2024年4月21日发(作者：旅小凝)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.2
(22)申请日 2012.04.28
(71)申请人 复旦大学附属华山医院
地址 200040 上海市乌鲁木齐中路12号
(72)发明人 刘杰 张骏
(74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人 吴桂琴
(51)
(10)申请公布号 CN 103374572 A
(43)申请公布日 2013.10.30
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
一种肝癌细胞的核酸适配体的序列
及应用
(57)摘要
本发明属细胞生物技术领域，具体
涉及一种肝癌细胞的核酸适配体的序列及
应用。本发明筛选与人肝癌细胞株HepG2
特异结合的核酸适配体，制得具有特异结
合HepG2的特征序列GGGCACC。本发明
所述的特征序列是核酸适配体与人肝癌细
胞株HepG2特异性结合的基础，可用于设
计、制备抗肝癌的靶向药物或制剂或其他
制品，以及可作为抗肝癌的分子探针或靶
点。本发明将为肝癌的分子诊断和靶向治
疗提供有力支持，其将具有重要的临床价
值。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种肝癌细胞的核酸适配体的序列，其特征在于，其具有特异结合肝癌细胞
2.根据权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体的序列，其特征在于，所述的
3.根据权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体的特征序列，其特征在于，所
4.根据权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体的序列，其特征在于，所述肝
5.权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体的序列中的特征序列在设计治疗
6.权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体的序列中的特征序列在制备治疗
肝癌药物中的用途。
癌细胞选自人肝癌细胞株HepG2。
述核酸适配体的序列含有与本特征序列的核苷酸的全部都相同的序列。
序列选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。
的特征序列，该特征序列结构为GGGCACC。
肝癌药物或其他制品中的用途。
7.权利要求1的肝癌细胞的核酸适配体的序列在制备检测肝癌的分子探针或
靶点中的用途。
说 明 书
技术领域
本发明属细胞生物技术领域。具体涉及一种肝癌细胞的核酸适配体的序列及应
背景技术
据报道，肝癌已是全球第六位最常见癌症，是全球第三位癌症致死原因，严重
威胁到人类健康。统计显示，我国是肝癌发生的第一大国，其发病率占全球
死亡率占全球45％，并以每年30多万例的速度上升。临床治
治肝癌，但仅限于少部分患者，对于多数患者，
移等因素，化疗仍是主要治疗手段，
为提供肝癌的化学治
用。
的55％，
疗方案中，手术虽可根
或因病灶较大或因考虑术后复发转
但目前肝癌的化学治疗尚缺少有效的治疗药物，
疗效果，本领域研究者致力于寻找有效的抗肝癌的药物靶点。
已知核酸适配体(aptamer)是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、
多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段。它的特异性
体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。
选技术被称为指数富集的配体系统进化
enrichment，SELEX)技术。
施加选择压力(结合
如同抗
核酸适配体的体外筛
(Systematic evolution of ligand by exponential
SELEX技术模拟自然进化过程，对随机寡核苷酸文库
靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段(如图1所示)。
研究显示，核酸适配体相比抗体等多肽类的适配体(peptide aptamer)的优势相
当明显，例如：制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性
靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰等等。或毒性、
核酸适配体的诸多优势令其在基础研究、临床检测、新药开发等方面有着广泛的用
途。在临床检测方面，目前能用抗原抗体反应进行检测的技术几乎都
配体替代，如Archemix公司开发的一种适配体分子传
以将检测到的蛋白信号直接
可以用核酸适
感器——RiboReporterTM即可
转化成光信号记录并分析，从而实现了对生物混合液(如
血清、细胞提取物)中的大分子蛋白的直接快速检测。在新药开发方
子便是第一个通过美国FDA批准上市的核酸适配体药
细胞生长因子(VEGF)的核酸适配体，被
另一个核酸适配体药物的例
明，AGRO100对多
究的科
面，最典型的例
物Macugen。它是抗血管内皮
用于治疗湿性老年性黄斑变性(wet AMD)。
子是由Aptamera公司研制的AGR0100。临床前试验表
种癌细胞均有抑制作用。目前国际上大部分从事核酸适配体研
学家和生物技术公司主要针对心血管疾病，而较少见有关针对中国人的常见
疾病，如肝炎、肝癌、胃癌等的报道，因此本发明采用核酸适配体应用于上
威胁我国人民健康的常见重大疾病，开发针对肝癌细胞的核酸
志物，为肝癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支
述严重
适配体作为特征性标
持，其将具有重要的临床价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝癌细胞的核酸适配体的序列，尤其涉及一种人肝癌
细胞株HepG2的核酸适配体中具有特异结合人肝癌细胞株HepG2的序列
中命名为肝癌适配体1号，简称HCCAp1)。 (本发明
本发明中，所述的肝癌细胞的核酸适配体的序列中含有特异结合HepG2细胞的
本发明中，所述的肝癌细胞选自人肝癌细胞株HepG2 7。
特征序列，该段特征序列为GGGCACC。
本发明的进一步目的是提供所述核酸适配体序列的用途，根据对该序列分析，
本发明的目的通过下述技术方案实现：
利用核酸适配体的体外筛选技术SELEX技术，以人肝癌细胞株HepG2(购自
筛
上海细胞库)为正筛靶标，以人正常肝细胞株HL-7702(购自上海细胞库)为反
靶标，从体外合成的随机寡聚DNA文库 (5’-
设计抗肝癌的药物并进一步制备抗肝癌的药物或制品。
acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’)中筛选出与所述的HepG2特异结合的核酸
体。将筛选出的序列用引物
Aptamer_R(5’-biotin-
载体(购自上
去白色
适配
Aptamer_L(5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’)和
gtcaccagcacgtccatgag-3’)进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T
海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)。挑
菌落以引物RV-M(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和M13(-47)
(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)进行PCR确定阳性克隆后，抽
粒并用M13(-47)(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)为测序
序反应，上测序仪测序；根据测序结果分析特征序列。
提质
引物进行测
本发明通过上述实验研究，获得一种核酸适配体的特征序列GGGCACC。
本发明中，所述的核酸适配体序列可选自天然存在或人工合成的序列，或任何
本发明中，所述的核酸适配体序列含有与所述特征序列的核苷酸的全部都相同
的序列；
其他来源的同样的序列；
本发明获得的核酸适配体的特征序列GGGCACC是核酸适配体与HepG2特异
性结合的基础，本领域的技术人员在上述结果的启示下，可用于药物设计、
肝癌的靶向药物或制剂或其他制品，可将含该特征序列的核酸
分子探针或药物靶点。本发明的核酸适配体的特
子诊断和靶向治疗提供有力支持，其将具
制备抗
适配体作为抗肝癌的
征序列GGGCACC将为肝癌的分
有重要的临床价值。
附图说明
图1是核酸适配体的体外筛选技术即SELEX技术的流程图。
具体实施方式
实施例1核酸适配体筛选(一轮)
首轮寡聚DNA文库序列：
5’-acgctcggatgccactacaNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
富集所用引物：
Aptamer_L：5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’
Aptamer_R：5’-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’
将寡聚DNA文库测定OD260后，离心干燥。用300ul结合缓冲液(PBS
中含 4.5g/L葡萄糖，5mM MgCl2，2mg/mL BSA，0.2mg/mL酵母tRNA)
250pmol(第一轮10nmol)，95℃5min，迅速置冰上，稍
NNNNctcatggacgtgctggtgac-3’
溶解文库，取
后快速离心。
反筛：将250pmol的文库吸入HL-7702生长覆盖度达到70～80％的直径6cm培
正筛：将反筛上清液加入HepG2生长覆盖度达到70～80％的直径6cm培养皿中
中，4℃摇床振荡1h。弃上清液。用洗涤缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，
洗涤HepG2细胞三遍。用细胞刮刮下HepG2细胞，用1mL
细胞转移到EP管中，95℃5min，迅速置冰上。
清转移到一干净的EP管中。
养皿中，用结合缓冲液补足到1mL。4℃摇床振荡1h。取上清液。
5mM MgCl2)
洗涤缓冲液将HepG2
待变冷后，10000rpm离心5min。上
富集：配置PCR体系(总体积1000ul)：H2O740ul，10×PCR缓冲液
100ul， dNTP80ul，引物混合物
25ul(H2O∶100uM Aptamer_L∶100uM Aptamer_R＝4∶
按如下条件，在PCR仪上扩增：94℃加热预变性2min后，94℃变性30s，58℃退
火20s，
纯化： 纯化柱用MilliQ水洗一遍，PBS洗两遍，加入150ul GE的Streptavidin
Sepharose后PBS洗两遍，加入PCR产物，摇床振荡20min，放出液体，
遍后，加0.5mL NaOH静置2-3min后放出液体，放出液上脱
几乎流尽时加1mL MilliQ水洗脱，同时开始接
寡聚DNA文库，可进行下一轮筛
72℃延伸20s，20个循环，72℃延伸4min，4℃保温＜1h。
0.5∶0.5)，DNA模板(正筛上清)50ul，Taq HS酶5ul。
PBS洗两
盐柱，待液体从脱盐柱
洗脱液1mL，该洗脱液即为富集了的
选。
实施例2 核酸适配体TA克隆
在微量离心管中配制下列溶液，全量为5ul：pMD19-T Vector 1ul，适配体PCR
加
产物1ul，dH2O 3ul。加入5ul的Solution I。 16℃反应30分钟。全量(10ul)
入至100ul DH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃加热45秒
中放置1分钟。加入
Amp
钟后，再在冰
890ul LB培养基，37℃振荡培养60分钟。在含有X-Gal、IPTG、
的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。
实施例3 核酸适配体克隆的菌落PCR与测序
pMD19-T菌落PCR和测序引物：
RV-M：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′
M13(-47)：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′
用灭菌牙签挑取白色单克隆菌落加入到4ml LB(Amp 50ng/L)液体培养基内，
作
配置PCR体系：菌液引物RV-M(10uM)0.5ul，引物M13(-47)0.5ul，2×Taq
Mix 7.5ul，水5.5ul(总体系15ul)。按如下条件，在PCR仪上扩增：95℃预
5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共33个循环；
180rpm，37℃摇菌过夜(＜16h).取菌液作PCR模板，进行PCR扩增。以水
为阴性对照。
变性
72℃总延伸10min。
反应结束后取3-6ul菌液PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，140V电泳20min。若
出现明亮的目的大小条带而阴性对照没有条带，说明该菌液为阳性克隆。
随后行质粒提取：取4ml过夜培养的新鲜菌液，收集菌体，按照Omega的质粒
提取试剂盒操作说明进行质粒提取。最后加水溶解。采用Nanodrop对提取
行浓度和纯度测定。 的质粒进
测序反应：BDT v3.1 0.5ul，质粒100ng，引物M13(-47)0.5ul，加水至5ul。96
℃加热预变性1min后，96℃变性10s，50℃退火10s，60℃延伸4min，33
4℃保温。反应结束后将5ul测序产物+1.25ul EDTA(125mM，
乙醇封好，震荡4次，室温放置15min，立即3860rpm，
后立即倒扣在纸巾上，离心到900rpm，立刻停。
好。随后室温下3860rpm，离心15min。
停。避光室温干燥15min，
4min，短暂离心，
个循环，
pH 8.0)+15ul无水
室温(25℃)离心40min
加60ul 70％乙醇，(不需震荡)封
立即倒扣在纸巾上，离心到900rpm，立刻
加10ul Hi-Di，封好盖。95℃变性4min，立刻冰上静置
上3730xl测序仪。测序结果发现50个克隆中有9个克隆都存在
同一个特征序列GGGCACC。因此，获得了具有特异结合
该段特征序列结构为GGGCACC。 HepG2细胞的特征序列，
2024年4月21日发(作者：旅小凝)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.2
(22)申请日 2012.04.28
(71)申请人 复旦大学附属华山医院
地址 200040 上海市乌鲁木齐中路12号
(72)发明人 刘杰 张骏
(74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人 吴桂琴
(51)
(10)申请公布号 CN 103374572 A
(43)申请公布日 2013.10.30
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
一种肝癌细胞的核酸适配体的序列
及应用
(57)摘要
本发明属细胞生物技术领域，具体
涉及一种肝癌细胞的核酸适配体的序列及
应用。本发明筛选与人肝癌细胞株HepG2
特异结合的核酸适配体，制得具有特异结
合HepG2的特征序列GGGCACC。本发明
所述的特征序列是核酸适配体与人肝癌细
胞株HepG2特异性结合的基础，可用于设
计、制备抗肝癌的靶向药物或制剂或其他
制品，以及可作为抗肝癌的分子探针或靶
点。本发明将为肝癌的分子诊断和靶向治
疗提供有力支持，其将具有重要的临床价
值。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种肝癌细胞的核酸适配体的序列，其特征在于，其具有特异结合肝癌细胞
2.根据权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体的序列，其特征在于，所述的
3.根据权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体的特征序列，其特征在于，所
4.根据权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体的序列，其特征在于，所述肝
5.权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体的序列中的特征序列在设计治疗
6.权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体的序列中的特征序列在制备治疗
肝癌药物中的用途。
癌细胞选自人肝癌细胞株HepG2。
述核酸适配体的序列含有与本特征序列的核苷酸的全部都相同的序列。
序列选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。
的特征序列，该特征序列结构为GGGCACC。
肝癌药物或其他制品中的用途。
7.权利要求1的肝癌细胞的核酸适配体的序列在制备检测肝癌的分子探针或
靶点中的用途。
说 明 书
技术领域
本发明属细胞生物技术领域。具体涉及一种肝癌细胞的核酸适配体的序列及应
背景技术
据报道，肝癌已是全球第六位最常见癌症，是全球第三位癌症致死原因，严重
威胁到人类健康。统计显示，我国是肝癌发生的第一大国，其发病率占全球
死亡率占全球45％，并以每年30多万例的速度上升。临床治
治肝癌，但仅限于少部分患者，对于多数患者，
移等因素，化疗仍是主要治疗手段，
为提供肝癌的化学治
用。
的55％，
疗方案中，手术虽可根
或因病灶较大或因考虑术后复发转
但目前肝癌的化学治疗尚缺少有效的治疗药物，
疗效果，本领域研究者致力于寻找有效的抗肝癌的药物靶点。
已知核酸适配体(aptamer)是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、
多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段。它的特异性
体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。
选技术被称为指数富集的配体系统进化
enrichment，SELEX)技术。
施加选择压力(结合
如同抗
核酸适配体的体外筛
(Systematic evolution of ligand by exponential
SELEX技术模拟自然进化过程，对随机寡核苷酸文库
靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段(如图1所示)。
研究显示，核酸适配体相比抗体等多肽类的适配体(peptide aptamer)的优势相
当明显，例如：制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性
靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰等等。或毒性、
核酸适配体的诸多优势令其在基础研究、临床检测、新药开发等方面有着广泛的用
途。在临床检测方面，目前能用抗原抗体反应进行检测的技术几乎都
配体替代，如Archemix公司开发的一种适配体分子传
以将检测到的蛋白信号直接
可以用核酸适
感器——RiboReporterTM即可
转化成光信号记录并分析，从而实现了对生物混合液(如
血清、细胞提取物)中的大分子蛋白的直接快速检测。在新药开发方
子便是第一个通过美国FDA批准上市的核酸适配体药
细胞生长因子(VEGF)的核酸适配体，被
另一个核酸适配体药物的例
明，AGRO100对多
究的科
面，最典型的例
物Macugen。它是抗血管内皮
用于治疗湿性老年性黄斑变性(wet AMD)。
子是由Aptamera公司研制的AGR0100。临床前试验表
种癌细胞均有抑制作用。目前国际上大部分从事核酸适配体研
学家和生物技术公司主要针对心血管疾病，而较少见有关针对中国人的常见
疾病，如肝炎、肝癌、胃癌等的报道，因此本发明采用核酸适配体应用于上
威胁我国人民健康的常见重大疾病，开发针对肝癌细胞的核酸
志物，为肝癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支
述严重
适配体作为特征性标
持，其将具有重要的临床价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝癌细胞的核酸适配体的序列，尤其涉及一种人肝癌
细胞株HepG2的核酸适配体中具有特异结合人肝癌细胞株HepG2的序列
中命名为肝癌适配体1号，简称HCCAp1)。 (本发明
本发明中，所述的肝癌细胞的核酸适配体的序列中含有特异结合HepG2细胞的
本发明中，所述的肝癌细胞选自人肝癌细胞株HepG2 7。
特征序列，该段特征序列为GGGCACC。
本发明的进一步目的是提供所述核酸适配体序列的用途，根据对该序列分析，
本发明的目的通过下述技术方案实现：
利用核酸适配体的体外筛选技术SELEX技术，以人肝癌细胞株HepG2(购自
筛
上海细胞库)为正筛靶标，以人正常肝细胞株HL-7702(购自上海细胞库)为反
靶标，从体外合成的随机寡聚DNA文库 (5’-
设计抗肝癌的药物并进一步制备抗肝癌的药物或制品。
acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’)中筛选出与所述的HepG2特异结合的核酸
体。将筛选出的序列用引物
Aptamer_R(5’-biotin-
载体(购自上
去白色
适配
Aptamer_L(5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’)和
gtcaccagcacgtccatgag-3’)进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T
海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)。挑
菌落以引物RV-M(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和M13(-47)
(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)进行PCR确定阳性克隆后，抽
粒并用M13(-47)(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)为测序
序反应，上测序仪测序；根据测序结果分析特征序列。
提质
引物进行测
本发明通过上述实验研究，获得一种核酸适配体的特征序列GGGCACC。
本发明中，所述的核酸适配体序列可选自天然存在或人工合成的序列，或任何
本发明中，所述的核酸适配体序列含有与所述特征序列的核苷酸的全部都相同
的序列；
其他来源的同样的序列；
本发明获得的核酸适配体的特征序列GGGCACC是核酸适配体与HepG2特异
性结合的基础，本领域的技术人员在上述结果的启示下，可用于药物设计、
肝癌的靶向药物或制剂或其他制品，可将含该特征序列的核酸
分子探针或药物靶点。本发明的核酸适配体的特
子诊断和靶向治疗提供有力支持，其将具
制备抗
适配体作为抗肝癌的
征序列GGGCACC将为肝癌的分
有重要的临床价值。
附图说明
图1是核酸适配体的体外筛选技术即SELEX技术的流程图。
具体实施方式
实施例1核酸适配体筛选(一轮)
首轮寡聚DNA文库序列：
5’-acgctcggatgccactacaNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
富集所用引物：
Aptamer_L：5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’
Aptamer_R：5’-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’
将寡聚DNA文库测定OD260后，离心干燥。用300ul结合缓冲液(PBS
中含 4.5g/L葡萄糖，5mM MgCl2，2mg/mL BSA，0.2mg/mL酵母tRNA)
250pmol(第一轮10nmol)，95℃5min，迅速置冰上，稍
NNNNctcatggacgtgctggtgac-3’
溶解文库，取
后快速离心。
反筛：将250pmol的文库吸入HL-7702生长覆盖度达到70～80％的直径6cm培
正筛：将反筛上清液加入HepG2生长覆盖度达到70～80％的直径6cm培养皿中
中，4℃摇床振荡1h。弃上清液。用洗涤缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，
洗涤HepG2细胞三遍。用细胞刮刮下HepG2细胞，用1mL
细胞转移到EP管中，95℃5min，迅速置冰上。
清转移到一干净的EP管中。
养皿中，用结合缓冲液补足到1mL。4℃摇床振荡1h。取上清液。
5mM MgCl2)
洗涤缓冲液将HepG2
待变冷后，10000rpm离心5min。上
富集：配置PCR体系(总体积1000ul)：H2O740ul，10×PCR缓冲液
100ul， dNTP80ul，引物混合物
25ul(H2O∶100uM Aptamer_L∶100uM Aptamer_R＝4∶
按如下条件，在PCR仪上扩增：94℃加热预变性2min后，94℃变性30s，58℃退
火20s，
纯化： 纯化柱用MilliQ水洗一遍，PBS洗两遍，加入150ul GE的Streptavidin
Sepharose后PBS洗两遍，加入PCR产物，摇床振荡20min，放出液体，
遍后，加0.5mL NaOH静置2-3min后放出液体，放出液上脱
几乎流尽时加1mL MilliQ水洗脱，同时开始接
寡聚DNA文库，可进行下一轮筛
72℃延伸20s，20个循环，72℃延伸4min，4℃保温＜1h。
0.5∶0.5)，DNA模板(正筛上清)50ul，Taq HS酶5ul。
PBS洗两
盐柱，待液体从脱盐柱
洗脱液1mL，该洗脱液即为富集了的
选。
实施例2 核酸适配体TA克隆
在微量离心管中配制下列溶液，全量为5ul：pMD19-T Vector 1ul，适配体PCR
加
产物1ul，dH2O 3ul。加入5ul的Solution I。 16℃反应30分钟。全量(10ul)
入至100ul DH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃加热45秒
中放置1分钟。加入
Amp
钟后，再在冰
890ul LB培养基，37℃振荡培养60分钟。在含有X-Gal、IPTG、
的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。
实施例3 核酸适配体克隆的菌落PCR与测序
pMD19-T菌落PCR和测序引物：
RV-M：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′
M13(-47)：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′
用灭菌牙签挑取白色单克隆菌落加入到4ml LB(Amp 50ng/L)液体培养基内，
作
配置PCR体系：菌液引物RV-M(10uM)0.5ul，引物M13(-47)0.5ul，2×Taq
Mix 7.5ul，水5.5ul(总体系15ul)。按如下条件，在PCR仪上扩增：95℃预
5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共33个循环；
180rpm，37℃摇菌过夜(＜16h).取菌液作PCR模板，进行PCR扩增。以水
为阴性对照。
变性
72℃总延伸10min。
反应结束后取3-6ul菌液PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，140V电泳20min。若
出现明亮的目的大小条带而阴性对照没有条带，说明该菌液为阳性克隆。
随后行质粒提取：取4ml过夜培养的新鲜菌液，收集菌体，按照Omega的质粒
提取试剂盒操作说明进行质粒提取。最后加水溶解。采用Nanodrop对提取
行浓度和纯度测定。 的质粒进
测序反应：BDT v3.1 0.5ul，质粒100ng，引物M13(-47)0.5ul，加水至5ul。96
℃加热预变性1min后，96℃变性10s，50℃退火10s，60℃延伸4min，33
4℃保温。反应结束后将5ul测序产物+1.25ul EDTA(125mM，
乙醇封好，震荡4次，室温放置15min，立即3860rpm，
后立即倒扣在纸巾上，离心到900rpm，立刻停。
好。随后室温下3860rpm，离心15min。
停。避光室温干燥15min，
4min，短暂离心，
个循环，
pH 8.0)+15ul无水
室温(25℃)离心40min
加60ul 70％乙醇，(不需震荡)封
立即倒扣在纸巾上，离心到900rpm，立刻
加10ul Hi-Di，封好盖。95℃变性4min，立刻冰上静置
上3730xl测序仪。测序结果发现50个克隆中有9个克隆都存在
同一个特征序列GGGCACC。因此，获得了具有特异结合
该段特征序列结构为GGGCACC。 HepG2细胞的特征序列，