2024年5月19日发(作者：寒静白)
16
细胞与分子免疫学杂志
（Chin J Cell Mol lmmUn
〇
l)2021 , 37( 1)
.论著. 文章编号：1007-8738(2021)01>0016"08
不同生长期小鼠胸腺
T
细胞不同亚群的变化及
ROCK
抑制剂对衰老小
鼠胸腺再生的促进作用
曾艳l’2A，陈昌蓉姜晓玲K2,刘美1童晨曦12,朱小康1二，宋银宏杜德兵2’3 C
三峡大学医学院病
原与免疫学系，2三峡大学感染与炎症损伤研究所，湖北宜昌443002; 3宜昌市第三人民医院肺病科，湖北宜昌443003)
[摘要]
目的研
究各发育阶段小鼠胸腺细胞、胸腺上皮细胞（
TEC
)
和
脾脏中
T
细胞的变化，探索
Rho
相关卷曲蛋白激酶
(
ROCK
)抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的作用
。方法
取幼年、青年、中年及老年期
M
7
BIV
6雌鼠的胸腺和脾脏，流式细胞术分
析小鼠胸腺细胞、
TEC
及脾脏中
T
细胞亚群；
ROCK
抑制剂体外处理衰老进程中小鼠
TEC
,荧光酶联斑点分析仪观察细胞增殖
情况；
ROCK
抑制剂处理20月龄衰老小鼠，流式细胞术检测小鼠胸腺细胞、
TEC
及脾脏中
T
细胞亚群的变化
。结果
随月龄
增加，胸腺细胞、
TEC
总数及各细胞亚群数量均显著降低；脾脏中总
CD
4+
T
细胞及
CD
8+
T
细胞比例无显著性改变，但
CD
4 +
初始
T
细胞、
CD
8 +初始
T
细胞和
CD
4 +近期胸腺迁出细胞（
RTE
)在脾脏中所占比例呈下降趋势；
ROCK
抑制剂在体外促进衰老
进程中小鼠
TEC
增殖，
ROCK
抑制剂在体内使衰老小鼠胸腺细胞、
TEC
以及外周脾脏中
T
淋巴细胞各亚群数量明显增加
。结论
随着小鼠月龄增加，胸腺呈进行性退化。
ROCK
抑制剂可以显著缓解衰老小鼠胸腺的萎缩，促进衰老小鼠胸腺再生。
[
关键词
]
胸腺；胸腺上皮细胞；
Rho
相关卷曲蛋白激酶（
ROCK
)抑制剂；衰老；再生
[文献标志码
]A
[中图分类号
]Q456, R392. 1
，
R322.5 + 3, Q945.48, R339.3 + 8
Changes of different cell subsets in thymus and spleen of mice at different growth
stages and the facilitating effect of ROCK inhibitor on thymus regeneration in
aged mice
ZENG
Yan''2A,
CHEN
Changrong1'2A,
JIANG
Xiaoling1'2,
UU
Mei1'2,
TONG
Chenxi1-2,
ZHU
Xiaokang1'2,
SONG
Yinhong1'2*, DU Debing2'3
1
Department
of
Pathology
and
Immunology
,
Medical
College
,
2Institute
of
Infection
and
Inflammation
,
China
Three
Gorges
University
,
Yichang
443002；
3Department
of
Lung
Diseases
,
The
Third
People
Hospital
of
Yichang
City
,
Yichang
443003,
China
*
Corresponding
author
,
E
-
：
syh
728@ 126.
com
[
Abstract
]
Objective
To investigate the changes of subsets of thymocytes, thymic epithelial cells (TECs) and T
lymphocytes in the spleen of mice at different growth stages, and to explore the effect of Rho-associated coiled-coil
protein kinase (ROCK) inhibitor on thymus regeneration in aged mice.
Methods
The thymus and spleens were harvested
from female C57BL76 mice at juvenile, mature adult, middle-aged and aged phases. The subsets of thymocytes, TECs and
T cells in the spleen were analyzed by flow cytometry (FCM). TECs of aging mice were treated with ROCK inhibitor
in vitro.
Cell proliferation was observed using fluorescence immune-linked spot analyzer. Aged mice of 20-month old were treated with
ROCK inhibitor
in vivo.
The changes of thymocytes, TECs and T cell subgroups in the spleen were detected with FCM.
Results
The total numbers of thymocytes and TECs as well as the number of each cell subpopulation decreased significantly
with aging. The proportions of CD4+ naive T cells, CD8+ naive T cells and CD4+ recent thymus emigrant cells (RTEs) in the
spleen showed significant decreasing trends although there were not obvious changes in the proportions of CD4+ T cells and
CD8+ T cells in the spleen of mice during aging. ROCK inhibitor facilitated the proliferation of TECs in aging mice
in vitro.
ROCK inhibitor also increased the numbers of the subsets of thymocytes, TECs and T cells in the spleen of aged mice
收稿日期
：
2020~09-30;
接受日期
：
2020-11 -27
基金项目
：国家自然科学基金（
81671397);
湖北省宜昌市科技局项目（
A16-301-32)
作者简介
：曾艳
（1995
-)，女，广东河源人，硕士研究生
Tel
：
188****9881
；
：
477152332@ qq. com
A同为第一作者
*
通讯作者，宋银宏，
E-mail: syh728@
1期曾艳，等.不同生长期小鼠胸腺
T
细胞不同亚群的变化及
ROCK
抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的促进作用
17
significantly.
Conclusion
The mouse thymus undergoes progressing degeneration with aging. ROCK inhibitor has potential
of relieving the atrophy of thymus, facilitating thymus regeneration in aged mice.
[Key words] thymus
；
thymic epithelial cells
；
ROCK inhibitor
；
aging
；
regeneration
胸腺是机体中枢免疫器官之一，是
T
淋巴细胞
发育、分化和成熟的主要场所。胸腺内细胞包括胸
腺细胞和胸腺基质细胞，胸腺细胞是
T
淋巴细胞的
前体细胞，胸腺基质细胞主要由胸腺上皮细胞
(thymic
epithelial
cells
,
TEC
)组成，为胸腺细胞的发
育提供最适宜的生存环境[1]。随年龄增加，动物和
人都存在不同程度的胸腺萎缩。胸腺萎缩是免疫系
统衰老的重要标志之一，增龄性胸腺退化是衰老小
鼠免疫功能衰退的重要原因。在衰老过程中，胸腺
形态及胸腺基质细胞等均出现相应变化[W]，其中
TEC
是胸腺基质细胞中最主要的成分，胸腺上皮祖
细胞（thymic epithelial progenitor cells, TEPC
)是
TEC
的来源，可以在体内分化为皮质胸腺上皮细胞(cortical
thymic epithelial cells, cTEC)及髓质胸腺上皮细胞
(medullary thymic epithelial cells, mTEC )
〇
cTEC 主
要介导胸腺细胞的阳性选择，而mTEC在阴性选择
中起重要作用。这些选择过程将保证最终发育成熟
的
T
淋巴细胞既具有自身主要组织相容性复合体
(major histocompatibility complex, MHC)分子限制性
又具有中枢免疫耐受的特性。随年龄增长
，
TEC在
数量和质量上均不断下降[4]，这导致机体对新出现
抗原的免疫应答减弱；患者在受到免疫损伤后，恢复
适应性免疫的能力受到损害，易产生自身免疫性疾
病等一系列疾病的发生。研究表明在微小RNA
(microRNA)和某些蛋白可以有效促进TEC的增
殖[5~，此外类固醇抑制可以保护胸腺细胞不衰
竭[7]，研究发现通过手术方式移植也可以达到胸腺
再生的目的[8]，但这些方法过程繁琐且结果不可控，
实施时会面临较多困难[9]，因此需要发展既可克服
上述弊端又能有效促进TEC增殖的策略。最近有报
道，利用Janus激酶（Janus kinase, JAK)抑制剂处理
胸腺受损后的小鼠，在一定时间内可以对TEC再生
发挥重要作用[
W
]，这给我们提供了新的实验思路。
本课题组前期将376种小分子抑制剂与TEC进行体
外共培养，结果显示
Rho
相关卷曲蛋白激酶
(
Rho-associated
coiled-coil
protein
kinase，ROCK
)抑
制剂对
TEC
增殖有明显的促进作用。本研究观察了
不同生长期胸腺细胞各亚群、
TEC
各亚群、脾脏
T
细
胞各亚群的具体变化，然后用
ROCK
抑制剂处理
20月龄衰老小鼠，并检测处理后胸腺细胞和
TEC
及对
应各亚群变化、脾脏
T
细胞及各亚群变化，明确
ROCK
抑制剂促进衰老个体
TEC
增殖及胸腺再生的效应，以
期为临床增强衰老个体的免疫力提供治疗思路。
1材料和方法
1.1材料
无特定病原体
（specific
pathogen
free
,
SPF
)级各
发育阶段雌性
C
57
BL
/6小鼠共30只，衰老（20月
龄）雌性
C
57
BIV
6小鼠30只，11周龄绿色荧光蛋白
(green
fluorescent
protein，GFP
)转基因（
GFP
+
C
57
BIV
6)小鼠10只，分笼饲养。室温20~25
t
，湿
度40% ~60% ,自由摄食饮水。野生型
C
57
BI
76小
鼠购自三峡大学实验动物中心，
GFP
+
C
57
BL
/6小鼠
购自赛业（广州）生物科技有限公司。胎牛血清
（fetal
bovine
serum
,
FBS
)和
DMEM
培养基购自
Gibco
公
司；
DNA
酶
I
、木瓜蛋白酶、
IV
型胶原蛋白酶购自
Worthington
公司；二甲基亚讽
（dimethyl
sulfoxide
,
DMS
0)购自国药集团公司；异硫氰酸荧光素
(fluorescein
isothiocyanate
，
FITC
)标记的抗
CD
3 抗体
(
CD
3
-FITC
)、
CD
4-
FITC
、
CD
11
b
-
FITC
、藻红蛋白
(
phycoerythrin
，
PE
)标记的抗
CD
19 抗体（
CD
19-
PE
)、
F
4/80-
PE
、
CD
117 (
c-kit
)-
PE
、别藻蓝蛋白
(
allophycocyanin
,
APC
)标记的抗
CD
25 抗体
(
CD
25-
APC
)、
CD
62
LAPC
、
CD
45-
APC
、
CD
45
RB
-
PE
、
I
-
A
/
I
-
E(MHC
II
)-
FITC
、
Ly
51-
PE
、亮紫421
(brilliant
violet
421，
BV
421 )标记的链霉亲和素（
streptavidin
)
(
Streptavidin
-
BV
421)、
CD
44-
BV
421、流式细胞仪购
自
BD
公司。008-?£、1^1.1-?£、1'细胞受体卩（丁
cell
receptor
p
，
TCR
(3)-
FITC
、
TCR
*
y
/
S
-
FITC
、别藻蓝
蛋白-花青素 7 (
allophycocyanin-cyanine
7，
APC
-
Cy
7)
标记的抗
CD
4抗体（
CD
4-
APC
-
Cy
7)、亮紫510
(brilliant
violet
510，
BV
510)标记的抗
CD
8
a
抗体
(0〇83-8¥510)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白-花青素5.5
(pieridinin
chlorophyll
protein-cyanine
5.5,
PerCP
-
Cy
5.5)
标记的抗上皮细胞黏附分子
（epithelial
cell
adhesion
molecule
，
EpCAM
/
CD
326)抗体（
EpCAM
/
CD
326*
PeiCP
-
Cy
5.5)、
EpCAM
/
CD
326-
PE
、纯化的
CD
16/32 抗
体购自
Biolegend
公司。
ROCK
抑制剂
Y
-27632购自
Cayman
公司；生物素标记的荆豆凝集素
（biotinylated
ulex
europaeus
agglutinin
I
，
UEA
-1)购自
VECTOR
公
司
；immunoSpot
S
6焚光酶联斑点分析仪购自
Cellular
Technology
Limited
公司。
18
细胞与分子免疫学杂志（
Chin J Cell M
〇
nmimm
〇
l)2021
，
37( 1)
1.2方法
1.2.1
获取胸腺及脾脏组织
SPF
级各发育阶段
备单个细胞悬液，计数胸腺细胞数量。用荧光基团
标记的抗体标记胸腺细胞，流式细胞术检测以下细
胞：双阴性细胞
（double negative cell, DN
)四个分化
发育阶段（
DN1
、
DN2
、
DN3
、
DN4)
、
CD4CD8
双阳性
细胞（
CD4+CD8+ double positive cell
，
CD4+CD8 +
C
57
BI
76
雌
性小鼠30只，分为幼年期（1月龄），青
年期(4月龄和6月龄），中年期（10月龄和12月龄)
和老年期（20月龄）共4个不同发育阶段[1142], 6个
不同月龄组，每组5只。小鼠常规伺养至相应月龄，
安乐死后，取出完整胸腺及脾脏。
1.2.2
流式细胞术检测各类指标胸
腺细胞各亚群
的检测，胸腺置于
DMEM
培养基中，剪切振荡法制
表1流式细胞术检测细胞及表面分子标志
细胞类型
DP)
、
CD4
单阳性细胞（
CD4 + CD8_ single positive cell,
CE4SP)
、
CD8
单阳性细胞
(CDTCD8+ single positive cell,
CD8SP)
、早期胸腺祖细胞
（early thymic prcgenitor cells,
■)
的数紐比例，各细胞表面标志賊
l
〇
表面分子标志
DN1
DN2
DN3
DN4
CD4 + CD8 + DP
CD4SP
CD8SP
ETP
TEC
cTEC
mTEC
TEPC
CD4 + T
细胞
CD8 + T
细胞
CD4 +
初始
T
细胞
CD8 +
初始
T
细胞
CD4 +
近期胸腺迁出细胞
（recent thymus emigrant cells
，
RTE)
CD8+ RTE
* Un - CD25 - CD44 +
*lin- CD25 + CD44*
* lin - CD25 + CD44 -
*lin~ CD25-CD44-
CD4 + CD8 +
CD4 + CD8 ~
CD4 ~ CD8 +
CD3 - CD4 - CD8 ' CD44 + CD25 ~ C-kit+
MHC II + CD45 - EpCAM +
MHC II + CD45 - EpCAM + Ly51 + UEA-1 '
MHC II + CD45 ' EpCAM + Ly51 ' UEA-1 +
MHC nlowCD45_ EpCAM +
CD3 + CD4 + CD8 _
CD3 + CD4 - CD8 +
CD3 + CD4 + CD8 ' CD62L + CD44'°
CD3 + CD4 - CD8 + CD62L + CD44'°
CD3 + CD4 + CD8 ' CD62L+ CD44loCD45RBl0
CD3 + CD4 - CD8 + CD62L+ CD44loCD45RBl0
*
谱系（
CD3
、
CD4
、
CDllb
、
TCR(3
、
TCR7/5
、
CD8
、
F4/80
、
NK1. 1
、
CD19).
TEC
及其亚群的检测，彻底吸去单细胞悬液，收
集余下胸腺组织，用
DNA
酶
I
联合木瓜蛋白酶
(
papain
)和
W
型胶原蛋白酶的方法消化[13]。37弋
消化25
min
后，用含20
miyL
胎牛血清的
PBS
终止
消化，可以得到富含
TEC
的细胞群体。先用抗
基因小鼠，安乐死后取胸腺，同上法制备富含
TEC
的细胞群体。然后，用
EPCAM
-
PE
标记
TEC
, 4
T
孵
育15
min
;清洗后，再加入结合磁珠的抗
PE
的抗体，
于4
t
孵育10
min
,离心彻底弃上清并用
PBS
重悬
细胞。200目滤膜过滤后，于生物安全柜内进行磁珠
分选，得到
EpCAM
阳性细胞。于7 x 104个/孔的细
胞数将细胞加至％孔板内，用10 |xm
〇
l/L
ROCK
抑
制剂Y-27632处理细胞，对照组用溶解
ROCK
的等
体积的
DMS
0加入细胞培养液中。连续培养96
h
，
再用
immunoSpot
S
6焚光酶联斑点分析仪检测每孔活
细胞数量，并进行统计分析。
1.2.4
流式细胞术检测
ROCK
抑制剂处理的衰老小
鼠胸腺细胞各亚群、
TEC
及其亚群以及脾脏中
T
淋
巴细胞各亚群将
10只20月龄雌性C57BL/6衰老
CD
16/32抗体封闭
TEC
的
Fc
受体，后用荧光基团标
记的抗体进行染色，流式细胞术检测
TEC
、
cTEC
、
mTEC
的数量及比例。
脾脏T细胞各亚群的检测，将脾脏置于DMEM
培养基中，研磨法制备单细胞悬液，用红细胞裂解液
处理去除红细胞，加
PBS
重悬后计数脾脏淋巴细胞
总数。先用抗CD16/32抗体封闭细胞膜上Fc受体,
再用荧光基团标记的抗体进行染色。流式细胞术检
测CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4+初始T细胞
(
CD4
+ nai've
T
cell)
、
CD8 +
naYve
T
cell
、
CD4
+
RTE
、
小鼠，随机分为实验组与对照组，每组各5只。用
1 mg/lcgROCK抑制剂隔日腹腔注射小鼠，对照组小
鼠注射溶解ROCK抑制剂等体积的DMSO,共7次。
停药一周，安乐死后取小鼠胸腺
及脾脏
，流式细胞术
CD8+ RTE的数量及比例。
1.2.3
荧光酶联斑点分析仪检测
TEC
增殖情况
采用11周龄的衰老进程中的GFP+C57BL/6转
1期曾艳，等.不同生长期小鼠胸腺
T
细胞不同亚群的变化及
ROCK
抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的促进作用19
检测小鼠胸腺细胞各亚群
（DNl
~
DN
4、
ETP
、
DP
、
CD
4
SP
、
CD
8
SP
)、TEC
及其亚群（
TEC
、
cTEC
、
mTEC
)以及脾脏中
T
淋巴细胞各亚群（
CD
4 +
T
细胞、
CD
8+
T
细胞、
CD
4 +初始
T
细胞、
CD
8 +初始
T
细胞、
CD
4 +
RTE
及
CD
8 +
RTE
),实验重复3次。最后，统
计分析实验结果。
1.2_ 5 统计学分析数据采用
GraphPad
Prism
6. 02
软件进行统计分析，两组间比较用双侧《检验，多组
间比较用单因素方差分析。数据均用
i
表示，
P
<〇.〇5为差异有统计学意义。
2结果
2.1各月龄正常小鼠胸腺DNl ~DN4、ETP、DP、
CD4SP、CD8SP数量与1月龄比较明显减少
流式细胞术检测小鼠不同发育阶段胸腺细胞各
亚群的变化
。DNl
~
DN
4的检测结果，
DN
1为
DNl
~
DN
4四组细胞亚群中细胞数量最少的一群，
与1月龄组相比，其余各组
DNl
~
DN
4均出现明显
的下降趋势，差异有统计学意义
（P
<0.01，图1
A
、
B
);
ETP
数量与1月龄组小鼠相比，其余各组均呈现显
著下降趋势，差异有统计学意义（
Z
3 <〇.〇1，图1
C
、
D
);此外，胸腺细胞亚群
DP
、
CD
4
SP
及
CD
8
SP
细胞
与1月龄比较也呈现明显下降趋势
（P
<〇. 01，
图 1
E
、
F
)。
2.2各月龄正常小鼠胸腺TEC及其亚群数量较
1月龄明显减少
流式细胞术检测
TEC
及其亚群（
cTEC
、
mTEC
)，
cTEC
数量明显少于
mTEC
,且
TEC
、
cTEC、mTEC
的
数量与月龄的增加呈反比关系，与1月龄组相比，其
余各组数量明显减少，差异有统计学意义(
P
< 〇.〇5,
图2)。
2.3 各月龄小鼠正常脾脏CD4+初始T细胞、
CD8 +初始T细胞和CD4 + RTE较1月龄显著减少
流式细胞术检测各月龄小鼠脾细胞中各个亚群
数量及比例。
CD
4+
T
细胞、
CD
8+
T
细胞比例随月
龄增加无明显下降趋势
(P
>0.05)，这说明年龄因素
对脾细胞中
CD
4+
T
细胞、
CD
8+
T
细胞占比影响不
大；脾脏
T
细胞亚群
CD
4 +初始
T
细胞、
CD
8 +初始
T
细胞和
CD
4+
RTE
所占比例随小鼠月龄的增加出
现明显的下降趋势，差异有统计学意义
（P
<〇.〇5);
与1月龄小鼠相比，仅20月龄小鼠
CD
8+
RTE
亚群在
脾脏
T
细胞中所占比例明显下降
(P
<0.05,图3)。
蝱
8
/
寸
1
寸
0.06
鎰
3
疵
>
DNl
冱
9
基
J618
DN2
0.33
-
.，龜
5
#
8
9.01
3
8
前向角散射
前向角散射
<
U CD3CD4CDllb CD25-APC
TCRB TCR
y
/8-FITC
i
2
«
s
s
Ji
前向角散射
CD3-FITC
0
3.76
1
S
w
A
d
8
-
-
8
1
8
L_J
CD4-APC-Cy7
CD44-BV421
CD25-APC
前向角散射
前向角散射
CD4-APC-Cy7
F
f
o
l
x
)
孬
荖
衷
藥
畧
DP CD4SP CD8SP
A
:流式细胞术检测胸腺细胞亚群
DN1 ~DN4; B:
不同月龄小鼠胸腺
细胞
DN1 ~DN4
亚群的半定量分析；
C
:流式细胞术检测
ETP; D:
不
同月龄小鼠胸腺
ETP
数量的半定量分析；
E:
流式细胞术
DP
、
CD4SP
、
CD8SP
胸腺细胞亚群；
F:
不同月龄小鼠胸腺
DP
、
CD4SP
、
CD8SP
数
量的半定量分析
.b
尸
<0.01 w 1
月龄
.
图1 各月龄小鼠胸腺细胞亚群
DN
1〜
DN
4、
ETP
、
DP
、
CD
4
SP
、
CD
8
SP
数量与1月龄相比明显减少
20
友
襄
聢
链
-
t
is
-
MHCII-FITC CD45-APC UEA-1-BV421
B
4
o
€
■ 1
月
□ 4
月
l
3
x
o
四
6
月
)
E
□
3
1
10
2
月
月
■ 20
月
®
鏟
2
o
3
3
1
1
o
1
1
k fk
f
ti
A:
流式细胞术检测正常小鼠
TEC; B: TEC
数量的半定量分析
.
W 1
月龄
.
图
2
各月龄正常小鼠
TEC
及其亚群与
1
月龄相比呈下降
趋势
A
甚
溢
联
i
L
s
3ft
星
.
前向角敗射
CD3-FITC
一
o
C
^
l
s
>
A
7
a
8
CD8+R1'E
-
'
-
8
8
T
•
3
!3
CD4-APC-Cyt CD62L-APC
CD45RB-PE
_
CD4+RTE
^
_
77.7
ri
CD62L-APC
CD45RB-PE
(
％
五
)
农
K
黏
n
阁
礞
碁
思
一
A:
流式细胞术检测正常小鼠脾脏中
T
淋巴细胞各亚群；
B: T
淋巴细
胞各亚群数量的半定量分析
.a/><0.05, *^<0.01 1
月龄
.
图3随月龄增加脾脏
T
细胞亚群的变化
细胞与分子免疫学杂志
（Chin J Cell Mol Immimol)2021
，
37( 1)
2.4 ROCK抑制剂在体外促进衰老进程中TEC的
增殖
ImmunoSpot
S
6酶联荧光斑点分析体外培养
TEC
的增殖情况，与对照组相比，
ROCK
抑制剂处理组细
胞数量显著增加，差异具有统计学意义
（P
<0.01，
图4)0
A
<-
<
)
曲
鉸
戔
思
-
5
徙
p
餘
^t
笠
A:
荧光酶联斑点分析仪检测每孔活细胞數量；
B: TEC
活细胞数量半
定量分析
.bP<
〇
.
〇
li«DMSO
组
.
图
4 ROCK
抑制剂在体外有效促进衰老进程中小鼠
TEC
增殖
2.5 ROCK抑制剂处理的衰老小鼠胸腺DN1 ~
DN4、DP、CD4SP、CD8SP以及ETP数量均增加
流式细胞术检测对照组与药物处理组小鼠胸腺
细胞各亚群数量变化情况，
ROCK
抑制剂处理小鼠后
胸腺细胞各亚群：
DN
1 ~
DN
4、
DP
、
CD
4
SP
、
CD
8
SP
以及
ETP
数量均较对照组明显增加，差异具有统计
学意义（尸<〇.〇5,图5)。
2.6 ROCK抑制剂处理的衰老小鼠TEC及其亚群
均增加
流式细胞术检测
TEC
及其亚群(
cTEC
、
mTEC
)
，
与
DMSO
组相比
ROCK
抑制剂处理组
TEC
及其亚群
cTEC、mTEC
细胞数量出现明显增加趋势
（P
<0.05,
图6)
。
而
TEPC
数量也出现明显上升趋势
(P
<0.01)
。
1期曾艳，等.不同生长期小鼠胸腺
T
细胞不同亚群的变化及
ROCK
抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的促进作用
21
A
DMSO
ROCK
CD8SP
DPDP
o
4.81
75.2
CD8SP
5.28
76.6
l
m
A
s
o
處
P
€
Q
o
u
I
9.96
i'J
4SP
i
10.
5.97
CWSP
12.2
CD4-APC-Cy7
B
4000
f
冬
□ DMSO
_3_ □ ROCK
o
3000
l
2000
x
)
釤
莛
100
-
菪
建
卺
200
0
r-fl
CD4+SP CD8+SP
c
DNl
DN2
DNl
f
l
1.404.251.74
DN2
7.08
N
l
-
i
i
.…:•參
|:
寒
u
dn
F
DN3
44.5
49.8
dn
I
DN3
40.9'
50.3
CD25-APC
D
□ DMSO
b
□ ROCK
(
1
,
2
兹
X)
衷
If
婆
莲
DN2 DN3
E
Lin'CD44+gated
ETP:
0.034%
15.1
ETP:
0.038%
5.03
w
d
-
|'.i
U
J
-
o
i
0.42
9
，.釋
ft
0.29
CD25-APC
F
25
r
b
C
20
-
—
1
X
15
-
—
a.
10
£
5
■ i
0'-------------------------------
. -
_
DMSO ROCK
A
:流式细胞木检测
DP
、
cmsp
、
CD
8
SP
胸腺细胞亚群；
B
:对照组及处理
组小鼠胸腺细胞
DP
、
cmsp
、
CD
8
SP
数量的半定量分析；
C
:流式细胞术
检测胸腺细胞亚群
DN
1 ~
DN
4;
D
:对照组及处理组小鼠胸腺细胞
DN
1 ~
DN
4数量的半定量分析；
E
:流式细胞术检测
ETP
;
F
:对照组及处理组小
鼠
ETP
数量的半定量分析.
a
/><〇.〇5,
bP
<0.01
w
DMSO
组.
图5
ROCK
抑制剂促进衰老小鼠体内胸腺细胞各亚群
增殖
C inTEC
S
• 2.5
S
0
UEA-1-BV421
l
蝱
lf
D
2g
l
_
(eo
□ DMSO
IB
rE
O.
i
5
a
鎰
o
1
0
a B ROCK
l
x
5
o
-
聢
_
-
)
1
n
0
I
f
_
鎬
-
i
_
M
菪
_
r
孬
MHCII-PE
TEC mTECcTEC TEPC
A:
流式细胞术检测
TEC; B:
流式细胞术检测
mTEC
、
cTEC; C
:流式
细胞术检测
TEPC; D:
对照组及处理组小鼠
TEC
各亚群数量的半定
量分析
.aP <0.05, b
尸
<0.01
似
DMSO
组
.
图6
ROCK
抑制剂促进衰老小鼠
TEC
各亚群增殖
2.7 ROCK抑制剂处理的衰老小鼠脾脏CD4 +初始
T细胞、CD8+初始T细胞、CD4+ RTE和CD8 +
RTE细胞数量增加
流式细胞术检测两组小鼠脾细胞中
T
淋巴细胞各
亚群数量及比例。总
Cm
+
T
细胞、总
CD
8+
T
细胞数
量未出现明显的增加趋势(
P
> 〇.〇5)。
ROCK
抑制剂处
理组小鼠脾脏中
T
细胞亚群
Cm
+初始
T
细胞、
CD
8 +初
始
T
细胞
、CM
+
RTE
和
CD
8+
RTE
数量较对照组显著
上升，差异有统计学意义(尸<〇.〇5,图7)〇
A
0
1
S
A
8
O
—
C
w
8
CD4
64.8
CD4-APC-Cy7
l
CD4
寸
fs
>
■
8
苳
CD4 Naive T
ni
CD4 NaiveT
rl
a
18.812.9
17.5
16.8
u
CD62L-APC
链
s
CD4 RTE CD4 RTE
58.1
73.1
CD8 RTECD8 RTE
安
3.88
3.47
f
昊
'=
n*
CD45RB-PE
T □ DMSO
□ ROCK
T
T
M
T
M
-I
.三
■
1
a
l
昏
r:
/
/
A:
流式细胞术检测脾脏中
T
淋巴细胞各亚群；对照组及处理组小
鼠脾脏中
T
淋巴细胞各亚群数量的半定量分析
•
，
DMSO
组
.
图7
ROCK
抑制剂增加衰老小鼠脾脏
T
细胞各亚群细胞数量
22
细胞与分子免疫学杂志
（Chin J Cell Mol Immunol)2021 , 37( 1 )
3讨论
本研究选用健康雌性未孕
C
57
BL
/6小鼠，排除
再生，从而增强老年个体的适应性免疫应答。
ROCK
属于丝氨酸-苏氨酸家族，是一种小
GTP
酶，可以被鸟嘌呤核苷酸交换因子激活，随后使多种
下游底物磷酸化。
Kamishibahara
等[21]的研究表明，
了类固醇激素对本实验的影响。结果表明，增龄过
程中小鼠胸腺细胞、
TEC
和脾脏
T
细胞的组成在数
量及占比上均发生改变。胸腺细胞各亚群数量减少
最为明显，其中
DN
并非为单纯的
CD
4-
CD
8 —细胞，
ROCK
抑制剂
Y
-27632能有效促进胚胎干细胞的定
向发育。此外，其他众多研究证实
ROCK
抑制剂在
而是
LirT
细胞，即排除了
B
细胞、巨噬细胞、树突状
细胞、自然杀伤
（natural
killer
,
NK
)细胞、自然杀伤
T
(natural
killer
T
,
NKT
)细胞及双阳性
T
细胞、单阳性
T
细胞等，再根据
CD
25及
CD
44的表达情况将
DN
细胞分为四个不同分化阶段，即
DN
1~
DN
4[1]。同
时发现随年龄增加
ETP
数量明显下降，且
ETP
下降
趋势及细胞数量与上述
DN
1大致相同。对
DP
、
CD
4
SP
、
CD
8
SP
细胞分析结果表明，
DP
细胞占总胸
腺细胞70%以上，这表明胸腺中大部分为未完成分
化的
DP
细胞，在阳性选择后，
DP
细胞分化为
CD
4
SP
与
CD
8
SP
细胞，其数量急剧减少，在增龄过
程中这一现象愈加明显。
TEC
来源于第三咽囊的内
胚层上皮[
M
]，早期
TEC
的发育受特异性转录因子叉
头盒
Nl
(
forkhead
box
Nl
,
F
0
XN
1
)、T
盒转录因子 1
(
T-box
transcription
factor
1 ,
Tbxl
)和配对盒基因 1
(paired
box
1，
Paxl
)[15]等特异性转录因子的调控,
F
0
XN
1是
TEC
发育和功能形成的主要调控因子[16]。
TEC
可分化发育为两个功能不同的亚群：
CTEC
和
mTEC
"7]。实验结果显示
mTEC
较
cTEC
多，这与现
有研究报导一致^8],这可能是因为
cTEC
位于胸腺
的皮质区域，此处基质网状结构包裹着密集的未成
熟的胸腺细胞；而
mTEC
位于胸腺髓质区域，髓质内
未成熟的胸腺细胞局部密度较低，基质细胞较丰富。
对脾脏中的
T
细胞检测发现，总
T
细胞数量及
CD
4 +
T
细胞和
CD
8+
T
细胞亚群并无明显升降趋势，这表
明青年期与衰老期小鼠免疫力强弱并不依赖于体内
T
细胞的总数；而
CD
4 +初始
T
细胞、
CD
8 +初始
T
细
胞以及
CD
4+
RTE
所占比例随小鼠月龄的增加出现
明显的下降趋势，这一结果表明，随着增龄性进程，
胸腺产生成熟
T
细胞并向外周运输的能力减弱，导
致脾内可被活化的
T
细胞数减少以及活化后的
T
细
胞功能欠佳，最终导致衰老小鼠免疫力降低[4]。
增龄过程中，胸腺会发生一系列的变化，其中最
明显的是胸腺细胞数减少与发育异常。除检测细胞
组成变化之外，本实验还观察了胸腺结构的变化及
TEC
的分布，实验结果与
Manley
等[19]描述的结果一
致。
Venables
等[20]发现衰老胸腺的再生依赖于
CTEC
的再生，由此推测，如果能恢复
TEC
的数量及相应
的功能，则可以促进衰老胸腺中功能正常的
T
细胞
维持胚胎干细胞多能性方面也有重要作用[22]。而
cTEC
—定程度上具有干细胞特性，胸腺内移植
CTEC
后，既可产生
cTEC
又可产生
mTEC
[23]。本研究围绕
ROCK
抑制剂
Y
-27632是否可以促进
TEC
增殖，从
而促进衰老胸腺再生进行相关实验。结果表明
ROCK
抑制剂体外能显著促进11周龄衰老进程小鼠
的
TEC
增殖。体内实验表明，
ROCK
抑制剂可以明
显促进衰老小鼠胸腺细胞各亚群、
TEC
及其亚群以
及脾脏中
T
淋巴细胞各亚群增殖。
Zhang
等[24]研究
发现
ROCK
抑制剂可以维持角化细胞增殖和分化的
平衡，这是由于
ROCK
抑制剂激活磷脂酰肌醇3激
酶/蛋白激酶
B
(
phosphatidylinositol
-3-
kinase/protein
kinaseB
,
PI
3
K
/
AKT
)信号通路，从而促进细胞的增
殖分化。而
PI
3
K
/
AKT
下游的哺乳动物雷帕霉素靶
蛋白
（mammalian
target
of
rapamycin
,
mTOR
)信号通
路与
TEC
生长发育密切相关，
mTOR
信号在细胞增
殖、分化、自噬和代谢中发挥重要作用，它的缺失会
导致
TEC
中自噬的增强，从而通过蓬乱蛋白2
(
dishevelled
-2 ,
Dvl
2 )的降解导致
Wnt
信号的衰
减[25]，而
Writ
信号在
TEC
中的作用已有明确报
道[26]，故我们推测
ROCK
抑制剂通过激活
mTOR
信
号通路从而促进
TEC
发育及成熟。此外，在临床治
疗中，
ROCK
抑制剂还被用于勃起功能障碍、青光眼
等疾病的治疗[27]。有研究证实，
ROCK
抑制剂可以
有效阻止乳腺癌细胞的迁移[M]，可作为抑制肿瘤发
生发展的潜在药物之一。由此可知，
ROCK
抑制剂在
合适的剂量范围内，有可能在抑制肿瘤发生发展的
同时，还能促进胸腺的再生。因此
ROCK
抑制剂可
以作为临床上治疗肿瘤引起的胸腺萎缩的潜在辅助
治疗用药之^*。
综上所述，随着增龄的发生，胸腺进行性退化、
萎缩，TEC各亚群数量减少，使功能正常的T细胞数
量急剧下降，导致外周初始T细胞与CD4+ RTE减
少，使得衰老小鼠免疫力降低。ROCK抑制剂可有效
促进衰老小鼠胸腺再生，对延缓胸腺萎缩有新的意
义和价值。在后续研究中，还需进一步探讨ROCK
抑制剂促进胸腺再生的具体机制，为ROCK抑制剂
的临床应用提供更多的实验依据。
1期曾艳，等.不同生长期小鼠胸腺
T
细胞不同亚群的变化及
ROCK
抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的促进作用
23
参考文献：
[1 ] Nitta T, Suzuki H. Thymic stromal cell subsets for T ceU development
[J]. Cell Mol Ufe Sci, 2016, 73(5)
：
1021-1037.
[2] Masters A R, Haynes L, Su D M, et al. Immune senescence
：
significance
of the stromal microenvironment [ J ] . Clin Exp Immunol, 2017 ,
187(1)
：
6-15.
[3] Barbouti A, Vasileiou P V S, Evangelou K, et al. Implications of
oxidative stress and cellular senescence in age-related thymus
involution[ J/OL]. Oxid Med Cell Longev, 2020, 2020
：
7986071.
DOI: 10.1155/2020/7986071. eCollection 2020.
[4] Barbouti A, Evangelou K, Pateras I S, et al. In situ evidence of
cellular senescence in thymic epithelial cells (TECs) during human
thymic involution[ J]. Mech Ageing Dev, 2019, 177
：
88-90.
[5 ] Xu M, 2iang X, Hong R, et al. microRNAs regulate thymic epithelium in
age-related thymic involution via down- or upregulation of
transcription factors [ J/OL ] • J Immunol Res, 2017, 2017
：
2528957. DOI
：
10.1155/2017/2528957. Epub 2017 Sep 10.
[6] Song Y, Su M, Zhu J, et al. FOXN1 recombinant protein enhances
T-cell regeneration after hematopoietic stem cell transplantation in
mice[J]. EurJ Immunol, 2016, 46(6)
：
1518-1528.
[7] Velardi E, Tsai J J, Radtke S, et al. Suppression of luteinizing hormone
enhances HSC recovery after hematopoietic injury [ J ]. Nat Med,
2018, 24(2)
：
239-246.
[8 ] Tang Y, Yang Y G, Bai O, et al. Long-term survival and differentiation
of human thymocytes in human thymus-grafted immunodeficient mice
[J]. Immunotherapy, 2019, 11(10
)：
881-888.
[9] Shichkin V P, Antica M. Thymus regeneration and future challenges
[J]. Stem Cell Rev Rep, 2020, 16(2)
：
239-250.
[10] Li L, Shang L, Gao J, et al. Janus kinase inhibitor ruxolitinib blocks
thymic regeneration after acute thymus injury [ J/OL ]. Biochem
Pharmacol, 2019, 171
：
113712. DOI
：
10. 1016/j. bcp. 2019.
113712. Epub 2019 Nov 11.
[11] Kevin F, Joanne M C, Harrison D E. Mouse models in aging
research[M]//in
：
Fox JGea. The Mouse in Biomedical Research
：
(Second edition) , Volume IE. Burlington
：
Academic Press, 2007
：
637-672.
[12] Padr6n A, Hurez V, Gupta H B, et al. Age effects of distinct
immune checkpoint blockade treatments in a mouse melanoma model
[J]. Exp Gerontol, 2018, 105
：
146-154.
[13] Kim M J, Serwold T. Isolation of highly viable thymic epithelial cells
for use in in vitro and in vivo experiments [ J]. Methods Mol Biol,
2019, 1899
：
143-156.
[14] Gordon J, Wilson V A, Blair N F, et al. Functional evidence for a
single endodermal origin for the thymic epithelium [ J ] ■ Nat
Immunol, 2004,5(5
)：
546-553.
[15] Yamazaki Y, Urrutia R, Franco L M, et al. PAX1 is essential for
development and function of the human thymus [ J/OL ]. Sci
Immunol, 2020, 5(44
)：
eaaxl036. DOI
：
10. 1126/sciimmunol.
aaxl036.
[16] Vigliano I, Gorrese M, Fusco A, et al. FOXN1 mutation abrogates
prenatal T-cell development in humans [ J ]. J Med Genet, 2011,
48(6) : 413416.
[17] Kadouri N, Nevo S, Goldfarb Y, ei al. Tliymic epithelial cell heterogeneity
：
TEC by TEC[J]. Nat Rev Immunol, 2020, 20(4)
：
239-253.
[18] Lepletier A, Hun M L, Hammett M V, et al. Interplay between
follistatin, activin A, and BMP4 signaling regulates postnatal thymic
epithelial progenitor cell differentiation during aging [ J/OL ] . Cell
Reports, 2019, 27( 13)
：
3887-3901. e4. DOI
：
10. 1016/j. celrep.
2019.05.045.
[19] Manley N R, Richie E R, Blackburn C C, et al. Structure and function of
the thymic microenvironment [ J ] . Front Biosci ( Landmark Ed ),
2011, 16
：
2461-2477.
[20] Venables T, Griffith A V, DeAraujo A, et al. Dynamic changes in
epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy
and regeneration [ J/OL ]. Nat Commun, 2019, 10 ( 1 )
：
4402.
DOI
：
10. 1038/s41467-019-11879-2.
[21 ] Kamishibahara Y, Kawaguchi H, Shimizu N. Rho kinase inhibitor
Y-27632 promotes neuronal differentiation in mouse embryonic stem
cells via phosphatidylinositol 3-kinase [ J ]. Neurosci Lett, 2016,
615: 4449.
[22] Zou Q, Wu M J, Zhong L W, et al. Development of a xeno-free
feeder-layer system from human umbilical cord mesenchymal stem
cells for prolonged expansion of human pluripotent stem cells
in culture [ J/OL], PLoS One, 2016, 11 ( 2 )
：
e0149023.
DOI
：
10. 1371/journal, pone.0149023. eCollection 2016.
[23] Kim M J, Miller C M, Shadrach J L, et al. Young, proliferative thymic
epithelial cells engraft and function in aging thymuses [ J ]. J
Immunol, 2015, 194(10)
：
47844795.
[24] Zhang X, Qin J, Xie Z, et al. Y-27632 preserves epidermal integrity
in a human skin organ-culture ( hSOC) system by regulating AKT
and ERK signaling pathways [J]. J Dermatol Sci, 2019, 96 ( 2
)：
99-109.
[25] Liang Z, Zhang L, Su H, et al. mTOR signaling is essential for the
development of thymic epithelial cells and the induction of central
immune tolerance [ J ]. Autophagy, 2018, 14(3
)：
505-517.
[26] Wei T L, Zhang N N, Guo Z B, et al. Wnt4 signaling is associated
with the decrease of proliferation and increase of apoptosis during
age-related thymic involution [ J ]. Mol Med Rep, 2015 , 12(5
)：
7568-7576.
[27] Honjo M, Tanihara H. Impact of the clinical use of ROCK inhibitor
on the pathogenesis and treatment of glaucoma [ J ]. Jpn J
Ophthalmol, 2018, 62(2
)：
109-126.
[28] Cascione M, De Matteis V, Toma C C, et al. Morphomechanical and
structural changes induced by ROCK inhibitor in breast cancer cells
[J]. Exp CeU Res, 2017, 360(2)
：
303-309.
2024年5月19日发(作者：寒静白)
16
细胞与分子免疫学杂志
（Chin J Cell Mol lmmUn
〇
l)2021 , 37( 1)
.论著. 文章编号：1007-8738(2021)01>0016"08
不同生长期小鼠胸腺
T
细胞不同亚群的变化及
ROCK
抑制剂对衰老小
鼠胸腺再生的促进作用
曾艳l’2A，陈昌蓉姜晓玲K2,刘美1童晨曦12,朱小康1二，宋银宏杜德兵2’3 C
三峡大学医学院病
原与免疫学系，2三峡大学感染与炎症损伤研究所，湖北宜昌443002; 3宜昌市第三人民医院肺病科，湖北宜昌443003)
[摘要]
目的研
究各发育阶段小鼠胸腺细胞、胸腺上皮细胞（
TEC
)
和
脾脏中
T
细胞的变化，探索
Rho
相关卷曲蛋白激酶
(
ROCK
)抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的作用
。方法
取幼年、青年、中年及老年期
M
7
BIV
6雌鼠的胸腺和脾脏，流式细胞术分
析小鼠胸腺细胞、
TEC
及脾脏中
T
细胞亚群；
ROCK
抑制剂体外处理衰老进程中小鼠
TEC
,荧光酶联斑点分析仪观察细胞增殖
情况；
ROCK
抑制剂处理20月龄衰老小鼠，流式细胞术检测小鼠胸腺细胞、
TEC
及脾脏中
T
细胞亚群的变化
。结果
随月龄
增加，胸腺细胞、
TEC
总数及各细胞亚群数量均显著降低；脾脏中总
CD
4+
T
细胞及
CD
8+
T
细胞比例无显著性改变，但
CD
4 +
初始
T
细胞、
CD
8 +初始
T
细胞和
CD
4 +近期胸腺迁出细胞（
RTE
)在脾脏中所占比例呈下降趋势；
ROCK
抑制剂在体外促进衰老
进程中小鼠
TEC
增殖，
ROCK
抑制剂在体内使衰老小鼠胸腺细胞、
TEC
以及外周脾脏中
T
淋巴细胞各亚群数量明显增加
。结论
随着小鼠月龄增加，胸腺呈进行性退化。
ROCK
抑制剂可以显著缓解衰老小鼠胸腺的萎缩，促进衰老小鼠胸腺再生。
[
关键词
]
胸腺；胸腺上皮细胞；
Rho
相关卷曲蛋白激酶（
ROCK
)抑制剂；衰老；再生
[文献标志码
]A
[中图分类号
]Q456, R392. 1
，
R322.5 + 3, Q945.48, R339.3 + 8
Changes of different cell subsets in thymus and spleen of mice at different growth
stages and the facilitating effect of ROCK inhibitor on thymus regeneration in
aged mice
ZENG
Yan''2A,
CHEN
Changrong1'2A,
JIANG
Xiaoling1'2,
UU
Mei1'2,
TONG
Chenxi1-2,
ZHU
Xiaokang1'2,
SONG
Yinhong1'2*, DU Debing2'3
1
Department
of
Pathology
and
Immunology
,
Medical
College
,
2Institute
of
Infection
and
Inflammation
,
China
Three
Gorges
University
,
Yichang
443002；
3Department
of
Lung
Diseases
,
The
Third
People
Hospital
of
Yichang
City
,
Yichang
443003,
China
*
Corresponding
author
,
E
-
：
syh
728@ 126.
com
[
Abstract
]
Objective
To investigate the changes of subsets of thymocytes, thymic epithelial cells (TECs) and T
lymphocytes in the spleen of mice at different growth stages, and to explore the effect of Rho-associated coiled-coil
protein kinase (ROCK) inhibitor on thymus regeneration in aged mice.
Methods
The thymus and spleens were harvested
from female C57BL76 mice at juvenile, mature adult, middle-aged and aged phases. The subsets of thymocytes, TECs and
T cells in the spleen were analyzed by flow cytometry (FCM). TECs of aging mice were treated with ROCK inhibitor
in vitro.
Cell proliferation was observed using fluorescence immune-linked spot analyzer. Aged mice of 20-month old were treated with
ROCK inhibitor
in vivo.
The changes of thymocytes, TECs and T cell subgroups in the spleen were detected with FCM.
Results
The total numbers of thymocytes and TECs as well as the number of each cell subpopulation decreased significantly
with aging. The proportions of CD4+ naive T cells, CD8+ naive T cells and CD4+ recent thymus emigrant cells (RTEs) in the
spleen showed significant decreasing trends although there were not obvious changes in the proportions of CD4+ T cells and
CD8+ T cells in the spleen of mice during aging. ROCK inhibitor facilitated the proliferation of TECs in aging mice
in vitro.
ROCK inhibitor also increased the numbers of the subsets of thymocytes, TECs and T cells in the spleen of aged mice
收稿日期
：
2020~09-30;
接受日期
：
2020-11 -27
基金项目
：国家自然科学基金（
81671397);
湖北省宜昌市科技局项目（
A16-301-32)
作者简介
：曾艳
（1995
-)，女，广东河源人，硕士研究生
Tel
：
188****9881
；
：
477152332@ qq. com
A同为第一作者
*
通讯作者，宋银宏，
E-mail: syh728@
1期曾艳，等.不同生长期小鼠胸腺
T
细胞不同亚群的变化及
ROCK
抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的促进作用
17
significantly.
Conclusion
The mouse thymus undergoes progressing degeneration with aging. ROCK inhibitor has potential
of relieving the atrophy of thymus, facilitating thymus regeneration in aged mice.
[Key words] thymus
；
thymic epithelial cells
；
ROCK inhibitor
；
aging
；
regeneration
胸腺是机体中枢免疫器官之一，是
T
淋巴细胞
发育、分化和成熟的主要场所。胸腺内细胞包括胸
腺细胞和胸腺基质细胞，胸腺细胞是
T
淋巴细胞的
前体细胞，胸腺基质细胞主要由胸腺上皮细胞
(thymic
epithelial
cells
,
TEC
)组成，为胸腺细胞的发
育提供最适宜的生存环境[1]。随年龄增加，动物和
人都存在不同程度的胸腺萎缩。胸腺萎缩是免疫系
统衰老的重要标志之一，增龄性胸腺退化是衰老小
鼠免疫功能衰退的重要原因。在衰老过程中，胸腺
形态及胸腺基质细胞等均出现相应变化[W]，其中
TEC
是胸腺基质细胞中最主要的成分，胸腺上皮祖
细胞（thymic epithelial progenitor cells, TEPC
)是
TEC
的来源，可以在体内分化为皮质胸腺上皮细胞(cortical
thymic epithelial cells, cTEC)及髓质胸腺上皮细胞
(medullary thymic epithelial cells, mTEC )
〇
cTEC 主
要介导胸腺细胞的阳性选择，而mTEC在阴性选择
中起重要作用。这些选择过程将保证最终发育成熟
的
T
淋巴细胞既具有自身主要组织相容性复合体
(major histocompatibility complex, MHC)分子限制性
又具有中枢免疫耐受的特性。随年龄增长
，
TEC在
数量和质量上均不断下降[4]，这导致机体对新出现
抗原的免疫应答减弱；患者在受到免疫损伤后，恢复
适应性免疫的能力受到损害，易产生自身免疫性疾
病等一系列疾病的发生。研究表明在微小RNA
(microRNA)和某些蛋白可以有效促进TEC的增
殖[5~，此外类固醇抑制可以保护胸腺细胞不衰
竭[7]，研究发现通过手术方式移植也可以达到胸腺
再生的目的[8]，但这些方法过程繁琐且结果不可控，
实施时会面临较多困难[9]，因此需要发展既可克服
上述弊端又能有效促进TEC增殖的策略。最近有报
道，利用Janus激酶（Janus kinase, JAK)抑制剂处理
胸腺受损后的小鼠，在一定时间内可以对TEC再生
发挥重要作用[
W
]，这给我们提供了新的实验思路。
本课题组前期将376种小分子抑制剂与TEC进行体
外共培养，结果显示
Rho
相关卷曲蛋白激酶
(
Rho-associated
coiled-coil
protein
kinase，ROCK
)抑
制剂对
TEC
增殖有明显的促进作用。本研究观察了
不同生长期胸腺细胞各亚群、
TEC
各亚群、脾脏
T
细
胞各亚群的具体变化，然后用
ROCK
抑制剂处理
20月龄衰老小鼠，并检测处理后胸腺细胞和
TEC
及对
应各亚群变化、脾脏
T
细胞及各亚群变化，明确
ROCK
抑制剂促进衰老个体
TEC
增殖及胸腺再生的效应，以
期为临床增强衰老个体的免疫力提供治疗思路。
1材料和方法
1.1材料
无特定病原体
（specific
pathogen
free
,
SPF
)级各
发育阶段雌性
C
57
BL
/6小鼠共30只，衰老（20月
龄）雌性
C
57
BIV
6小鼠30只，11周龄绿色荧光蛋白
(green
fluorescent
protein，GFP
)转基因（
GFP
+
C
57
BIV
6)小鼠10只，分笼饲养。室温20~25
t
，湿
度40% ~60% ,自由摄食饮水。野生型
C
57
BI
76小
鼠购自三峡大学实验动物中心，
GFP
+
C
57
BL
/6小鼠
购自赛业（广州）生物科技有限公司。胎牛血清
（fetal
bovine
serum
,
FBS
)和
DMEM
培养基购自
Gibco
公
司；
DNA
酶
I
、木瓜蛋白酶、
IV
型胶原蛋白酶购自
Worthington
公司；二甲基亚讽
（dimethyl
sulfoxide
,
DMS
0)购自国药集团公司；异硫氰酸荧光素
(fluorescein
isothiocyanate
，
FITC
)标记的抗
CD
3 抗体
(
CD
3
-FITC
)、
CD
4-
FITC
、
CD
11
b
-
FITC
、藻红蛋白
(
phycoerythrin
，
PE
)标记的抗
CD
19 抗体（
CD
19-
PE
)、
F
4/80-
PE
、
CD
117 (
c-kit
)-
PE
、别藻蓝蛋白
(
allophycocyanin
,
APC
)标记的抗
CD
25 抗体
(
CD
25-
APC
)、
CD
62
LAPC
、
CD
45-
APC
、
CD
45
RB
-
PE
、
I
-
A
/
I
-
E(MHC
II
)-
FITC
、
Ly
51-
PE
、亮紫421
(brilliant
violet
421，
BV
421 )标记的链霉亲和素（
streptavidin
)
(
Streptavidin
-
BV
421)、
CD
44-
BV
421、流式细胞仪购
自
BD
公司。008-?£、1^1.1-?£、1'细胞受体卩（丁
cell
receptor
p
，
TCR
(3)-
FITC
、
TCR
*
y
/
S
-
FITC
、别藻蓝
蛋白-花青素 7 (
allophycocyanin-cyanine
7，
APC
-
Cy
7)
标记的抗
CD
4抗体（
CD
4-
APC
-
Cy
7)、亮紫510
(brilliant
violet
510，
BV
510)标记的抗
CD
8
a
抗体
(0〇83-8¥510)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白-花青素5.5
(pieridinin
chlorophyll
protein-cyanine
5.5,
PerCP
-
Cy
5.5)
标记的抗上皮细胞黏附分子
（epithelial
cell
adhesion
molecule
，
EpCAM
/
CD
326)抗体（
EpCAM
/
CD
326*
PeiCP
-
Cy
5.5)、
EpCAM
/
CD
326-
PE
、纯化的
CD
16/32 抗
体购自
Biolegend
公司。
ROCK
抑制剂
Y
-27632购自
Cayman
公司；生物素标记的荆豆凝集素
（biotinylated
ulex
europaeus
agglutinin
I
，
UEA
-1)购自
VECTOR
公
司
；immunoSpot
S
6焚光酶联斑点分析仪购自
Cellular
Technology
Limited
公司。
18
细胞与分子免疫学杂志（
Chin J Cell M
〇
nmimm
〇
l)2021
，
37( 1)
1.2方法
1.2.1
获取胸腺及脾脏组织
SPF
级各发育阶段
备单个细胞悬液，计数胸腺细胞数量。用荧光基团
标记的抗体标记胸腺细胞，流式细胞术检测以下细
胞：双阴性细胞
（double negative cell, DN
)四个分化
发育阶段（
DN1
、
DN2
、
DN3
、
DN4)
、
CD4CD8
双阳性
细胞（
CD4+CD8+ double positive cell
，
CD4+CD8 +
C
57
BI
76
雌
性小鼠30只，分为幼年期（1月龄），青
年期(4月龄和6月龄），中年期（10月龄和12月龄)
和老年期（20月龄）共4个不同发育阶段[1142], 6个
不同月龄组，每组5只。小鼠常规伺养至相应月龄，
安乐死后，取出完整胸腺及脾脏。
1.2.2
流式细胞术检测各类指标胸
腺细胞各亚群
的检测，胸腺置于
DMEM
培养基中，剪切振荡法制
表1流式细胞术检测细胞及表面分子标志
细胞类型
DP)
、
CD4
单阳性细胞（
CD4 + CD8_ single positive cell,
CE4SP)
、
CD8
单阳性细胞
(CDTCD8+ single positive cell,
CD8SP)
、早期胸腺祖细胞
（early thymic prcgenitor cells,
■)
的数紐比例，各细胞表面标志賊
l
〇
表面分子标志
DN1
DN2
DN3
DN4
CD4 + CD8 + DP
CD4SP
CD8SP
ETP
TEC
cTEC
mTEC
TEPC
CD4 + T
细胞
CD8 + T
细胞
CD4 +
初始
T
细胞
CD8 +
初始
T
细胞
CD4 +
近期胸腺迁出细胞
（recent thymus emigrant cells
，
RTE)
CD8+ RTE
* Un - CD25 - CD44 +
*lin- CD25 + CD44*
* lin - CD25 + CD44 -
*lin~ CD25-CD44-
CD4 + CD8 +
CD4 + CD8 ~
CD4 ~ CD8 +
CD3 - CD4 - CD8 ' CD44 + CD25 ~ C-kit+
MHC II + CD45 - EpCAM +
MHC II + CD45 - EpCAM + Ly51 + UEA-1 '
MHC II + CD45 ' EpCAM + Ly51 ' UEA-1 +
MHC nlowCD45_ EpCAM +
CD3 + CD4 + CD8 _
CD3 + CD4 - CD8 +
CD3 + CD4 + CD8 ' CD62L + CD44'°
CD3 + CD4 - CD8 + CD62L + CD44'°
CD3 + CD4 + CD8 ' CD62L+ CD44loCD45RBl0
CD3 + CD4 - CD8 + CD62L+ CD44loCD45RBl0
*
谱系（
CD3
、
CD4
、
CDllb
、
TCR(3
、
TCR7/5
、
CD8
、
F4/80
、
NK1. 1
、
CD19).
TEC
及其亚群的检测，彻底吸去单细胞悬液，收
集余下胸腺组织，用
DNA
酶
I
联合木瓜蛋白酶
(
papain
)和
W
型胶原蛋白酶的方法消化[13]。37弋
消化25
min
后，用含20
miyL
胎牛血清的
PBS
终止
消化，可以得到富含
TEC
的细胞群体。先用抗
基因小鼠，安乐死后取胸腺，同上法制备富含
TEC
的细胞群体。然后，用
EPCAM
-
PE
标记
TEC
, 4
T
孵
育15
min
;清洗后，再加入结合磁珠的抗
PE
的抗体，
于4
t
孵育10
min
,离心彻底弃上清并用
PBS
重悬
细胞。200目滤膜过滤后，于生物安全柜内进行磁珠
分选，得到
EpCAM
阳性细胞。于7 x 104个/孔的细
胞数将细胞加至％孔板内，用10 |xm
〇
l/L
ROCK
抑
制剂Y-27632处理细胞，对照组用溶解
ROCK
的等
体积的
DMS
0加入细胞培养液中。连续培养96
h
，
再用
immunoSpot
S
6焚光酶联斑点分析仪检测每孔活
细胞数量，并进行统计分析。
1.2.4
流式细胞术检测
ROCK
抑制剂处理的衰老小
鼠胸腺细胞各亚群、
TEC
及其亚群以及脾脏中
T
淋
巴细胞各亚群将
10只20月龄雌性C57BL/6衰老
CD
16/32抗体封闭
TEC
的
Fc
受体，后用荧光基团标
记的抗体进行染色，流式细胞术检测
TEC
、
cTEC
、
mTEC
的数量及比例。
脾脏T细胞各亚群的检测，将脾脏置于DMEM
培养基中，研磨法制备单细胞悬液，用红细胞裂解液
处理去除红细胞，加
PBS
重悬后计数脾脏淋巴细胞
总数。先用抗CD16/32抗体封闭细胞膜上Fc受体,
再用荧光基团标记的抗体进行染色。流式细胞术检
测CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4+初始T细胞
(
CD4
+ nai've
T
cell)
、
CD8 +
naYve
T
cell
、
CD4
+
RTE
、
小鼠，随机分为实验组与对照组，每组各5只。用
1 mg/lcgROCK抑制剂隔日腹腔注射小鼠，对照组小
鼠注射溶解ROCK抑制剂等体积的DMSO,共7次。
停药一周，安乐死后取小鼠胸腺
及脾脏
，流式细胞术
CD8+ RTE的数量及比例。
1.2.3
荧光酶联斑点分析仪检测
TEC
增殖情况
采用11周龄的衰老进程中的GFP+C57BL/6转
1期曾艳，等.不同生长期小鼠胸腺
T
细胞不同亚群的变化及
ROCK
抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的促进作用19
检测小鼠胸腺细胞各亚群
（DNl
~
DN
4、
ETP
、
DP
、
CD
4
SP
、
CD
8
SP
)、TEC
及其亚群（
TEC
、
cTEC
、
mTEC
)以及脾脏中
T
淋巴细胞各亚群（
CD
4 +
T
细胞、
CD
8+
T
细胞、
CD
4 +初始
T
细胞、
CD
8 +初始
T
细胞、
CD
4 +
RTE
及
CD
8 +
RTE
),实验重复3次。最后，统
计分析实验结果。
1.2_ 5 统计学分析数据采用
GraphPad
Prism
6. 02
软件进行统计分析，两组间比较用双侧《检验，多组
间比较用单因素方差分析。数据均用
i
表示，
P
<〇.〇5为差异有统计学意义。
2结果
2.1各月龄正常小鼠胸腺DNl ~DN4、ETP、DP、
CD4SP、CD8SP数量与1月龄比较明显减少
流式细胞术检测小鼠不同发育阶段胸腺细胞各
亚群的变化
。DNl
~
DN
4的检测结果，
DN
1为
DNl
~
DN
4四组细胞亚群中细胞数量最少的一群，
与1月龄组相比，其余各组
DNl
~
DN
4均出现明显
的下降趋势，差异有统计学意义
（P
<0.01，图1
A
、
B
);
ETP
数量与1月龄组小鼠相比，其余各组均呈现显
著下降趋势，差异有统计学意义（
Z
3 <〇.〇1，图1
C
、
D
);此外，胸腺细胞亚群
DP
、
CD
4
SP
及
CD
8
SP
细胞
与1月龄比较也呈现明显下降趋势
（P
<〇. 01，
图 1
E
、
F
)。
2.2各月龄正常小鼠胸腺TEC及其亚群数量较
1月龄明显减少
流式细胞术检测
TEC
及其亚群（
cTEC
、
mTEC
)，
cTEC
数量明显少于
mTEC
,且
TEC
、
cTEC、mTEC
的
数量与月龄的增加呈反比关系，与1月龄组相比，其
余各组数量明显减少，差异有统计学意义(
P
< 〇.〇5,
图2)。
2.3 各月龄小鼠正常脾脏CD4+初始T细胞、
CD8 +初始T细胞和CD4 + RTE较1月龄显著减少
流式细胞术检测各月龄小鼠脾细胞中各个亚群
数量及比例。
CD
4+
T
细胞、
CD
8+
T
细胞比例随月
龄增加无明显下降趋势
(P
>0.05)，这说明年龄因素
对脾细胞中
CD
4+
T
细胞、
CD
8+
T
细胞占比影响不
大；脾脏
T
细胞亚群
CD
4 +初始
T
细胞、
CD
8 +初始
T
细胞和
CD
4+
RTE
所占比例随小鼠月龄的增加出
现明显的下降趋势，差异有统计学意义
（P
<〇.〇5);
与1月龄小鼠相比，仅20月龄小鼠
CD
8+
RTE
亚群在
脾脏
T
细胞中所占比例明显下降
(P
<0.05,图3)。
蝱
8
/
寸
1
寸
0.06
鎰
3
疵
>
DNl
冱
9
基
J618
DN2
0.33
-
.，龜
5
#
8
9.01
3
8
前向角散射
前向角散射
<
U CD3CD4CDllb CD25-APC
TCRB TCR
y
/8-FITC
i
2
«
s
s
Ji
前向角散射
CD3-FITC
0
3.76
1
S
w
A
d
8
-
-
8
1
8
L_J
CD4-APC-Cy7
CD44-BV421
CD25-APC
前向角散射
前向角散射
CD4-APC-Cy7
F
f
o
l
x
)
孬
荖
衷
藥
畧
DP CD4SP CD8SP
A
:流式细胞术检测胸腺细胞亚群
DN1 ~DN4; B:
不同月龄小鼠胸腺
细胞
DN1 ~DN4
亚群的半定量分析；
C
:流式细胞术检测
ETP; D:
不
同月龄小鼠胸腺
ETP
数量的半定量分析；
E:
流式细胞术
DP
、
CD4SP
、
CD8SP
胸腺细胞亚群；
F:
不同月龄小鼠胸腺
DP
、
CD4SP
、
CD8SP
数
量的半定量分析
.b
尸
<0.01 w 1
月龄
.
图1 各月龄小鼠胸腺细胞亚群
DN
1〜
DN
4、
ETP
、
DP
、
CD
4
SP
、
CD
8
SP
数量与1月龄相比明显减少
20
友
襄
聢
链
-
t
is
-
MHCII-FITC CD45-APC UEA-1-BV421
B
4
o
€
■ 1
月
□ 4
月
l
3
x
o
四
6
月
)
E
□
3
1
10
2
月
月
■ 20
月
®
鏟
2
o
3
3
1
1
o
1
1
k fk
f
ti
A:
流式细胞术检测正常小鼠
TEC; B: TEC
数量的半定量分析
.
W 1
月龄
.
图
2
各月龄正常小鼠
TEC
及其亚群与
1
月龄相比呈下降
趋势
A
甚
溢
联
i
L
s
3ft
星
.
前向角敗射
CD3-FITC
一
o
C
^
l
s
>
A
7
a
8
CD8+R1'E
-
'
-
8
8
T
•
3
!3
CD4-APC-Cyt CD62L-APC
CD45RB-PE
_
CD4+RTE
^
_
77.7
ri
CD62L-APC
CD45RB-PE
(
％
五
)
农
K
黏
n
阁
礞
碁
思
一
A:
流式细胞术检测正常小鼠脾脏中
T
淋巴细胞各亚群；
B: T
淋巴细
胞各亚群数量的半定量分析
.a/><0.05, *^<0.01 1
月龄
.
图3随月龄增加脾脏
T
细胞亚群的变化
细胞与分子免疫学杂志
（Chin J Cell Mol Immimol)2021
，
37( 1)
2.4 ROCK抑制剂在体外促进衰老进程中TEC的
增殖
ImmunoSpot
S
6酶联荧光斑点分析体外培养
TEC
的增殖情况，与对照组相比，
ROCK
抑制剂处理组细
胞数量显著增加，差异具有统计学意义
（P
<0.01，
图4)0
A
<-
<
)
曲
鉸
戔
思
-
5
徙
p
餘
^t
笠
A:
荧光酶联斑点分析仪检测每孔活细胞數量；
B: TEC
活细胞数量半
定量分析
.bP<
〇
.
〇
li«DMSO
组
.
图
4 ROCK
抑制剂在体外有效促进衰老进程中小鼠
TEC
增殖
2.5 ROCK抑制剂处理的衰老小鼠胸腺DN1 ~
DN4、DP、CD4SP、CD8SP以及ETP数量均增加
流式细胞术检测对照组与药物处理组小鼠胸腺
细胞各亚群数量变化情况，
ROCK
抑制剂处理小鼠后
胸腺细胞各亚群：
DN
1 ~
DN
4、
DP
、
CD
4
SP
、
CD
8
SP
以及
ETP
数量均较对照组明显增加，差异具有统计
学意义（尸<〇.〇5,图5)。
2.6 ROCK抑制剂处理的衰老小鼠TEC及其亚群
均增加
流式细胞术检测
TEC
及其亚群(
cTEC
、
mTEC
)
，
与
DMSO
组相比
ROCK
抑制剂处理组
TEC
及其亚群
cTEC、mTEC
细胞数量出现明显增加趋势
（P
<0.05,
图6)
。
而
TEPC
数量也出现明显上升趋势
(P
<0.01)
。
1期曾艳，等.不同生长期小鼠胸腺
T
细胞不同亚群的变化及
ROCK
抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的促进作用
21
A
DMSO
ROCK
CD8SP
DPDP
o
4.81
75.2
CD8SP
5.28
76.6
l
m
A
s
o
處
P
€
Q
o
u
I
9.96
i'J
4SP
i
10.
5.97
CWSP
12.2
CD4-APC-Cy7
B
4000
f
冬
□ DMSO
_3_ □ ROCK
o
3000
l
2000
x
)
釤
莛
100
-
菪
建
卺
200
0
r-fl
CD4+SP CD8+SP
c
DNl
DN2
DNl
f
l
1.404.251.74
DN2
7.08
N
l
-
i
i
.…:•參
|:
寒
u
dn
F
DN3
44.5
49.8
dn
I
DN3
40.9'
50.3
CD25-APC
D
□ DMSO
b
□ ROCK
(
1
,
2
兹
X)
衷
If
婆
莲
DN2 DN3
E
Lin'CD44+gated
ETP:
0.034%
15.1
ETP:
0.038%
5.03
w
d
-
|'.i
U
J
-
o
i
0.42
9
，.釋
ft
0.29
CD25-APC
F
25
r
b
C
20
-
—
1
X
15
-
—
a.
10
£
5
■ i
0'-------------------------------
. -
_
DMSO ROCK
A
:流式细胞木检测
DP
、
cmsp
、
CD
8
SP
胸腺细胞亚群；
B
:对照组及处理
组小鼠胸腺细胞
DP
、
cmsp
、
CD
8
SP
数量的半定量分析；
C
:流式细胞术
检测胸腺细胞亚群
DN
1 ~
DN
4;
D
:对照组及处理组小鼠胸腺细胞
DN
1 ~
DN
4数量的半定量分析；
E
:流式细胞术检测
ETP
;
F
:对照组及处理组小
鼠
ETP
数量的半定量分析.
a
/><〇.〇5,
bP
<0.01
w
DMSO
组.
图5
ROCK
抑制剂促进衰老小鼠体内胸腺细胞各亚群
增殖
C inTEC
S
• 2.5
S
0
UEA-1-BV421
l
蝱
lf
D
2g
l
_
(eo
□ DMSO
IB
rE
O.
i
5
a
鎰
o
1
0
a B ROCK
l
x
5
o
-
聢
_
-
)
1
n
0
I
f
_
鎬
-
i
_
M
菪
_
r
孬
MHCII-PE
TEC mTECcTEC TEPC
A:
流式细胞术检测
TEC; B:
流式细胞术检测
mTEC
、
cTEC; C
:流式
细胞术检测
TEPC; D:
对照组及处理组小鼠
TEC
各亚群数量的半定
量分析
.aP <0.05, b
尸
<0.01
似
DMSO
组
.
图6
ROCK
抑制剂促进衰老小鼠
TEC
各亚群增殖
2.7 ROCK抑制剂处理的衰老小鼠脾脏CD4 +初始
T细胞、CD8+初始T细胞、CD4+ RTE和CD8 +
RTE细胞数量增加
流式细胞术检测两组小鼠脾细胞中
T
淋巴细胞各
亚群数量及比例。总
Cm
+
T
细胞、总
CD
8+
T
细胞数
量未出现明显的增加趋势(
P
> 〇.〇5)。
ROCK
抑制剂处
理组小鼠脾脏中
T
细胞亚群
Cm
+初始
T
细胞、
CD
8 +初
始
T
细胞
、CM
+
RTE
和
CD
8+
RTE
数量较对照组显著
上升，差异有统计学意义(尸<〇.〇5,图7)〇
A
0
1
S
A
8
O
—
C
w
8
CD4
64.8
CD4-APC-Cy7
l
CD4
寸
fs
>
■
8
苳
CD4 Naive T
ni
CD4 NaiveT
rl
a
18.812.9
17.5
16.8
u
CD62L-APC
链
s
CD4 RTE CD4 RTE
58.1
73.1
CD8 RTECD8 RTE
安
3.88
3.47
f
昊
'=
n*
CD45RB-PE
T □ DMSO
□ ROCK
T
T
M
T
M
-I
.三
■
1
a
l
昏
r:
/
/
A:
流式细胞术检测脾脏中
T
淋巴细胞各亚群；对照组及处理组小
鼠脾脏中
T
淋巴细胞各亚群数量的半定量分析
•
，
DMSO
组
.
图7
ROCK
抑制剂增加衰老小鼠脾脏
T
细胞各亚群细胞数量
22
细胞与分子免疫学杂志
（Chin J Cell Mol Immunol)2021 , 37( 1 )
3讨论
本研究选用健康雌性未孕
C
57
BL
/6小鼠，排除
再生，从而增强老年个体的适应性免疫应答。
ROCK
属于丝氨酸-苏氨酸家族，是一种小
GTP
酶，可以被鸟嘌呤核苷酸交换因子激活，随后使多种
下游底物磷酸化。
Kamishibahara
等[21]的研究表明，
了类固醇激素对本实验的影响。结果表明，增龄过
程中小鼠胸腺细胞、
TEC
和脾脏
T
细胞的组成在数
量及占比上均发生改变。胸腺细胞各亚群数量减少
最为明显，其中
DN
并非为单纯的
CD
4-
CD
8 —细胞，
ROCK
抑制剂
Y
-27632能有效促进胚胎干细胞的定
向发育。此外，其他众多研究证实
ROCK
抑制剂在
而是
LirT
细胞，即排除了
B
细胞、巨噬细胞、树突状
细胞、自然杀伤
（natural
killer
,
NK
)细胞、自然杀伤
T
(natural
killer
T
,
NKT
)细胞及双阳性
T
细胞、单阳性
T
细胞等，再根据
CD
25及
CD
44的表达情况将
DN
细胞分为四个不同分化阶段，即
DN
1~
DN
4[1]。同
时发现随年龄增加
ETP
数量明显下降，且
ETP
下降
趋势及细胞数量与上述
DN
1大致相同。对
DP
、
CD
4
SP
、
CD
8
SP
细胞分析结果表明，
DP
细胞占总胸
腺细胞70%以上，这表明胸腺中大部分为未完成分
化的
DP
细胞，在阳性选择后，
DP
细胞分化为
CD
4
SP
与
CD
8
SP
细胞，其数量急剧减少，在增龄过
程中这一现象愈加明显。
TEC
来源于第三咽囊的内
胚层上皮[
M
]，早期
TEC
的发育受特异性转录因子叉
头盒
Nl
(
forkhead
box
Nl
,
F
0
XN
1
)、T
盒转录因子 1
(
T-box
transcription
factor
1 ,
Tbxl
)和配对盒基因 1
(paired
box
1，
Paxl
)[15]等特异性转录因子的调控,
F
0
XN
1是
TEC
发育和功能形成的主要调控因子[16]。
TEC
可分化发育为两个功能不同的亚群：
CTEC
和
mTEC
"7]。实验结果显示
mTEC
较
cTEC
多，这与现
有研究报导一致^8],这可能是因为
cTEC
位于胸腺
的皮质区域，此处基质网状结构包裹着密集的未成
熟的胸腺细胞；而
mTEC
位于胸腺髓质区域，髓质内
未成熟的胸腺细胞局部密度较低，基质细胞较丰富。
对脾脏中的
T
细胞检测发现，总
T
细胞数量及
CD
4 +
T
细胞和
CD
8+
T
细胞亚群并无明显升降趋势，这表
明青年期与衰老期小鼠免疫力强弱并不依赖于体内
T
细胞的总数；而
CD
4 +初始
T
细胞、
CD
8 +初始
T
细
胞以及
CD
4+
RTE
所占比例随小鼠月龄的增加出现
明显的下降趋势，这一结果表明，随着增龄性进程，
胸腺产生成熟
T
细胞并向外周运输的能力减弱，导
致脾内可被活化的
T
细胞数减少以及活化后的
T
细
胞功能欠佳，最终导致衰老小鼠免疫力降低[4]。
增龄过程中，胸腺会发生一系列的变化，其中最
明显的是胸腺细胞数减少与发育异常。除检测细胞
组成变化之外，本实验还观察了胸腺结构的变化及
TEC
的分布，实验结果与
Manley
等[19]描述的结果一
致。
Venables
等[20]发现衰老胸腺的再生依赖于
CTEC
的再生，由此推测，如果能恢复
TEC
的数量及相应
的功能，则可以促进衰老胸腺中功能正常的
T
细胞
维持胚胎干细胞多能性方面也有重要作用[22]。而
cTEC
—定程度上具有干细胞特性，胸腺内移植
CTEC
后，既可产生
cTEC
又可产生
mTEC
[23]。本研究围绕
ROCK
抑制剂
Y
-27632是否可以促进
TEC
增殖，从
而促进衰老胸腺再生进行相关实验。结果表明
ROCK
抑制剂体外能显著促进11周龄衰老进程小鼠
的
TEC
增殖。体内实验表明，
ROCK
抑制剂可以明
显促进衰老小鼠胸腺细胞各亚群、
TEC
及其亚群以
及脾脏中
T
淋巴细胞各亚群增殖。
Zhang
等[24]研究
发现
ROCK
抑制剂可以维持角化细胞增殖和分化的
平衡，这是由于
ROCK
抑制剂激活磷脂酰肌醇3激
酶/蛋白激酶
B
(
phosphatidylinositol
-3-
kinase/protein
kinaseB
,
PI
3
K
/
AKT
)信号通路，从而促进细胞的增
殖分化。而
PI
3
K
/
AKT
下游的哺乳动物雷帕霉素靶
蛋白
（mammalian
target
of
rapamycin
,
mTOR
)信号通
路与
TEC
生长发育密切相关，
mTOR
信号在细胞增
殖、分化、自噬和代谢中发挥重要作用，它的缺失会
导致
TEC
中自噬的增强，从而通过蓬乱蛋白2
(
dishevelled
-2 ,
Dvl
2 )的降解导致
Wnt
信号的衰
减[25]，而
Writ
信号在
TEC
中的作用已有明确报
道[26]，故我们推测
ROCK
抑制剂通过激活
mTOR
信
号通路从而促进
TEC
发育及成熟。此外，在临床治
疗中，
ROCK
抑制剂还被用于勃起功能障碍、青光眼
等疾病的治疗[27]。有研究证实，
ROCK
抑制剂可以
有效阻止乳腺癌细胞的迁移[M]，可作为抑制肿瘤发
生发展的潜在药物之一。由此可知，
ROCK
抑制剂在
合适的剂量范围内，有可能在抑制肿瘤发生发展的
同时，还能促进胸腺的再生。因此
ROCK
抑制剂可
以作为临床上治疗肿瘤引起的胸腺萎缩的潜在辅助
治疗用药之^*。
综上所述，随着增龄的发生，胸腺进行性退化、
萎缩，TEC各亚群数量减少，使功能正常的T细胞数
量急剧下降，导致外周初始T细胞与CD4+ RTE减
少，使得衰老小鼠免疫力降低。ROCK抑制剂可有效
促进衰老小鼠胸腺再生，对延缓胸腺萎缩有新的意
义和价值。在后续研究中，还需进一步探讨ROCK
抑制剂促进胸腺再生的具体机制，为ROCK抑制剂
的临床应用提供更多的实验依据。
1期曾艳，等.不同生长期小鼠胸腺
T
细胞不同亚群的变化及
ROCK
抑制剂对衰老小鼠胸腺再生的促进作用
23
参考文献：
[1 ] Nitta T, Suzuki H. Thymic stromal cell subsets for T ceU development
[J]. Cell Mol Ufe Sci, 2016, 73(5)
：
1021-1037.
[2] Masters A R, Haynes L, Su D M, et al. Immune senescence
：
significance
of the stromal microenvironment [ J ] . Clin Exp Immunol, 2017 ,
187(1)
：
6-15.
[3] Barbouti A, Vasileiou P V S, Evangelou K, et al. Implications of
oxidative stress and cellular senescence in age-related thymus
involution[ J/OL]. Oxid Med Cell Longev, 2020, 2020
：
7986071.
DOI: 10.1155/2020/7986071. eCollection 2020.
[4] Barbouti A, Evangelou K, Pateras I S, et al. In situ evidence of
cellular senescence in thymic epithelial cells (TECs) during human
thymic involution[ J]. Mech Ageing Dev, 2019, 177
：
88-90.
[5 ] Xu M, 2iang X, Hong R, et al. microRNAs regulate thymic epithelium in
age-related thymic involution via down- or upregulation of
transcription factors [ J/OL ] • J Immunol Res, 2017, 2017
：
2528957. DOI
：
10.1155/2017/2528957. Epub 2017 Sep 10.
[6] Song Y, Su M, Zhu J, et al. FOXN1 recombinant protein enhances
T-cell regeneration after hematopoietic stem cell transplantation in
mice[J]. EurJ Immunol, 2016, 46(6)
：
1518-1528.
[7] Velardi E, Tsai J J, Radtke S, et al. Suppression of luteinizing hormone
enhances HSC recovery after hematopoietic injury [ J ]. Nat Med,
2018, 24(2)
：
239-246.
[8 ] Tang Y, Yang Y G, Bai O, et al. Long-term survival and differentiation
of human thymocytes in human thymus-grafted immunodeficient mice
[J]. Immunotherapy, 2019, 11(10
)：
881-888.
[9] Shichkin V P, Antica M. Thymus regeneration and future challenges
[J]. Stem Cell Rev Rep, 2020, 16(2)
：
239-250.
[10] Li L, Shang L, Gao J, et al. Janus kinase inhibitor ruxolitinib blocks
thymic regeneration after acute thymus injury [ J/OL ]. Biochem
Pharmacol, 2019, 171
：
113712. DOI
：
10. 1016/j. bcp. 2019.
113712. Epub 2019 Nov 11.
[11] Kevin F, Joanne M C, Harrison D E. Mouse models in aging
research[M]//in
：
Fox JGea. The Mouse in Biomedical Research
：
(Second edition) , Volume IE. Burlington
：
Academic Press, 2007
：
637-672.
[12] Padr6n A, Hurez V, Gupta H B, et al. Age effects of distinct
immune checkpoint blockade treatments in a mouse melanoma model
[J]. Exp Gerontol, 2018, 105
：
146-154.
[13] Kim M J, Serwold T. Isolation of highly viable thymic epithelial cells
for use in in vitro and in vivo experiments [ J]. Methods Mol Biol,
2019, 1899
：
143-156.
[14] Gordon J, Wilson V A, Blair N F, et al. Functional evidence for a
single endodermal origin for the thymic epithelium [ J ] ■ Nat
Immunol, 2004,5(5
)：
546-553.
[15] Yamazaki Y, Urrutia R, Franco L M, et al. PAX1 is essential for
development and function of the human thymus [ J/OL ]. Sci
Immunol, 2020, 5(44
)：
eaaxl036. DOI
：
10. 1126/sciimmunol.
aaxl036.
[16] Vigliano I, Gorrese M, Fusco A, et al. FOXN1 mutation abrogates
prenatal T-cell development in humans [ J ]. J Med Genet, 2011,
48(6) : 413416.
[17] Kadouri N, Nevo S, Goldfarb Y, ei al. Tliymic epithelial cell heterogeneity
：
TEC by TEC[J]. Nat Rev Immunol, 2020, 20(4)
：
239-253.
[18] Lepletier A, Hun M L, Hammett M V, et al. Interplay between
follistatin, activin A, and BMP4 signaling regulates postnatal thymic
epithelial progenitor cell differentiation during aging [ J/OL ] . Cell
Reports, 2019, 27( 13)
：
3887-3901. e4. DOI
：
10. 1016/j. celrep.
2019.05.045.
[19] Manley N R, Richie E R, Blackburn C C, et al. Structure and function of
the thymic microenvironment [ J ] . Front Biosci ( Landmark Ed ),
2011, 16
：
2461-2477.
[20] Venables T, Griffith A V, DeAraujo A, et al. Dynamic changes in
epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy
and regeneration [ J/OL ]. Nat Commun, 2019, 10 ( 1 )
：
4402.
DOI
：
10. 1038/s41467-019-11879-2.
[21 ] Kamishibahara Y, Kawaguchi H, Shimizu N. Rho kinase inhibitor
Y-27632 promotes neuronal differentiation in mouse embryonic stem
cells via phosphatidylinositol 3-kinase [ J ]. Neurosci Lett, 2016,
615: 4449.
[22] Zou Q, Wu M J, Zhong L W, et al. Development of a xeno-free
feeder-layer system from human umbilical cord mesenchymal stem
cells for prolonged expansion of human pluripotent stem cells
in culture [ J/OL], PLoS One, 2016, 11 ( 2 )
：
e0149023.
DOI
：
10. 1371/journal, pone.0149023. eCollection 2016.
[23] Kim M J, Miller C M, Shadrach J L, et al. Young, proliferative thymic
epithelial cells engraft and function in aging thymuses [ J ]. J
Immunol, 2015, 194(10)
：
47844795.
[24] Zhang X, Qin J, Xie Z, et al. Y-27632 preserves epidermal integrity
in a human skin organ-culture ( hSOC) system by regulating AKT
and ERK signaling pathways [J]. J Dermatol Sci, 2019, 96 ( 2
)：
99-109.
[25] Liang Z, Zhang L, Su H, et al. mTOR signaling is essential for the
development of thymic epithelial cells and the induction of central
immune tolerance [ J ]. Autophagy, 2018, 14(3
)：
505-517.
[26] Wei T L, Zhang N N, Guo Z B, et al. Wnt4 signaling is associated
with the decrease of proliferation and increase of apoptosis during
age-related thymic involution [ J ]. Mol Med Rep, 2015 , 12(5
)：
7568-7576.
[27] Honjo M, Tanihara H. Impact of the clinical use of ROCK inhibitor
on the pathogenesis and treatment of glaucoma [ J ]. Jpn J
Ophthalmol, 2018, 62(2
)：
109-126.
[28] Cascione M, De Matteis V, Toma C C, et al. Morphomechanical and
structural changes induced by ROCK inhibitor in breast cancer cells
[J]. Exp CeU Res, 2017, 360(2)
：
303-309.