2024年4月22日发(作者：弓小谷)
纯菌落的PCR实验
一、实验准备：所需黄枪头，小白枪头（挑菌用）、2ml离心管等都需要提前半天灭菌，在
无菌台内放干。
二、药品：正向引物、反向引物、tap mix、ddH
2
O、marker(DS2000)
注意
1、 新的引物为粉末状，因为引物药品较贵，打开时应离心（3000转，1min），防止盖子上
沾染。加入ddH
2
O（最好加TE），充分振荡5min溶解，加入量看标签n mol乘以100
微升。
2、 药品需放在-20度，都准备好后，现用现拿，拿出后用手暖溶解。
mix 应避免反复冻融，2-8度可保存3个月；
引物应避免反复冻融，需放在-20度，一周内经常使用可存于-4度。
Marker(DS2000)可存放在2-8度，长期保存请置于-20度。
去蛋白（粗取DNA）
枪头挑点菌涮洗在100微升灭菌水中，在沸水中煮1分钟，-20度冰箱放置2分钟，然后再
放在沸水中1分钟，离心，取上清液1微升作为DNA模版。
三、步骤：
1、配体系：在无菌台内，放冰上操作。每一个取过的药剂，放在盒中左下角，以免混淆。
每个菌落PCR反应体系体积为50μl,反应体系组成如下：
（向灭菌2ml离心管内，拿200μl分子移液枪加入）
(一) 2*Taq Master mix 25.0μl
(二) (细菌通用引物)正向引物 1.0μl
(三) (细菌通用引物)反向引物 1.0μl
(四) ddH
2
O 22μl
(五) 挑菌（菌落PCR实验）或加模版DNA 1.0μl
总体积 50μl
(如实验组做n个PCR，考虑到量极少很容易沾染，致使量不够。所以，应配制n+1个PCR
所需量)。
【引物以及DNA加入具体适宜量根据实验情况调整，相应调整ddH
2
O的量，用以补齐体
系50μl】
举例：做四个PCR，则需要5个PCR体系的用量：
2*Tap Master mix 25.0*5=125μl
(注意，此药剂为2倍浓度，总体积为50*5=250μl,所以只需取25.0*5=125μl)
正向引物27F（10μM） 1.0*5=5μl
反向引物149R（10μM） 1.0*5=5μl
ddH
2
O 22.0*5=110μl
2、配完体系后，盖上离心管盖子，上下颠倒几次混匀（量少时，用少轻弹）。分装到n个
PCR（白色2.5ul）小管中（放置在里蓝外白枪头盒），每管取49μl体系。
3、 在PCR（白色2.5μl）小管上部及侧面都编号【手写下编号所一一对应的菌】。分别用钢
头移液枪挑n中菌（或用枪吸取DNA），涮洗在n个PCR（白色2.5μl）小管中，可（抽
吸几次）盖上盖子。（把气泡弹掉后，手掌离心机，瞬间离心一下），放入PCR炉中。【尽
量往中间放，炉子不要宁太紧】
4、 PCR时间完成前40分钟左右，开始准备制胶：
一倍的TAE（量筒量约100ml）+大约1g琼脂糖hyagarose(0.8胶软-2.0胶硬)，放入微波
中加热，仔细观察，沸腾时取出，几次重复，直到对光观察，内无颗粒为止。（用不完
的可下回回收利用，用时加少量（1ml）1倍的TAE，补充蒸发掉的水分，防止浓度增
加）
1倍的TAE：用移液管移取20ml,50倍的TAE，到1000ml容量瓶。
5、 封边+倒胶
将挡板和梳子放入制胶盒中，胶冷却至不太烫时，用移液枪（1ml蓝色枪头）封边后，
在一侧缓缓将胶倒入（胶刚好布满底部时，停住倒胶）。
不要动，等胶凝固发白后，将封边胶刮掉，将制胶盒放入电泳仪（侵泡有1倍的TAE）
中，用双手缓慢分别将挡板和梳子提起。观察制胶盒中TAE液体水位，应浸没胶，并
应该放置水平。
6、等胶完全冷却后，用灭过菌的黄色枪头点样（12个孔的薄梳子，大约用5μl）：最左测点
marker作为对照（DS2000），中间点P过的PCR。
7、开电泳仪，调整电压U（100伏）和时间T（45分钟）等参数，跑胶。
8、向塘磁盘中加入染料，约10μl以上，染料见光会分解，应加盖。将胶放入染色盒中，显
色15分钟左右，放入超纯水中，浸泡清洗2分钟左右。
9、将清洗后的胶，放入PCR仪器中，照相：
打开软件：
新建实验协议---凝胶成像----应用程序（选择）----合算凝胶----GELRED---最下面显示选
项中“高亮显示饱和像素”不勾选---放置凝胶---缩小（放大）至画面中心
文件：导出以便发布，改为JPG格式。
送测注意事项：
1、 连同2引物一起送出去，每引物取3*n微升
2、 盖上也标明编号
3、 写明是“双向测序”，要求拼接后发回“拼接后”结果
4、 样品：“PCR产物，未纯化”
PCR反应体系（50μl）：Template（基因组） 2μL，27F（10μM） 1μL，1492R（10μ
M） 1μL，dNTP mix（10mM each） 1μL，10×Taq Buffer 5μL，MgCl2（25mM） 4
μL，Taq（5U/μL） 0.25μL，
PCR程序：首先94℃变性5min；然后进行30个循环；94℃，30s；59℃，30s；72℃，60s；
最后72℃延伸7min。
PCR产物作1.5%琼脂糖凝胶电泳。
2024年4月22日发(作者：弓小谷)
纯菌落的PCR实验
一、实验准备：所需黄枪头，小白枪头（挑菌用）、2ml离心管等都需要提前半天灭菌，在
无菌台内放干。
二、药品：正向引物、反向引物、tap mix、ddH
2
O、marker(DS2000)
注意
1、 新的引物为粉末状，因为引物药品较贵，打开时应离心（3000转，1min），防止盖子上
沾染。加入ddH
2
O（最好加TE），充分振荡5min溶解，加入量看标签n mol乘以100
微升。
2、 药品需放在-20度，都准备好后，现用现拿，拿出后用手暖溶解。
mix 应避免反复冻融，2-8度可保存3个月；
引物应避免反复冻融，需放在-20度，一周内经常使用可存于-4度。
Marker(DS2000)可存放在2-8度，长期保存请置于-20度。
去蛋白（粗取DNA）
枪头挑点菌涮洗在100微升灭菌水中，在沸水中煮1分钟，-20度冰箱放置2分钟，然后再
放在沸水中1分钟，离心，取上清液1微升作为DNA模版。
三、步骤：
1、配体系：在无菌台内，放冰上操作。每一个取过的药剂，放在盒中左下角，以免混淆。
每个菌落PCR反应体系体积为50μl,反应体系组成如下：
（向灭菌2ml离心管内，拿200μl分子移液枪加入）
(一) 2*Taq Master mix 25.0μl
(二) (细菌通用引物)正向引物 1.0μl
(三) (细菌通用引物)反向引物 1.0μl
(四) ddH
2
O 22μl
(五) 挑菌（菌落PCR实验）或加模版DNA 1.0μl
总体积 50μl
(如实验组做n个PCR，考虑到量极少很容易沾染，致使量不够。所以，应配制n+1个PCR
所需量)。
【引物以及DNA加入具体适宜量根据实验情况调整，相应调整ddH
2
O的量，用以补齐体
系50μl】
举例：做四个PCR，则需要5个PCR体系的用量：
2*Tap Master mix 25.0*5=125μl
(注意，此药剂为2倍浓度，总体积为50*5=250μl,所以只需取25.0*5=125μl)
正向引物27F（10μM） 1.0*5=5μl
反向引物149R（10μM） 1.0*5=5μl
ddH
2
O 22.0*5=110μl
2、配完体系后，盖上离心管盖子，上下颠倒几次混匀（量少时，用少轻弹）。分装到n个
PCR（白色2.5ul）小管中（放置在里蓝外白枪头盒），每管取49μl体系。
3、 在PCR（白色2.5μl）小管上部及侧面都编号【手写下编号所一一对应的菌】。分别用钢
头移液枪挑n中菌（或用枪吸取DNA），涮洗在n个PCR（白色2.5μl）小管中，可（抽
吸几次）盖上盖子。（把气泡弹掉后，手掌离心机，瞬间离心一下），放入PCR炉中。【尽
量往中间放，炉子不要宁太紧】
4、 PCR时间完成前40分钟左右，开始准备制胶：
一倍的TAE（量筒量约100ml）+大约1g琼脂糖hyagarose(0.8胶软-2.0胶硬)，放入微波
中加热，仔细观察，沸腾时取出，几次重复，直到对光观察，内无颗粒为止。（用不完
的可下回回收利用，用时加少量（1ml）1倍的TAE，补充蒸发掉的水分，防止浓度增
加）
1倍的TAE：用移液管移取20ml,50倍的TAE，到1000ml容量瓶。
5、 封边+倒胶
将挡板和梳子放入制胶盒中，胶冷却至不太烫时，用移液枪（1ml蓝色枪头）封边后，
在一侧缓缓将胶倒入（胶刚好布满底部时，停住倒胶）。
不要动，等胶凝固发白后，将封边胶刮掉，将制胶盒放入电泳仪（侵泡有1倍的TAE）
中，用双手缓慢分别将挡板和梳子提起。观察制胶盒中TAE液体水位，应浸没胶，并
应该放置水平。
6、等胶完全冷却后，用灭过菌的黄色枪头点样（12个孔的薄梳子，大约用5μl）：最左测点
marker作为对照（DS2000），中间点P过的PCR。
7、开电泳仪，调整电压U（100伏）和时间T（45分钟）等参数，跑胶。
8、向塘磁盘中加入染料，约10μl以上，染料见光会分解，应加盖。将胶放入染色盒中，显
色15分钟左右，放入超纯水中，浸泡清洗2分钟左右。
9、将清洗后的胶，放入PCR仪器中，照相：
打开软件：
新建实验协议---凝胶成像----应用程序（选择）----合算凝胶----GELRED---最下面显示选
项中“高亮显示饱和像素”不勾选---放置凝胶---缩小（放大）至画面中心
文件：导出以便发布，改为JPG格式。
送测注意事项：
1、 连同2引物一起送出去，每引物取3*n微升
2、 盖上也标明编号
3、 写明是“双向测序”，要求拼接后发回“拼接后”结果
4、 样品：“PCR产物，未纯化”
PCR反应体系（50μl）：Template（基因组） 2μL，27F（10μM） 1μL，1492R（10μ
M） 1μL，dNTP mix（10mM each） 1μL，10×Taq Buffer 5μL，MgCl2（25mM） 4
μL，Taq（5U/μL） 0.25μL，
PCR程序：首先94℃变性5min；然后进行30个循环；94℃，30s；59℃，30s；72℃，60s；
最后72℃延伸7min。
PCR产物作1.5%琼脂糖凝胶电泳。