10 mg·kg-1时，分别固定在3 mg·kg-1和10 mg·kg-1的低、
高两个剂量。
参考文献［5］方法，T和TG组小鼠进行无坡度跑台训练，14 m·min-1，每次
50 min，每周5次，全程监控小鼠耐力训练，共15周。
2.3 动物取材及标本制备 各组小鼠均以10%水合氯醛(400 mg·kg-1，ip)麻醉后，
迅速取出腓肠肌。按纤维走行方向取部分腓肠肌，即刻按所需截面修正为约1
mm3的立方小块，迅速以电镜固定液固定，定时1 h，取出用磷酸缓冲液冲洗干
净，重复3次。将固定标本制备超薄切片，透射电镜观察，拍照，分析。另取部
分腓肠肌，剔除肌膜，迅速放入液氮预冷的异戊烷中，保存于-70℃;按照编号取出
相应的组织，待温度回升到-25℃时OTC包埋，冰冻切片，厚度为5 μm，每例样
本按照“一对一”连续切片，分别用于肌纤维类型(异染性染料ATP酶法)检测
［6］。剩余腓肠肌，液氮速冻，-80℃冻存备用。
2.4 小鼠腓肠肌ATP酶染色及肌纤维类型分析参照文献［6］(Ogilvie RW)以异染
性染料法测定腓肠肌ATP酶活性，并在Olympus显微照像系统下观察并拍照记
录。染色片中呈阳性的I型肌纤维显深蓝色，Ⅱa型纤维显浅蓝色，Ⅱb型骨骼肌
纤维为阴性未被着色，呈白色，IPP图像系统处理，电脑格度扫描，计算出各类肌
纤维的构成比例。
2.5 骨骼肌 PPARδ、PGC-1α、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa蛋白含量
测定［7］ 取适量液氮冻存骨骼肌组织匀浆，用 RIPA法提取骨骼肌中PPARδ蛋
白，NP-40法提取骨骼肌全细胞蛋白(PGC-1α、COXⅣ、MHCⅠ、MHCⅡ、
MHCⅡa)，以考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度，确定合适的上样量。蛋白电泳完毕
后，采用湿法将蛋白质电转印至PVDF膜，根据预染蛋白Marker剪取目的蛋白条
带。按各蛋白所用一抗的说明书，稀释一抗，4℃孵育过夜后，TBST洗膜，HRP
标记的二抗(中杉金桥生物技术公司)室温温育1～2 h;使用
LumiGLO®Chemiluminescent Substrate(KPL)进行发光底物孵育，曝光。使用
Quantity ONE(Bio-Rad)软件对目的蛋白进行光密度分析，以β-tubulin为内参
蛋白。目的蛋白相对含量=目的蛋白灰度值/β-tubulin蛋白灰度值。
2.6 统计学处理 激动剂补充与耐力训练为本实验涉及的两种干预因素，两个因素
既有单独效应也表现出交互作用，故采用SPSS 13.0软件中的2*2析因分析法进
行统计分析检验。实验结果以±s表示。
3 结果
3.1 小鼠腓肠肌超微结构观察 如Fig 1所示:透射电镜6 000倍下观察，小鼠骨骼
肌超微结构显示出:无激动剂干预的C组和T组，线粒体呈粒状或杆状，体积小、
数目相对较少;激动剂干预各组(LG、TG)线粒体呈椭圆形，排列整齐，数目明显增
多，提示线粒体的生物合成增加。
Fig 1 Transmission EM photos of mice’s gastrocnemius muscles(×6
000)C:Control;T:Training;LG:Low dose GW501516(3 mg·kg-1·d-
1);TG:Training and low dose GW501516(3 mg·kg-1·d-1)
3.2 GW501516及耐力训练对小鼠腓肠肌PPARδ、PGC-1α和 COXIV及 MHCs
蛋白表达的影响 如Fig 2所示:A图中，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.01)和TG组(P
＜0.05)小鼠腓肠肌PPARδ蛋白表达量均较C组提高;B图中，T组(P＜0.05)、LG
组(P＜0.05)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌PGC-1α蛋白表达量均较C组提高;C图
中，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌COXIV蛋白表
达量均较C组提高;激动剂和训练在小鼠骨骼肌以上各蛋白表达量变化中均有交互
作用(P＜0.05)。
Fig 2 The protein expression of PPARδ，PGC-1α，COXIV and MHCs in
mice’s gastrocnemiusA:PPARδ;B:PGC-1α;C:COXIV;D:MHCⅠ;E:MHC
Ⅱ;F:MHCⅡa.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 exhibited
additional enhancing effects in TG group by GW501516 and training
D图中，LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌MHCⅠ蛋白表达量均较C
组提高，T组较C组无增加;E图中LG组(P＜0.01)和TG组(P＜0.05)小鼠腓肠肌
MHCⅡ蛋白表达量均较C组降低;F图中，T组(P＜0.05)、LG组(P＜0.05)和TG
组(P＜0.05)小鼠腓肠肌MHCⅡa蛋白表达量均较C组提高;激动剂和训练在小鼠
腓肠肌MHCⅠ、MHCⅡ、MHCⅡa蛋白含量变化中有交互作用(P＜0.05)。
3.3 小鼠腓肠肌异染性染料ATP酶染色图片分析如Fig 3所示，T组(P＜0.05)、
LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.01)Ⅱb型肌纤维(%)均较C组降低;T组(P＜0.05)、
LG组(P＜0.05)和TG组(P＜0.01)Ⅱa型肌纤维(%)均较C组提高;相对于C组，T
组的Ⅰ型肌纤维比例无变化;TG组的Ⅰ型肌纤维明显增加。激动剂和训练在小鼠各
型肌纤维(%)变化中有交互作用(P＜0.01)。
Fig 3 Metachromatic staining of mice’s gastrocnemius(A)and the analysis
of muscle types(%)(B)A:TypeⅠ fibers were stained dark blue，type Ⅱa
fibers were stained light blue，and TypeⅡb fibers were white;*P ＜0.05 vs
control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 exhibited additional enhancing effects in TG
group by GW501516 and training
4 讨论
Oliver等［3］在 2003 年研发了 GW501516，此化合物对PPARδ的激动作用具
有很强的选择性，其选择性高出其它亚型1 000倍，在nmol·L-1的浓度水平就可
以激动PPARδ。Wang等［4］实验证明在服用GW501516激动剂10 d后，
C57鼠的线粒体生物合成和呼吸氧化和骨骼肌慢肌纤维的基因皆有上调。
线粒体的生物合成(mitochondrial biogenesis)，是指线粒体的种系发生也可以指
线粒体的个体发生的过程。细胞内线粒体的生物合成至少包括以下两种改变:①单
位体积组织中线粒体含量的改变，②线粒体本身成分的改变，如线粒体蛋白/磷脂
的构成比例的改变。线粒体生物合成是一个复杂的过程，包括核基因和线粒体基因
的激活、转录、翻译、蛋白质前体的运输以及进入线粒体的蛋白质的正确组装等多
个步骤。运动和电刺激引起的肌肉收缩会诱导线 粒 体 生 物 合 成 已 成 共 识［8-
9］。PGC-1α 即PPARGC-1α(PPAR γ coactivator-1α)是线粒体合成途径中一个
关键因子［10］，其属于 PGC-1家族，是PPAR γ的转录辅激活因子，也是通用
的辅激活因子，同时PGC-1α是PPAR s及甲状腺素受体(TR)的强烈转录协同刺激
因子，对线粒体的生物合成和细胞能量代谢起着关键的调控作用［11］。另有Lin
等［12］研究发现，PGC-1α是I型肌纤维的生理性调节因子，当PGC-1α在富
含Ⅱ型纤维(快肌纤维)的肌肉里表达升高时，其可导致肌肉形态、基因及功能发生
变化，促进I型肌纤维的形成。Arany等［13］曾报道PGC-1α的辅因子PGC-
1β的增多上调了线粒体生物合成，使骨骼肌纤维的Ⅱx型纤维增多。
PGC-1α的表达受很多因素影响，已明确PGC-1α可以与大多数核激素受体包括
PPARδ在内的超家族成员，以不同的方式与其发生分子对接，进而调控其生物学
功能［14］，这也提示可以考虑从激活PPARδ上调PGC-1α的表达，增加由
PGC-1α调控的线粒体生物合成分子机制的为切入点进行研究观察。
我们参考Arany等［13］的实验方法，用电镜观察骨骼肌超微结构，也发现了
GW501516补充组小鼠骨骼肌线粒体合成明显增加。从蛋白分析结果可以看出，
GW501516补充可明显增加小鼠骨骼肌PGC-1α、COXIV蛋白含量，说明伴随着
PPARδ受体的激活，诱导了小鼠骨骼肌的线粒体生物合成。
骨骼肌由慢缩肌纤维和快缩肌纤维组成。根据肌球蛋白ATP酶染色或(和)肌球蛋
白重链(myosin heavy chain，MHC)异构体的表达，成年啮齿动物骨骼肌纤维可
单纯地分为Ⅰ型(氧化型慢缩肌，线粒体极为丰富)和Ⅱa型(糖氧化型快缩肌)、Ⅱb
型(糖酵解型快缩肌)、Ⅱx型(介于Ⅱa与Ⅱb之间)。骨骼肌既是执行运动及调节机
体葡萄糖、脂质、蛋白质代谢的重要器官，也是一可塑性器官。不同的代谢功能需
求和代谢变化(如运动、饮食的改变)，骨骼肌纤维大小和类型可产生相应的适应性
改变。高果糖饮食不仅可以导致胰岛素抵抗(IR)，而且用ATP酶染色可见慢肌纤
维比例的下降［15］。IR和糖尿病显示骨骼肌慢肌比例下降［1］。
Luquet等［16］首次使用PPARδ的转基因小鼠，观察到这种小鼠骨骼肌中慢肌
纤维比例的明显增加。Wang等［4］在 PPARδ转基因小鼠的研究中，运用慢肌
肌钙蛋白以及异染性染料ATP酶染色发现，PPARδ转基因小鼠的肌纤维类型发生
了明显改变，即快肌纤维向慢肌纤维的转换。
与转基因动物研究不同，以往的研究对于运动训练能否造成骨骼肌纤维从Ⅱ型肌纤
维(快肌类型)向Ⅰ型肌纤维(慢肌纤维)类型转换的结论并不一致。Demirel等［17］
注意到SD大鼠75%强度跑台训练10周的实验中，当训练时间为每天30 min和
60 min时，没有观察到足底肌MHC蛋白组成的改变，但训练时间延长至90 min
时观察到MHCs组成的改变。Perhonen等［18］Wistar大鼠跑台训练，测得的
趾长伸肌和比目鱼肌肌纤维组成无明显改变。近年来人们通过MHCs的观察研究，
在运动对骨骼肌纤维类型的影响上持有的观点渐趋一致:即耐力运动对骨骼肌的纤
维类型影响大多局限于Ⅱa，Ⅱb，Ⅱx之间的转变。
本研究中以耐力训练为运动模型，对C57鼠进行15周的跑台训练(每天50 min)，
未观察到运动小鼠骨骼肌纤维比例以及肌球蛋白重链MHCs有明显肌纤维类型上
的转换。但在GW501516激动剂的长期干预下，小鼠骨骼肌纤维表现出从快肌纤
维向慢肌纤维的转换，尤其TG组可见明显增加。
我们的研究结果结合文献［4，16］报道说明，不同于单纯运动训练，无论是转
PPARδ基因还是PPARδ激动剂干预，都可以促使实验动物骨骼肌纤维类型的转
换。
我们还发现GW501516与耐力训练存在交互作用，这可能是运动会使骨骼肌长链
不饱和脂肪酸氧化增加，而使PPARδ内源性配体增加。因此，在同剂量激动剂干
预的情况下，由于运动因素的加入，加大了受体被激活的程度。此外，运动上调了
PGC-1α，PGC-1α与PPARδ相互应答，使二者的活性与表达协调共增，作用叠
加。
综上所述，本研究用小鼠外源性补充PPARδ激动剂GW501516并辅以运动的实
验模型，证实了单纯耐力训练和GW501516补充都可诱导小鼠骨骼肌线粒体生物
发生，同时GW501516补充促进了骨骼肌纤维类型从糖酵解型向有氧氧化型转换，
而单纯耐力训练未发生肌纤维类型转变。其机制可能为GW501516激活PPARδ
受体后，与受体共激活因子PGC1α协同作用，进而上调线粒体的生物合成，并促
使小鼠骨骼肌代谢类型的转化。
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