2024年4月21日发(作者：温世韵)
中华临床医师杂志（电子舨）２０１２年２月第６卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｆｅｂｒｕａｒｙ１５，２０１２，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．４
・
新技术・新方法・
酶偶联法测定１，５．脱水葡糖苷方法学建立
张颖于永光刘倩
Ｍｅｔｈｏｄ：ＥＮＤ；Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｌｏｐｅ＋；Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ １：Ｆｉｒｓｔｏ ０；Ｌａｓｔ
１０；Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ ２：Ｆｉｒｓｔｏ １１；Ｌａｓｔ ２７。
１，５－脱水葡糖苷（１，５－Ａｎｈｙｄｒｏｇｕｃｉｔｏｌ，１，５－ＡＧ）又称Ｉ，５－脱水
山梨醇，是呋喃葡萄糖的ｃｌ脱氧形式，存在于人的血浆和脑脊
液中，正常人血浆中１，５－ＡＧ比较稳定，不受饮食影响。有资料
表明，血浆葡萄糖＞８．３ ｍｍｏｌ／Ｌ者，无一例伴有高水平的血浆
１，５－ＡＧ，无论１型或２型糖尿病，其血浆１，５－ＡＧ水平均低于正
常人水平，ｌ型糖尿患者较之２型糖尿患者尤甚。当糖尿病得到
控制时血浆１，５－ＡＧ逐渐回升，所以血浆１，５－ＡＧ测定越来越受
到重视¨引。由于已有的酶法测定１，５－ＡＧ操作复杂，当前开展
此项检查的实验室较少，我们改进了一个简便、快速的酶偶联法
测定１，５－脱水葡糖苷试剂盒并对其评价。
一
、
材料与方法
１．实验仪器：１３本ＯＬＹＭＰＵＳ—ＡＵ５４００全自动生化分析仪。
２．实验试剂：氧化型辅酶Ⅱ（ＮＡＤＰ）（上海丽珠东风生物技
术有限公司产品）；二磷酸腺酐（ＡＤＰ）（罗氏公司产品）。ＡＤＰ
依赖的己糖激酶（ＡＤＰ－ＨＫＴｌＩ）、葡糖醇．６－磷酸脱氢酶（ＡＧ－６一
ＰｄＨＩＩ）（日本旭化成株式会社），缓冲液为８００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—
ＨＣ１，内含防腐剂、稳定剂、表面活性剂适量，最终ｐＨ ９．５。基质
液：称取ＮＡＤＰ ９９０ ｍｇ、ＡＤＰ １６９．６ ｍｇ、比活４２７．３ Ｕ／ｍｌ的ＡＤＰ—
ＨＫＴｌＩ １１．７ ｍｌ，加入到６ＯＯ ｍｌ缓冲液中，最后补足至８００ ｍｌ为
试剂Ｉ。取比活４１０ Ｕ／ｍｌ的ＡＧ－６－ＰｄＨＩ１ ２．４４ ｍｌ加入到１５０ ｍｌ
的缓冲液中，最后补足至２００ ｍｌ此为试剂Ⅱ。此时ＮＡＤＰ的终
浓度为２．８ ｍｍｏｌ／Ｌ、ＡＤＰ．ＨＫＴ ＩＩ的终浓度５０００ Ｕ／Ｌ、ＡＤＰ终浓
度０．７２ ｍｍｏｌ／Ｌ、ＡＧ－６．Ｐ ｄＨ ＩＩ终浓度１０００ Ｕ／Ｌ。１，５－ＡＧ检测使
用自行研制试剂盒，血糖检测为氧化酶法，使用日本奥林巴斯公
司产品。
３．实验分组：选取我院２００８年１～７月收治的２型糖尿病
患者９２例（男５１例，４６—６８岁；女４ｌ例，年龄４２～６７岁），均符
合１９９７年ＷＨＯ糖尿病分类诊断标准，其中空腹血糖浓度７．６～
３５．９ ｍｍｏｌ／Ｌ。健康对照组选自我院健康体检者１０６例（男５６
例，４２岁～６８岁；女５０例，４０～６７岁），其空腹血糖浓度３．６—
５．９ ｍｍｏｌ／Ｌ。
４．标本采集：糖尿病患者及健康体检者禁食１２ ｈ后，清晨
采集静脉血。
５．测定原理：
ＡＤＰ＋１，５－ＡＧ ＡＤＰ—ＨＫＴⅡ ＡＭＰ
＋１，５－ＡＧ－６－Ｐ
Ｇ６
ＰＤ
Ｈ
Ｕ
１ ５ ＡＧ－．．
５．ＡＧ－６．Ｐ＋
６ Ｐ ＮＡＤＰ ．＋
—Ａ
————————＿＿＋Ｃ‘
——
，
＿＿＋ｃ６Ｈｌｌ０８Ｈ ０ Ｐ ＮＡＤＰＨ＋Ｈ １ｌ口＋ ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ
该反应在３４０ ｎｎｌ有吸光度的上升，上升幅度与１，５－ＡＧ浓
度成正比。
ＯＬＹＭＰＵＳ－ＡＵ５４００全自动生化分析仪主要参数设置；Ｓａｍ．
ｐｉｅ：Ｖｏｌｕｍｅ ２０；Ｒ１ Ｖｏｌｕｍｅ １６０；Ｒ２ Ｖｏｌｕｍｅ ２０；Ｗａｖｅｌｅｅｎｇｔｈ：３４０；
ＤＯＩ：１０．３８７７／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－０７８５．２０１２．０４．０５７
作者单位：１５０００１ 哈尔滨医科大学附属第一医院体检中心（张
颖），检验科（于永光、刘倩）
通讯作者：于永光，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｙｏｎｇｇｕａｎｇ１９５７＠１６３．ｔｏｍ
计算：１，５－ＡＧ（ｐ．ｍｏｌ／Ｌ）＝ＡＡｕ×ＡＡＳ～Ｘ Ｃｓ；ＡＡｕ＝
ＡＡｕ２一ＡＡｕｌ；ＡＡＳ＝ＡＡＳ２一ＡＡＳ１；其中ＡＡｕ代表测定管吸
光度差值，ＡＡＳ代表标准管吸光度差值，ｃｓ代表标准液浓度。
６．统计学分析：应用ＳＰＳＳ １３．０统计学软件，对１０６例健康
对照组和９２例２型糖尿病患者血清１，５－ＡＧ和血糖用均数±标
准差（ ±ｓ）表示，两组间计量资料的比较用显著性ｔ检验，Ｐ＜
０．０５有统计学意义。
二、结果
１．内源性ＮＡＤＰ消耗：因为血液中存在着谷氨酸脱氢酶、乳
酸脱氢酶、谷草转氨酶等可利用ＮＡＤ（Ｐ）而发生内源性消耗，可
使测定结果不准确。我们的ＮＡＤＰ法基质加血清在３７℃观察
３４０ ｎｎｌ有吸光度上升，结果在３ ｍｉｎ达到平衡，所以在３ ｍｉｎ后
加入第二试剂（ＡＧ－６－ＰｄＨＩＩ），启动反应。
２．不同浓度的氧化型辅酶Ⅱ对反应速度的影响（图１）：
ＮＡＤＰ浓度２．８ ｍｍｏｌ／Ｌ达最大反应速度，再增加ＮＡＤＰ浓度，反
应速度不再增加。
３．ＡＤＰ—ＨＫＴＩＩ浓度对反应速度的影响（图２）：ＡＤＰ—ＨＫＴＩＩ
作为第一试剂——限速酶，在５．０ ｋＵ／Ｌ时达最大反应速度，由
此确定试剂盒的ＡＤＰ—ＨＫＴ ＩＩ最终浓度为５．０ ｋＵ／Ｌ。
４．ＡＧ－６ＰＤＨＩＩ对反应速度的影响（图３）：ＡＧ－６ＰＤＨ Ｉ１浓度
为１．０ ｋＵ／Ｌ时达到最大反应速度，可作为第二试剂加人。
５．不同ｐＨ对反应速度的影响（图４）：使用Ｔｒｉｓ・ＨＣ１做ｐＨ
８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５的缓冲液，测试其最大点反应速
度。结果ｐＨ ９～１０时有最大反应速度。
６．方法的线性实验（图５）：制作０．２、０．４、０．６、０．８、
１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的１，５－ＡＧ标准液，测定其线性范围。该法测定的最
大线性范围可达０．８０ ｍｍｏｌ／Ｌ。
７．试剂盒稳定性实验（图６）：实验用浓度０．４ ｍｍｏｌ／Ｌ的１，
５－ＡＧ，在相同条件下，检测在４℃保存的试剂盒单位时间的吸光
变化，这样能够反映试剂盒酶和辅酶的稳定性。酶偶联法测定
１，５－ＡＧ试剂盒在４℃密封条件下保存１年，酶活力下降１５％左
右。基本可以满足临床要求。
８．１，５－ＡＧ检测临床应用观察（表１）：通过对我院１０６例健
康体检者和９２例２型糖尿病患者血清１，５－ＡＧ、空腹血糖检测，
结果显示健康对照组与糖尿病组１，５－ＡＧ、血糖均有统计学差异
（Ｐ＜０．０５）。
表１健康对照组、糖尿病组ｌ，５－ＡＧ、血糖测定（ｍｍｏｌ／Ｌ，元±ｓ）
９．使用高、中、低三水平１，５－ＡＧ做重复性实验（表２）：１，５一
ＡＧ在０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ时有较好的重复性。
２０１２年２月第６卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｆｅｂｒｕａｒｙ １５ ２ｏ ０１．
表２ １，５－ＡＧ重复性实验
我们ＮＡＤＰ法基质加血清在３７℃观察３４０ ａｍ有吸光度上升，结
果在３ ｍｉｎ达到平衡，所以在３ ｍｉｎ后加入（ＡＧ－６一ＰｄＨⅡ）第二试
剂，启动反应。在本项试剂盒研制过程中可以使用的色源有两
种即辅酶Ｉ和辅酶Ⅱ，辅酶Ⅱ比辅酶Ｉ特异性高所以选择了辅
酶Ⅱ。为了降低达到平衡时间试剂盒加入抗干扰剂。试剂盒还
采用了表面活性剂降低溶血和乳糜血的干扰。
本论文侧重于一项酶偶联法１，５－ＡＧ试剂盒的研制，对于试
１０．回收实验：使用１．０５６、０．２６０、０．１４２ ｍｍｏｌ／Ｌ的１，５－ＡＧ 剂盒的技术指标主要包括：试剂盒的有效期（一般为１年），这项
标准品做回收实验，回收率分别是１０４．２％、９８．５％和９６．１％。
指标用稳定性来衡量；试剂盒的准确性，用回收率来衡量，回收
行业要求的酶试剂盒回收率在９５％～１０５％。 率在９５％～１０５％为符合行业标准；重复性用ＣＶ值衡量，一般在
三、讨论
５％以下为合格；线性范围其高值越高越好，低值越低越好，这样
１，５－ＡＧ测定方法有多种，如高分辨率气象色谱－质谱分析
才有较大的线性范围，当然这要与生化分析仪配合使用，设置好
（ＧＣ．ＭＳ）、高效液相色谱法、微柱层析法等。这些方法较灵敏，
参数才能使试剂盒获得最好的检测结果 Ｊ。我们研制的试剂盒
但操作繁琐、费时、设备要求高。而酶法测定具有简便、特异性
进行了上述指标检测，其检测值也在允许范围，除上述指标外试
高、微量、快速的特点。在日本学者田添荣、三池彰的酶法测定
剂盒配方设计还应考虑抗干扰能力等。
１，５－脱水山梨醇试剂盒专利中并未涉及该发明的有效期。而在
（本文图片见光盘）
具体应用举例中列举的试剂种类酶、辅酶、色源、表面活性剂、稳
定剂等有三十余种Ｈ Ｊ，我们在此基础上进行了改进，并利用研制
参考文献
酮体试剂盒时获得的防腐技术、酶稳定技术、抗干扰等专利技术
研制了两个酶参与的试剂盒 ，价格较低廉。包括ＯＬＹＭＰＵＳ－
［１］ 于永光，张颖．血清１，５－脱水葡糖苷浓度变化与糖尿病酮症酸中
ＡＵ５４００在内的多数生化分析仪测试时间一般不超过１０ ｍｉｎ，所
毒监测的研究．中国急救医学，２００８，２８：６４３－６４４．
以检测步骤复杂的就不能在生化分析仪上进行。关于ＡＤＰ—ＨＫＴ
［２］ 陈家坚，叶余辉，温卓莲，等．１，５－脱水葡萄糖醇对糖尿病的诊断
Ⅱ，此酶是一个特异性较差的己糖激酶，所以作为试剂Ｉ，设置
价值．中国糖尿病杂志，２０１０，１８：１９８－２００．
参数在最初的３ ｍｉｎ内消除内源性谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、
［３］ 张颖．１，５．脱水．Ｄ一山梨醇对糖尿病早期诊断的意义．天津医科大
谷草转氨酶、葡萄糖等的干扰，在本实验中ＡＤＰ依赖的己糖激
学．２００８． ’
酶的浓度为５．０ ｋＵ／Ｌ。用本方法测定１，５－ＡＧ的波长是３４０ ｎｍ，
［４］ 田添荣，三池彰．１，５－脱水山梨醇的定量方法及定量试剂．中华人
与日本协和公司的试剂盒相比，检测线性范围小一些，但本项检
民共和国发明专利，专利号９９１２４７９９．Ｘ．
测在诊断糖尿病时，检测值低于正常值才有意义，故不影响其Ｉ临
［５］ 陈正炎．临床生物化学和生物化学检验试验指导．北京：人民卫生
出版社，１９９９：２４８－２５１．
床应用。关于１，５－ＡＧ用于糖尿病的诊断，较多文献认为，１，５一
［６］ 于永光，周艳春，李晓光．酶法测定乙酰乙酸试剂盒．中华人民共
ＡＧ与血浆葡萄糖、ＨｂＡｌｃ和果糖胺呈明显负相关 。本文
和国发明专利，专利号１９９１１２９６６．０．２００４－９－２９．
侧重于１，５－ＡＧ试剂盒的质量评价，故对其临床意义未做详细研
［７］ Ｋａｓｈｉｎｅ Ｓ，Ｋｉｓｈｉｄａ Ｋ，Ｆｕｎａｈａｓｈｉ Ｔ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｉｓｔ
究。但就本文１０６例健康对照组和９２例２型糖尿病患者所做的
ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆｆ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｌｅｅｐ—ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ
血糖和血浆１，５－ＡＧ结果与已有报道相似 ，但Ｐ＜０．０５，这可
ｂｒｅａｔｈｉｎｇ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｗｉｈｔ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅＵｉｔｕｓ．Ｉｎｔｅｒｎ
能与本实验选取２型糖尿病患者有关，更详细的结果有待于进
Ｍｅｄ，２０１１，５０：１８９５—１９０３．
一
步的研究。
（收稿日期：２０１１－０９—１６）
因为血液中存在着谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶
（本文编辑：戚红丹）
等也可以利用ＮＡＤ（Ｐ）而发生内源消耗，可以使结果不准确。
张颖，于永光，刘倩．酶偶联法测定１，５－脱水葡糖苷方法学建立［Ｊ／ＣＤ］．中华临床医师杂志：电子版，２０１２，６（４）：１０３１－１０３２
2024年4月21日发(作者：温世韵)
中华临床医师杂志（电子舨）２０１２年２月第６卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｆｅｂｒｕａｒｙ１５，２０１２，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．４
・
新技术・新方法・
酶偶联法测定１，５．脱水葡糖苷方法学建立
张颖于永光刘倩
Ｍｅｔｈｏｄ：ＥＮＤ；Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｌｏｐｅ＋；Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ １：Ｆｉｒｓｔｏ ０；Ｌａｓｔ
１０；Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ ２：Ｆｉｒｓｔｏ １１；Ｌａｓｔ ２７。
１，５－脱水葡糖苷（１，５－Ａｎｈｙｄｒｏｇｕｃｉｔｏｌ，１，５－ＡＧ）又称Ｉ，５－脱水
山梨醇，是呋喃葡萄糖的ｃｌ脱氧形式，存在于人的血浆和脑脊
液中，正常人血浆中１，５－ＡＧ比较稳定，不受饮食影响。有资料
表明，血浆葡萄糖＞８．３ ｍｍｏｌ／Ｌ者，无一例伴有高水平的血浆
１，５－ＡＧ，无论１型或２型糖尿病，其血浆１，５－ＡＧ水平均低于正
常人水平，ｌ型糖尿患者较之２型糖尿患者尤甚。当糖尿病得到
控制时血浆１，５－ＡＧ逐渐回升，所以血浆１，５－ＡＧ测定越来越受
到重视¨引。由于已有的酶法测定１，５－ＡＧ操作复杂，当前开展
此项检查的实验室较少，我们改进了一个简便、快速的酶偶联法
测定１，５－脱水葡糖苷试剂盒并对其评价。
一
、
材料与方法
１．实验仪器：１３本ＯＬＹＭＰＵＳ—ＡＵ５４００全自动生化分析仪。
２．实验试剂：氧化型辅酶Ⅱ（ＮＡＤＰ）（上海丽珠东风生物技
术有限公司产品）；二磷酸腺酐（ＡＤＰ）（罗氏公司产品）。ＡＤＰ
依赖的己糖激酶（ＡＤＰ－ＨＫＴｌＩ）、葡糖醇．６－磷酸脱氢酶（ＡＧ－６一
ＰｄＨＩＩ）（日本旭化成株式会社），缓冲液为８００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—
ＨＣ１，内含防腐剂、稳定剂、表面活性剂适量，最终ｐＨ ９．５。基质
液：称取ＮＡＤＰ ９９０ ｍｇ、ＡＤＰ １６９．６ ｍｇ、比活４２７．３ Ｕ／ｍｌ的ＡＤＰ—
ＨＫＴｌＩ １１．７ ｍｌ，加入到６ＯＯ ｍｌ缓冲液中，最后补足至８００ ｍｌ为
试剂Ｉ。取比活４１０ Ｕ／ｍｌ的ＡＧ－６－ＰｄＨＩ１ ２．４４ ｍｌ加入到１５０ ｍｌ
的缓冲液中，最后补足至２００ ｍｌ此为试剂Ⅱ。此时ＮＡＤＰ的终
浓度为２．８ ｍｍｏｌ／Ｌ、ＡＤＰ．ＨＫＴ ＩＩ的终浓度５０００ Ｕ／Ｌ、ＡＤＰ终浓
度０．７２ ｍｍｏｌ／Ｌ、ＡＧ－６．Ｐ ｄＨ ＩＩ终浓度１０００ Ｕ／Ｌ。１，５－ＡＧ检测使
用自行研制试剂盒，血糖检测为氧化酶法，使用日本奥林巴斯公
司产品。
３．实验分组：选取我院２００８年１～７月收治的２型糖尿病
患者９２例（男５１例，４６—６８岁；女４ｌ例，年龄４２～６７岁），均符
合１９９７年ＷＨＯ糖尿病分类诊断标准，其中空腹血糖浓度７．６～
３５．９ ｍｍｏｌ／Ｌ。健康对照组选自我院健康体检者１０６例（男５６
例，４２岁～６８岁；女５０例，４０～６７岁），其空腹血糖浓度３．６—
５．９ ｍｍｏｌ／Ｌ。
４．标本采集：糖尿病患者及健康体检者禁食１２ ｈ后，清晨
采集静脉血。
５．测定原理：
ＡＤＰ＋１，５－ＡＧ ＡＤＰ—ＨＫＴⅡ ＡＭＰ
＋１，５－ＡＧ－６－Ｐ
Ｇ６
ＰＤ
Ｈ
Ｕ
１ ５ ＡＧ－．．
５．ＡＧ－６．Ｐ＋
６ Ｐ ＮＡＤＰ ．＋
—Ａ
————————＿＿＋Ｃ‘
——
，
＿＿＋ｃ６Ｈｌｌ０８Ｈ ０ Ｐ ＮＡＤＰＨ＋Ｈ １ｌ口＋ ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ
该反应在３４０ ｎｎｌ有吸光度的上升，上升幅度与１，５－ＡＧ浓
度成正比。
ＯＬＹＭＰＵＳ－ＡＵ５４００全自动生化分析仪主要参数设置；Ｓａｍ．
ｐｉｅ：Ｖｏｌｕｍｅ ２０；Ｒ１ Ｖｏｌｕｍｅ １６０；Ｒ２ Ｖｏｌｕｍｅ ２０；Ｗａｖｅｌｅｅｎｇｔｈ：３４０；
ＤＯＩ：１０．３８７７／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－０７８５．２０１２．０４．０５７
作者单位：１５０００１ 哈尔滨医科大学附属第一医院体检中心（张
颖），检验科（于永光、刘倩）
通讯作者：于永光，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｙｏｎｇｇｕａｎｇ１９５７＠１６３．ｔｏｍ
计算：１，５－ＡＧ（ｐ．ｍｏｌ／Ｌ）＝ＡＡｕ×ＡＡＳ～Ｘ Ｃｓ；ＡＡｕ＝
ＡＡｕ２一ＡＡｕｌ；ＡＡＳ＝ＡＡＳ２一ＡＡＳ１；其中ＡＡｕ代表测定管吸
光度差值，ＡＡＳ代表标准管吸光度差值，ｃｓ代表标准液浓度。
６．统计学分析：应用ＳＰＳＳ １３．０统计学软件，对１０６例健康
对照组和９２例２型糖尿病患者血清１，５－ＡＧ和血糖用均数±标
准差（ ±ｓ）表示，两组间计量资料的比较用显著性ｔ检验，Ｐ＜
０．０５有统计学意义。
二、结果
１．内源性ＮＡＤＰ消耗：因为血液中存在着谷氨酸脱氢酶、乳
酸脱氢酶、谷草转氨酶等可利用ＮＡＤ（Ｐ）而发生内源性消耗，可
使测定结果不准确。我们的ＮＡＤＰ法基质加血清在３７℃观察
３４０ ｎｎｌ有吸光度上升，结果在３ ｍｉｎ达到平衡，所以在３ ｍｉｎ后
加入第二试剂（ＡＧ－６－ＰｄＨＩＩ），启动反应。
２．不同浓度的氧化型辅酶Ⅱ对反应速度的影响（图１）：
ＮＡＤＰ浓度２．８ ｍｍｏｌ／Ｌ达最大反应速度，再增加ＮＡＤＰ浓度，反
应速度不再增加。
３．ＡＤＰ—ＨＫＴＩＩ浓度对反应速度的影响（图２）：ＡＤＰ—ＨＫＴＩＩ
作为第一试剂——限速酶，在５．０ ｋＵ／Ｌ时达最大反应速度，由
此确定试剂盒的ＡＤＰ—ＨＫＴ ＩＩ最终浓度为５．０ ｋＵ／Ｌ。
４．ＡＧ－６ＰＤＨＩＩ对反应速度的影响（图３）：ＡＧ－６ＰＤＨ Ｉ１浓度
为１．０ ｋＵ／Ｌ时达到最大反应速度，可作为第二试剂加人。
５．不同ｐＨ对反应速度的影响（图４）：使用Ｔｒｉｓ・ＨＣ１做ｐＨ
８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５的缓冲液，测试其最大点反应速
度。结果ｐＨ ９～１０时有最大反应速度。
６．方法的线性实验（图５）：制作０．２、０．４、０．６、０．８、
１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ的１，５－ＡＧ标准液，测定其线性范围。该法测定的最
大线性范围可达０．８０ ｍｍｏｌ／Ｌ。
７．试剂盒稳定性实验（图６）：实验用浓度０．４ ｍｍｏｌ／Ｌ的１，
５－ＡＧ，在相同条件下，检测在４℃保存的试剂盒单位时间的吸光
变化，这样能够反映试剂盒酶和辅酶的稳定性。酶偶联法测定
１，５－ＡＧ试剂盒在４℃密封条件下保存１年，酶活力下降１５％左
右。基本可以满足临床要求。
８．１，５－ＡＧ检测临床应用观察（表１）：通过对我院１０６例健
康体检者和９２例２型糖尿病患者血清１，５－ＡＧ、空腹血糖检测，
结果显示健康对照组与糖尿病组１，５－ＡＧ、血糖均有统计学差异
（Ｐ＜０．０５）。
表１健康对照组、糖尿病组ｌ，５－ＡＧ、血糖测定（ｍｍｏｌ／Ｌ，元±ｓ）
９．使用高、中、低三水平１，５－ＡＧ做重复性实验（表２）：１，５一
ＡＧ在０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ时有较好的重复性。
２０１２年２月第６卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｆｅｂｒｕａｒｙ １５ ２ｏ ０１．
表２ １，５－ＡＧ重复性实验
我们ＮＡＤＰ法基质加血清在３７℃观察３４０ ａｍ有吸光度上升，结
果在３ ｍｉｎ达到平衡，所以在３ ｍｉｎ后加入（ＡＧ－６一ＰｄＨⅡ）第二试
剂，启动反应。在本项试剂盒研制过程中可以使用的色源有两
种即辅酶Ｉ和辅酶Ⅱ，辅酶Ⅱ比辅酶Ｉ特异性高所以选择了辅
酶Ⅱ。为了降低达到平衡时间试剂盒加入抗干扰剂。试剂盒还
采用了表面活性剂降低溶血和乳糜血的干扰。
本论文侧重于一项酶偶联法１，５－ＡＧ试剂盒的研制，对于试
１０．回收实验：使用１．０５６、０．２６０、０．１４２ ｍｍｏｌ／Ｌ的１，５－ＡＧ 剂盒的技术指标主要包括：试剂盒的有效期（一般为１年），这项
标准品做回收实验，回收率分别是１０４．２％、９８．５％和９６．１％。
指标用稳定性来衡量；试剂盒的准确性，用回收率来衡量，回收
行业要求的酶试剂盒回收率在９５％～１０５％。 率在９５％～１０５％为符合行业标准；重复性用ＣＶ值衡量，一般在
三、讨论
５％以下为合格；线性范围其高值越高越好，低值越低越好，这样
１，５－ＡＧ测定方法有多种，如高分辨率气象色谱－质谱分析
才有较大的线性范围，当然这要与生化分析仪配合使用，设置好
（ＧＣ．ＭＳ）、高效液相色谱法、微柱层析法等。这些方法较灵敏，
参数才能使试剂盒获得最好的检测结果 Ｊ。我们研制的试剂盒
但操作繁琐、费时、设备要求高。而酶法测定具有简便、特异性
进行了上述指标检测，其检测值也在允许范围，除上述指标外试
高、微量、快速的特点。在日本学者田添荣、三池彰的酶法测定
剂盒配方设计还应考虑抗干扰能力等。
１，５－脱水山梨醇试剂盒专利中并未涉及该发明的有效期。而在
（本文图片见光盘）
具体应用举例中列举的试剂种类酶、辅酶、色源、表面活性剂、稳
定剂等有三十余种Ｈ Ｊ，我们在此基础上进行了改进，并利用研制
参考文献
酮体试剂盒时获得的防腐技术、酶稳定技术、抗干扰等专利技术
研制了两个酶参与的试剂盒 ，价格较低廉。包括ＯＬＹＭＰＵＳ－
［１］ 于永光，张颖．血清１，５－脱水葡糖苷浓度变化与糖尿病酮症酸中
ＡＵ５４００在内的多数生化分析仪测试时间一般不超过１０ ｍｉｎ，所
毒监测的研究．中国急救医学，２００８，２８：６４３－６４４．
以检测步骤复杂的就不能在生化分析仪上进行。关于ＡＤＰ—ＨＫＴ
［２］ 陈家坚，叶余辉，温卓莲，等．１，５－脱水葡萄糖醇对糖尿病的诊断
Ⅱ，此酶是一个特异性较差的己糖激酶，所以作为试剂Ｉ，设置
价值．中国糖尿病杂志，２０１０，１８：１９８－２００．
参数在最初的３ ｍｉｎ内消除内源性谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、
［３］ 张颖．１，５．脱水．Ｄ一山梨醇对糖尿病早期诊断的意义．天津医科大
谷草转氨酶、葡萄糖等的干扰，在本实验中ＡＤＰ依赖的己糖激
学．２００８． ’
酶的浓度为５．０ ｋＵ／Ｌ。用本方法测定１，５－ＡＧ的波长是３４０ ｎｍ，
［４］ 田添荣，三池彰．１，５－脱水山梨醇的定量方法及定量试剂．中华人
与日本协和公司的试剂盒相比，检测线性范围小一些，但本项检
民共和国发明专利，专利号９９１２４７９９．Ｘ．
测在诊断糖尿病时，检测值低于正常值才有意义，故不影响其Ｉ临
［５］ 陈正炎．临床生物化学和生物化学检验试验指导．北京：人民卫生
出版社，１９９９：２４８－２５１．
床应用。关于１，５－ＡＧ用于糖尿病的诊断，较多文献认为，１，５一
［６］ 于永光，周艳春，李晓光．酶法测定乙酰乙酸试剂盒．中华人民共
ＡＧ与血浆葡萄糖、ＨｂＡｌｃ和果糖胺呈明显负相关 。本文
和国发明专利，专利号１９９１１２９６６．０．２００４－９－２９．
侧重于１，５－ＡＧ试剂盒的质量评价，故对其临床意义未做详细研
［７］ Ｋａｓｈｉｎｅ Ｓ，Ｋｉｓｈｉｄａ Ｋ，Ｆｕｎａｈａｓｈｉ Ｔ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｉｓｔ
究。但就本文１０６例健康对照组和９２例２型糖尿病患者所做的
ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆｆ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｌｅｅｐ—ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ
血糖和血浆１，５－ＡＧ结果与已有报道相似 ，但Ｐ＜０．０５，这可
ｂｒｅａｔｈｉｎｇ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｗｉｈｔ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅＵｉｔｕｓ．Ｉｎｔｅｒｎ
能与本实验选取２型糖尿病患者有关，更详细的结果有待于进
Ｍｅｄ，２０１１，５０：１８９５—１９０３．
一
步的研究。
（收稿日期：２０１１－０９—１６）
因为血液中存在着谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶
（本文编辑：戚红丹）
等也可以利用ＮＡＤ（Ｐ）而发生内源消耗，可以使结果不准确。
张颖，于永光，刘倩．酶偶联法测定１，５－脱水葡糖苷方法学建立［Ｊ／ＣＤ］．中华临床医师杂志：电子版，２０１２，６（４）：１０３１－１０３２